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Rekombinante Proteinfraktion in E. coli

Rekombinante Proteinfraktion in E. coli


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Wenn ein Protein in E. coli unter dem T7-Promotor heterolog exprimiert wird, welcher Anteil der Gesamtproteinkonzentration in der Zelle ist dann das heterolog exprimierte Protein? Wie hoch könnte seine Konzentration höchstens sein? Hängt sie stark von der Größe des Proteins ab oder gibt es bestimmte Größenschwellen für niedrige/hohe Expression?


Miroux und Walker (1996)Überproduktion von Proteinen in Escherichia coli: Mutierte Wirte, die die Synthese einiger Membranproteine ​​und globulärer Proteine ​​auf hohem Niveau ermöglichen. J. Mol. Biol. 260: 289-298

Die Autoren berichten über Probleme der Überexpression von Membranproteinen in E coli unter Verwendung eines T7 (pET)-Systems. Sie isolieren Mutantenstämme, die im Vergleich zum Elternstamm BL21(DE3) verbesserte Expressionsniveaus aufweisen. In ihrer Tabelle 1 dokumentieren sie die Expressionsniveaus von 17 Proteinen, darunter als Kontrolle GFP. GFP wurde als Kombination aus löslichem und Einschlusskörperprotein in einer Konzentration von 37 mg L . gefunden-1 in BL21(DE3) und 140 mg L-1 in einem ihrer Mutantenstämme (C41(DE3)). Das höchste Expressionsniveau, das sie beobachteten, betrug 300 mg L .-1 für Rinder-OSCP.

Leider dokumentieren die Autoren weder den Gesamtproteingehalt noch die Zelldichte der von ihnen analysierten Kulturen.

Nehmen wir an, die Kulturen waren 10e9 Zellen ml-1 = 10e12 Zellen L-1.

Laut dieser Quelle (unter Berufung auf Neidhardt F.C. Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology. Vol. 1, S. 14, ASM Press 1996) ist das Trockengewicht von an E coli Zelle ist 2,8e-13 g

Der allgemein anerkannte Wert für Protein als Bruchteil des Trockengewichts in E coli = 0.55

Ich berechne aus diesen Zahlen einen Wert von 1540 mg Protein L-1. Für die drei oben beschriebenen Proteinexpressionsniveaus bedeutet dies:

GFP in BL21(DE3) = 2,4%

GFP in C41(DE3) = 9,6%

Rinder-OSCP in C41(DE3) = 19,4%

Ich schließe (aus diesen Zahlen und aus persönlicher Erfahrung), dass die Überexpressionsniveaus sehr variabel sind und belastungs- und proteinabhängig sein werden. Werte im Bereich von 1-20% Gesamtzellprotein können erwartet werden.


Aus dieser Studie ist klar, dass daher für eine hohe Rückgewinnung des aktiven Proteinmoleküls die Solubilisierungs- und Rückfaltungsteile von hoher Präzision sein müssen. Einschlusskörperchen bestehen aus Polypeptiden des rekombinanten Proteins. Sie sind die inaktiven sekundären &ndashlike Strukturen. Somit sind die Isolierung und Reinigung des Proteins einfach. Die Aktivität des ungefalteten Proteins kann unter Anwendung milder Solubilisierungsbedingungen hervorgebracht werden. Dies wird zu einer höheren Rückgewinnung des bioaktiven Proteins beitragen, als dies im Vergleich zur Löslichkeit unter Verwendung eines stark chaotropen Mittels der Fall ist.

Zur Herstellung des rekombinanten Proteins aus den Inclusion Bodies können die folgenden Downstream-Prozessierungsschritte verwendet werden. Das rekombinante E. coli wird in LB-Medium mit Antibiotika wie Kanamycin oder Ampicillin oder Chloramphenicol basierend auf dem Plasmid gezüchtet. Die Kolben werden bei etwa 150 bis 250 U/min geschüttelt und die Temperatur wird bei 37 Grad Celsius gehalten. Nachdem die Zellen die Log-Phase erreicht haben, skizziert diese Studie, dass IPTG zugegeben und für 4-6 Stunden weiter geschüttelt wird. Die Zellen werden zentrifugiert und in 50 mM Natriumphosphatpuffer resuspendiert.

Die Zellen werden unter Verwendung des Homogenisators oder Beschallers lysiert. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und unter Verwendung einer 0,45 &mgr;m Polyethersulfonatmembran filtriert. Für die erhöhte Löslichkeit der rekombinanten Proteine ​​in E. coli stehen viele proteinspezifische Methoden zur Verfügung. Um die löslichen Proteine ​​zurückzugewinnen, werden starke Denaturierungsmittel wie Harnstoff, Guanidiniumhydrochlorid verwendet. Die Solubilisierung wird unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Diese Einschlusskörper müssen vor der Solubilisierung gut gewaschen werden. Solubilisierungsmittel wie Thioredoxin sind dafür bekannt, die Löslichkeit der Proteine ​​zu verbessern.

