Information

Können zwei denaturierte DNA-Stränge reassoziieren?

Können zwei denaturierte DNA-Stränge reassoziieren?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Was auch, wenn ich die Temperatur auf 95°C erhöhe. Also doppelsträngige DNA denaturiert in zwei ssDNA, und dann reduziere ich die Temperatur auf Raumtemperatur. Können sie sich nach Denaturierung reassoziieren?


Ja, das Erhitzen der DNA über 94 °C für einige Zeit wird dsDNA in zwei ssDNA-Stränge schmelzen oder denaturieren. Beim Abkühlen kommen die komplementären Stränge zum Annealing zurück. Der Grad und die Vollständigkeit des Annealings oder der Assoziation hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Abkühlgeschwindigkeit und den strukturellen Eigenschaften der DNA selbst (% GC-Gehalt, Sekundärstruktur). Ich würde nicht erwarten, dass die Mehrheit der ssDNA-Stränge vollständig an einen einzelnen, komplementären dsDNA-Strang anlagert. Wahrscheinlicher ist, dass der DNA-Mix eher wie Spaghetti aussieht, wobei ein Strang teilweise an zwei andere Stränge angelagert ist. Bei der Durchführung der PCR werden die Primer so konzipiert, dass sie spezifisch sind und im Überschuss hinzugefügt werden, so dass Sie die Wahrscheinlichkeit des Annealings beeinflussen, um eine Primer:ssDNA-Assoziation zu begünstigen. Wenn dies nicht der Fall wäre, könnten wir unmöglich eine effiziente PCR-Amplifikation haben.


Können zwei denaturierte DNA-Stränge reassoziieren? - Biologie

Hybridisierungstechnologie

Renaturierung von Nukleinsäuren

Im Gegensatz dazu ist die nachglühen aus zwei Einzelsträngen ist a bimolekular Reaktion.

Zwei komplementäre Einzelstränge
müssen sich treffen
und dann bilden sich zwischen den beiden Strängen komplementäre Basenpaare.

Da es sich um eine bimolekulare Reaktion handelt, hängt die Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration der Reaktanten - den beiden komplementären Strängen - ab.

Da es sich beim Reannealing um eine bimolekulare Reaktion handelt, interessiert uns in erster Linie die Geschwindigkeit, mit der die Reaktion abläuft.

Die Reannealing-Reaktionsbedingungen werden daher gewählt, um die Geschwindigkeit, mit der sich Hybride bilden, zu MAXIMIEREN.

Die rechte Kurve zeigt die Abhängigkeit der Reannealing-Geschwindigkeit von der Temperatur.

Um die Wiederanlagerungsrate zu maximieren, hybridisieren wir typischerweise 15 °C unter der Tm des Hybrids. Die Hybridisierung wird auch bei hohem Salzgehalt durchgeführt, um die Abstoßung des zu minimieren
Zucker-Phosphat-Rückgrat.

Um dieses Konzept zu visualisieren, betrachten Sie das Reannealing einer Vielzahl von DNA-Proben.

Bedingungen zu standardisieren,
jede DNA-Probe wird zu zufälligen Fragmenten mit einer Länge von 500 bp geschert.
Jede DNA-Probe weist die gleiche DNA- (50 ug/ml) und NaCl-Konzentration (1 M) auf.
Jede Probe wird zum Sieden erhitzt, um sie zu denaturieren, und dann bei (Tm-15ºC) gehalten, während die Menge an verbleibender einzelsträngiger DNA überwacht wird.

Der % Einzelstrang ist als Funktion von

Cot - die anfängliche DNA-Konzentration (Co) mal Zeit (t)

Da die Reaktion einer bimolekularen Kinetik folgt, erhalten wir einen Wert

Kinderbett1/2 = Cot, bei dem 1/2 der DNA reannealt ist

Kinderbett1/2 misst die Reannealing-Rate, die umgekehrt proportional zur Konzentration der untersuchten komplementären Sequenzen ist.

Kleines Kinderbett1/2 Werte zeigen an, dass die komplementären Sequenzen in hoher Konzentration vorliegen.
(sie glühen sehr schnell wieder, t ist klein)
Großes Kinderbett1/2 Werte zeigen an, dass die komplementären Sequenzen in niedriger Konzentration vorliegen.
(sie erneuern sehr langsam, t ist groß)

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der "Cot-Analyse (viel Glück)

Der Mittelpunkt der Kurve liefert den Wert für Cot1/2 - die Zeit, die benötigt wird, bis die Hälfte der Einzelstränge bei einer definierten DNA-Ausgangskonzentration in doppelsträngiger Form vorliegt.

Im Gegensatz zum obigen Beispiel besteht das Genom von E. coli aus 5.000.000 bp einer einzigartigen Sequenz.

Bei der Auftragung des prozentualen Einzelstrangs als Funktion von Cot beobachten wir wiederum eine einzelne sigmoidale Kurve, die bestätigt, dass das Genom von E. coli als eine einzelne kinetische Klasse reannealt.

Beachten Sie, dass sich die Cot-Kurve relativ zur Lambda-Cot-Kurve nach rechts verschoben hat. Die Zunahme von Cot1/2 spiegelt die Anzahl der Kopien des E. coli-Genoms in Lösung im Vergleich zum Lambda-Genom wider. Da das Genom von E coli 2 Größenordnungen größer ist als das Lambda-Genom, wird jedes gegebene 500 bp-Fragment in einer 100-mal niedrigeren Konzentration in der E coli-Genomprobe vorhanden sein.

