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Herkunft des biochemischen Begriffs Pi (anorganisches Phosphat)

Herkunft des biochemischen Begriffs Pi (anorganisches Phosphat)


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ich würde gerne wissen Wenn der Begriff Pi (anorganisches Phosphat) wurde in die Darstellung biochemischer Reaktionen eingeführt, wie er ursprünglich definiert wurde und die damals gegebene Begründung dafür, ihn anstelle einer einzelnen Phosphatart zu verwenden.

(Die aktuelle Begründung würde mich auch interessieren, aber das ist wohl eine andere Frage.)

Lassen Sie mich einige Hintergrundinformationen zu meiner Frage geben. Phosphorsäure (H3Bestellung4) hat drei Ionisationen, die nacheinander die Spezies produzieren: Dihydrogenphosphat (H2Bestellung4-), Monohydrogenphosphat (HPO42-) und Orthophosphat (PO43-). Bei pH 7,4 sind laut Wikipedia-Eintrag zu Phosphat die Hauptspezies die Mono- und Dihydrogenphosphate (61% bzw. 39%). Der Begriff Pi muss spätestens in den 1950er Jahren (vielleicht vor dem Krieg) eingeführt worden sein, zu einer Zeit, als man noch wenig über die Natur der an Phosphatreaktionen beteiligten Spezies - schon gar nicht an den aktiven Zentren von Enzymen - wusste.

Einer der Gründe, warum ich neugierig bin, wie der Begriff eingeführt wurde, ist das Ausmaß, in dem er in biochemischen Lehrbüchern des 21. verwenden es immer noch zu einer Zeit, in der viel mehr über die Reaktionsmechanismen bekannt ist. Keiner der beiden bekannten Texte erklärt die unterschiedlichen Ionisationen von Phosphat und gibt nur in Klammern Definitionen in Bezug auf eine einzelne Spezies - jeweils unterschiedlich: Berg et al. bezeichnet Pi als Orthophosphat, während Nelson und Cox's, Lehninger Prinzipien der Biochemie bezeichnet es als HPO42-.

Bestätigung: Diese Frage wurde durch die SE-Biologie-Frage provoziert - Woher kommt das H+-Ion in diesem Schritt der Glykolyse?


Diese Terminologie ist mindestens so alt wie im September 1944, als die Enzymatische Synthese von Acetylphosphat Zeitschrift für biologische Chemie 155, 55-70 wurde von Lipmann veröffentlicht, in dem es heißt:

Anorganisches Phosphat, bezeichnet als Pich, wurde kolorimetrisch geschätzt

Siehe auch die Definition von "anorganischem Phosphat" und "Orthophosphat" aus dieser Dissertation der University of Wisconsin von 1943:

Verbindung: Anorganisches Phosphat oder Orthophosphat

Definition: Phosphat, dessen Calciumsalz in Wasser-Alkohol-Gemischen unter den zu beschreibenden Bedingungen unlöslich ist. Z.B. NaH2Bestellung4

Mit anderen Worten, "Orthophosphat" war ein allgemeiner Begriff für mono-, di- oder tribasisches Phosphat. Es hatte nicht die engere Bedeutung, die im OP zugeschrieben wurde.


2: Übersicht über Phosphatgruppen

  • Von Tim Soderberg
  • Emeritierter außerordentlicher Professor für Chemie an der University of Minnesota Morris

Phosphat findet sich überall in der Biochemie. Wie wir in der Einleitung zu diesem Kapitel daran erinnert haben, ist unsere DNA durch Phosphat verbunden:

Die Funktion vieler Proteine ​​wird durch Enzyme reguliert – ein- und ausgeschaltet –, die eine Phosphatgruppe an die Seitenketten von Serin-, Threonin- oder Tyrosinresten anlagern oder entfernen.

Unzählige Krankheiten werden durch Defekte in phosphatübertragenden Enzymen verursacht. Nur ein Beispiel: Achondroplasie, eine häufige Ursache von Zwergwuchs, wird durch einen Defekt in einem Enzym verursacht, dessen Funktion es ist, ein Phosphat auf einen Tyrosinrest in einem wachstumsbezogenen Signalprotein zu übertragen.

Schließlich sind Phosphate ausgezeichnete Abgangsgruppen in biologisch-organischen Reaktionen, wie wir im weiteren Verlauf dieses Buches noch oft sehen werden.

Ein Verständnis der Phosphatchemie ist eindeutig von zentraler Bedeutung für das Studium der biologischen organischen Chemie. Wir beginnen mit einem Überblick über die Begriffe, die im Zusammenhang mit Phosphaten verwendet werden.


I. Einleitung

Phosphor ist ein essentieller Nährstoff für alle lebenden Organismen und stellt einen der neun Makronährstoffe dar, die in großen Mengen in Pflanzengeweben vorhanden sind. Phosphor wird von Pflanzen in Form von anorganischem Phosphat aufgenommen (Pi für eine Liste der in diesem Artikel verwendeten Abkürzungen, siehe Tabelle 1) (Abb. 1a). Pi ist ein wesentlicher Baustein für viele zelluläre Komponenten wie Nukleinsäuren und Membranen, ist ein Hauptbestandteil von Molekülen, die als Energiewährung der Zelle fungieren, und ist ein wichtiges Signalmolekül. Daher kann ein Pi-Mangel ein breites Spektrum biologischer Prozesse beeinflussen, was sich letztendlich auf das Pflanzenwachstum und die Entwicklung auswirkt (Rouached et al., 2010 ).

Abkürzung Definition
TSCHAD C-terminal konservierte α-helikale Domäne
CK Kaseinkinase
InsP Inositolpolyphosphat
IP6K Inositol-Hexakisphosphat-Kinase
n Stickstoff
NUDTs Nudix Hydrolase-Familie
P Phosphor
BREI Lila saure Phosphatase
PH-Domain Pleckstrin-Homologiedomäne
PHO-Pfad Phosphat-Signaltransduktionsweg (Hefe)
PHR1 Reaktion auf Phosphathunger 1
Pi Anorganisches Phosphat
PIP Phosphoinositid
Polyp Anorganisches Polyphosphat
PP-InsP Inositolpyrophosphat
PPIP5K Diphosphoinositol-Pentakisphosphat-Kinase
PPK PolyP-Kinase
PPN Endopolyphosphatase
pppGpp Guanosinpentaphosphat
PPX Exopolyphosphatase
PSR Reaktion auf Phosphatmangel (Pflanzen)
SPX SYG1/Pho81/XPR1
TTM Triphosphat-Tunnel-Metalloenzym
VIH VIP1 HOMOLOG
VTC Vakuoläre Transporter-Begleitperson

Pflanzen speichern Pi in ihren Vakuolen und verlagern es in das Zytosol, wenn die intrazellulären Pi-Konzentrationen niedrig sind (Liu et al., 2016). Einige Pflanzengewebe wie Samen und Früchte können Pi in Form von Phytinsäure (Inositolhexakisphosphat, InsP .) speichern6 Abb. 1b) (Secco et al., 2017). Phytinsäure ist eine von mehreren multiphosphorylierten Inositol-Verbindungen, die in Pflanzen vorkommen, und diese Verbindungen teilen die D-myo-Inositolring-tragende Esterphosphatgruppe an einer oder mehreren Positionen. Während InsP6 kann eine Speicherform von Pi in Pflanzen darstellen, höher phosphorylierte Inositolpyrophosphate wirken in Pflanzen als Signalmoleküle (Laha et al., 2015 Wild et al., 2016 Zhu et al., 2019) und viele andere Eukaryoten (Azevedo & Saiardi, 2017).

Anorganische Polyphosphate (polyPs) kommen in vielen Prokaryoten und Eukaryoten vor und bilden einen Hauptvorrat von Pi, beispielsweise in Hefe (Urech et al., 1978). PolyPs bilden lineare Ketten, die in der Länge von 3 bis variieren C. 1000 Pi-Einheiten und sind durch energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen verknüpft (Abb. 1c). Der Abbau von Inositolpyrophosphaten (PP-InsPs) in Hefe führt zu einer massiven Abnahme der PolyP-Konzentration (Lonetti et al., 2011). Dies legt nahe, dass der Pi-, InsP- und polyP-Stoffwechsel funktionell verbunden sind, insbesondere in sessilen, bodenlebenden Organismen. Es ist jedoch derzeit unklar, ob polyPs in Pflanzen vorkommen und ob sie zum Stoffwechsel und zur Speicherung von Pi beitragen. Hier überprüfen wir kritisch unser aktuelles Wissen über polyPs in Pflanzen und die Rolle von PP-InsPs in der Pi-Sensorik und Zellsignalisierung.