Ebenso gut eignen sich Genfusionstechniken zur Trennung der Proteine. Es wurde gefunden, dass Maltose-bindendes Protein und Glutathion-S-Transferase gut an das Protein binden und durch Verwendung von Affinitätschromatographietechniken entfernt werden können. Die Rückfaltung wird unter Verwendung von Verdünnung oder Diafliltration in Puffern mit niedrigem Wert durchgeführt.


Rekombinante Proteinproduktion in E. coli

Escherichia coli (E. coli) wurde über Jahrzehnte genetisch untersucht und dieser Organismus wurde zu einem unvermeidlichen Schlüsselelement in Laboratorien.
Die Entwicklung der Gentechnik und der synthetischen Biologie in Verbindung mit einer kurzfristigen Generation und einer Flexibilität, eine bestimmte genetische Information zu nutzen, definieren E. coli als einen Wirt der Wahl für die rekombinante Proteinproduktion.
Basierend auf unserem Know-how in der Gentechnik, in der Fermentation und in der Proteinproduktion haben wir Technologien und Dienstleistungen in der rekombinanten Proteinproduktion entwickelt.

Unsere Technologie Staby®Express ist eine Verbesserung der verfügbaren Technologien, die wir normalerweise verwenden. Es ermöglicht die Entfernung von Antibiotikaresistenzgenen in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Aufsichtsbehörden und eine Reduzierung der energetischen Keimbelastung bei gleichzeitiger Gewährleistung einer perfekten Plasmidstabilisierung.

Unsere Dienstleistungen zur Herstellung rekombinanter Proteine ​​werden mit oder ohne unsere Technologie durchgeführt und umfassen verschiedene Anpassungen/Optimierungen für Ihre Produktion:

  • Sequenz- und Codon-Optimierung
  • Gensynthese
  • Auswahl eines Promoters
  • Hinzufügen eines Tags zur Proteinreinigung oder -identifikation

Nach der genetischen Konstruktion Ihres Expressionsvektors führen wir einen kleinen Expressionstest durch, um die Kultur und Expressionsbedingungen zu optimieren. Wir bewerten dann das Vorhandensein Ihres Proteins in der löslichen oder unlöslichen Fraktion, die für den Reinigungsprozess ausschlaggebend ist.

Nach der Validierung der Expressionsbedingung produzieren wir Ihr Protein im Maßstab Ihrer Wahl und reinigen es nach einem definierten Protokoll.

Proteine ​​können im Schüttelkolben oder im Fermenter (von 5 L bis 50 L) hergestellt werden.
Wir liefern gereinigtes Protein von mg bis zu mehreren Gramm.


Strategien, bei denen Zielmodifikationen vermieden werden

Einige Proteine ​​beeinflussen durch ihre katalytischen Eigenschaften direkt den Zellstoffwechsel des Wirts, aber im Allgemeinen induziert die Expression rekombinanter Proteine ​​eine "metabolische Belastung". Die metabolische Belastung ist definiert als die Menge an Ressourcen (Rohstoff und Energie), die dem Wirtsstoffwechsel zur Erhaltung und Expression der Fremd-DNA entzogen werden [6]. Die Bildung von Einschlusskörperchen erfolgt als Reaktion auf die Akkumulation von denaturiertem Protein. Die metabolische Belastung und die Bildung von Einschlusskörpern sind nicht direkt miteinander verbunden, gehören aber beide zu den Hauptfaktoren, um die Fähigkeit von Zellen zu bestimmen, lösliches rekombinantes Protein zu produzieren. Da die Akkumulation von denaturiertem Protein und die metabolische Belastung durch eine Reihe von Umweltfaktoren gesteuert werden können, sind wir teilweise in der Lage, die Bildung von löslichem Protein zu kontrollieren in vivo.

Proteinexpression bei reduzierten Temperaturen

Eine bekannte Technik zur Begrenzung der in vivo Die Aggregation rekombinanter Proteine ​​besteht in der Kultivierung bei reduzierten Temperaturen [7]. Diese Strategie hat sich bei der Verbesserung der Löslichkeit einer Reihe von schwierigen Proteinen als wirksam erwiesen, darunter menschliches Interferon α-2, Subtilisin E, Ricin-A-Kette, bakterielle Luciferase, Fab-Fragmente, β-Lactamase, Reis-Lipoxygenase L-2, Sojabohnen-Lypoxygenase L-1 , Kanamycin-Nuclotidyltransferase und Kaninchenmuskel-Glykogen-Phosphorylase (siehe [8] und darin zitierte Referenzen).