Dies kann veranschaulicht werden, indem man bedenkt, was passiert, wenn die DNA-Probe aus gleichen Massenmengen der Lambda- und E-coli-Genome besteht (jeweils 25 ug/ml).

Die Cot-Kurve hat jetzt zwei kinetische Komponenten,
die jeweils etwa 1/2 der gesamten DNA in der Probe umfassen,
einer mit einem Kinderbett1/2 des Lambda-Genoms,
einer mit einem Kinderbett1/2 des Genoms von E. coli.

Was ist mit Eukaryoten? Wie sieht das Reannealing eukaryontischer Genome aus?

Im Gegensatz zu den meisten Prokaryoten sind die Cot-Kurven eukaryotischer Genome komplexe Kurven. Eine auf bimolekularer Kinetik basierende Modellierung ermöglicht es uns, die Daten zu „fitten“, um drei kinetische Klassen zu definieren, die sich in ihrer Wiederholungsfrequenz im Genom unterscheiden.

Die erste Klasse stellt einen kleinen Teil des Genoms dar (typischerweise etwa 10 %), wird jedoch sehr häufig wiederholt (10.000 Kopien). Dies sind kurze, stark geclusterte wiederholte Sequenzen, die an eukaryotischen Telomeren und Zentromeren gefunden werden. Verteilte Kopien dieser einfachen Sequenzwiederholungen sind ebenfalls üblich.

Die dritte kinetische Klasse ist die einzigartige Sequenz des Genoms. In dieser Klasse finden wir die meisten Protein-kodierenden Sequenzen des Genoms. Diese Klasse enthält typischerweise den Großteil der Sequenz im eukaryontischen Genom.


Beispiele für denaturierte Proteine

Obwohl Proteindenaturierung für das Überleben von Zellen schädlich ist, wird sie im täglichen Leben häufig angetroffen. Eiweiß besteht zum Beispiel hauptsächlich aus löslichen Proteinen und ist in frischen Eiern flüssig und durchscheinend. Wenn es gekocht wird, denaturiert die Hitze die Proteine ​​und lässt sie ihre Löslichkeit verlieren. Denaturierte Proteine ​​aggregieren und bilden eine Masse, die nun undurchsichtig und fest ist. In ähnlicher Weise denaturiert die Veränderung des pH-Werts von Milch durch Zugabe von Säuren wie Zitronensäure aus Zitronensaft die Milchproteine ​​und lässt die Milch gerinnen. Der feste weiße Teil, der sich von der Molke trennt, ist denaturiertes Protein. Dies kann auch beobachtet werden, wenn Milch aufgrund einer bakteriellen Besiedelung auf natürliche Weise gerinnt. Bakterien können als Nebenprodukt des Stoffwechsels Milchsäure produzieren. Bei richtiger Kontrolle wird dieser Denaturierungsprozess zur Herstellung von Joghurt und Frischkäse verwendet.


Kinetische Klassen der dna-biologischen Diskussion

In diesem Artikel werden wir über die wiederholte Sequenz der chromosomalen DNA diskutieren.

Eukaryotische Genome enthalten eine große Menge sich wiederholender Sequenzen, die manchmal in Hunderten oder Tausenden von Kopien pro Genom vorliegen. Das Verständnis repetitiver Sequenzen basiert auf Studien zur Denaturierung (Trennung der DNA-Doppelhelix in ihre beiden Teilstränge) und Renaturierung (Reassoziation der Einzelstränge zu stabilen doppelsträngigen DNA-Molekülen) von DNA.

Die beiden Stränge eines DNA-Moleküls werden durch schwache nicht-kovalente Bindungen zusammengehalten. Wenn DNA in Kochsalzlösung erwärmt wird, wird eine Temperatur erreicht, bei der sich zwei Stränge zu trennen beginnen, was zu einzelsträngigen Molekülen in Lösung führt. Dies wird als thermische Denaturierung oder DNA-Schmelzen bezeichnet.

Das Fortschreiten der thermischen Denaturierung kann durch Beobachten der Zunahme der Absorption der gelösten DNA verfolgt werden. Die stickstoffhaltigen Basen der DNA absorbieren ultraviolette Strahlung mit einem Absorptionsmaximum nahe 260 nm. In einzelsträngiger DNA sind die durch Basenstapelung verursachten hydrophoben Wechselwirkungen erhöht, was die Fähigkeit der Basen erhöht, ultraviolette Strahlung zu absorbieren.

Die Temperatur, bei der die Extinktionsverschiebung halb abgeschlossen ist, wird als Schmelztemperatur (Tm) der DNA bezeichnet. Je höher der GC-Gehalt der DNA, desto höher die Tm. Der Grund dafür ist, dass es 3 Wasserstoffbrücken zwischen G und C gibt, die GC-Paaren Stabilität verleihen, im Vergleich zu AT-Paaren, die durch zwei Wasserstoffbrücken verbunden sind. Somit schmelzen die AT-reichen DNA-Abschnitte vor den GC-reichen Abschnitten.

Wenn denaturierte DNA langsam abgekühlt wird, assoziieren die Einzelstränge zu doppelsträngigen Molekülen und die Eigenschaften der doppelhelikalen DNA werden wiederhergestellt, dh sie absorbiert weniger ultraviolettes Licht. Dies wird als Renaturierung oder Reannealing bezeichnet. Wie später beschrieben, hat die Eigenschaft des Reannealings zur Entwicklung einer Methode geführt, die als Nukleinsäurehybridisierung bezeichnet wird.

