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Klonen mit pET28a und Proteinexpression in DH5alpha und BL21

Klonen mit pET28a und Proteinexpression in DH5alpha und BL21


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Kann mich bitte jemand auf eine E-Ressource oder ein Buch verweisen, das einem Neuling wie mir helfen wird, eingehender über das Klonen mit pET28a und Proteinexpression in DH5alpha und BL21 zu lernen. Obwohl ich mit TA-Vektoren kloniert habe, ist pET28a für mich sehr neu. Ich muss Primer mit Restriktionsschnittstellen entwerfen, um meine GOI in pET28a einzufügen, daher würde ich gerne lernen, wie man diese Schnittstellen auswählt.


Rindergeschlechts-bestimmende Region Y: Klonierung, optimierte Expression und Reinigung

Das Gen für die geschlechtsbestimmende Region Y (SRY) befindet sich auf dem Y-Chromosom und kodiert für ein Protein mit 229 Aminosäuren. In dieser Studie wurde die ORF-Region von SRY mit einer Länge von 690 bp unter Verwendung von PCR synthetisiert und mit pET28a (+) ligiert, dann in E. coli DH5α transformiert. Der Stamm E. coli BL21 (DE3) wurde ausgewählt, um rekombinantes Rinder-SRY-Protein zu exprimieren. Eine Reihe von Optimierungsschritten wurde durchgeführt, einschließlich verschiedener Konzentrationen von IPTG, Glucose und Temperaturen bei unterschiedlichen Inkubationszeiten nach der Induktion. Die Ergebnisse zeigten, dass Temperaturpunkte und unterschiedliche Konzentrationen von IPTG und Glukose eine signifikante Wirkung (p < 0,01) auf das Gesamtprotein und das rekombinante Rinder-SRY hatten. Nach der Reinigung zeigten verschiedene Temperaturen und Konzentrationen von IPTG bedeutsame Wirkungen (p < 0,01) auf die Löslichkeit von exprimiertem rekombinantem SRY. Die höchste Menge an löslichem rSRY-Protein wurde erreicht, wenn während der Induktion 0,5 mM IPTG und 0,5% Glucose bei 20 °C verwendet wurden. In Abwesenheit von Glucose wurde die höchste Menge an löslichen rekombinanten SRY-Spiegeln bei den Konzentrationen von 0,8 mM IPTG bei 28 °C, 20 °C und 1,5 mM IPTG bei 37 °C während der Induktion für 16, 24 und 8 . erreicht Stunden bzw. In Bezug auf die in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass mit abnehmender Temperatur und Induktorkonzentration die Expression des löslichen bovinen SRY-Proteins zunimmt.

Schlüsselwörter: Klonierung Expressionsreinigung rekombinantes Rinder-SRY-Protein geschlechtsdeterminante Region Y-Chromosom.


[Klonierung und Expression von humaner Interleukin-21-cDNA in E. coli]

Ziel: Um cDNA von menschlichem Interleukin-21 (IL-21) in voller Länge zu klonieren und sie in E. coli zu exprimieren.

Methoden: Gesamt-RNA wurde aus peripheren Lymphozyten isoliert, die mit Anti-CD3-Antikörper stimuliert wurden. 5'- und 3'-terminale Fragmente des IL-21-Gens (242 bp bzw. 425 bp Fragmente) wurden unter Verwendung von RT-PCR amplifiziert. Die IL-21-cDNA voller Länge wurde durch Rekombinations-PCR aus den Produkten der RT-PCR amplifiziert. Das Expressionsplasmid pET28a(+)-IL21 wurde durch Insertion von IL-21-cDNA in pET28a(+) konstruiert und dann in BL21(DE3) transformiert. Die Expression von hIL-21 wurde durch IPTG bei 37 Grad Celsius für 5 h induziert. Das Zielprotein wurde durch Ni(2+)-chelatisierende Sepharose Fast Flow gereinigt. Gereinigtes rhIL-21 wurde unter Verwendung des Dialyseverfahrens rückgefaltet. Und die Bioaktivität wurde durch MTT bei der Kostimulation der T-Zell-Proliferation mit Anti-CD3 nachgewiesen.

Ergebnisse: IL-21 wurde kloniert und in E. coli erfolgreich exprimiert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass IL-21 in Form eines unlöslichen Einschlusskörpers exprimiert wurde. Das umgefaltete rhIL-21 könnte die Proliferation von reifen humanen T-Zellen in Gegenwart von Anti-CD3 stimulieren.

Abschluss: Das rhIL-21 mit Bioaktivität wurde erhalten, was den Grundstein für das Studium seiner Funktion legt.


II. Fehlerbehebung bei Ausdrücken

In diesem Abschnitt stellen wir verschiedene Strategien zur Optimierung der rekombinanten Proteinproduktion in E coli wenn Sie auf Ausdruckshindernisse stoßen. Mögliche Gründe und Lösungen für jeden Fall werden in den folgenden Tabellen diskutiert.

Wenn das interessierende Protein nicht durch eine empfindliche Technik (z. B. Westernblot) oder nur in sehr geringen Konzentrationen (weniger als Mikrogramm pro Liter Kultur) nachgewiesen werden kann, liegt das Problem häufig in einer schädlichen Wirkung, die das heterologe Protein auf ausübt die Zelle.

  • Niedrigere Induktionstemperatur
  • Wachsen in schlechten Medien
  • Verwenden Sie Promotoren mit strengerer Regulierung
  • Niedrigere Plasmidkopienzahl
  • Verwenden Sie pLysS/pLysE-Lagerstämme in T7-basierten Systemen
  • Verwenden Sie Stämme, die besser für die Expression toxischer Proteine ​​​​sind (C41 oder C43)
  • Induktion bei hoher OD . starten
  • Einarbeitungszeit verkürzen
  • Glukose hinzufügen, wenn Expressionsvektoren verwendet werden, die lac-basierte Promotoren enthalten
  • Verwenden Sie definierte Medien mit Glucose als Kohlenstoffquelle

2) Proteinaggregation

Die Ansammlungen von Proteinaggregaten werden als Inclusion Bodies (IBs) bezeichnet. Die Bildung von IB resultiert aus einem unausgeglichenen Gleichgewicht zwischen Proteinaggregation und Solubilisierung. So ist es möglich, ein lösliches rekombinantes Protein durch Strategien zu erhalten, die die Faktoren, die zur IB-Bildung führen, verbessern.