Die Aggregationsreaktion wird im Allgemeinen bei höheren Temperaturen aufgrund der starken Temperaturabhängigkeit der hydrophoben Wechselwirkungen, die die Aggregationsreaktion bestimmen, begünstigt [9]. Eine direkte Folge der Temperatursenkung ist die teilweise Eliminierung von Hitzeschockproteasen, die unter Überexpressionsbedingungen induziert werden [10]. Darüber hinaus ist die Aktivität und der Ausdruck einer Reihe von E coli Chaperone sind bei Temperaturen um 30°C erhöht [11, 12]. Die erhöhte Stabilität und das Potenzial für eine korrekte Faltung bei niedrigen Temperaturen werden teilweise durch diese Faktoren erklärt.

Ein plötzlicher Abfall der Kultivierungstemperatur hemmt jedoch Replikation, Transkription und Translation [13]. Herkömmliche Promotoren, die in Vektoren zur rekombinanten Proteinexpression verwendet werden, werden ebenfalls stark in Bezug auf die Effizienz beeinflusst [14]. Ein ähnlicher transkriptioneller Effekt wird erreicht, wenn ein mäßig starker oder schwacher Promotor verwendet wird oder wenn ein starker Promotor teilweise induziert wird. Es wurde festgestellt, dass niedrige Induktionsspiegel zu höheren Mengen an löslichem Protein führen [15]. Dies ist auf die Verringerung der zellulären Proteinkonzentration zurückzuführen, die die Faltung begünstigt. Das Bakterienwachstum wird jedoch verringert, was zu einer verringerten Menge an Biomasse führt.

Verschiedene Strategien, die darauf abzielen, die Expression rekombinanter Proteine ​​bei niedriger Temperatur zu optimieren, sind wie folgt.

Ein System basierend auf der cspA Promotor wurde für die Expression von Proteinen bei niedriger Temperatur entwickelt [16]. Die cspA Promotor wird bei niedriger Temperatur stark induziert und wird bei und über 37°C gut reprimiert. Eine Sequenz, die für das TolAI-β-Lactamase-Fusionsprotein kodiert, das toxisch ist für E coli und bei 37 °C schnell abgebaut wurde unter die Kontrolle der cspA Promoter. Eine Temperaturabsenkung auf 15 oder 23°C verhinderte den Abbau des Fusionsproteins und der toxische Phänotyp, der mit der Expression bei 37°C verbunden war, wurde unterdrückt. Es wurde vorgeschlagen, dass dieses System ein wertvolles Werkzeug für die Produktion von Proteinen ist, die membranüberspannende Domänen oder anderweitig instabile Genprodukte in enthalten E coli.

Kürzlich wurde ein Prinzip vorgestellt, das die Proteinexpression und -faltung bei 4 °C ermöglicht [17]. Dieses Prinzip basiert auf der Co-Expression des Zielproteins mit Chaperonen aus einem psychrophilen Bakterium. Die beiden Chaperone (Cpn60 und Cpn10 von Oleispira Antarktis RB8 T ) erlauben E coli mit hohen Raten bei 4°C wachsen [12]. Eine Esterase aus O. Antarktis RB8 T wurde mit Cpn60 und Cpn10 in . co-exprimiert E coli bei 4°C. Dieses Verfahren erhöhte die spezifische Aktivität der gereinigten Esterase um das 180-fache im Vergleich zu Enzym, das aus Kultivierungen bei 37ºC hergestellt wurde. Es wurde der Schluss gezogen, dass die niedrige Temperatur der Faltung zuträglich ist und das System wurde als Werkzeug für die Expression und korrekte Faltung rekombinanter Proteine ​​im Zytoplasma von . vorgeschlagen E coli.

E coliStämme zur Verbesserung der löslichen Expression

Zahlreiche spezialisierte Wirtsstämme wurden entwickelt, um die metabolische Belastung im Zusammenhang mit einer hohen Proteinexpression zu überwinden.

Zwei E coli Mutantenstämme haben wesentlich zur löslichen Expression von schwierigen rekombinanten Proteinen beigetragen. C41(DE3) und C43(DE3) sind Mutanten, die eine Überexpression einiger globulärer und Membranproteine ​​ermöglichen, die im Elternstamm BL21(DE3) nicht in hohem Maße exprimiert werden können [18]. Ausdruck des F1FÖ Das ATP-Synthase-Untereinheit-b-Membranprotein in diesen Stämmen, insbesondere C43(DE3), wird von der Proliferation intrazellulärer Membranen begleitet und es fehlen Einschlusskörperchen [19]. Diese Stämme werden jetzt von Avidis http://www.avidis.fr kommerzialisiert und eine große Zahl von Berichten über ihre Verwendung bei der Expression schwieriger Proteine ​​wurde veröffentlicht [20–23]. Eine neuere Arbeit berichtet, dass die Stabilität von Plasmiden, die toxische Proteine ​​kodieren, in C41(DE3) und insbesondere in C43(DE3) erhöht ist [24].