Inhalt

Das Phosphation hat eine Molmasse von 94,97 g/mol und besteht aus einem zentralen Phosphoratom, das von vier Sauerstoffatomen in einer tetraedrischen Anordnung umgeben ist. Es ist die konjugierte Base des Hydrogenphosphat-Ions H(PO
4 ) 2−
, die wiederum die konjugierte Base des Dihydrogenphosphat-Ions H
2 (PO
4 ) −
, die wiederum die konjugierte Base der Orthophosphorsäure ist, H
3 Bestellung
4 .

Viele Phosphate sind bei Standardtemperatur und -druck in Wasser löslich. Die Natrium-, Kalium-, Rubidium-, Cäsium- und Ammoniumphosphate sind alle wasserlöslich. Die meisten anderen Phosphate sind in Wasser nur wenig löslich oder unlöslich. In der Regel sind die Hydrogen- und Dihydrogenphosphate etwas besser löslich als die entsprechenden Phosphate.

Gleichgewichte in Lösung Bearbeiten

In wässriger Lösung koexistieren Orthophosphorsäure und ihre drei abgeleiteten Anionen gemäß den folgenden Dissoziations- und Rekombinationsgleichgewichten [3]

Gleichgewicht Dissoziationskonstante Kein [4] PKein
h3Bestellung4 H
2 PO −
4 + H +
Kein1 = [ H +
] [ H
2 PO −
4 ] / [ H
3 Bestellung
4 ] ≈ 7.5 × 10 −3
PKa1 = 2.14
h
2 PO −
4 ⇌ HPO 2−
4 + H +
Kein2 = [ H +
] [ HPO 2−
4 ] / [ H
2 PO −
4 ] ≈ 6.2 × 10 −8
PKa2 = 7.20
HPO 2−
4 ⇌ PO 3−
4 + H +
Kein3 = [ H +
] [ PO 3−
4 ] / [ HPO 2−
4 ] ≈ 2.14 × 10 −13
PKa3 = 12.37

Werte sind bei 25 °C und 0 Ionenstärke.

Das pKein Werte sind die pH-Werte, bei denen die Konzentration jeder Spezies gleich der ihrer konjugierten Basen ist. Bei pH 1 oder darunter ist die Phosphorsäure praktisch undissoziiert. Etwa pH 4,7 (auf halbem Weg zwischen den ersten beiden pKein Werte) das Dihydrogenphosphat-Ion, [H
2 Bestellung
4 ] −
, ist praktisch die einzige vorkommende Art. Etwa pH 9,8 (auf halbem Weg zwischen dem zweiten und dritten pKein Werte) das Monohydrogenphosphat-Ion, [HPO
4 ] 2−
, ist die einzige vorhandene Art. Bei pH 13 oder höher wird die Säure vollständig als Phosphation dissoziiert (PO
4 ) 3−
.

Dies bedeutet, dass Salze der Mono- und Diphosphat-Ionen selektiv aus wässriger Lösung kristallisiert werden können, indem der pH-Wert entweder auf 4,7 oder 9,8 eingestellt wird.

Tatsächlich ist H
3 Bestellung
4 , H
2 (PO
4 ) −
und H(PO
4 ) 2−
verhalten sich wie getrennte schwache Säuren, da die aufeinanderfolgenden pKein unterscheiden sich um mehr als 4.

Phosphat kann viele polymere Ionen wie Pyrophosphat bilden (P
2 Ö
7 ) 4−
, und Triphosphat, (P
3 Ö
10 ) 5−
. Die verschiedenen Metaphosphat-Ionen (die normalerweise lange lineare Polymere sind) haben eine empirische Formel von (PO
3 ) −
und kommen in vielen Verbindungen vor.

Biochemie der Phosphate Bearbeiten

In biologischen Systemen kommt Phosphor als freie Phosphatanionen in Lösung vor (anorganisches Phosphat) oder als verschiedene Organophosphate an organische Moleküle gebunden.

Anorganisches Phosphat wird allgemein als . bezeichnet Pich und bei physiologischem (homöostatischem) pH-Wert hauptsächlich aus einer Mischung von [HPO
4 ] 2−
und [H
2 Bestellung
4 ] −
Ionen. Bei neutralem pH-Wert wie im Cytosol (pH = 7,0) haben die Konzentrationen der Orthophosphorsäure und ihrer drei Anionen die Verhältnisse

Somit ist nur [H
2 Bestellung
4 ] −
und [HPO
4 ] 2−
Ionen sind in signifikanten Mengen im Zytosol vorhanden (62% [H
2 Bestellung
4 ] −
, 38% [HPO
4 ] 2−
). In extrazellulärer Flüssigkeit (pH = 7,4) ist dieser Anteil umgekehrt (61% [HPO
4 ] 2−
, 39% [H
2 Bestellung
4 ] −
).

Anorganisches Phosphat kann auch als Pyrophosphat-Anionen vorliegen [P
2 Ö
7 ] 4−
, das durch Hydrolyse Orthophosphat ergeben kann:

Organische Phosphate kommen häufig in Form von Estern als Nukleotiden (z. B. AMP, ADP und ATP) sowie in DNA und RNA vor. Freie Orthophosphatanionen können durch Hydrolyse der Phosphoanhydridbindungen in ATP oder ADP freigesetzt werden. Diese Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen sind der unmittelbare Energiespeicher und die Energiequelle für viele Stoffwechselprozesse. ATP und ADP werden oft als energiereiche Phosphate bezeichnet, ebenso wie die Phosphate im Muskelgewebe. Ähnliche Reaktionen existieren für die anderen Nukleosiddiphosphate und -triphosphate.

Knochen und Zähne Bearbeiten

Ein wichtiges Vorkommen von Phosphaten in biologischen Systemen ist das Strukturmaterial von Knochen und Zähnen. Diese Strukturen bestehen aus kristallinem Calciumphosphat in Form von Hydroxyapatit. Der harte, dichte Schmelz von Säugetierzähnen besteht aus Fluorapatit, einem Hydroxycalciumphosphat, bei dem einige der Hydroxylgruppen durch Fluoridionen ersetzt wurden.

Medizinische und biologische Forschung verwendet Bearbeiten

Der Arzneistoff (Salz) von Phosphor ist Phosphat. Einige Phosphate, die bei der Heilung vieler Harnwegsinfektionen helfen, werden verwendet, um den Urin saurer zu machen. Um die Bildung von Kalksteinen in den Harnwegen zu vermeiden, werden einige Phosphate verwendet. [5] Für Patienten, die nicht in der Lage sind, genügend Phosphor in ihrer täglichen Ernährung aufzunehmen, werden Phosphate als Nahrungsergänzungsmittel verwendet, normalerweise aufgrund bestimmter Störungen oder Krankheiten. [5] Injizierbare Phosphate können nur von einem Gesundheitsdienstleister gehandhabt werden. [5]

Pflanzenstoffwechsel Bearbeiten

Pflanzen nehmen Phosphor über mehrere Wege auf: den arbuskulären Mykorrhiza-Weg und den direkten Aufnahmeweg.

Hyperphosphatämie oder ein hoher Phosphatspiegel im Blut ist mit einer erhöhten Mortalität in der Allgemeinbevölkerung verbunden. Hyperphosphatämie wird in der Regel durch Phosphatzusätze, also Phosphate, die Nahrungsmittelzubereitungen zugesetzt werden, verursacht, da in Nahrungsmitteln natürlich vorkommende Phosphate vom Magen-Darm-Trakt nicht vollständig aufgenommen werden. Phosphate induzieren eine Gefäßverkalkung, und eine hohe Phosphatkonzentration im Blut erwies sich als Prädiktor für kardiovaskuläre Ereignisse. [6]

Phosphate werden häufig als Zusatzstoffe in industriell verarbeiteten Lebensmitteln und Fastfood verwendet. Fast Food und verzehrfertige Fertiggerichte sind die Hauptverursacher des steigenden Phosphatkonsums in der Bevölkerung. Phosphatzusätze werden auch häufig in aromatisierten Erfrischungsgetränken sowie in bestimmten Milchprodukten gefunden. [6]

Geologisches Vorkommen Bearbeiten

Phosphate sind die natürlich vorkommende Form des Elements Phosphor, das in vielen Phosphatmineralien vorkommt. In der Mineralogie und Geologie bezieht sich Phosphat auf ein Gestein oder Erz, das Phosphationen enthält. Anorganische Phosphate werden abgebaut, um Phosphor für den Einsatz in Landwirtschaft und Industrie zu gewinnen. [2]

Der weltweit größte Produzent und Exporteur von Phosphaten ist Marokko. Innerhalb Nordamerikas liegen die größten Lagerstätten in der Region Bone Valley in Zentralflorida, in der Region Soda Springs im Südosten von Idaho und an der Küste von North Carolina. Kleinere Lagerstätten befinden sich in Montana, Tennessee, Georgia und South Carolina. Der kleine Inselstaat Nauru und seine Nachbarinsel Banaba, die früher über massive Phosphatvorkommen bester Qualität verfügten, wurden exzessiv abgebaut. Rohphosphat findet sich auch in Ägypten, Palästina, der Westsahara, der Insel Navassa, Tunesien, Togo und Jordanien, Ländern mit großer Phosphatabbauindustrie.