  • Fusionspartner hinzufügen, einschließlich Thioredoxin, DsbA, DsbC
  • Klonen in einem Vektor, der ein Sekretionssignal an das Zellperiplasma enthält
  • Niedrigere Induktorkonzentration
  • Niedrigere Induktionstemperatur
  • Verwenden Sie einen Lösungspartner
  • Mit molekularen Chaperonen koexprimieren
  • Ergänzen Sie Medien mit chemischen Chaperonen und Cofaktoren
  • Induktor entfernen und frisches Medium hinzufügen
  • Niedrigere Induktorkonzentration
  • Niedrigere Temperatur
  • Fügen Sie Fusions-Tags hinzu, einschließlich GST, MBP, SUMO usw.
  • Generieren Sie verkürzte Formen von Proteinen
  • Niedrigere Induktionstemperatur
  • Einarbeitungszeit verkürzen
  • Wachsen in schlechtem Medium
  • Hitzeschock-Begleiter hinzufügen

Manchmal wird eher eine verkürzte Form von Protein als ein vollständiges Wildprotein exprimiert. Gründe für das Phänomen und mögliche Lösungen sind unten angegeben.

  • Niedrigere Induktionstemperatur
  • Wachsen in schlechten Medien
  • Induzieren bei hoher OD
  • Induzieren bei niedriger Temperatur
  • Einarbeitungszeit verkürzen
  • Verwenden Sie Protease-Inhibitoren, wenn Sie Zellen aufbrechen
  • Anderes Fusionsprotein ändern
  • Fusionsprotein zum C-Terminus verschieben
  • Induzieren bei niedriger Temperatur
  • Einarbeitungszeit verkürzen
  • Wechseln Sie zu schlechten Medien

Eine schöne Menge an löslichem Protein zu erhalten, ist nicht das Ende des Weges. Das Protein kann immer noch von schlechter Qualität sein, d. h. es hat nicht die Aktivität, die es sollte.

  • Verwenden Sie einen Lösungspartner
  • Mit molekularen Chaperonen koexprimieren
  • Überwachen Sie die Bildung von Disulfidbrücken und ermöglichen Sie die weitere Faltung in vitro
  • Niedrigere Temperatur

Verweise:

Fakruddin M et al (2012). Kritische Faktoren, die den Erfolg der Klonierung, Expression und Massenproduktion von Enzymen durch rekombinantes . beeinflussen E coli. ISRN-Biotechnologie, 132013:590587.

Francis DM, Seite R (2010). Strategien zur Optimierung der Proteinexpression in E coli. Aktuelle Protokolle in der Proteinwissenschaft, Kapitel 5:Einheit 5.24.1-29.


Mendeley
Zotero
JabRef
Grammatik

Klonierung und Expression des hGAD65-Gens in E. coli BL21

https://doi.org/10.22146/ijbiotech.7868

Rista Nikmatu Rohmah (1*), Soraya Widyasari (2), A. Aulanni’am (3), F. Fatchiyah (4)

(1) Fakultät für Biologie, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Universitas Brawijaya, Malang
(2) Fakultät für Biologie, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Universitas Brawijaya, Malang
(3) Departement of Chemistry, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Universitas Brawijaya, Malang
(4) Fakultät für Biologie, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Universitas Brawijaya, Malang
(*) Korrespondierender Autor

Abstrakt

Schlüsselwörter

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DOI: https://doi.org/10.22146/ijbiotech.7868

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Frühere Ausgaben

Die Indonesisches Journal für Biotechnologie (Print ISSN 0853-8654 online ISSN 2089-2241) wird vom Forschungszentrum für Biotechnologie in Zusammenarbeit mit der Graduate School of Universitas Gadjah Mada herausgegeben. Der Inhalt dieser Website ist unter einer Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License lizenziert und wird Siti Nurleily Marliana und Joaquim Baeta zugeschrieben. Basierend auf OJS 2.4.8.1 des Public Knowledge Project und entworfen von Joaquim Baeta. Website-Statistiken anzeigen.


ERGEBNISSE

RNA-Extraktion—

Etwa 20 µg Gesamt-RNA wurden von jedem Präparat erhalten. Die RNA-Qualität wurde durch das Vorhandensein von Banden sichergestellt, die der ribosomalen 18S- und 28S-RNA entsprachen (Abb. 1 .).EIN).

Isolierung und Amplifikation von ocI ORF—

Die ocI ORF wurde durch RT-PCR erhalten, was zu einem Produkt mit etwa 300 bp führte, entsprechend der ocI ORF (nur aus RNA gekeimter Samen). Das PCR-Produkt ist in Abb. 1 dargestelltB.

Klonen in pET28a—

Nach der Umwandlung von E coli BL21 (DE3), 60 Klone wurden für das Screening durch PCR ausgewählt. Einige von ihnen enthielten das Insert mit einer Größe von etwa 300 bp (Abb. 1C). Die Plasmid-DNA von drei dieser Klone wurde dann extrahiert und sequenziert. Ein Klon hatte die richtige Sequenz, aber die anderen beiden zeigten keine qualitativ hochwertigen Sequenzen.

Induktion der Expression, Löslichkeitstest und Proteinreinigung—

Die Proteinexpression wurde mit 0,4 mM IPTG über einen Zeitraum von 3 h induziert. Wie auf der 15% SDS-PAGE gezeigt (Abb. 2EIN) wurde die Proteinexpression nach 1 h induziert und nahm in den folgenden 2 h anscheinend nicht zu.