Cysteine ​​im E coli Zytoplasma werden durch Stoffwechselwege, an denen Thioredoxinreduktase und Glutaredoxin beteiligt sind, aktiv reduziert. Die disulfidbindungsabhängige Faltung heterologer Proteine ​​wird in den Origami-Stämmen von Novagen verbessert. Störung der trxB und gor Gene, die für die beiden Reduktasen kodieren, ermöglichen die Bildung von Disulfidbrücken im E coli Zytoplasma. Die trxB (Novagen AD494) und trxB/gor (Novagen Origami) negative Stämme von E coli wurden in mehreren Expressionssituationen ausgewählt [25–27]. Die Faltung und Bildung von Disulfidbindungen im Zielprotein wird durch die Fusion mit Thioredoxin in Stämmen ohne Thioredoxinreduktase (trxB) [28]. Eine Überexpression der periplasmatischen Foldase DsbC im Zytoplasma stimuliert die Bildung von Disulfidbrücken weiter [27].

Modifikation von Kultivierungsstrategien, um lösliches Protein zu erhalten

Der einfachste Weg zur Herstellung eines rekombinanten Proteins ist die Batch-Kultivierung. Hier werden von Anfang an alle für das Wachstum notwendigen Nährstoffe zugeführt und das Wachstum während des Prozesses nur eingeschränkt kontrolliert. Diese Einschränkung führt oft zu Veränderungen des Wachstumsmediums, wie Veränderungen des pH-Werts und der Konzentration von gelöstem Sauerstoff sowie Substratverarmung. Außerdem reichern sich Hemmprodukte verschiedener Stoffwechselwege an. Zelldichten und Produktionsniveaus sind bei Batch-Kultivierungen nur mäßig.

Bei Fed-Batch-Kultivierungen kann die Konzentration der Energieträger je nach Verbrauch angepasst werden. Mehrere andere Faktoren können ebenfalls reguliert werden, um das maximale Produktionsniveau in Bezug auf das Zielprotein pro Biomasse zu erreichen. Die Bildung von Einschlusskörperchen kann in Fed-Batch-Kultivierungen verfolgt werden, indem Veränderungen der intrinsischen Lichtstreuung mittels Durchflusszytometrie überwacht werden [29]. Dies ermöglicht eine Echtzeitoptimierung der Wachstumsbedingungen, sobald Einschlusskörperchen bereits in geringen Konzentrationen nachgewiesen werden und die Bildung von Einschlusskörperchen potenziell vermieden werden kann [30].

Die Faltung einiger Proteine ​​erfordert die Existenz eines spezifischen Cofaktors. Die Zugabe solcher Cofaktoren oder Bindungspartner zu den Kultivierungsmedien kann die Ausbeute an löslichem Protein dramatisch erhöhen. Dies wurde für eine rekombinante Hämoglobin-Mutante gezeigt, bei der die Akkumulation des löslichen Produkts bei Häm-Überschuss verbessert wurde [31]. In ähnlicher Weise wurde für Gloshedobin ein Anstieg der Löslichkeit um 50 % beobachtet, wenn E coli Rekombinanten wurden in Gegenwart von 0,1 mM Mg 2+ kultiviert [32]. Ein wichtiger Faktor bei der löslichen Expression rekombinanter Proteine ​​ist die Medienzusammensetzung und -optimierung. Obwohl dies meist durch Versuch und Irrtum erreicht wird, kann es dennoch von Vorteil sein.

Molekulare Chaperone treiben die Faltung rekombinanter Proteine ​​an

Eine mögliche Strategie zur Verhinderung der Bildung von Einschlusskörperchen ist die Co-Überexpression von molekularen Chaperonen. Diese Strategie ist attraktiv, aber es gibt keine Garantie dafür, dass Chaperone die Löslichkeit von rekombinantem Protein verbessern. E coli kodieren Chaperone, von denen einige Faltungsversuche antreiben, während andere die Proteinaggregation verhindern [4, 11, 33]. Sobald neu synthetisierte Proteine ​​den Austrittstunnel des E coli Ribosomen assoziieren sie mit dem Triggerfaktor Chaperon [34]. Freiliegende hydrophobe Flecken auf neu synthetisierten Proteinen werden durch Assoziation mit Triggerfaktor vor unbeabsichtigten inter- oder intramolekularen Wechselwirkungen geschützt, wodurch eine vorzeitige Faltung verhindert wird. Proteine ​​können nach Freisetzung des Triggerfaktors ihre Faltung in den nativen Zustand beginnen oder fortsetzen. Proteine, die in nicht-nativen und aggregationsanfälligen Konformationen gefangen sind, sind Substrate für DnaK und GroEL. DnaK (Hsp70-Chaperon-Familie) verhindert die Bildung von Einschlusskörperchen, indem es die Aggregation reduziert und die Proteolyse von fehlgefalteten Proteinen fördert [11]. Ein Bi-Chaperon-System mit DnaK und ClpB (Hsp100-Chaperon-Familie) vermittelt die Solubilisierung oder Disaggregation von Proteinen [35]. GroEL (Hsp60-Chaperon-Familie) steuert den Proteintransit zwischen löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen und beteiligt sich positiv an der Disaggregation und der Bildung von Einschlusskörperchen. Die kleinen Hitzeschockproteine ​​lbpA und lbpB schützen hitzedenaturierte Proteine ​​vor irreversibler Aggregation und wurden mit Einschlusskörperchen assoziiert gefunden [36, 37].