Phosphoritminen findet man hauptsächlich in:

Im Jahr 2007 wurde bei der derzeitigen Verbrauchsrate der Phosphorvorrat in 345 Jahren aufgebraucht. [7] Einige Wissenschaftler dachten jedoch, dass in 30 Jahren ein „Peak-Phosphor“ auftreten wird, und Dana Cordell vom Institute for Sustainable Futures sagte, dass die Reserven bei den „aktuellen Raten in den nächsten 50 bis 100 Jahren erschöpft sein werden“. [8] Reserven beziehen sich auf die Menge, von der angenommen wird, dass sie zu aktuellen Marktpreisen förderbar ist, und im Jahr 2012 schätzte das USGS 71 Milliarden Tonnen der Weltreserven, während im Jahr 2011 weltweit 0,19 Milliarden Tonnen abgebaut wurden das durchschnittliche Gestein [10] (während die typische Konzentration in der Vegetation aus Sicht von 0,03 % bis 0,2 %), [11] und folglich befinden sich Billiarden Tonnen Phosphor in der 3 * 10 19 Tonnen schweren Erdkruste, [12] wenn auch in überwiegend geringerer Konzentration als die als Reserven aus der Inventarisierung gezählten Lagerstätten und billiger in der Gewinnung, wenn angenommen wird, dass die Phosphatmineralien im Phosphatgestein Hydroxyapatit und Fluorapatit sind, Phosphatmineralien etwa 18,5 Gew.-% Phosphor enthalten und wenn Phosphatgestein etwa 20 % enthält Von diesen Mineralien enthält das durchschnittliche Phosphatgestein etwa 3,7 Gew.-% Phosphor.

Einige Phosphatgesteinslagerstätten wie Mulberry in Florida [13] zeichnen sich durch den Einschluss signifikanter Mengen radioaktiver Uranisotope aus. Dieses Syndrom ist bemerkenswert, da beim Ausbringen des resultierenden Phosphatdüngers (z. B. in vielen Tabakanbaubetrieben im Südosten der USA) Radioaktivität in Oberflächengewässer freigesetzt werden kann [14].

Im Dezember 2012 gab Cominco Resources eine aktualisierte JORC-konforme Ressource ihres Hinda-Projekts im Kongo-Brazzaville mit 531 Mt bekannt, was es zur größten gemessenen und angezeigten Phosphatlagerstätte der Welt macht. [fünfzehn]

Bergbau Bearbeiten

Auf die drei wichtigsten Phosphatproduzenten (China, Marokko und die Vereinigten Staaten) entfallen etwa 70 % der Weltproduktion.


Inhalt

Die erste Pflanzenphytase wurde 1907 aus Reiskleie [3] [4] und 1908 aus einem Tier (Kalbsleber und Blut) gefunden. [4] [5] Im Jahr 1962 begann der erste Versuch, Phytasen zur Verbesserung der Tierfutterernährung zu kommerzialisieren, als International Minerals & Chemicals (IMC) über 2000 Mikroorganismen untersuchte, um die geeignetsten für die Phytaseproduktion zu finden. Dieses Projekt wurde zum Teil aufgrund von Bedenken hinsichtlich des Ausgehens abbaubarer Quellen für anorganischen Phosphor (siehe Peak-Phosphor), den IMC zu dieser Zeit für die Futtermittelindustrie lieferte, ins Leben gerufen. Aspergillus (ficuum) Niger Als vielversprechender Kandidat wurde der Pilzstamm NRRL 3135 (ATCC 66876) identifiziert [6], da er große Mengen extrazellulärer Phytasen produzieren konnte. [7] Die Effizienz des Organismus reichte jedoch nicht für eine Kommerzialisierung aus, so dass das Projekt 1968 als Fehlschlag endete. [6]

Trotzdem identifizieren A. niger führte 1984 zu einem neuen Versuch mit A. niger Mutanten, die mit der relativ kürzlich erfundenen rekombinanten DNA-Technologie hergestellt wurden. Dieses USDA-finanzierte Projekt wurde von Dr. Rudy Wodzinski initiiert, der früher am Projekt des IMC beteiligt war. [6] Dieses Projekt von 1984 führte 1991 zum ersten teilweise klonierten Phytase-Gen phyA (von A. niger NRRL 31235) [6] [8] und später 1993 zur Klonierung des vollständigen Gens und seiner Überexpression in A. niger. [6] [9]

1991 begann BASF mit dem Verkauf der ersten kommerziellen Phytase, die in A. niger unter der Marke Natuphos die verwendet wurde, um den Nährstoffgehalt von Tierfutter zu erhöhen. [6]

Im Jahr 1999 Escherichia coli bakterielle Phytasen wurden als wirksamer identifiziert als A. niger Pilzphytasen. [6] [10] [11] Dies führte in der Folge zum Einsatz dieser neuen Generation bakterieller Phytasen, die Pilzphytasen in vielerlei Hinsicht überlegen waren. [6]

In der Literatur wurden vier verschiedene Phytaseklassen charakterisiert: saure Histidin-Phosphatasen (HAPS), Beta-Propeller-Phytasen (BPPs), violette saure Phosphatasen (PAPs) [2] und zuletzt Protein-Tyrosin-Phosphatase-ähnliche Phytasen (PTP- wie Phytasen). [12]

Histidinsaure Phosphatasen (HAPs) Bearbeiten

Die meisten der bekannten Phytasen gehören zu einer Enzymklasse, die als Histidin-Säure-Phosphatasen (HAPs) bezeichnet wird. HAPs wurden aus Fadenpilzen, Bakterien, Hefen und Pflanzen isoliert. [1] Alle Mitglieder dieser Phytaseklasse teilen ein gemeinsames Sequenzmotiv des aktiven Zentrums (Arg-His-Gly-X-Arg-X-Pro) und haben einen zweistufigen Mechanismus, der Phytinsäure (sowie einige andere Phosphoester) hydrolysiert ). [2] Die Phytase aus dem Pilz Aspergillus niger ist ein HAP und ist bekannt für seine hohe spezifische Aktivität und seine kommerziell vermarktete Rolle als Futtermittelzusatzstoff zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit von Phosphat aus Phytinsäure in der getreidebasierten Ernährung von Geflügel und Schweinen. [13] HAPs wurden auch in mehreren transgenen Pflanzen als potenzielle alternative Methode der Phytaseproduktion für die Futtermittelindustrie überexprimiert [14] und erst kürzlich wurde das HAP-Phytase-Gen aus E coli wurde erfolgreich in einem transgenen Schwein exprimiert. [fünfzehn]

Β-Propeller-Phytasen Bearbeiten

β-Propeller-Phytasen bilden eine kürzlich entdeckte Phytase-Klasse. Diese ersten Beispiele dieser Enzymklasse wurden ursprünglich aus Bazillus Arten, [2], aber inzwischen wurden zahlreiche Mikroorganismen identifiziert, die β-Propeller-Phytasen produzieren. Die dreidimensionale Struktur der β-Propeller-Phytase ähnelt einem Propeller mit sechs Blättern. Aktuelle Forschungen legen nahe, dass β-Propeller-Phytasen die wichtigsten Phytat-abbauenden Enzyme in Wasser und Boden sind und eine wichtige Rolle beim Phytat-Phosphor-Kreislauf spielen könnten. [16]

Lila saure Phosphatasen Bearbeiten

Kürzlich wurde aus den Keimblättern keimender Sojabohnen eine Phytase isoliert, die das Motiv des aktiven Zentrums einer sauren Purpurphosphatase (PAP) aufweist. Diese Klasse von Metalloenzymen wurde gut untersucht und Recherchen in genomischen Datenbanken zeigen PAP-ähnliche Sequenzen in Pflanzen, Säugetieren, Pilzen und Bakterien. Es wurde jedoch festgestellt, dass nur das PAP aus Sojabohnen eine signifikante Phytaseaktivität aufweist. Die dreidimensionale Struktur, das Sequenzmotiv des aktiven Zentrums und der vorgeschlagene Katalysemechanismus wurden für PAPs bestimmt. [ Zitat benötigt ]