Das rekombinante OCI wurde sowohl in löslichen als auch in unlöslichen Fraktionen erhalten (Abb. 2EIN). Es gab genügend Protein in der löslichen Fraktion, um in der nativen Form zu reinigen. Die Reinigung erfolgte mit einem Nickelharz und die Proteinelution begann mit 50 mM Imidazol. Die beste Elution wurde jedoch beim Waschen mit 100 und 250 mM Imidazol erreicht (Abb. 2B). Die so gesammelten Proben wurden gepoolt und insgesamt 10 mg Protein pro Liter Kultur erhalten. Eine Dialyse wurde durchgeführt, um überschüssiges Imidazol zu entfernen.

Antimykotischer Aktivitätstest—

Die antimykotische Aktivität des rekombinanten Proteins wurde gegen den Fadenpilz getestet T. reesei. Das Pilzwachstum wurde in beiden getesteten Konzentrationen (50 und 100 µg/ml) erfolgreich gehemmt (Abb. 3).

Verfassen des Manuskripts—

Die Ergebnisse wurden zusammengestellt und diskutiert, woraufhin die Studierenden diesen Artikel unter Anleitung der Studiengangskoordinatoren verfassten.


Wahl des Vektors

Die grundlegende Architektur eines E. coli-Expressionsvektors ist in der folgenden Abbildung dargestellt und enthält die folgenden Merkmale:

Wählbarer Marker. Ohne selektiven Druck gehen Plasmide aus dem Wirt verloren. Insbesondere im Fall von Plasmiden mit sehr hoher Kopienzahl und wenn Plasmid-getragene Gene für den Wirt toxisch sind oder seine Wachstumsrate auf andere Weise signifikant reduzieren. Der einfachste Weg, dieses Problem anzugehen, besteht darin, aus demselben Plasmid einen Antibiotikum-Resistenz-Marker zu exprimieren und das Medium mit dem geeigneten Antibiotikum zu ergänzen, um Plasmid-freie Zellen abzutöten. Die am häufigsten verwendeten Antibiotika und ihre wirksamen Konzentrationen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Anwendung von Ampicillin erfordert besondere Sorgfalt. Der selektierbare Marker, b-Lactamase, wird in das Medium sezerniert, wo er das gesamte Ampicillin hydrolysiert. Dieser Punkt ist bereits erreicht, wenn die Kultur kaum trübe ist. Von nun an werden Zellen, denen das Plasmid fehlt, nicht mehr abgetötet und könnten die Kultur überwuchern. Einige mögliche Lösungen sind:

  • Kultur über Nacht bei 30°C oder weniger wachsen lassen.
  • über Nacht Kulturen zentrifugieren und das Pellet in frischem Medium resuspendieren, um die produzierte b-Lactamase zu entfernen.
  • Verwenden Sie anstelle von Ampicillin das stabilere Carbenicillin.

Regulatorisches Gen (Repressor). Viele Promoter zeigen Undichtigkeiten in ihrem Ausdruck d.h. Genprodukte werden vor der Zugabe des Induktors auf niedrigem Niveau exprimiert. Dies wird zu einem Problem, wenn das Genprodukt für den Wirt toxisch ist. Dies kann durch die konstitutive Expression eines Repressorproteins verhindert werden.

Die lac-abgeleitete Promotoren sind besonders undicht. Diese Promotoren können durch die Insertion von a . gesteuert werden lac-Operatorsequenz stromabwärts des Promotors und die Expression des lac-Repressor durch Wirtsstämme, die die lacI q Allel (für Plasmide mit mittlerer Kopienzahl) oder von demselben oder einem Helferplasmid (für Plasmide mit höherer Kopienzahl). Alternativ kann die Repression durch Zugabe von 1% Glucose zum Kulturmedium erreicht werden.

Ursprung der Replikation. Der Replikationsursprung kontrolliert die Kopienzahl des Plasmids.

Promoter. Der Promotor initiiert die Transkription und ist 10-100 Nukleotide stromaufwärts der Ribosomenbindungsstelle positioniert. Der ideale Promoter weist mehrere wünschenswerte Eigenschaften auf:

  • Es ist stark genug, um eine Produktakkumulation von bis zu 50% des gesamten zellulären Proteins zu ermöglichen.
  • Es hat einen niedrigen basalen Expressionsspiegel (d.h. es ist streng reguliert, um Produkttoxizität zu verhindern).
  • Es ist leicht zu induzieren.

Eine ausführliche Liste möglicher Promotoren ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die am häufigsten verwendeten Promotoren sind rot markiert.

Transkriptionsterminator. Der Transkriptionsterminator reduziert unerwünschte Transkription und erhöht die Plasmid- und mRNA-Stabilität.

Shine-Delgarno-Sequenz. Die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz wird für die Translationsinitiation benötigt und ist komplementär zum 3'-Ende der 16S-ribosomalen RNA. Die Effizienz der Translationsinitiation am Startcodon hängt von der tatsächlichen Sequenz ab. Die Konsensussequenz ist: 5'- TAAGGAGG -3'. Es ist 4-14 Nukleotide stromaufwärts des Startcodons positioniert, wobei der optimale Abstand 8 Nukleotide beträgt. Um die Bildung von Sekundärstrukturen (die das Expressionsniveau verringert) zu vermeiden, sollte diese Region reich an A-Resten sein.

Codon starten. Ausgangspunkt der Übersetzung. In E coli das am häufigsten verwendete Startcodon ist ATG. GTG wird in 8% der Fälle verwendet. TTG und TAA werden kaum genutzt.