Britten und Kohne (1967) untersuchten die Renaturierungskinetik von DNA und entdeckten wiederholte Sequenzen.

Walker (1969) unterschied 3 kinetische DNA-Klassen:

Schnelle Reannealing-Fraktion oder stark repetitive DNA,

Intermediate Reannealing-Fraktion oder mäßig repetitive DNA und

Die langsame Annealing-Unikat- oder Einzelkopie-Fraktion.

1. Häufig wiederholte DNA-Sequenzen:

Auch als wiederholte oder redundante DNA bezeichnet. Besteht aus Sequenzen, die in mindestens einer Million Kopien pro Genom vorhanden sind, macht etwa 10 % der gesamten DNA in Vertebraten aus. Solche Sequenzen sind normalerweise kurz, etwa einige hundert Nukleotide lang, und liegen in Clustern vor, in denen die gegebene Sequenz ohne Unterbrechung in Tandem-Arrays (End-to-End-Weise) immer und immer wieder wiederholt wird. Zu den stark wiederholten Sequenzen gehören die Satelliten-DNAs, die Minisatelliten-DNAs und die Mikrosatelliten-DNAs.

Besteht aus kurzen Sequenzen von etwa 5 bis 100 bp Länge. Während der Dichtegradienten-Zentrifugation trennt sich die Satelliten-DNA in eine deutliche Bande, da sich die Basenzusammensetzung der Satelliten-DNA von der der Massen-DNA unterscheidet. Eine Spezies kann mehr als eine Satellitensequenz aufweisen, wie bei Drosophila virilis, die 3 Satellitensequenzen mit jeweils 7 Nukleotiden Länge hat.

Satelliten-DNA ist in zentromerischem Heterochromatin um Zentromere herum vorhanden. Beim Menschen sind 3 Blöcke von Satelliten-DNA in den sekundären Verengungen der Chromosomen 1, 9 und 16 vorhanden. Ein vierter Block befindet sich im distalen Abschnitt des langen Arms des Y-Chromosoms.

Diese treten normalerweise in Clustern mit etwa 3000 Wiederholungen auf, deren Größe zwischen 12 und 100 bp lang ist. Minisatellitensequenzen nehmen kürzere Abschnitte des Genoms ein als die Satellitensequenzen. Minisatelliten sind oft instabil und die Anzahl der Kopien von Minisatelliten kann von einer Generation zur nächsten zunehmen oder abnehmen. Die Länge des Minisatelliten-Locus kann innerhalb derselben Familie und in der Population variieren (Polymorphismus). Veränderungen der Minisatellitensequenzen können die Expression benachbarter Gene beeinflussen.


Materialen und Methoden

Plasmid-/DNA-Behandlungen und Denaturierungs-/Renaturierungsreaktionen

Die genomischen Klone aus dem humanen DM-Locus (Positionen 357–433, wie in 7) enthalten die (CTG)n·(KAG)n wiederholen, wo n = 30, n = 50 und n = 255, beschrieben ( 4, 5, 8). Die n = 30 und n = 50 Wiederholungstrakte sind frei von Sequenzunterbrechungen, während die n = 255 Trakt enthält vier ACT-Unterbrechungen, was zu einem Trakt von (CTG) führt27AKT(CTG)40AKT(CTG)38AKT(CTG)40AKT(CTG)106±5. Plasmide wurden unter Verwendung von Detergens-Lyse, wie zuvor beschrieben (5), hergestellt. Plasmide wurden mit DNase-freien RNasen A und T1 (Sigma) behandelt, mit Phenol extrahiert, zweimal durch isopyknische Zentrifugation gereinigt und in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) bei –20°C gelagert. Es wurden alle Vorkehrungen getroffen, um Deletionen während der Plasmidvermehrung in zu vermeiden Escherichia coli ( 5, 9).

Die Endmarkierung der 5'- oder 3'-Enden wurde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (USB) bzw. AMV-Reverser Transkriptase (USB) wie beschrieben (4, 5, 10, 11) durchgeführt. Alle Denaturierungs-/Renaturierungsreaktionen wurden wie beschrieben durchgeführt und es wurden Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um eine Dehydratisierung der Probe zu vermeiden (4, 5, 10, 11). Alle Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs bezogen und die Reaktionen wurden wie vom Hersteller angegeben durchgeführt. Die Slip-Strand-Strukturen wurden aus Polyacrylamidgelen ausgeschnitten und die DNA wie beschrieben elektroeluiert ( 5, 10, 11).

Elektrophorese

Polyacrylamidgele (4%, 13 × 9 × 0,15 cm, 40:2 Acrylamid: Bisacrylamid) wurden in TBE (90 mM Tris, 90 mM Borat, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) gegossen und einer konstanten Spannung (150 V, 10–12 V/cm) bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Die Gele wurden dann mit Ethidiumbromid gefärbt, fotografiert und/oder auf Whatman-Papier getrocknet und einem Röntgenfilm (Kodak) in Gegenwart eines Verstärkungsschirms bei –70 °C oder eines PhosphorImager-Schirmes (Molecular Dynamics) ausgesetzt. Die Menge an gebildeter S-DNA wurde durch densitometrische Analysen als Prozentsatz der Gesamtpopulation von Wiederholungs-enthaltenden Molekülen gemessen. Die gesamte Quantifizierung erfolgte in 3–10 Experimenten durch PhosphorImager-Analyse unter Verwendung der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics). Alle relativen Wanderungen und Basenpaarschätzungen wurden in Bezug auf die Wanderung einer 123 bp-Leiter (Gibco BRL) wie zuvor beschrieben berechnet (8).