Protein-Tyrosin-Phosphatase-ähnliche Phytasen Bearbeiten

Nur wenige der bekannten Phytasen gehören zu einer Superfamilie von Enzymen, die als Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs) bezeichnet werden. PTP-ähnliche Phytasen, eine relativ neu entdeckte Phytaseklasse, wurden aus Bakterien isoliert, die normalerweise im Darm von Wiederkäuern leben. [17] Alle charakterisierten PTP-ähnlichen Phytasen teilen ein Sequenzmotiv des aktiven Zentrums (His-Cys-(X)5-Arg), einen zweistufigen Säure-Base-Mechanismus der Dephosphorylierung und Aktivität gegenüber phosphrylierten Tyrosinresten, Eigenschaften, die allen Enzymen der PTP-Superfamilie gemeinsam. [18] [19] Wie bei vielen Enzymen der PTP-Superfamilie wurden die genauen biologischen Substrate und Rollen bakterieller PTP-ähnlicher Phytasen noch nicht eindeutig identifiziert. Die charakterisierten PTP-ähnlichen Phytasen aus Pansenbakterien haben eine Sequenz- und Strukturhomologie mit der PTP-ähnlichen Phosphoinositid/-Inositol-Phosphatase PTEN aus Säugetieren [12] und eine signifikante Sequenzhomologie zur PTP-Domäne eines Typ III-sekretierten Virulenzproteins von Pseudomonas syringae (HopPtoD2). [20]

Substratspezifität Bearbeiten

Die meisten Phytasen zeigen eine breite Substratspezifität und haben die Fähigkeit, viele phosphorylierte Verbindungen zu hydrolysieren, die Phytinsäure strukturell nicht ähnlich sind, wie ADP, ATP, Phenylphosphat, Fructose-1,6-Bisphosphat, Glucose-6-Phosphat, Glycerophosphat und 3-Phosphoglycerat . Nur wenige Phytasen wurden als hochspezifisch für Phytinsäure beschrieben, wie Phytasen aus Bacillus sp., Aspergillus sp., E. coli [21] und die zur Klasse der PTP-ähnlichen Phytasen gehörenden Phytasen [18]

Wege der Phytinsäure-Dephosphorylierung Bearbeiten

Phytinsäure hat sechs Phosphatgruppen, die von Phytasen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit und in unterschiedlicher Reihenfolge freigesetzt werden können. Phytasen hydrolysieren schrittweise Phosphate aus Phytinsäure und liefern Produkte, die wiederum zu Substraten für die weitere Hydrolyse werden. Die meisten Phytasen sind in der Lage, fünf der sechs Phosphatgruppen von Phytinsäure abzuspalten. Phytasen wurden nach der ersten hydrolysierten Phosphatposition der Phytinsäure gruppiert. Das Enzym Nomenclature Committee der International Union of Biochemistry erkennt drei Arten von Phytasen basierend auf der Position des ersten hydrolysierten Phosphats an, nämlich 3-Phytase (EC 3.1.3.8), 4-Phytase (EC 3.1.3.26) und 5- Phytase (EC 3.1.3.72). Bis heute sind die meisten bekannten Phytasen 3-Phytasen oder 4-Phytasen, [21] nur eine aus Lilienpollen gereinigte HAP [22] und eine PTP-ähnliche Phytase aus Selenomonas ruminantium Untersp. Lactilytika [20] wurden als 5-Phytasen bestimmt.

Phytinsäure und ihre Metaboliten spielen in Samen und Körnern mehrere wichtige Rollen, insbesondere fungiert Phytinsäure als Phosphorspeicher, als Energiespeicher, als Kationenquelle und als Quelle für Myo-Inositol (ein Zellwandvorläufer). Phytinsäure ist die wichtigste Speicherform von Phosphor in Pflanzensamen und die Hauptquelle für Phosphor in der getreidebasierten Ernährung, die in der Intensivtierhaltung verwendet wird. Das in Phytinsäure enthaltene organische Phosphat ist für die Tiere, die es konsumieren, weitgehend nicht verfügbar, aber das anorganische Phosphat, das Phytasen freisetzen, kann leicht aufgenommen werden. Wiederkäuer können Phytinsäure als Phosphorquelle verwenden, da die Bakterien, die ihren Darm bewohnen, gut charakterisierte Produzenten vieler Arten von Phytasen sind. Monogastrische Tiere tragen jedoch keine Bakterien, die Phytase produzieren, daher können diese Tiere Phytinsäure nicht als Hauptquelle für Phosphor verwenden und sie wird mit dem Kot ausgeschieden. [23] Menschen – insbesondere Vegetarier und Veganer aufgrund der erhöhten Anpassung des Darmmikrobioms – können jedoch Mikroben in ihrem Darm haben, die Phytase produzieren können, die Phytinsäure abbaut. [24]

Phytinsäure und ihre Metaboliten haben mehrere andere wichtige Rollen in eukaryotischen physiologischen Prozessen. Als solche spielen auch Phytasen, die Phytinsäure und ihre Metaboliten hydrolysieren, eine wichtige Rolle. Phytinsäure und ihre Metaboliten sind an der DNA-Reparatur, dem clathrinbeschichteten vesikulären Recycling, der Kontrolle der Neurotransmission und der Zellproliferation beteiligt. [25] [26] [27] Die genaue Rolle der Phytasen bei der Regulation der Phytinsäure und ihrer Metaboliten und die daraus resultierende Rolle in den oben beschriebenen physiologischen Prozessen sind noch weitgehend unbekannt und Gegenstand vieler Forschungen.

Es wurde berichtet, dass Phytase bei Menschen, die während der Zugabe des Enzyms zu Rinderfutter exponiert wurden, eine Überempfindlichkeitspneumonitis verursacht. [28] [29]

Phytase wird von Bakterien im Darm von Wiederkäuern (Rinder, Schafe) produziert, die es ihnen ermöglichen, die im Getreide enthaltene Phytinsäure als Phosphorquelle zu nutzen. [30] Nichtwiederkäuer (monogastrische Tiere) wie Menschen, Hunde, Schweine, Vögel usw. produzieren keine Phytase. Die Forschung im Bereich der Tierernährung hat die Idee entwickelt, Futtermittel mit Phytase zu ergänzen, um dem Tier phytatgebundene Nährstoffe wie Calcium, Phosphor, Mineralstoffe, Kohlenhydrate, Aminosäuren und Proteine ​​zur Verfügung zu stellen. [31] In Kanada wurde ein genetisch verändertes Schwein namens Enviropig entwickelt, das die Fähigkeit besitzt, Phytase hauptsächlich durch seine Speicheldrüsen zu produzieren, und für eine begrenzte Produktion zugelassen. [32] [33]

Phytase wird als Futterergänzungsmittel – häufig bei Geflügel und Schweinen – verwendet, um den Nährwert von Pflanzenmaterial durch Freisetzung von anorganischem Phosphat aus Phytinsäure (Myo-Inositol-Hexakisphosphat) zu erhöhen. Phytase kann aus transgenen Mikroben gereinigt werden und wurde kürzlich in transgenen Raps-, Luzerne- und Reispflanzen produziert. [34]


OSTEOBLASTISCHE ZELLLINIE

JANE E. AUBIN , . JOHAN N.M. HEERSCHE, in Zell- und Molekularbiologie des Knochens, 1993

1 Alkalische Phosphatase (APase EC 3.1.3.1)

Alkalische Phosphatase ist ein Ektoenzym, das Monophosphatester bei einem hohen pH-Optimum hydrolysieren kann (für eine allgemeine Übersicht siehe Wuthier und Register, 1984 Harris, 1989 Whyte, 1989). Strukturstudien haben gezeigt, dass APase mit spezifischen Phospholipiden auf der Osteoblasten-Plasmamembran wechselwirkt (zur Übersicht siehe Cross, 1987, Ferguson und Williams, 1988, Low, 1989a, b). Alkalische Phosphatase gehört zu einer wachsenden Klasse von Zelloberflächenproteinen (einschließlich Thy-1 und N-CAM), die kovalent an Phosphatidylinositol (PI)-Phospholipidkomplexe in der Plasmamembran gebunden sind. Somit kann membrangebundene APase aus Zellen (z. B. den ROS- und UMR-Zelllinien) durch PI-spezifische Phospholipase C (Noda et al., 1987 Turksen und Aubin, 1991).