Tags und Fusionsproteine. N- oder C-terminale Fusionen von heterologen Proteinen an kurze Peptide (Tags) oder an andere Proteine ​​(Fusionspartner) bieten mehrere potenzielle Vorteile:

  • Verbesserter Ausdruck. Die Fusion des N-Terminus eines heterologen Proteins mit dem C-Terminus eines stark exprimierten Fusionspartners führt oft zu einer Expression des Fusionsproteins auf hohem Niveau.
  • Verbesserte Löslichkeit. Die Fusion des N-Terminus eines heterologen Proteins mit dem C-Terminus eines löslichen Fusionspartners verbessert oft die Löslichkeit des Fusionsproteins.
  • Verbesserte Erkennung. Fusion eines Proteins entweder an den Terminus eines kurzen Peptids (Epitop-Tag) oder eines Proteins, das durch einen Antikörper oder ein Bindungsprotein (Western-Blot-Analyse) oder durch biophysikalische Methoden erkannt wird (z.B. GFP durch Fluoreszenz) ermöglicht den Nachweis eines Proteins während der Expression und Reinigung.
  • Verbesserte Reinigung. Einfache Reinigungsschemata wurden für Proteine ​​entwickelt, die an beiden Enden an Tags fusioniert sind, oder für Proteine, die spezifisch an Affinitätsharze binden (siehe Tabelle 3 und Referenzen darin).

Protease-Spaltungsstelle. Protease-Spaltstellen werden häufig hinzugefügt, um nach der Expression einen Tag oder Fusionspartner aus dem Fusionsprotein entfernen zu können. Die am häufigsten verwendeten Proteasen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Spaltung ist jedoch selten vollständig und oft sind zusätzliche Reinigungsschritte erforderlich.

Website zum mehrfachen Klonen. Eine Reihe einzigartiger Restriktionsschnittstellen, die es Ihnen ermöglichen, Ihr interessierendes Gen in den Vektor zu klonen.

Codon stoppen. Beendigung der Übersetzung. Es gibt 3 mögliche Stoppcodons, aber TAA wird bevorzugt, weil es weniger anfällig für das Durchlesen ist als SCHILD und TGA. Die Effizienz der Termination wird durch die Verwendung von 2 oder 3 Stopcodons in Reihe erhöht.


Klonierung, Expression und Reinigung von rekombinantem Lysostaphin aus Staphylococcus simulans

So zitieren Sie: Farhangnia L, Ghaznavi-Rad E, Mollaee N, Abtahi H. Klonen, Expression und Reinigung von rekombinantem Lysostaphin aus Staphylococcus simulans, Jundishapur J Microbiol. 2014 7(5):e10009. doi: 10.5812/jjm.10009.

Abstrakt

Hintergrund: Staphylococcus aureus ist eine der häufigsten Ursachen für nosokomiale Infektionen und ihre Antibiotikaresistenz ist weltweit besorgniserregend. Lysostaphin ist ein antimikrobielles Mittel, das zu einer Hauptklasse antimikrobieller Peptide und Proteine ​​gehört, die als Bakteriocine bekannt sind. Es weist eine hohe bakteriolytische Wirkung gegen Staphylokokken auf.

Ziele: In dieser Studie wurde ein hoher Spiegel an rekombinantem reifem Lysostaphin in Escherichia coli wurde unter Verwendung des pET32a-Expressionsvektors hergestellt.

Materialen und Methoden: Die S. simulans Das für Lysostaphin kodierende Gen wurde extrahiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und in den prokaryontischen Expressionsvektor pET32a subkloniert. E coli BL21 (DE3) plysS wurden mit pET32a-lys transformiert und die Genexpression wurde durch IPTG induziert. Das exprimierte Protein wurde durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von (Ni-NTA)-Harz gereinigt.

Ergebnisse: PCR- und Sequenzierungsergebnisse bestätigten die erfolgreiche Klonierung des Zielgens in den Vektor. Die Proteinexpression wurde durch IPTG induziert und eine hohe Konzentration des rekombinanten Proteins wurde über den Reinigungsprozess durch Affinitätschromatographie erhalten.

Schlussfolgerungen: Unsere Daten zeigten, dass das rekombinante reife Lysostaphin-Protein, das vom pET32a-Vektor produziert wird, in E coli System war sehr effizient.

1. Hintergrund

Staphylococcus aureus ist weltweit eine der Hauptursachen für nosokomiale und ambulant erworbene Infektionen, die eine Vielzahl von Krankheiten verursachen, darunter Endokarditis, Osteomyelitis, Lungenentzündung, toxisches Schocksyndrom, Lebensmittelvergiftung, Karbunkel und Furunkel (1). Vermehrtes Auftreten von Multiresistenzen bei Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA)-Stämme sind im Krankenhausumfeld zu einem großen Problem geworden, da sie eine enorme finanzielle Belastung und eine erhöhte Morbidität und Mortalität aufgrund schwer zu behandelnder systemischer Infektionen mit sich bringen (2).

Heutzutage ist Vancomycin das Antibiotikum der Wahl zur Behandlung von MRSA, jedoch häufen sich Mutationen in S. aureus haben zu einer intermediären Resistenz gegen Vancomycin (VISA) geführt (3). Es hat uns das Spektrum von sehr wenigen wirksamen Antibiotika hinterlassen, die zur Behandlung verfügbar sind S. aureus Infektionen und mit der Wahrscheinlichkeit, dass Resistenzen gegen die verbleibenden Antibiotika auftreten würden. Daher muss das Problem der Arzneimittelresistenz bei dieser Gruppe von Krankheitserregern durch den angemessenen Einsatz vorhandener Arzneimittel sowie durch die Entwicklung neuer Wirkstoffe angegangen werden (4, 5). Staphylokokken sind potenzielle Angriffspunkte für Bakteriocine, einschließlich Lysostaphin.