Elektronenmikroskopie

DNA-Proben wurden hergestellt und EM wurde wie beschrieben durchgeführt (12). Kurz gesagt wurden die Proben mit einem Puffer gemischt, der 0,15 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;2 und 2 mM Spermidin, adsorbiert an durch Glühen geladene dünne Kohlenstofffilme, gewaschen mit einer Reihe von Wasser/abgestuftem Ethanol und rotierendem Schattenwurf mit Wolfram. Die Proben wurden unter Verwendung eines Phillips CM12-Elektronenmikroskops untersucht. Mikroskopische Aufnahmen sind in umgekehrtem Kontrast gezeigt. Ein an einen Macintosh-Computer angeschlossener Nikon-Multiformat-Filmscanner und Adobe Photoshop wurden verwendet, um Montagen der Bilder zu erstellen.

Denaturierung und Renaturierung von DM-DNA-Fragmenten, die (CTG) enthaltenn·(KAG)n Wiederholungen führen zu langsam wandernden DNAs in Bezug auf DNAs, die nie denaturiert/renaturiert wurden. (EIN) Karte der DM (CTG)n·(KAG)nHindIII-ÖkoRI-Fragment. Menschliche nicht-repetitive flankierende Sequenzen (Positionen 357–375 und 391–433, wie in 7) sind fett gedruckt. Die dünnen Linien repräsentieren Plasmidvektorsequenzen. (B) (CTG)n·(KAG)n-enthaltende Fragmente mit n = 30 und n = 50 werden angezeigt. Lineare unbehandelte (LNT) Kontrollen (Bahnen 1 und 3) und reanaled (RD) (Bahnen 2 und 4) 32 P-markiert HindIII-ÖkoRI-Restriktionsverdauungsprodukte wurden auf einem 4% Polyacrylamidgel aufgetrennt, getrocknet und einer Autoradiographie ausgesetzt. Die Klammern geben die Verteilung der Gesamtradioaktivität an, die anomal nach dem Reannealing wandert. Die linearen Duplex-DNAs sind ebenfalls angegeben. Das Muster der langsam wandernden Produkte war nicht unterscheidbar, wenn entweder die CTG- oder die CAG-Stränge radioaktiv markiert waren, was darauf hinweist, dass die neuen Produkte sowohl aus CTG- als auch aus CAG-haltigen Strängen bestanden. (C) Neigung der S-DNA-Bildung als Funktion der Wiederholungslänge. Die Prozentsätze wurden wie in Materialien und Methoden beschrieben gemessen.

Denaturierung und Renaturierung von DM-DNA-Fragmenten, die (CTG) enthaltenn·(KAG)n Wiederholungen führen zu langsam wandernden DNAs in Bezug auf DNAs, die nie denaturiert/renaturiert wurden. (EIN) Karte der DM (CTG)n·(KAG)nHindIII-ÖkoRI-Fragment. Menschliche nicht-repetitive flankierende Sequenzen (Positionen 357–375 und 391–433, wie in 7) sind fett gedruckt. Die dünnen Linien repräsentieren Plasmidvektorsequenzen. (B) (CTG)n·(KAG)n-enthaltende Fragmente mit n = 30 und n = 50 werden angezeigt. Lineare unbehandelte (LNT) Kontrollen (Bahnen 1 und 3) und reanaled (RD) (Bahnen 2 und 4) 32 P-markiert HindIII-ÖkoRI-Restriktionsverdauungsprodukte wurden auf einem 4% Polyacrylamidgel aufgetrennt, getrocknet und einer Autoradiographie ausgesetzt. Die Klammern geben die Verteilung der Gesamtradioaktivität an, die anomal nach dem Reannealing wandert. Die linearen Duplex-DNAs sind ebenfalls angegeben. Das Muster der langsam wandernden Produkte war nicht unterscheidbar, wenn entweder die CTG- oder die CAG-Stränge radioaktiv markiert waren, was darauf hinweist, dass die neuen Produkte sowohl aus CTG- als auch aus CAG-haltigen Strängen bestanden. (C) Neigung der S-DNA-Bildung als Funktion der Wiederholungslänge. Die Prozentsätze wurden wie in Materialien und Methoden beschrieben gemessen.


Wiederholte Sequenz chromosomaler DNA | Genetik

In diesem Artikel werden wir über die wiederholte Sequenz der chromosomalen DNA diskutieren.

Eukaryotische Genome enthalten eine große Menge sich wiederholender Sequenzen, die manchmal in Hunderten oder Tausenden von Kopien pro Genom vorliegen. Das Verständnis repetitiver Sequenzen basiert auf Untersuchungen zur Denaturierung (Trennung der DNA-Doppelhelix in ihre beiden Teilstränge) und Renaturierung (Re-Assoziation der Einzelstränge zu stabilen doppelsträngigen DNA-Molekülen) von DNA.