Die gleichzeitige Überexpression von Chaperon-kodierenden Genen und rekombinanten Zielproteinen erwies sich in mehreren Fällen als wirksam. Die Co-Überexpression des Triggerfaktors in Rekombinanten verhinderte die Aggregation von Maus-Endostatin, humanem Sauerstoff-reguliertem Protein ORP150, humanem Lysozym und Meerschweinchenleber-Transglutaminase [38, 39]. Die lösliche Expression wurde durch die Co-Überexpression des GroEL-GroES- und DnaK-DnaJ-GrpE-Chaperonsystems zusammen mit dem Triggerfaktor weiter stimuliert [39]. Die Chaperon-Systeme sind kooperativ und die günstigsten Strategien beinhalten die Co-Expression von Kombinationen von Chaperonen der GroEL-, DnaK-, ClpB- und Ribosomen-assoziierten Triggerfaktor-Familien von Chaperonen [40–42].

Interaktionspartner und Proteinfaltung

Proteinunlöslichkeit im E coli Zytoplasma hängt teilweise mit der Verteilung hydrophober Reste auf der Oberfläche des Proteins zusammen. Die lösliche Expression von Untereinheiten von heteromultimeren Proteinen leidet daher manchmal an der Bildung von Einschlusskörperchen in Abwesenheit eines geeigneten Bindungspartners.

Löslicher Ausdruck in E coli des Bakteriophagen T4-Genprodukts 23 (Hauptkapsidprotein) erforderte die Co-Expression des Genprodukts 31 (Phagen-Co-Chaperonin gp31) [43]. Die Expression des richtigen Interaktionspartners ermöglichte es gp23, sich korrekt zu falten und lange regelmäßige Strukturen im Zytoplasma von . zu bilden E coli.

Eine andere Studie berichtet über die Reinigung eines heterodimeren Komplexes durch Expression jeder Untereinheit (Pheromaxein A und C) als Fusion mit Thioredoxin [44]. Jede Untereinheit blieb in Lösung löslich, wenn Thioredoxin proteolytisch entfernt wurde, nur in Gegenwart der anderen.

Zusammenfassend begünstigen Interaktionspartner potenziell in vivo Löslichkeit von Zielproteinen. Neue Systeme zur Co-Expression mehrerer Proteine, die an komplexen Strukturen beteiligt sind, ermöglichen solche Strategien [1].


MATERIALEN UND METHODEN

Plasmidkonstruktion, Klonierung und E coli Transformation

Nach der Analyse der Codon-Nutzung wurde ein 320 bp langes Konstrukt mit codon-optimierten RMCP1 Gensequenz (NM_001082294.1) flankiert von zwei Restriktionsschnittstellen, NcoIch und XhoI in pUC57 (RMCP1/pUC57) wurde von GeneCust (Dudelange, Luxemburg) erzeugt ( 1 ). RMCP1/pUC57 wurde dann verwendet, um E coli Zellen des TOP10F'-Stamms (TOP10), um die Plasmid-DNA zu amplifizieren. Die Zellen wurden in Luria-Bertani (LB)-Brühe (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), die Tetracyclin (10 &mgr;g/ml) enthielt, bei 37 °C und 200 Upm gezüchtet. Das Plasmid wurde dann mit dem SolGent Plasmid Mini Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Seoul, Korea) extrahiert und mit XhoIch und NcoI. Die Verdauungsprodukte wurden auf Agarosegel aufgetrennt und die RMCP1-enthaltendes Fragment wurde durch Gelextraktion unter Verwendung eines GeNet Bio Kit (Daegeon, Korea) gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit an . ligiert XhoIch und NcoI-verdauter pET28a-Vektor (Pasteur Institute, Teheran, Iran) und verwendet, um TOP10-Zellen zu transformieren. Alle TOP10-Transformationen wurden unter Verwendung des Calciumchlorid- und Hitzeschockprotokolls durchgeführt. Eine Sequenz, die ein His . kodiert6-tag ist unmittelbar nach dem vorhanden XhoI-Restriktionsstelle auf dem pET28a-Plasmid, und das erzeugte rekombinante Protein wurde daher mit einem fusionierten C-terminalen His . hergestellt6-Schild.