Lysostaphin ist eine Glycin-Glycin-Endopeptidase, die von S. simulans das spezifisch die Glycin-Glycin-Bindung spaltet, die für die Interpeptid-Kreuzbrücke von . einzigartig ist S. aureus Zellenwand. Aufgrund seiner einzigartigen Spezifität besitzt Lysostaphin ein hohes Potenzial zur Behandlung antibiotikaresistenter Staphylokokken-Infektionen (1). Studien zur sekundären Proteinstruktur von Lysostaphin haben drei verschiedene Regionen im Vorläuferprotein ergeben: ein typisches Signalpeptid (ca. 38 Aminosäuren), eine hydrophile und hochgeordnete Proteindomäne mit 14 repetitiven Sequenzen (296 Aminosäuren) und die hydrophobe reifes Lysostaphin (6). Reifes Lysostaphin ist eine einzelne Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 27 kDa (7).

Lysostaphin ist einzigartig, da es eine extrem hohe Aktivität gegen eine Vielzahl von Staphylokokkenstämmen einschließlich MRSA besitzt. S. aureus ist einer der am weitesten verbreiteten Mikroorganismen der Hautflora und kodierende Sequenz der reifen, meist isoliert aus Wund-, Haut- und Weichteilinfektionen. Daher die Produktion des reinen und wirksamen rekombinanten Lysostaphin (r-Lysostaphin)-Proteins in vitro könnte zu einer möglichen Behandlung führen S. aureus. Zuvor wurde Lysostaphin kloniert und heterolog in exprimiert Escherichia coli (8), in der Affennierenzelllinie (9) und in Lactococcus lactis (10). Derzeit sind mehrere Lysostaphin-Überexpressionssysteme beschrieben (9-11). Obwohl Forscher in diesen Studien versucht haben, die Menge der Lysostaphin-Produktion zu verbessern, blieb die Ausbeute unbefriedigend und die Reinigungsverfahren sind kompliziert.

2. Ziele

In der vorliegenden Studie haben wir ein neues Expressionssystem zur Herstellung von r-Lysostaphin in beschrieben E coli, ein sicherer nicht-pathogener Wirt im Labormaßstab mit Potenzialen zum industriellen Maßstab. Außerdem wurde ein Verfahren zur Reinigung von Ni-NTA-Harzen mit hoher Kapazität verwendet, um große Mengen an reinem Lysostaphin zu erhalten.

3. Materialien und Methoden

3.1. Bakterienstämme, Vektoren und andere Regenten

S. simulans PTCC 1442 (Iran) und pET32a-Vektor (Novagene, USA) wurden gekauft. Dieser Vektor kann ein Fusionsprotein mit einem 6-Histidin-Tag an der Thrombinstelle und einem T7-Tag am N-Terminus exprimieren. Diese zusätzlichen Aminosäuren erhöhen die Größe des exprimierten Proteins um 15 kDa. Restriktionsenzyme, DNA-Ligase (Fermentas, Litauen), wurden erhalten. E coli Stamm DH5α (f-gyr A96 Nalr, recA1 relA1 Thi-1 hsdR17 r-k m+k, Stratagene, USA) wurden für die anfängliche Klonierung verwendet. Das rekombinante pET32a (pET32a- Lysostaphin) wurde in E coli, BL21 (DE3) pLysS (f–ompthsdB, rB–mB–, dcm gal, DE3, pLYsScmr) als Wirtsstamm von (Novagene, USA).

Protein Purification Kit (Qiagene, Deutschland) wurde bereitgestellt. MHB (Müller Hinton Broth, Sigma, USA) und LB Broth (Luria Bertani Broth, Sigma, USA) wurden für die routinemäßige Bakterienkultur verwendet. Die benötigten Antibiotika Ampicillin (100 µg/mL) und Chloramphenicol (34 µg/mL) (Sigma, USA) wurden den LB-Medien entsprechend der Referenzempfehlung (12) zugesetzt. Alle Chemikalien wurden von Merck (Deutschland) bezogen und die Enzyme wurden von Fermentas (Litauen) oder Cinagene Teheran (Iran) bezogen.

3.2. Isolierung von Plasmid-DNA

Nach Inkubation von . über Nacht S. simulans in MHB bei 37 °C wurden Bakterienzellen bei 4000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde in 100 &mgr;l SET-Puffer (Saccharose 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM, pH = 8) suspendiert. Plasmid-DNA wurde gemäß der Standard-Minipräparations-Plasmid-Methode hergestellt. Kurz gesagt, ein Bakterienpellet wurde aus 1,5 ml Bakterienkultur über Nacht erhalten, die erneut in SET-Puffer suspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur belassen wurde. Danach wurden die Bakterienzellen mit frischem, kaltem Lysepuffer (NaOH5N, SDS 10%, DDW) lysiert, dann wurde KAC (KAC 5M, Essigsäure, DDW) zugegeben.

Die Zelltrümmer, Proteine ​​und chromosomale DNA wurden durch zweimaliges Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)-Gemisch entfernt. DNA wurde mit Ethanol (100%) präzipitiert und in Ethanol (70%) gewaschen, dann wurde das Pellet an der Luft getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Die Qualität und Quantität der gereinigten Plasmid-DNA wurden durch 0,8% Agarosegelelektrophorese in 1X TBE-Puffer bzw. Spektrophotometrie (260/280 nm) getestet (12).

3.3. Polymerase-Kettenreaktion und Konstruktion des rekombinanten Plasmids pET-lys

Primer wurden gemäß der vollständigen Lysostaphin-Gensequenz (Gene Bank Accession No: X06121) entworfen. Die kodierende Sequenz des reifen Peptids (738 bp) wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: 5´-AGA GGA TCC GCT GCA ACA CAT GAA -3´ (Vorwärtsprimer mit einer Endonuklease-Stelle BamHI) und 5´-CGC CTC GAG TCA CTT TAT AGT TCC-3´ (Reverse Primer mit einer Endonuklease-Stelle XhoICH). Restriktionsendonuklease-Stellen für BamHallo und XhoIch wurde für Subklonierungszwecke jeweils am 5´- und 3´-Ende des reifen Gens eingebaut. Die Genamplifikation des Lysostaphin-Gens wurde in einem Gesamtvolumen durchgeführt, das 20 ng Matrizen-DNA, 0,5 &mgr;M von jedem Primer, 2 mM Mg2+, 200 ml von jedem Desoxynukleotidtriphosphat, 1X PCR-Puffer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthielt.