Die beiden Stränge eines DNA-Moleküls werden durch schwache nicht-kovalente Bindungen zusammengehalten. Wenn DNA in Kochsalzlösung erwärmt wird, wird eine Temperatur erreicht, bei der sich zwei Stränge zu trennen beginnen, was zu einzelsträngigen Molekülen in Lösung führt. Dies wird als thermische Denaturierung oder DNA-Schmelzen bezeichnet.

Das Fortschreiten der thermischen Denaturierung kann durch Beobachten der Zunahme der Absorption der gelösten DNA verfolgt werden. Die stickstoffhaltigen Basen der DNA absorbieren ultraviolette Strahlung mit einem Absorptionsmaximum nahe 260 nm. In einzelsträngiger DNA sind die durch die Basenstapelung verursachten hydrophoben Wechselwirkungen erhöht, was die Fähigkeit der Basen erhöht, ultraviolette Strahlung zu absorbieren.

Die Temperatur, bei der die Extinktionsverschiebung halb abgeschlossen ist, wird als Schmelztemperatur (Tm) der DNA bezeichnet. Je höher der GC-Gehalt der DNA, desto höher die Tm. Der Grund dafür ist, dass es 3 Wasserstoffbrücken zwischen G und C gibt, die GC-Paaren Stabilität verleihen, im Vergleich zu AT-Paaren, die durch zwei Wasserstoffbrücken verbunden sind. Somit schmelzen die AT-reichen DNA-Abschnitte vor den GC-reichen Abschnitten.

Wenn denaturierte DNA langsam abgekühlt wird, reassoziieren die Einzelstränge zu doppelsträngigen Molekülen, und die Eigenschaften der doppelhelikalen DNA werden wiederhergestellt, dh sie absorbiert weniger ultraviolettes Licht. Dies wird als Renaturierung oder Reannealing bezeichnet. Wie später beschrieben, hat die Eigenschaft des Reannealings zur Entwicklung einer Methode geführt, die als Nukleinsäurehybridisierung bezeichnet wird.

Britten und Kohne (1967) untersuchten die Renaturierungskinetik von DNA und entdeckten wiederholte Sequenzen.

Walker (1969) unterschied 3 kinetische DNA-Klassen:

Schnelle Reannealing-Fraktion oder stark repetitive DNA,

Intermediate Reannealing-Fraktion oder mäßig repetitive DNA und

Die langsame Annealing-Unikat- oder Einzelkopie-Fraktion.

Kinetische Klassen der DNA:

1. Häufig wiederholte DNA-Sequenzen:

Auch als wiederholte oder redundante DNA bezeichnet. Besteht aus Sequenzen, die in mindestens einer Million Kopien pro Genom vorhanden sind, macht etwa 10 % der gesamten DNA in Vertebraten aus. Solche Sequenzen sind normalerweise kurz, etwa einige hundert Nukleotide lang, und liegen in Clustern vor, in denen die gegebene Sequenz ohne Unterbrechung in Tandem-Arrays (End-to-End-Weise) immer und immer wieder wiederholt wird. Zu den stark wiederholten Sequenzen gehören die Satelliten-DNAs, die Minisatelliten-DNAs und die Mikrosatelliten-DNAs.

Besteht aus kurzen Sequenzen von etwa 5 bis 100 bp Länge. Während der Dichtegradienten-Zentrifugation trennt sich die Satelliten-DNA in eine deutliche Bande, da sich die Basenzusammensetzung der Satelliten-DNA von der der Massen-DNA unterscheidet. Eine Spezies kann mehr als eine Satellitensequenz aufweisen, wie bei Drosophila virilis, die 3 Satellitensequenzen mit jeweils 7 Nukleotiden Länge hat.

Satelliten-DNA ist in zentromerischem Heterochromatin um Zentromere herum vorhanden. Beim Menschen sind 3 Blöcke von Satelliten-DNA in den sekundären Verengungen der Chromosomen 1, 9 und 16 vorhanden. Ein vierter Block befindet sich am distalen Teil des langen Arms des Y-Chromosoms.

Diese treten normalerweise in Clustern mit etwa 3000 Wiederholungen auf, deren Größe zwischen 12 und 100 bp lang ist. Minisatellitensequenzen nehmen kürzere Abschnitte des Genoms ein als die Satellitensequenzen. Minisatelliten sind oft instabil und die Anzahl der Kopien von Minisatelliten kann von einer Generation zur nächsten zunehmen oder abnehmen. Die Länge des Minisatelliten-Locus kann innerhalb derselben Familie und in der Population variieren (Polymorphismus). Veränderungen der Minisatellitensequenzen können die Expression benachbarter Gene beeinflussen.

Dazu gehören die kürzesten Sequenzen mit einer Länge von ein bis fünf Basenpaaren, die in Clustern von etwa 50 bis 100 Basenpaaren Länge vorliegen. Sie sind gleichmäßig in der DNA verteilt. Das menschliche Genom enthält etwa 30.000 verschiedene Mikrosatelliten-Loci. Veränderungen in der Kopienzahl bestimmter Mikrosatellitensequenzen sind für einige Erbkrankheiten verantwortlich.

2. Mäßig wiederholte DNA-Sequenzen:

Diese sind teilweise überflüssig. Die Sequenzen sind sehr ähnlich, aber möglicherweise nicht identisch. Diese Fraktion umfasst Sequenzen, die innerhalb des Genoms einige Male bis Zehntausende Male wiederholt werden. Die Gene für RNAs und Histone sind von diesem Typ. Sie machen 15 % der DNA in Mäusen aus, 45 % in Xenopus und 80 % in Weizen, Zwiebeln und Lachs.