Obwohl bis heute die genaue physiologische Rolle dieses Enzyms im Knochen nicht bekannt ist, ist APase-Aktivität vorhanden, wenn Zellen als Präosteoblasten und Osteoblasten erkannt werden, aber sie fehlt in den Osteozyten (Doty und Schofield, 1976). Es ist allgemein anerkannt, dass mit zunehmender spezifischer Aktivität von APase in einer Population von Knochenzellen eine entsprechende Verschiebung zu einem differenzierteren Zustand stattfindet, und die Menge an osteoblastischer APase wurde routinemäßig in in vitro Experimente als relativer Marker der Osteoblastendifferenzierung (Rodan und Rodan, 1984). Kürzlich hat eine Reihe von Studien vorgeschlagen, dass PI-gebundene Proteine ​​an der Transmembran-Signalübertragung beteiligt sein könnten (für eine Übersicht siehe Saltier et al., 1989 niedrig, 1989a, b). Daher ist es interessant zu spekulieren, dass APase eine Rolle bei der Regulation der Osteoblastendifferenzierung spielen könnte. Eine häufiger zugeschriebene Funktion der APase liegt in der Mineralisierung, jedoch gibt es immer noch Kontroversen über ihre genaue Rolle in diesem Prozess (für eine aktuelle Diskussion siehe Heersche et al., 1990). In Übereinstimmung mit der histologischen Beobachtung, dass APase bereits auf präosteoblastischen Zellen vorhanden ist, bevor sie die typischerweise mit dem reifen Osteoblasten assoziierte quaderförmige Form annehmen, legen eine Reihe neuerer Studien auch nahe, dass die APase-Expression in differenzierenden Osteoblastenzellen vor der Expression des Matrixmoleküls auftritt Osteocalcin (Bronckers et al., 1987 Aronow et al., 1990 Owen et al., 1990 ).


Veranschaulichung metabolischer Quellen und Senken von Phosphat

Was könnten daher die zellulären Phosphatquellen sein, und können sie nun genau identifiziert werden? Wir untersuchten systematisch die vom zentralen Kohlenstoff abgeleiteten Stoffwechselwege (wie von KEGG [Ogata et al., 1999] erhalten), um mögliche zelluläre Phosphatquellen und -senken anhand eines Beispiels von Hefe-Stoffwechselnetzwerken zu identifizieren. Aus dieser umfassenden Analyse geht hervor, dass die Trehalose-, Serin-, Chorismat-, Inositol- und Glycerinsynthese, die alle von der Freisetzung von Pi begleitet werden, die wahrscheinlichen Beispiele für Phosphatquellen darstellen, indem sie alle erforderlichen Kriterien wie zuvor definiert erfüllen (Abbildung 3C). Beachten Sie hier, dass keiner dieser Metaboliten – Trehalose, Serin, Chorismat, Inositol oder Glycerin – Phosphate enthält. Stattdessen werden alle diese Metaboliten über Zwischenreaktionen hergestellt, bei denen Pi freigesetzt wird, was diese Vorstellung davon veranschaulicht, was eine Pi-Quelle sein könnte (und dass dies kein phosphathaltiger Metabolit sein muss). Trehalose ist ein wichtiges „Speicher“-Kohlenhydrat, das sich in sehr hohen Konzentrationen in Zellen anreichert (Chester, 1963, François und Parrou, 2001, Stewart et al et al., 2019 Gupta und Laxman, 2020). Trehalose wird aus den Zuckerphosphaten Glucose-6-Phosphat (G6P) und UDP-Glucose in zwei Schritten hergestellt, wobei der letzte Schritt (katalysiert durch Tps2) zur Trehalosebildung und zur Freisetzung eines Pi-Moleküls führt (Abbildung 3C). Bei glukosegesättigten Bedingungen sind diese beiden Schritte an einem sinnlosen Zyklus von Trehalose während der Glykolyse beteiligt, und die Trehalose-Synthese ermöglicht einen ordnungsgemäßen glykolytischen Fluss durch Aufrechterhaltung des Phosphatgleichgewichts (van Heerden et al., 2014b van Heerden et al., 2014a). Entsprechend dämpfen die PHO Reaktion (die eine Phosphatlimitierung nachahmt), führt zu einem Kohlenstofffluss (Glukose), der in Richtung der Trehalosesynthese und weg vom Pentosephosphatweg (PPP) und der Glykolyse geleitet wird (Gupta et al., 2019 Gupta und Laxman, 2020). Dies wird weitgehend durch Massenwirkung bestimmt, ohne dass Änderungen der Mengen an Glykolyse/PPP-Enzym erforderlich sind. Mehrere Beweislinien deuten darauf hin, dass die Umleitung des Stoffwechselflusses in Richtung Trehalose das Pi-Gleichgewicht wiederherstellt (Gupta et al., 2019). Wenn der letzte Schritt der Trehalose-Synthese (der Phosphat freisetzt) ​​entfernt wird (tps2Δ-Zellen), verringert dies die zellulären Phosphatpools (Gupta et al., 2019). Zusammengenommen erfüllen alle diese Daten die Kriterien für Trehalose als Phosphatquelle. Ein ähnlicher, prädiktiver Fall kann für Glycerin aufgestellt werden, das während des Unterarms der Glykolyse synthetisiert wird und von der Freisetzung von Pi begleitet wird. Die Glycerinbiosynthese aus Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) erfolgt in zwei Schritten, wobei der erste Schritt zur Synthese von Glycerin-3-phosphat (katalysiert durch Gpd1 und Gpd2) und der zweite Schritt zur Synthese von Glycerin und der Freisetzung von einem führt Pi-Molekül durch die Wirkung von Glycerin-3-Phosphatasen (Hor2 und Rhr2) (Austin und Mayer, 2020 Abbildung 3C). Entsprechend der Rolle von Glycerin als Phosphatquelle sind die Glycerinspiegel als Reaktion auf eine Phosphatlimitierung erhöht (Kazemi Seresht et al., 2011). Darüber hinaus werden die an diesen biochemischen Umwandlungen beteiligten metabolischen Phosphatasen, die Trehalose-6-Phosphat-Synthase/Phosphatase bzw et al., 2000). Dies legt eine verstärkte Reaktion (durch die transkriptionelle Induktion dieser Enzyme) als einen Weg zur Mobilisierung metabolischer Reserven von Pi nahe. Wenn Phosphate vorübergehend begrenzt sind, werden Glucose-6-Phosphat und Dihydroxyacetonphosphat also weg von der Glykolyse und dem PPP und hin zu Trehalose bzw. Glycerin umgeleitet. Dies kann zwar das Phosphatgleichgewicht wiederherstellen, führt aber auch zu einer Verringerung des gesamten glykolytischen und PPP-Flusses.

Drei weitere wichtige biosynthetische Prozesse, die aus dem Glukosestoffwechsel stammen, führen zu reichlich vorhandenen Produkten und setzen ebenfalls Phosphat frei. Die Serinbiosynthese aus 3-Phosphoglycerat (3PG) erfolgt in drei Schritten, wobei im letzten Schritt ein Pi-Molekül freigesetzt wird. Die Chorismatsynthese (eine Vorstufe für aromatische Aminosäuren und die Vitamine p-Aminobenzoat und p-Hydroxybenzoat) erfordert ein Molekül Erythrose-4-P (E4P) (aus dem Pentosephosphatweg) und zwei Moleküle Phosphoenolpyruvat (PEP) und erfolgt in sieben Schritten. Hier werden drei Pi-Moleküle freigesetzt (Abbildung 3C). Die Vorhersage ist daher, dass der Fluss zu diesen Molekülen zunehmen wird, wenn Phosphate limitierend sind. Indeed, consistent with this prediction, independent studies with phosphate starvation have all observed that amino acid amounts strongly increase (Boer et al., 2010 Gupta et al., 2019), along with reduced metabolites of the PPP and glycolysis. These data therefore are consistent with these metabolites acting as phosphate sources. Finally, a predictive case can be made for myo-inositol (inositol) biosynthesis as a source of phosphate. Inositol is perhaps the most abundantly present stereoisomer in yeast and mammalian cells (Desfougères et al., 2019). Inositol biosynthesis from glucose-6-phosphate (G6P) occurs in two steps. In the first step, Ino1 converts glucose-6-phosphate to inositol-1-phosphate. The second step is catalyzed by inositol monophosphatases (Inm1 and Inm2), and inositol-1-phosphate is converted to inositol and one molecule of Pi is released (Figure 3C). Although the inositol biosynthetic pathway is relatively poorly studied in yeast, and there is insufficient metabolic data in this (Pi relevant) context, inositol monophosphatase, Inm1, is upregulated under low phosphate conditions (Kazemi Seresht et al., 2011). Therefore, we can predict that this inositol synthesis, accompanied by Pi release, can help restore internal Pi levels. To summarize, phosphate sources can modulate the overall carbon flux distribution in a metabolic network depending on the internal phosphate levels, and will thereby determine the metabolic state of the cell.