Das folgende Programm (Eppendorf PCR) wurde für die Amplifikation verwendet: Heißstart bei 94 °C für fünf Minuten, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei 94 °C für eine Minute, Annealing bei 56 °C für eine Minute und Verlängerung bei 72 °C für eine Minute. Dem Programm folgte eine letzte Verlängerung bei 72 °C für fünf Minuten. Die PCR-Produkte wurden in 0,8% Agarosegel in 1X TBE-Puffer analysiert und mit dem High Pure PCR-Produktreinigungskit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus dem Gel gereinigt.

Das PCR-Produkt wurde mit verdaut BamHallo und XhoI und wurde mit pET32a ligiert, die durch die gleichen Restriktionsenzyme verdaut wurden, um das rekombinante Plasmid pET32a-lys (pET-lys) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase zu erzeugen (12). Die E coli DH5α wurde zur Transformation des pET32a-lys-Plasmids verwendet. Die transformierten Bakterien wurden durch Screening der Kolonien auf Ampicillin (100 &mgr;g/ml) enthaltendem Medium und Plasmidreinigung selektiert. Dann wurden die Kolonien durch Restriktionsenzymverdau und PCR weiter analysiert. Das Lysostaphin-Gen des rekombinanten Plasmids wurde nach der Sanger-Methode sequenziert.

3.4. Expression und Reinigung von rekombinantem reifen Lysostaphin

Der Ausdruck host E coli BL21 (DE3) pLysS wurde als Transformationswirt für den pET-lys-Vektor verwendet. Dieser Stamm, der das T7-RNA-Polymerase-Gen unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors enthält, wurde mit pET-lys transformiert. Eine einzige Kolonie von transformierten E coli BL21 (DE3) mit pET-lys wurde über Nacht auf einem Schüttelinkubator in 2 ml Luria-Bertani-Bouillon (LB)-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (34 µg/ml) bei 37 °C unter konstantem Rühren (200 .) inkubiert Umdrehungen pro Minute). Am nächsten Tag wurden 500 µl Kulturmaterial entnommen und in 25 ml LB-Brühe beimpft (pro Liter: 14 g Hefeextrakt, 12 g Bactotrypton, 10 g NaCl, 1 g KCl, 0,5 g MgCl, 0,5 g CaCl).

Die Kultur wurde bei einer OD600 nm von 0,6 unter kräftigem Schütteln (200 UpM) bei 37ºC gezüchtet. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurde zur Expression von reifem Lysostaphin in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben E coli. Die Inkubationszeit wurde für weitere vier Stunden bei 37ºC unter Schütteln bei 200 U/min fortgesetzt. Zur Herstellung des Expressionsproteins wurden Bakteriensuspensionen in zwei- und vierstündigen Abständen getestet und auf 12% SDS-PAGE analysiert (13). Das exprimierte Protein wurde unter Verwendung einer Ni-NTA-Agarosesäule gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagene, Hilden, Deutschland) gereinigt. Das gereinigte Protein wurde dialysiert und mit PBS (enthaltend PMSF 0,2 mM, pH = 7,2) bei 4 °C über Nacht erneut gefaltet. Die Qualität und Quantität des gereinigten rekombinanten reifen Lysostaphins wurde auf einer 12% SDS-PAGE-Gelelektrophorese mit Bradford-Methoden analysiert (14).

4. Ergebnisse

4.1. Isolierung von Plasmid

Die Plasmid-DNA von S. simulans extrahiert und die Konzentration wurde auf 4 µg/µL eingestellt, die als Matrize für die Amplifikation des Gen-kodierten Lysostaphins verwendet wurden.

4.2. Konstruktion des rekombinanten Plasmids pET-lys

Das Sequenzierungsergebnis wurde durch den Vergleich mit der Datenbank unter Verwendung der Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)-Software bestätigt. Das Enzymverdauverfahren, der PCR-Assay und das Sequenzierungsergebnis zeigten, dass das Zielgen korrekt in das rekombinante Plasmid pET-lys eingefügt wurde (Daten sind nicht gezeigt).

4.3. Expression und Reinigung von rekombinantem reifen Lysostaphin

Das positive rekombinante Plasmid wurde in den Wirt transformiert, E coli BL21 (DE3). Die Zugabe von IPTG induzierte die Überexpression von rekombinantem Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 42 kDa. Das exprimierte Protein wurde erfolgreich über Affinitätschromatographie mit Ni-NTA-Harz gereinigt (Abbildung 1). Der Reinigungs- und Dialyseprozess führte zu einer Ausbeute von etwa 30 mg gereinigtem Protein aus 1 L E coli BL21 (DE3) + pET-lys-Kultur.

Die SDS-PAGE-Gele zeigen uninduzierten Zellextrakt aus E coli BL21(DE3)+PET-lys für eine Stunde (Spur 1) und zwei Stunden (Spur 2), induzierter Zellextrakt für zwei Stunden (Spur 3) und vier Stunden (Spur4) und extrahierte Proteine ​​nach Ni-NTA-Affinitätschromatographie ( Bahn 5). Ein Marker mit hohem Molekulargewicht ist auf der linken Seite gezeigt (Spur M).

5. Diskussion

In dieser Studie wurde das reife rekombinante Protein Lysostaphin aus S. simulans wurde kloniert, unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimiert und unter Verwendung von Ni-NTA-Harz gereinigt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass das pET 32a-System sehr effizient war.