3. Eindeutige oder Einzelkopie-Sequenzen:

Diese Sequenzen sind im Genom nur einmal oder höchstens in wenigen Kopien vorhanden. Sie haben eine langsame Reassoziationsrate. Die meisten der Strukturgene sind unter den einzigartigen Sequenzen zu finden. Maus enthält 70 % und Xenopus etwa 55 % der Einzelkopiesequenzen.

Verteilte wiederholte Sequenzen:

Anders als oben beschriebene wiederholte DNA, bei der wiederholte Sequenzen in Tandemweise geclustert werden, gibt es einige Wiederholungssequenzen, die über das gesamte Genom verstreut sind und als dispergierte oder eingestreute DNA bezeichnet werden, anstatt als Tandemwiederholungen geclustert zu werden. Verteilte wiederholte Sequenzen wurden in vielen Organismen untersucht.

Dies sind Familien wiederholter Sequenzen, die im gesamten Genom mit einzigartiger Sequenz-DNA durchsetzt sind. Oft haben eine kleine Anzahl von Familien sehr hohe Kopienzahlen und machen den größten Teil der dispergierten wiederholten DNA im Genom aus. Im Allgemeinen trifft man auf zwei Einstreumuster, die es ermöglichen, diese Sequenzen als SINEs (kurze eingestreute Elemente) oder LINEs (lange eingestreute Elemente) zu klassifizieren.

Familien von SINEs haben Sequenzen von etwa 100 bis 400 bp Länge, während LINEs etwa 1000 bis 7000 bp haben. Alle eukaryotischen Organismen haben LINEs und SINEs, obwohl ihre relativen Anteile stark variieren. Drosophila und Vögel haben meist LINEs, Menschen und Frösche haben meist SINEs. LINEs und SINEs repräsentieren einen signifikanten Anteil der gesamten mäßig repetitiven DNA im Genom.

Diploide Genome von Säugetieren weisen etwa 500.000 Kopien der LINE-1 (L1)-Familie wiederholter Sequenzen auf, die etwa 15% des Genoms darstellen. Andere LINE-Familien sind viel weniger häufig als LINE-1. Die LINE-1-Familienmitglieder in voller Länge sind 6 bis 7 Kilobasen lang. Die LINE-1-Elemente voller Länge sind Transposons, das heißt, sie codieren Enzyme für die Bewegung dieser Elemente im Genom.

Ein gutes Beispiel für SINEs sind die Alu-Sequenzen in Säugetiergenomen, die so genannt werden, weil sie eine einzelne Stelle für die Restriktionsendonuklease Alu I enthalten. Alu-Sequenzen sind etwa 300 Basenpaare lang, und etwa eine Million solcher Sequenzen sind im gesamten Genom verteilt für fast 10 % der gesamten zellulären DNA.

Alu-Sequenzen werden in RNA transkribiert, aber sie kodieren keine Proteine ​​und ihre Funktion ist nicht bekannt. Bezeichnenderweise sind Alu-Sequenzen ebenso wie die LINE-1-Sequenzen transponierbare Elemente und können sich an verschiedene Stellen in der genomischen DNA bewegen, wenn die für die Bewegung erforderlichen Enzyme von aktiven LINE-Elementen geliefert werden.

In-situ-Lokalisierung von Satelliten-DNA:

Die genauen Positionen wiederholter DNA-Sequenzen auf eukaryontischen Chromosomen wurden durch die Technik der in situ-Hybridisierung bestimmt, die zuerst von Pardue und Gall (1970) entwickelt wurde. Das Verfahren beruht darauf, dass nur solche Einzelstränge von DNA/DNA oder DNA/RNA hybridisieren, die komplementäre Basensequenzen aufweisen.

Zytologische Präparate von Chromosomen-Spreads werden mit NaOH behandelt, das DNA dissoziiert. Die Präparate werden in einer Lösung inkubiert, die einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle (entweder DNA oder transkribierte RNA) enthält, die mit Tritium markiert sind. Die Bereiche der Chromosomen, die komplementäre Basensequenzen enthalten, hybridisieren mit den entsprechenden Sequenzen in einzelsträngigen Molekülen. Ihre Lage wird durch Autoradiographie bestimmt.

Unter Verwendung markierter Maus-Satelliten-DNA konnten Pardue und Gall (1970) die Position von Satellitensequenzen im konstitutiven Heterochromatin neben den Zentromeren der mitotischen Chromosomen bestimmen (Abb. 19.2c). Mit Ausnahme von Y haben alle verbleibenden Mauschromosomen Satelliten-DNA an den Zentromeren. Später haben viele Materialien Satelliten-DNA in konstitutivem Heterochromatin gezeigt, das mit Giemsa C-Banden bildet.

Manchmal kann es in einem Genom mehr als eine Art von Satelliten-DNA geben. Menschliche Chromosomen haben 4 Satelliten-Unterfraktionen, die in den Chromosomen 1, 9, 16 und Y vorhanden sind. Alle 4 Satelliten-Unterfraktionen hybridisieren mit Chromosom 9. Es ist auch aus evolutionärer Sicht interessant, dass alle menschlichen Satelliten-Unterfraktionen mit Affen hybridisieren und Schimpansen-DNA.