(ein) Schematische Darstellung des Konstrukts, das Kaninchen-MCP1-kodierende Sequenz enthält. (B) Nukleotid- (unten) und translatierte Aminosäuresequenzen (oben) des rekombinanten Kaninchen-MCP1. Position 1 in der Aminosäuresequenz entspricht der ersten Aminosäure (Methionin) des MCP1-Proteins des reifen Kaninchens.

(ein) Schematische Darstellung des Konstrukts, das Kaninchen-MCP1-kodierende Sequenz enthält. (B) Nukleotid- (unten) und translatierte Aminosäuresequenzen (oben) des rekombinanten Kaninchen-MCP1. Position 1 in der Aminosäuresequenz entspricht der ersten Aminosäure (Methionin) des MCP1-Proteins des reifen Kaninchens.

Die resultierenden positiven Klone wurden durch Kolonie-PCR und Verdau bewertet. Die PCR-Reaktionsmischungen enthielten Taq DNA-Polymerase (Thermo Scientific, Waltham, MA) (0,3 µl, 1,25 U), 10X Puffer (2,5 µl Thermo Scientific), 10 mM dNTPs (1 µl), 1,25 mM MgCl2 (0,5 µL Thermo Scientific), doppelt destilliertes Wasser (17,75 µL) und 1 µL 10 mM T7 Vorwärts- (F, 5΄-TAATACGACTCACTATAGGG-3΄) und Rückwärts-Primer (R, 5΄-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3΄). Das PCR-Programm wurde mit einer 4-minütigen Inkubation bei 96 °C gestartet, gefolgt von 30 Zyklen von 95 °C für 30 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 50 s und endete mit einem Schritt bei 72 °C für 10 Minuten. Für die PCR wurde ein Bio-Rad Thermocycler (Hercules, CA) verwendet. Die PCR-Produktgrößen wurden durch Agarosegel-(1%)-Elektrophorese und Vergleich mit einer DNA-Mix-Leiter (Fermentase) verifiziert.

Rekombinante Proteinexpression

Das konstruierte Plasmid (RMCP1/pET28a) wurde aus positiven Klonen extrahiert und verwendet, um E coli BL21 (DE3) (BL21) (Pasteur-Institut). Einzelne Transformanten wurden auf LB-Agar (Sigma-Aldrich) mit 25 µg/ml Kanamycin selektiert und durch Kolonie-PCR verifiziert und XhoICH/NcoI Restriktionsenzymverdauung. Die genaue Sequenz des inserierten Fragments in den resultierenden Klonen (zwei Klone) wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt, die von Bioneer Company (Korea) durchgeführt wurde.

Die beiden positiven Klone (Klone 2 und 3) wurden für die rRMCP1-Proteinproduktion selektiert. Um die Proteinexpression zu induzieren, wurden die Klone in LB-Brühe, ergänzt mit 25 &mgr;g/ml Kanamycin, mit Isopropyl-&bgr;-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)-Induktion kultiviert. Um die optimalen Bedingungen zu bestimmen, die eine mittlere Proteinexpression ermöglichen, wurden die folgenden Induktionsparameter untersucht: OD600 Bakterienkultur bei Induktion (0,4–0,5, 1,0–1,2 und 2,0–2,5), Temperatur (26°C, 30°C und 37°C), Induktionsdauer (5–24 h), Schüttelrate (180–250 U/min .) ) und Endkonzentration von IPTG (0,5, 1 und 2 mM). Der Effekt des Medienaustausches alle 4–6 h während der Induktion wurde ebenfalls untersucht, nämlich alle 4–6 h wurden die Bakterien durch Zentrifugation gesammelt und frisches Kulturmedium mit den gleichen Antibiotika- und IPTG-Konzentrationen zugegeben.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit Proteinvisualisierung durch Coomassie Brilliant Blue R-250-Färbung und Western-Blotting mit konjugierter Meerrettichperoxidase/Anti-His-Antikörper (Thermo Scientific) wurde durchgeführt, um die Expression von rRMCP1 zu überprüfen.