Im Gegensatz zu einem Antibiotikum, das das Bakterienwachstum stört, ist Lysostaphin bei der Lyse hochwirksam S. aureus Zellen während der gesamten Stoffwechselphase. Frühere Methoden zur Herstellung von Lysostaphin-Endopeptidase zielten darauf ab, diese aus Rohextrakt von . zu reinigen S. simulans (15, 16), die mit geringen Mengen an Pyogenen/Allergenen kontaminiert sein können. Darüber hinaus wird reifes Lysostaphin mit wieder vom Propeptid abgespalten S. simulans Auszug (9, 17). Die Reinigung von Wildtyp-Lysostaphin ist jedoch sehr schwierig. Obwohl über mehrere Methoden zur Lysostaphin-Produktion berichtet wurde, waren Ausbeute und Reinheit sehr begrenzt (11, 17, 18).

Es gibt eine Reihe von Berichten über die Expression von Lysostaphin-Endopeptidase in E coli unter Verwendung des Lysostaphin-Endopeptidase-Promotors (6, 8). Proendopeptidase wurde auch im eukaryontischen System unter der transkriptionellen Kontrolle des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors exprimiert (9). Die Expression von rekombinantem Prolysostaphin in Bacillus subtilis und B.sphaericus wurde berichtet, die ihre Fähigkeit zeigten, große Mengen an Lysostaphin in das Kulturmedium zu sekretieren. B. sphaericus produziert etwa fünfmal mehr Lysostaphin als seine natürliche Quelle (19).

Lysostaphin wurde auch in Mäusen exprimiert, bei denen die 5'-flankierende Region des bovinen β-Lactoglobulin-Gens die Sekretion von Lysostaphin in die Milch steuerte (20). Was Pharmazeutika/Therapeutika betrifft, E coli gilt als sicherer Expressionswirt. Zahlreiche Proteine ​​wurden exprimiert in E coli deshalb, E coli wird sowohl in der Forschung als auch in der Industrie häufig als Expressionswirt verwendet.

In mehreren Studien wurde r-Lysostaphin durch verschiedene pET-Vektoren hergestellt, darunter pET28a mit einer Ausbeute von 22 mg, pET 23b mit einer Ausbeute von 20 mg und pET15b mit einer Ausbeute von 11 mg gereinigtem Protein aus 1 l E coli BL21(DE3) + pET-lys-Kultur (7, 21, 22). Das Lysostaphin wurde ebenfalls überexprimiert und unter Verwendung der Intein-Chitin-Bindungsdomäne (Intein-CBD) als Fusionsprotein mit einer Ausbeute von 6 mg/L gereinigt (11). Ein r-Lysostaphin exprimiert in E coli wird von Sigma-Aldrich kommerziell vertrieben und ist für genetische Staphylokokken-Studien unverzichtbar, wird zur DNA-Isolierung (23), zur Bildung von Protoplasten und zur Differenzierung von Staphylokokken-Stämmen verwendet (24).

Die weitere Bewertung des anti-Staphylokokken-Potenzials von Lysostaphin als Therapeutikum und seiner Verwendung als Laborreagenz hängt von der Verfügbarkeit großer Mengen hochreinen Proteins aus einer sicheren und nicht pathogenen Quelle ab. Daher sind die geringe Ausbeute bei der Lysostaphin-Produktion (7, 21, 22), die Pathogenese und die Mehrfachresistenz von S. aureus (2) sowie ein hochpreisiges industrielles Produkt von Lysostaphin waren der Hauptgrund für die Suche nach einer rekombinanten Quelle für dieses therapeutische Mittel. Dies ist der erste Bericht über rekombinantes reifes Lysostaphin aus dem Iran.

In der vorliegenden Studie wurde das pET32a-System verwendet, um das r-Lysostaphin in zu exprimieren E coli. Unter Verwendung dieses Reinigungsverfahrens erhielten wir etwa 30 mg r-Lysostaphin pro Liter des Wachstumsmediums im pET 32a-System. In diesem Assay wurde das r-Lysostaphin unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagene, Deutschland) gereinigt. Diese Aufreinigungsmethode ist sehr einfach und wurde in Labors durchgeführt, die weder über das Fachwissen noch über die notwendige Ausrüstung für traditionelle Proteinreinigungssysteme verfügten. Das Verfahren zur Herstellung von r-Lysostaphin ist recht bequem und effizient und würde es einem Labor ermöglichen, große Mengen an r-Lysostaphin herzustellen. Um in dieser Studie eine hochgradige Expression von Fusionsproteinen zu erhalten, E coli BL21(DE3) plys S wurde als exprimierter Wirt verwendet, dem die bekannten zytoplasmatischen Protease-Genprodukte fehlen (25). Daher ist die höchste Expression von Lysostaphin in E coli BL21 (DE3) plys S könnte auf einen Proteasemangel in diesem Stamm zurückzuführen sein. Das pET-System gilt als eine der leistungsstärksten Methoden zur Herstellung rekombinanter Proteine ​​in E coli und die bedeutenden Vorteile dieses Systems wurden vielfach diskutiert.

Daher haben wir mit dem vorgestellten Verfahren von E coli zur Herstellung einer großen Menge von r-Lysostaphin für Struktur-Funktions-Studien und zur Bewertung seines klinischen Potenzials in der Therapie sowie zur Prophylaxe gegen Staphylokokken-Infektionen. Unsere Daten zeigten, dass die reife Lysostaphin-Region des Lysostaphin-Gens durch den pET32a-Vektor in exprimiert werden kann E coli, und der T7-lac-Promotor könnte stärker sein als andere Promotoren bei der Induktions-Lysostaphin-Produktion.