What then are the sinks of phosphates? Nucleoside-, di-, tri-phosphates, NAD(P) + , inositol pyrophosphates, and polyphosphates (PolyP) are all putative phosphate sinks (and not sources). Is there evidence that is consistent with the plausibility of these metabolites as phosphate sinks? Going by the earlier described criteria of a sink, these metabolites are abundant in cells (Belenky et al., 2007 Ermakova et al., 1981 Gakière et al., 2018 Kukko and Saarento, 1983 Ljungdahl and Daignan-Fornier, 2012 Pestov et al., 2004 Rao et al., 1998). A second criterion is that upon phosphate limitation, their levels will reduce due to both decreased synthesis and increased degradation (mobilization), and this will release phosphate. The case for nucleotides as phosphate sinks: as sinks, the synthesis of these molecules should verringern in response to phosphate limitation, they should have a slow turnover rate, and should accumulate in abundance. These criteria appear to be well-satisfied for nucleotides (mono-, di-, tri phosphates). Phosphate limitation results in a rapid decrease in both their synthesis and steady-state levels (Ashihara et al., 1988 Boer et al., 2010 Klosinska et al., 2011). In a recent study, the reduction in (but not absence of) PHO gene expression (phosphate transporters, phosphatases etc.), which mimics phosphate limitation, also revealed reduced de novo nucleotide synthesis. This was not due to reduced amounts of nucleotide biosynthesis enzymes, but instead was governed by mass action (Gupta et al., 2019). Further, phosphate limitation also increases the amounts of 5’-, 3’-nucleotidases and nucleotide pyrophosphatase enzymes, which thereby increases nucleotide degradation (and will allow phosphate release) (Alipanah et al., 2018 Hammond et al., 2003 Kennedy et al., 2005 Misson et al., 2005 Rittmann et al., 2005 Shimano and Ashihara, 2006 Uhde-Stone et al., 2003 Wasaki et al., 2006 Yin et al., 2007). Phm8, a nucleotidase, is transcriptionally induced (a longer term response) upon carbon, nitrogen, and Pi starvation (Xu et al., 2013). The relavance of these nucleotidases (in the context of Pi sinks) will become clearer in the following paragraph.

Using very similar analyses, the phosphate moiety of NAD(P) + and its intermediate metabolites also become potential phosphate sinks. Although direct estimates of these molecules during phosphate limitation have not been made, we can predict that there will be reduced synthesis of these metabolites, as they utilize nucleotide triphosphates as their phosphate donor, and nucleotide synthesis itself decreases under these conditions. Indeed, consistent with this prediction, during low Pi conditions, pyridine nucleotides, NAD + and NAD + intermediates (NMN and NaMN) are broken down by specific nucleotidases, and this will also release phosphate (Bogan and Brenner, 2010). Indeed, somewhat overlooked reports suggest connections between phosphate signaling and NAD(P) + metabolism (Bogan and Brenner, 2010 Kato and Lin, 2014).

In this context of nucleotides, as well as NAD(P) + molecules as Pi sinks, two relevant points emerge. In an insightful review, Bogan and Brenner summarize that ribonucleoside monophosphates (which are potential substrates of 5’-nucleotidases) come from both salvage and de novo synthesis. The 5’-nucleotidases themselves allow the reverse reactions of nucleoside kinases (and therefore oppose salvage pathways, and nucleotide generation) (Bogan and Brenner, 2010). These opposing substrate cycles, and the relative activity of phosphorylation/dephosphorylation, determine how much nucleoside monophosphates (and eventually triphosphates) are present, or if they will be converted to nucleosides. A more recent review points to the fact that upon extreme Pi starvation, as a ‘last resort’ cells induce enzymes that release Pi from nucleotides, since it would otherwise be illogical for cells to deplete its pools of nucleotides, which are critical for future cell division (Austin and Mayer, 2020). These points are all entirely consistent with nucleotides (and NAD related molecules) being Pi sinks, which will serve to eventually release Pi if phosphate levels within cells are not restored.

Finally, inositol pyrophosphates and polyphosphates are likely phosphate sink candidates. Inositol pyrophosphates have the highest proportion of phosphate groups for any metabolite, containing more phosphates than carbon atoms (Saiardi, 2012), and they regulate the expression of PHO related transcripts in yeast (Auesukaree et al., 2005 Lee et al., 2008 Lee et al., 2007), suggesting cross-talk between inositol pyrophosphate metabolism and phosphate signaling. Polyphosphates (polyP) are linear polymers of many phosphate residues, ranging from few to hundreds, and are linked by the same high-energy phosphoanhydride bonds that are found in ATP. PolyPs are mainly stored inside the vacuole, with small pools also found in cytosol, nucleus and mitochondria (Gerasimaitė and Mayer, 2016 Saiardi, 2012). Evidence from some organisms (bacteria, yeasts) suggest that polyphosphates are effective phosphate reservoirs, and upon phosphate starvation, these stores are degraded by the action of exo- and endo-polyphosphatases to restore phosphate (Brown and Kornberg, 2008 Kulaev et al., 1999 Kulaev and Kulakovskaya, 2000 Shirahama et al., 1996). We would therefore predict these metabolites to collectively be intracellular phosphate sinks, with inositol phosphates and polyphosphates likely to be the major sinks. All these are now directly testable predictions.

Two broad points emerge when we define phosphate sources and sinks in this way. First, we reiterate a close coupling of glucose metabolism with internal phosphate homeostasis. Altering flux toward different arms of glucose metabolism – glycolysis, the pentose phosphate pathway, and trehalose/glycogen synthesis – will therefore result in substantial changes in phosphate release/utilization (as shown earlier in Figure 3C). Second, we can now with some confidence predict key metabolic state changes (based on metabolic flux through these defined sources and sinks) due to a transient phosphate limitation (or ‘squeeze’). Primarily, trehalose, aromatic amino acids/chorismate, serine, glycerol, and inositol (phosphate sources) will all increase, while nucleotides, polyphosphates and (some) inositol pyrophosphates (phosphate sinks) will decrease. Flux through glycolysis and the pentose phosphate pathway will correspondingly decrease. Amounts of these hallmark metabolites therefore represent a concise metabolic signature of a phosphate-limited cell. In summary, this conceptualization of the phosphate sources and sinks together with their biochemical reactions illustrate the importance of these metabolites in maintaining the overall phosphate levels in the cell. Second, mass-action driven metabolic processes play a fundamental role in phosphate homeostasis by regulating flux through the key phosphate-related metabolic nodes. Collective evidence therefore indicates that there is an intimate relationship and interdependence between phosphate balance and carbon metabolism.


What is an Inorganic Phosphate

An inorganic phosphate is a salt of phosphoric acid. Here, a phosphate group is connected to a metal cation. The phosphate atom is in the center surrounded by four oxygen atoms that are chemically bonded to the phosphorous atom. The phosphate group has an overall negative charge of -3. Therefore, it can form monobasic, dibasic and tribasic salts. The phosphate group has a tetrahedral arrangement.

Inorganic phosphates can be found naturally. Usually, these compounds can be found as salts of group 1 elements such as sodium, potassium, calcium, etc. There are two types of inorganic phosphate compounds: orthophosphates and condensed phosphates.

Figure 2: Diammonium Phosphate is an Inorganic Phosphate

Orthophosphates are reactive phosphate compounds. These are the simplest compounds among other phosphates and are composed of one phosphate unit. Hence these are also called as monophosphates. Condensed phosphates are composed of more than one phosphate unit.

Inorganic phosphates are also widely used as fertilizers. For example, Superphosphate and Triple super phosphate are common fertilizer substances.


Catalytic site nucleotide and inorganic phosphate dependence of the conformation of the epsilon subunit in Escherichia coli adenosinetriphosphatase

The rate of trypsin cleavage of the epsilon subunit of Escherichia coli F1 (ECF1) has been found to be ligand-dependent, as measured indirectly by the activation of the enzyme that occurs on protease digestion, or when followed directly by monitoring the cleavage of this subunit using monoclonal antibodies. The cleavage of the epsilon subunit was fast in the presence of ADP alone, ADP + MG2+, ATP + EDTA, or AMP-PNP, but slow when Pi was added along with ADP + Mg2+ or when ATP + Mg2+ was added to generate ADP + Pi (+Mg2+) in the catalytic site(s). The half-maximal concentration of Pi required in the presence of ADP + Mg2+ to protect the epsilon subunit from cleavage by trypsin was 50 microM, which is in the range measured for the high-affinity binding of Pi to F1. The ligand-dependent conformational changes in the epsilon subunit were also examined in cross-linking experiments using the water-soluble carbodiimide 1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide (EDC). In the presence of ATP + Mg2+ or ADP + Mg2+ + Pi, the epsilon subunit cross-linked to beta in high yield. With ATP + EDTA or ADP + Mg2+ (no Pi), the yield of the beta-epsilon cross-linked product was much reduced. We conclude that the epsilon subunit undergoes a conformational change dependent on the presence of Pi. It has been found previously that binding of the epsilon subunit to ECF1 inhibits ATPase activity by decreasing the off rate of Pi [Dunn, S. D., Zadorozny, V. D., Tozer, R. G., & Orr, L. E. (1987) Biochemistry 26, 4488-4493]. This reciprocal relationship between Pi binding and epsilon-subunit conformation has important implications for energy transduction by the E. coli ATP synthase.