Rekombinante Proteinreinigung

BL21-Zellen, die das rRMCP1-Protein produzieren, wurden in 4 ml Lysepuffer [100 mM NaH&sub2;2Bestellung4, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 8 M Harnstoff] pro 1 g Bakterienpellet, und dieser Vorgang wurde durch Beschallung (fünf Pulse von 50 s) gemäß dem Proteinreinigungsprotokoll von QIAGEN (Hilden, Deutschland) abgeschlossen. Die Lysate wurden bei 8500 × zentrifugiert g bei 4 °C für 3 min, und der Überstand wurde dann mit Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Harz (QIAGEN) bei Raumtemperatur (22 °C–25 °C) für 45 min inkubiert. Der Protein/Harz-Komplex wurde auf eine Miniatur-QIAGEN-Säule aufgetragen, gewaschen und unter Verwendung der Puffer B bis E eluiert und die Fraktionen wurden getrennt gesammelt. Nach der SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen wurden die gereinigten Proteinfraktionen gepoolt und unter Verwendung von Amicon Ultra-4-Zentrifugalfiltern (Merck Millipore, Billerica, MA) konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bradford-Assays (Bradford 1976) mit Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich) als Standard bestimmt.

SDS-PAGE und Western Blotting

SDB-SEITE

BL21-, BL21/pET28a- und BL21/pET28a/RMCP1-Zellen wurden in LB-Brühemedium kultiviert. Bei OD600 = 0,4–0,5, BL21/pET28a/RMCP1-Kultur wurde in zwei Röhrchen aufgeteilt und eine Hälfte wurde 24 h lang durch IPTG induziert. Die Proben wurden 5, 16 und 24 h nach der Induktion entnommen und die Bakterienmenge wurde zwischen den drei Bedingungen durch Messung ihrer OD . normalisiert600s und gleich ihnen durch Verdünnung, und für die Elektrophorese vorbereitet. Die Proben und ein vorgefärbter Proteinmarker (10–270 kDa, Thermo Scientific) wurden auf ein 15% SDS-PAGE-Gel aufgetragen, dann in einer Coomassie R-250-Lösung 3 h gefärbt und entfärbt.

Western-Blotting

Nach der SDS-PAGE wurden die Proteine ​​unter Verwendung von Transferpuffer (25 mM Tris-Base, 190 mM Glycin, 20 % Methanol, pH 8,3) bei 90 V für 90 Minuten auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran transferiert. (Feizollahzadeh et al. 2016). Das rRMCP1-Protein wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-Poly-Histidin-Peroxidase-konjugierten Antikörpers (Arbeitsverdünnung von 1:2000 Sigma-Aldrich) nachgewiesen.

Biologische Aktivität von rRMCP1

Monozytenkultur

Fast 3 ml Blut aus den Ohren von zwei männlichen weißen Neuseeland-Kaninchen (2,3 ± 0,2 kg) (erworben vom Pasteur Institute) wurden entnommen. Das Experiment wurde von der Tierethikkommission der Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran, genehmigt.

Die Monozyten wurden mit Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich) gemäß den Empfehlungen des Herstellers abgetrennt. Die abgetrennten Monozyten wurden in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) (Biosera, Nuaille, Frankreich), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Sigma-Aldrich), 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Invitrogen®) gehalten , Carlsbad, CA), in einem feuchten Inkubator bei einer Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C.

RRMCP1-vermittelter Monozytenmigrationsassay

Es wurden zwei Sechs-Well-Zellen mit einer 0,4-μm-Poren-Polycarbonat (PCTE)-Membran (Sterlitech Corporation, Kent, OH) verwendet. Es wurden verschiedene Konzentrationen von gereinigtem rRMCP1 (5, 10, 15 oder 20 µg pro 2 ml RPMI-Medium, ergänzt mit 0,5 % fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin) hergestellt und in die untere Kammer jeder Vertiefung, in zweifacher Ausfertigung. Zwei Vertiefungen waren die Kontrollen, denen kein Protein zugesetzt wurde. Monozyten (2,5 × 10 6 Zellen) wurden in 10 ml RPMI suspendiert und 1 ml der Suspension wurde in die obere Kammer gegeben. Die Platten wurden dann bei 37 °C in einem feuchten Inkubator, 5 % CO&sub2;2, über Nacht. Die Medien in den oberen Kammern wurden in separate Röhrchen überführt. Die Medien aus den unteren Kammern wurden in separate Röhrchen überführt und bei 1500 × zentrifugiert g für 5 min bei Raumtemperatur wurden die Pellets in 1 ml RPMI suspendiert und die Zellen nach Trypanblau-Färbung gezählt. Die Migration von Monozyten wurde basierend auf der Anzahl der Zellen bewertet, die von der oberen Kammer durch die Membran in die untere Kammer in jeder Vertiefung wanderten, die 0,18, 0,36 oder 0,72 ng/ml enthielt, verglichen mit der Kontrolle. Die Zahl der Monozyten, die durch den Filter wanderten, war proportional zur Chemotaxis.

Statistische Analyse

Die Daten des Monozyten-Migrations-Assays wurden in der IBM SPSS-Software (Version 20.0) unter Verwendung des unabhängigen T Test und Einweg-ANOVA. P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen.