Danksagung

Diese Studie wurde mit finanzieller Unterstützung der Arak University of Medical Sciences, Iran, durchgeführt, und wir danken für ihren unschätzbaren Beitrag zu dieser Studie. Diese Studie war die Diplomarbeit (Nr: 772) von Frau Leila Farhangnia, der Masterstudentin der Biotechnologie an der Arak University of Medical Sciences, Iran.

Fußnoten

  • Implikationen für Gesundheitspolitik/Praxis/Forschung/medizinische Ausbildung: Recombinant lysostaphin protein was produced in this study through cloning and expression method can be further implemented for clinical and molecular biology works.
  • Authors’ Contribution: All authors had equal contribution.
  • Financial Disclosure: There is no Financial Disclosure.
  • Funding/Support: Funding for this work was provided by the Arak University of Medical Sciences.

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Cloning, expression and purification of binding domains of lethal factor and protective antigen of Bacillus anthracis in Escherichia coli and evaluation of their related murine antibody

Anthrax is common disease between human and animals caused by Bacillus anthracis. The cell binding domain of protective antigen (PAD4) and the binding domain of lethal factor (LFD1) have high immunogenicity potential and always were considered as a vaccine candidate against anthrax. The aims of this study are cloning and expressing of PAD4 and LFD1 in Escherichia coli, purification of the recombinant proteins and determination of their immunogenicity through evaluating of the relative produced polyclonal antibodies in mice. PAD4 and LFD1 genes were cloned in pET28a(+) vector and expressed in E coli Bl21(DE3)PlysS. Expression and purification of the two recombinant proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting techniques. The PAD4 and LFD1 were purified using Ni + -NTA affinity chromatography (95–98 %), yielding 37.5 and 45 mg/l of culture, respectively. The antigens were injected three times into mice and production of relative antibodies was evaluated by ELISA test. The results showed that both PAD4 and LFD1 are immunogenic, but LFD1 has higher potential to stimulate Murine immune system. With regard to the high level of LFD1 and PAD4 expression and also significant increment in produced polyclonal antibodies, these recombinant proteins can be considered as a recombinant vaccine candidate against anthrax.


Trouble transforming pET28a in E. coli BL21(DE3) - (Feb/04/2020 )

We  are  facing  issues  while  transforming  pET28a  vectors  in  expression  strains.  Please  refer  to  the  image  attached  and  suggest  improvements.

The quality of vector DNA and transformation efficiency in Top10 is good. All the suggestions will be appreciated

How many times have you observed this phenomenon and which plasmid extraction system are you using? If you are doing manual minipreps (i.e. not kit) it is possible that the DNA is not clean enough to get a good transformation and resulting in no plasmids coming out the final step.

bob1 on Wed Feb 5 02:10:39 2020 said:

How many times have you observed this phenomenon and which plasmid extraction system are you using? If you are doing manual minipreps (i.e. not kit) it is possible that the DNA is not clean enough to get a good transformation and resulting in no plasmids coming out the final step.

we have observed this particular phenomenon 3 times. The plasmid isolation method is manual and the plasmid quantity and quality is good (Verified by nanodrop and quantus). The same plasmid can be transformed in Top10 but not in expression strain. Other plasmids are also isolated by this same method and they are getting transformed properly. This problem is only seen in case of pET28a vector.

Based on your flowchart it seems you have done most of the appropriate experimental controls to eliminate bad plasmid preps and “incompetent” BL21(DE3) competent cells as the problem.  When you say transformation failed, do you mean that you get no colonies at all?  Or you get colonies but they have incorrect (deleted) plasmids?

I’m not an expert with this Novagen plasmid/host system.  I’d revisit the Novagen manual and make sure you have the correct Vector/Expression host pairing.  I took a quick look and BL21(DE3) is indeed the most commonly used strain, but there is one called BLR (DE3) that is a recA- derivative of BL21(DE3) that may stabilize some target genes with repeats.  You also have to consider the possible toxicity of the expressed protein on the bacterial cells. Though that would not explain why you can’t get empty vector into the expression host. Also, when you get stuff from other labs (part A of your chart), you do have to consider the possibility something was not labeled correctly and what you got was not what you think it is.  So I’d do some RE digests and make sure the plasmid you are using is what it is supposed to be.

I am baffled, as are you, at experiment B with the commercial construct- 1 st generation transformation successful with both hosts, 2 nd gen transformation not (but only for the DE3 strain).  Did you try the TOP10 cells for that 2 nd transformation? That would have been an important comparison.

I hope you figure this out and if you do, let us know!

OldCloner on Thu Feb 6 19:59:20 2020 said:

Based on your flowchart it seems you have done most of the appropriate experimental controls to eliminate bad plasmid preps and “incompetent” BL21(DE3) competent cells as the problem.  When you say transformation failed, do you mean that you get no colonies at all?  Or you get colonies but they have incorrect (deleted) plasmids?

 

I’m not an expert with this Novagen plasmid/host system.  I’d revisit the Novagen manual and make sure you have the correct Vector/Expression host pairing.  I took a quick look and BL21(DE3) is indeed the most commonly used strain, but there is one called BLR (DE3) that is a recA- derivative of BL21(DE3) that may stabilize some target genes with repeats.  You also have to consider the possible toxicity of the expressed protein on the bacterial cells. Though that would not explain why you can’t get empty vector into the expression host. Also, when you get stuff from other labs (part A of your chart), you do have to consider the possibility something was not labeled correctly and what you got was not what you think it is.  So I’d do some RE digests and make sure the plasmid you are using is what it is supposed to be.

 

I am baffled, as are you, at experiment B with the commercial construct- 1 st generation transformation successful with both hosts, 2 nd gen transformation not (but only for the DE3 strain).  Did you try the TOP10 cells for that 2 nd transformation? That would have been an important comparison.

 

I hope you figure this out and if you do, let us know!

Failed transformation means no colonies observed. Also, I tried TOP10 cells for the 2 nd transformation and it was successful. I am also puzzled on how to proceed with this problem. I will keep posting on this thread regarding the progress.