Inhalt

In Gram-negative bacteria, such as Escherichia coli (E coli), alkaline phosphatase is located in the periplasmic space, external to the inner cell membrane and within the peptidoglycan portion of the cell wall. Since the periplasmic gap is more prone to environmental variation than the inner cell, alkaline phosphatase is suitably resistant to inactivation, denaturation, or degradation. This characteristic of the enzyme is uncommon to many other proteins. [10]

The precise structure and function of the four isozymes (Int in E coli) are solely geared to supply a source of inorganic phosphate when the environment lacks this metabolite. The four enzymes are dependent upon the location of the tissue expression. The four sites of tissue expression are the Intestinal AlP, Placental ALP, Germ Cell ALP and Liver/Bone/Kidney ALP. [11] The inorganic phosphates produced by these isozymes are then bound to carrier proteins which deliver the inorganic phosphates to a specific high-affinity transport system, known as the Pst system, which transports phosphate across the cytoplasmic membrane. [12]

While the outer membrane of E coli contains porins that are permeable to phosphorylated compounds, the inner membrane does not. Then, an issue arises in how to transport such compounds across the inner membrane and into the cytosol. Surely, with the strong anionic charge of phosphate groups along with the remainder of the compound they are very much immiscible in the nonpolar region of the bilayer. The solution arises in cleaving the phosphate group away from the compound via ALP. In effect, along with the concomitant compound the phosphate was bound to, this enzyme yields pure inorganic phosphate which can be ultimately targeted by the phosphate-specific transport system (Pst system) [13] for translocation into the cytosol. [14] As such, the main purpose of dephosphorylation by alkaline phosphatase is to increase the rate of diffusion of the molecules into the cells and inhibit them from diffusing out. [fünfzehn]

Alkaline phosphatase is a zinc-containing dimeric enzyme with the MW: 86,000 Da, each subunit containing 429 amino acids with four cysteine residues linking the two subunits. [16] Alkaline phosphatase contains four Zn ions and two Mg ions, with Zn occupying active sites A and B, and Mg occupying site C, so the fully active native alkaline phosphatase is referred to as (ZnEINZnBMgC)2 Enzym. The mechanism of action of alkaline phosphatase involves the geometric coordination of the substrate between the Zn ions in the active sites, whereas the Mg site doesn't appear to be close enough to directly partake in the hydrolysis mechanism, however, it may contribute to the shape of the electrostatic potential around the active center. [16] Alkaline phosphatase has a Km of 8.4 x 10 −4 . [17]

Alkaline phosphatase in E coli is uncommonly soluble and active within elevated temperature conditions such as 80 °C. Due to the kinetic energy induced by this temperature the weak hydrogen bonds and hydrophobic interactions of common proteins become degraded and therefore coalesce and precipitate. However, upon dimerization of ALP the bonds maintaining its secondary and tertiary structures are effectively buried such that they are not affected as much at this temperature. Furthermore, even at more elevated temperatures such as 90 °C ALP has the uncommon characteristic of reverse denaturation. Due to this, while ALP ultimately denatures at about 90 °C it has the added ability to accurately reform its bonds and return to its original structure and function once cooled back down. [10]

Alkaline phosphatase in E coli is located in the periplasmic space and can thus be released using techniques that weaken the cell wall and release the protein. Due to the location of the enzyme, and the protein layout of the enzyme, the enzyme is in solution with a smaller amount of proteins than there are in another portion of the cell. [18] The proteins' heat stability can also be taken advantage of when isolating this enzyme (through heat denaturation). In addition, alkaline phosphatase can be assayed using p-Nitrophenyl phosphate. A reaction where alkaline phosphatase dephosphorylates the non-specific substrate, p-Nitrophenyl phosphate in order to produce p-Nitrophenol(PNP) and inorganic phosphate. PNP's yellow color, and its λmax at 410 allows spectrophotometry to determine important information about enzymatic activity. [19] Some complexities of bacterial regulation and metabolism suggest that other, more subtle, purposes for the enzyme may also play a role for the cell. In the laboratory, however, mutant Escherichia coli lacking alkaline phosphatase survive quite well, as do mutants unable to shut off alkaline phosphatase production. [20]

The optimal pH for the activity of the E coli enzyme is 8.0 [21] while the bovine enzyme optimum pH is slightly higher at 8.5. [22] Alkaline phosphatase accounts for 6% of all proteins in derepressed cells. [17]

Intragenic complementation Edit

When multiple copies of a polypeptide encoded by a gene form an aggregate, this protein structure is referred to as a multimer. When a multimer is formed from polypeptides produced by two different mutant alleles of a particular gene, the mixed multimer may exhibit greater functional activity than the unmixed multimers formed by each of the mutants alone. In such a case, the phenomenon is referred to as intragenic complementation. E coli alkaline phosphatase, a dimer enzyme, exhibits intragenic complementation. [23] When particular mutant versions of alkaline phosphatase were combined, the heterodimeric enzymes formed as a result exhibited a higher level of activity than would be expected based on the relative activities of the parental enzymes. These findings indicated that the dimer structure of E coli alkaline phosphatase allows cooperative interactions between the constituent monomers that can generate a more functional form of the holoenzyme.

By changing the amino acids of the wild-type alkaline phosphatase enzyme produced by Escherichia coli, a mutant alkaline phosphatase is created which not only has a 36-fold increase in enzyme activity, but also retains thermal stability. [24] Typical uses in the lab for alkaline phosphatases include removing phosphate monoesters to prevent self-ligation, which is undesirable during plasmid DNA cloning. [25]

Common alkaline phosphatases used in research include:

  • Shrimp alkaline phosphatase (SAP), from a species of Arctic shrimp (Pandalus borealis). This phosphatase is easily inactivated by heat, a useful feature in some applications. (CIP) (PLAP) and its C terminally truncated version that lacks the last 24 amino acids (constituting the domain that targets for GPI membrane anchoring) – the secreted alkaline phosphatase (SEAP). It presents certain characteristics like heat stability, substrate specificity, and resistance to chemical inactivation. [26]
  • Human-intestinal alkaline phosphatase. The human body has multiple types of alkaline phosphatase present, which are determined by a minimum of three gene loci. Each one of these three loci controls a different kind of alkaline phosphatase isozyme. However, the development of this enzyme can be strictly regulated by other factors such as thermostability, electrophoresis, inhibition, or immunology. [27]

Human-intestinal ALPase shows around 80% homology with bovine intestinal ALPase, which holds true their shared evolutionary origins. That same bovine enzyme has more than 70% homology with human placental enzyme. However, the human intestinal enzyme and the placental enzyme only share 20% homology despite their structural similarities. [28]

Alkaline phosphatase has become a useful tool in molecular biology laboratories, since DNA normally possesses phosphate groups on the 5' end. Removing these phosphates prevents the DNA from ligating (the 5' end attaching to the 3' end), thereby keeping DNA molecules linear until the next step of the process for which they are being prepared also, removal of the phosphate groups allows radiolabeling (replacement by radioactive phosphate groups) in order to measure the presence of the labeled DNA through further steps in the process or experiment. For these purposes, the alkaline phosphatase from shrimp is the most useful, as it is the easiest to inactivate once it has done its job.

Another important use of alkaline phosphatase is as a label for enzyme immunoassays.

Undifferentiated pluripotent stem cells have elevated levels of alkaline phosphatase on their cell membrane, therefore alkaline phosphatase staining is used to detect these cells and to test pluripotency (i.e., embryonic stem cells or embryonal carcinoma cells). [29]

There is a positive correlation between serum bone alkaline phosphatase (B-ALP) levels and bone formation in humans, although its use as a biomarker in clinical practice is not recommended. [30]

Ongoing research Edit

Current researchers are looking into the increase of tumor necrosis factor-α and its direct effect on the expression of alkaline phosphatase in vascular smooth muscle cells as well as how alkaline phosphatase (AP) affects the inflammatory responses and may play a direct role in preventing organ damage. [31]

  • Alkaline phosphatase (AP) affects the inflammatory responses in patients with Chronic kidney disease and is directly associated with Erythropoiesis stimulating agent resistant anemia. [32]
  • Intestinal alkaline phosphatase (IAP) and the mechanism it uses to regulate pH and ATP hydrolysis in rat duodenum. [33]
  • Testing the effectiveness of the inhibitor and its impact on IAP in acute intestinal inflammation as well as explore the molecular mechanisms of IAP in "ameliorating intestinal permeability." [34]

Dairy industry Edit

Alkaline phosphatase is commonly used in the dairy industry as an indicator of successful pasteurization. This is because the most heat stable bacterium found in milk, Mycobacterium paratuberculosis, is destroyed by temperatures lower than those required to denature ALP. Therefore, ALP presence is ideal for indicating failed pasteurization. [35] [36]

Pasteurization verification is typically performed by measuring the fluorescence of a solution which becomes fluorescent when exposed to active ALP. Fluorimetry assays are required by milk producers in the UK to prove alkaline phosphatase has been denatured, [37] as p-Nitrophenylphosphate tests are not considered accurate enough to meet health standards.