Können zwei denaturierte DNA-Stränge reassoziieren? - Biologie

Hybridisierungstechnologie

Denaturierende Nukleinsäuren

Im Gegensatz zu diesen stabilisierenden Wechselwirkungen steht die elektrostatische Abstoßung von
das geladene Zucker-Phosphat-Rückgrat.

Es gibt zwei grundlegende Ansätze zur Denaturierung doppelsträngiger DNA
- Erhitzen und chemische Behandlung.

Chemische Vergällungsmittel können in drei Klassen eingeteilt werden

Bevor wir das Thema DNA-Denaturierung verlassen, schauen wir uns etwas genauer an
Hitzedenaturierung.
Überlegen Sie, was passiert, wenn wir eine Nukleinsäurelösung erhitzen – sagen wir das Genom von E. coli. Um die DNA für dieses Experiment vorzubereiten, scheren wir sie in kleine Stücke (ca. 500 bp lang) und erhitzen sie langsam, während wir die A260.

Das anfängliche A260 ist stabil, bis über einen Zeitraum von ca. 5 °C die A260 steigt plötzlich um etwa 40 % an.

Diese Extinktionszunahme wird als bezeichnet
Hyperchrome Verschiebung.

Die hyperchrome Verschiebung ist auf das Aufschmelzen der Doppelhelix in zwei Einzelstränge zurückzuführen. Die erhöhte Rotationsfreiheit der N-Basen bei der Strangtrennung erklärt den beobachteten Anstieg der Extinktion.

Die Schmelztemperatur , oder Tm , ist die Temperatur am Mittelpunkt der hyperchormischen Verschiebung, wie links gezeigt.

Drei Hauptfaktoren beeinflussen die Schmelztemperatur.

Die GC-Inhalt der Nukleinsäureprobe.
Dies liegt daran, dass AT-Basenpaare 2 H-Brücken teilen, während GC-Basenpaare 3 H-Brücken teilen.

[Salz]
Tm ist empfindlich gegenüber der Na + -Konzentration.
Na + schützt die negativen Ladungen des Zucker-Phosphat-Rückgrats vor gegenseitiger Wechselwirkung. Die Abstoßung zwischen den negativ geladenen Phosphat-Rückgraten ist die Hauptkraft, die die Doppelhelix destabilisiert, daher erhöht eine Erhöhung der Na + -Konzentration die Helix-Stabilität und eine Verringerung der Na + -Konzentration verringert die Helix-Stabilität.

DNA-Hybridlänge
Je länger das DNA-Hybrid ist, desto mehr H-Brücken halten die beiden Stränge zusammen. Je länger das Hybrid, desto mehr H-Brücken müssen gleichzeitig gebrochen werden, damit sich die beiden Stränge trennen.
Dies ist nach dem (berüchtigten) kanadischen Erfinder Zippy als „Reißverschluss-Effekt“ bekannt. Für unsere Zwecke betrachten wir nur die beiden Extreme des Reißverschlusseffekts. Für diesen Kurs werden wir nur die Extremitäten der Hybridlänge betrachten - Hybride mit einer Länge von weniger als 50 bp (kurz) und solche mit einer Länge von etwa 500 bp (lang).


Können zwei denaturierte DNA-Stränge reassoziieren? - Biologie

DNA-Denaturierung, Reannealing, Hybridisierung sind Prozesse, die auf der Chemie der Basenpaarung zwischen komplementären Strängen der DNA-Doppelhelix basieren.

Die beiden DNA-Stränge Doppelhelix zusammenbleiben über Basenpaarung von stickstoffhaltige Basen: Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin. Denken Sie daran, dass Adenin (A) mit Thymin (T) zwei Wasserstoffbrückenbindungen eingeht, während Guanin (G) mit Cytosin (C) drei Wasserstoffbrückenbindungen bildet. Brechen diese Wasserstoffbrücken auf, schmilzt die Doppelhelix und es entstehen zwei Einzelstränge. Dieser Vorgang heißt DNA-Denaturierung (oder DNA-Schmelzen). Hohe Temperaturen und bestimmte Chemikalien führen zur Denaturierung der DNA. Da zwischen G- und C-Basenpaaren mehr Wasserstoffbrückenbindungen bestehen als zwischen A- und T-Basenpaaren, ist die Schmelztemperatur umso höher, je mehr G-C-Basenpaare ein DNA-Strang hat.

Glücklicherweise ist die DNA-Denaturierung ein reversibler Prozess. Wenn die Temperatur langsam abgekühlt wird, kommen komplementäre Einzelstränge zusammen und bilden entsprechende Wasserstoffbrückenbindungen. Und folglich nachglühen Bei diesem Vorgang rekombinieren die beiden Einzelstränge zur Doppelhelix.

In einem einzelsträngigen Zustand könnte DNA jedoch an eine andere einzelsträngige DNA unterschiedlichen Ursprungs binden, wenn sie eine ausreichende Komplementarität oder eine ausreichende Basenpaarung aufweisen. Dies wird als Nukleinsäure bezeichnet Hybridisierung.

Fragen zum Üben

Khan Akademie

Offizielle MCAT-Vorbereitung (AAMC)

Abschnitt Bank C/P Abschnitt Passage 9 Frage 70

Online-Lernkarten Biochemie Frage 5

Biologie-Fragenpaket, Band 2. Passage 9 Frage 58

• DNA-Denaturierung ist das Aufwickeln der Doppelhelix bei höheren Temperaturen oder extremen chemischen Bedingungen.