Alternatively the colour change of a para-Nitrophenylphosphate substrate in a buffered solution (Aschaffenburg Mullen Test) can be used. [38] Raw milk would typically produce a yellow colouration within a couple of minutes, whereas properly pasteurised milk should show no change. There are exceptions to this, as in the case of heat-stable alkaline phophatases produced by some bacteria, but these bacteria should not be present in milk.

Inhibitors Edit

All mammalian alkaline phosphatase isoenzymes except placental (PALP and SEAP) are inhibited by homoarginine, and, in similar manner, all except the intestinal and placental ones are blocked by levamisole. [11] Phosphate is another inhibitor which competitively inhibits alkaline phosphatase. [39]

Another known example of an alkaline phosphatase inhibitor is [(4-Nitrophenyl)methyl]phosphonic acid. [40]

In metal contaminated soil, alkaline phosphatase are inhibited by Cd (Cadmium). In addition, temperature enhances the inhibition of Cd on ALP activity, which is shown in the increasing values of Km. [41]

Physiology Edit

In humans, alkaline phosphatase is present in all tissues throughout the body, but is particularly concentrated in the liver, bile duct, kidney, bone, intestinal mucosa and placenta. In the serum, two types of alkaline phosphatase isozymes predominate: skeletal and liver. During childhood the majority of alkaline phosphatase are of skeletal origin. [42] Humans and most other mammals contain the following alkaline phosphatase isozymes:

    – intestinal (molecular weight of 150 kDa) – tissue-nonspecific (expressed mainly in liver, bone, and kidney) – placental (Regan isozyme)
  • ALPG – germ cell

Four genes encode the four isozymes. The gene for tissue-nonspecific alkaline phosphatase is located on chromosome 1, and the genes for the other three isoforms are located on chromosome 2. [4]

Intestinal alkaline phosphatase Edit

Intestinal alkaline phosphatase (IAP) is secreted by enterocytes, and seems to play a pivotal role in intestinal homeostasis and protection [43] [44] as well as in suppressing inflammation [45] via repression of the downstream Toll-like receptor (TLR)-4-dependent and MyD88-dependent inflammatory cascade. [46] It dephosphorylates toxic/inflammatory microbial ligands like lipopolysaccharides (LPSs), [47] unmethylated cytosine-guanine dinucleotides, flagellin, and extracellular nucleotides such as uridine diphosphate or ATP. Dephosphorylation of LPS by IAP can reduce the severity of Salmonella tryphimurium und Clostridioides difficile infection restoring normal gut microbiota. [47] Thus, altered IAP expression has been implicated in chronic inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease (IBD). [47] [48] It also seems to regulate lipid absorption [49] and bicarbonate secretion [50] in the duodenal mucosa, which regulates the surface pH.

In cancer cells Edit

Studies show that the alkaline phosphatase protein found in cancer cells is similar to that found in nonmalignant body tissues and that the protein originates from the same gene in both. One study compared the enzymes of liver metastases of giant-cell lung carcinoma and nonmalignant placental cells. The two were similar in NH2-terminal sequence, peptide map, subunit molecular weight, and isoelectronic point. [51]

In a different study in which scientists examined alkaline phosphatase protein presence in a human colon cancer cell line, also known as HT-29, results showed that the enzyme activity was similar to that of the non-malignant intestinal type. However, this study revealed that without the influence of sodium butyrate, alkaline phosphatase activity is fairly low in cancer cells. [52] A study based on sodium butyrate effects on cancer cells conveys that it has an effect on androgen receptor co-regulator expression, transcription activity, and also on histone acetylation in cancer cells. [53] This explains why the addition of sodium butyrate show increased activity of alkaline phosphatase in the cancer cells of the human colon. [52] In addition, this further supports the theory that alkaline phosphatase enzyme activity is actually present in cancer cells.

In another study, choriocarcinoma cells were grown in the presence of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdUrd) and results conveyed a 30- to 40- fold increase in alkaline phosphatase activity. This procedure of enhancing the activity of the enzyme is known as enzyme induction. The evidence shows that there is in fact activity of alkaline phosphatase in tumor cells, but it is minimal and needs to be enhanced. Results from this study further indicate that activities of this enzyme vary among the different choriocarcinoma cell lines and that the activity of the alkaline phosphatase protein in these cells is lower than in the non-malignant placenta cells. [54] [55] but levels are significantly higher in children and pregnant women. Blood tests should always be interpreted using the reference range from the laboratory that performed the test. High ALP levels can occur if the bile ducts are obstructed. [56]

Also, ALP increases if there is active bone formation occurring, as ALP is a byproduct of osteoblast activity (such as the case in Paget's disease of bone).

ALP is much more elevated in metastatic prostate cancer cells than non-metastatic prostate cancer cells. [57] High levels of ALP in prostate cancer patients is associated with a significant decrease in survival. [57]

Levels are also elevated in people with untreated coeliac disease. [58] Lowered levels of ALP are less common than elevated levels. The source of elevated ALP levels can be deduced by obtaining serum levels of gamma glutamyltransferase (GGT). Concomitant increases of ALP with GGT should raise the suspicion of hepatobiliary disease. [59]

Some diseases do not affect the levels of alkaline phosphatase, for example, hepatitis C. A high level of this enzyme does not reflect any damage in the liver, even though high alkaline phosphatase levels may result from a blockage of flow in the biliary tract or an increase in the pressure of the liver. [60]

Elevated levels Edit

If it is unclear why alkaline phosphatase is elevated, isoenzyme studies using electrophoresis can confirm the source of the ALP. Skelphosphatase (which is localized in osteoblasts and extracellular layers of newly synthesized matrix) is released into circulation by a yet unclear mechanism. [61] Placental alkaline phosphatase is elevated in seminomas [62] and active forms of rickets, as well as in the following diseases and conditions: [63]

Lowered levels Edit

The following conditions or diseases may lead to reduced levels of alkaline phosphatase: [65]

    , an autosomal recessive disease women receiving estrogen therapy because of aging
  • Men with recent heart surgery, malnutrition, magnesium deficiency, or severe anemia
  • Children with achondroplasia and congenital iodine deficiency
  • Children after a severe episode of enteritis
  • Steroid treatment
  • Colitis

In addition, oral contraceptives have been demonstrated to reduce alkaline phosphatase. [66]

Prognostic uses Edit

Measuring alkaline phosphatase (along with prostate specific antigen) during, and after six months of hormone treated metastatic prostate cancer was shown to predict the survival of patients. [67]

Leukocyte alkaline phosphatase Edit

Leukocyte alkaline phosphatase (LAP) is found within mature white blood cells. White blood cell levels of LAP can help in the diagnosis of certain conditions.

  • Higher levels are seen in the physiological response, the leukemoid reaction, and in pathologies that include mature white blood cells, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocytosis (ET), and in primary myelofibrosis (PM).
  • Lower levels are found in pathologies that involve undeveloped leukocytes, such as chronic myelogenous leukemia[68] (CML), paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and acute myelogenous leukaemia (AML).

Structure and properties Edit

Alkaline phosphatase is homodimeric enzyme, meaning it is formed with two molecules. Three metal ions, two Zn and one Mg, are contained in the catalytic sites, and both types are crucial for enzymatic activity to occur. The enzymes catalyze the hydrolysis of monoesters in phosphoric acid which can additionally catalyze a transphosphorylation reaction with large concentrations of phosphate acceptors. While the main features of the catalytic mechanism and activity are conserved between mammalian and bacterial alkaline phosphate, mammalian alkaline phosphatase has a higher specific activity and Km values thus a lower affinity, more alkaline pH optimum, lower heat stability, and are typically membrane bound and are inhibited by l-amino acids and peptides via a means of uncompetitive mechanism. These properties noticeably differ between different mammalian alkaline phosphatase isozymes and therefore showcase a difference in in vivo Funktionen.

Alkaline phosphatase has homology in a large number of other enzymes and composes part of a superfamily of enzymes with several overlapping catalytic aspects and substrate traits. This explains why most salient structural features of mammalian alkaline are the way they are and reference their substrate specificity and homology to other members of the nucleoside pyrophosphatase/phosphodiesterase family of isozyme. [4] Research has shown a relationship between members of the alkaline phosphatase family with aryl sulfatases. The similarities in structure indicate that these two enzyme families came from a common ancestor. Further analysis has linked alkaline phosphates and aryl sulfatases to a larger superfamily. Some of the common genes found in this superfamily, are ones that encode phosphodiesterases as well as autotoxin. [69]


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