• Wenn diese Bedingungen wieder günstig sind, bildet sich in einem Reannealing-Prozess wieder eine DNA-Doppelhelix.

• DNA-Stränge sind einander nicht vollkommen treu: Sie können Hybridisierungen eingehen, die Doppelstränge mit anderen komplementären Strängen bilden.

DNA-Denaturierung:Bezieht sich auf das Schmelzen von doppelsträngiger DNA, um zwei Einzelstränge zu erzeugen.

Stickstoffbasen : Organische Moleküle, die Teil der Nukleotide in der DNA sind und basische chemische Eigenschaften aufweisen.

Basenpaarung: Die spezifische Art und Weise, wie sich Basen der DNA aneinanderreihen und aneinander binden A immer mit T und G immer mit C.

Doppelhelix: Die Struktur der DNA, die wie eine gewundene Treppe aussieht.

Hybridisierung: Die spontane Paarung komplementärer DNA-Sequenzen durch Wasserstoffbrückenbindung, um ein doppelsträngiges Molekül zu erzeugen.


Stichprobe

Experimentieren Sie (B1-1). Eigenschaften von DNA
Hintergrundinformation
DNA ist ein extrem langes Molekül, das sehr dünn, aber ziemlich starr ist. Die Isolierung intakter DNA-Moleküle aus einer Zelle ist aufgrund der relativen Leichtigkeit, mit der diese langen stäbchenförmigen Moleküle aufgebrochen werden können, schwierig. Sogar die Injektion einer DNA-Lösung durch die Nadel einer Injektionsspritze kann zu einem umfangreichen Abbau von DNA-Molekülen führen. DNA kann auch durch Enzyme, die Desoxyribonukleasen genannt werden, abgebaut werden. Desoxyribonuklease I (DNAse I), ein Enzym, das aus der Bauchspeicheldrüse von Säugetieren isoliert wurde, wird im heutigen Experiment verwendet. Dieses Enzym bricht die Phosphodiesterbindungen, die die Nukleotideinheiten in der DNA verbinden, und baut lange DNA-Moleküle zu einer Mischung kleiner Nukleotidketten ab, wie in Abbildung 1-1 dargestellt.

Ein DNA-Molekül besteht aus zwei Polynukleotidketten, die umeinander gewunden sind, um eine starre Doppelhelix zu bilden (siehe Seite 4). Die doppelhelikale Struktur der DNA ist bei Raumtemperatur sehr stabil, da die Wasserstoff- und hydrophoben Bindungen zwischen den gestapelten Basen die beiden Polynukleotidketten zusammenhalten. Wenn jedoch eine DNA-Lösung auf eine kritische Temperatur erhitzt wird, werden diese Bindungen aufgebrochen und die beiden Polynukleotidstränge durch einen Prozess namens Denaturierung getrennt. Die DNA-Denaturierung geht mit einer Abnahme der Viskosität (Dicke) der Lösung einher, da einzelsträngige DNA-Moleküle flexible gewundene Strukturen bilden, die die starre native Struktur der DNA-Doppelhelix nicht mehr beibehalten (Abbildung 1-2). Wenn die DNA schnell abgekühlt wird, bleiben die Moleküle als einzelsträngige Polynukleotide zurück. Wenn die Lösung jedoch sehr langsam abgekühlt wird, erfolgt eine Wiederherstellung der DNA-Helix. Der Zusammenbau der beiden getrennten Polynukleotidstränge wird als Renaturierung bezeichnet.

Makromoleküle wie DNA, RNA und Protein sind in Alkohollösungen nicht löslich und fallen bei Zugabe von Alkohol aus (kommen aus der Lösung). Im Allgemeinen bilden globuläre Proteine ​​und RNA in Alkohol feine, nicht-faserige Präzipitate. Im Gegensatz dazu fallen die stäbchenförmigen DNA-Moleküle in Alkohol als lange Fasern aus, die auf einen Glasstab aufgespult werden können. Die Fähigkeit der DNA, in Alkohol Fasern zu bilden, hängt von den physikalischen Eigenschaften der DNA-Moleküle ab. Zum Beispiel bildet DNA, die durch DNAse I-Verdau in kleine Stücke gebrochen wurde, keine Fasern, ebenso wenig einzelsträngige DNA, die durch Hitzedenaturierung der DNA-Doppelhelix hergestellt wurde. Diese Eigenschaften der DNA werden in den heutigen Experimenten veranschaulicht.


Studienfragen und Analyse

1. Beschreiben Sie die grundlegenden Eigenschaften der DNA, die für die Faserbildung verantwortlich sind, wenn Alkohol zu einer Lösung hinzugefügt wird, die native (doppelsträngige) DNA enthält.
2. Describe the type of precipitate that is formed when alcohol is added to denatured (single stranded) DNA. Offer an explanation as to why this precipi¬tate is different from that which is observed with native DNA.
3. Describe the action of DNAse Ion DNA and relate this effect to the results of your experiment in Section HI.


Zusammenfassung

  • Reassociation kinetics defines different classes of DNA in genomes: single copy, middle repetitive and highly-repetitive
  • Reassociation kinetics makes it possible to determine the fraction of a genome in each kinetic class, and which transcripts are produced from each class

Authors: Dr. B. Fristensky and N. Brien

Unless otherwise cited or referenced, all content on this page is licensed under the Creative Commons License Attribution Share-Alike 2.5 Canada