Klonierung, hohe Expression und Reinigung von rekombinantem humanem Intereferon-β-1b in Escherichia coli

Sequenzielle Bewertung und Prozesskontrollstrategie wurden für das Verunreinigungsprofil und die hohe Wiederfindung mit der Qualität von rhIFN-β-1b, exprimiert in , verwendet Escherichia coli. Die Expression auf hohem Niveau wurde durch Verwendung von Codon-Substitution (AT-Gehalt von 52,6% im N-terminalen Bereich) und Optimierung der Kulturbedingungen erreicht. Die Zugabe von Rifampicin in einer Konzentration von 200 µg/ml hat die spezifische Produktausbeute von 66 mg optische Dichte –1 l –1 (43,5% des gesamten zellulären Proteins) erhöht. 83 % Lipopolysaccharide, 32 % Wirtsdesoxyribonukleinsäure (DNA) und 78 % Wirtszellproteine ​​wurden durch Waschen mit 0,75 % Triton X-100 und 2 M Harnstoff entfernt. Elf Prozent Lipopolysaccharide, 39 % Wirts-DNA und 12 % Wirtszellproteine ​​wurden beim Solubilisierungsschritt entfernt. Zweiundneunzig Prozent der Proteinrückfaltung wurden durch das Hochdruck-Diafiltrationsverfahren erreicht. Die Rückfaltung durch Hochdruckdiafiltration, die Betthöhe und die Höhe, die dem theoretischen Bodenwert in der Chromatographiesäule entspricht, wurden als Schlüsselparameter für eine hohe Rückgewinnung mit Reinheit identifiziert. Schließlich lieferte das etablierte Verfahren 34 % gereinigtes Protein mit einer Reinheit von mehr als 99 % und ist für präklinische toxikologische Studien akzeptabel. Das in dieser Studie erhaltene gereinigte rhIFN-β-1b ist das höchste, das bisher berichtet wurde.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Proteinexpression in E coli

Proteinexpression im Bakterium E coli ist das beliebteste Mittel zur Herstellung von rekombinantem Protein. E coli ist ein gut etablierter Wirt, der kurze Kultivierungszeiten, einfache genetische Manipulation und kostengünstige Medien bietet. Zusätzlich, E coli hat eine lange Geschichte in der Lage, eine Vielzahl von verschiedenen Arten von Proteinen herzustellen. Sogar Proteine, die Disulfidbrücken enthalten, können im Zytoplasma von NEB SHuffle ®-Stämmen exprimiert werden.

Im Bereich von E coli Expression ist das T7-System der beliebteste Ansatz zur Herstellung von Proteinen. In diesem System wird ein Expressionsvektor, der ein stromabwärts des T7-Promotors kloniertes Gen von Interesse enthält, in einen T7-Expressionswirt eingeführt. T7-Expressionswirte wie DE3-Stämme oder T7-Express-Stämme tragen eine chromosomale Kopie des Phagen-T7-RNA-Polymerase-Gens. Wenn der Induktor hinzugefügt wird, wird die T7-RNA-Polymerase exprimiert und wird der Transkription des interessierenden Gens gewidmet.

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  • NiCo21(DE3) übertrifft BL21(DE3) in Bezug auf die Reinheit des His-markierten Proteins
  • T7-kontrollierte Expression von Protein in E coli Gastgeber
  • Das Lemo System™ für die Membranproteinexpression
  • Bildung von Disulfidbrücken
  • NiCo21(DE3) Zweistufige Reinigung
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Feature-Artikel

Dieser Artikel bietet einen Überblick über die Fortschritte in der Proteinexpression und -reinigungsmethodik in den letzten 40 Jahren.

Die Bildung von Disulfidbindungen im Zytoplasma von Wildtyp-E. coli ist nicht günstig, während SHuffle Proteine ​​mit mehreren Disulfidbindungen im Zytoplasma korrekt falten kann.

Dieses Produkt ist durch ein oder mehrere Patente, Warenzeichen und/oder Urheberrechte geschützt, die sich im Besitz von New England Biolabs, Inc (NEB) befinden oder von ihr kontrolliert werden.

Während NEB seine Produkte für verschiedene Anwendungen entwickelt und validiert, kann die Verwendung dieses Produkts erfordern, dass der Käufer für bestimmte Anwendungen zusätzliche geistige Eigentumsrechte Dritter erwerben muss.

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Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt. Dieses Produkt ist nicht für therapeutische oder diagnostische Zwecke bei Mensch oder Tier bestimmt.

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Lösungen für die Expression schwieriger Proteine

NEB hat eine lange Geschichte in der rekombinanten Proteinexpression und hat eine breite Palette von Lösungen für schwer zu exprimierende Proteine ​​entwickelt.


Lyse und Reinigung von rekombinantem Protein

Traditionell wird die Proteinreinigung aus E coli umfasst vier Phasen: Ernte, Bakterienzelllyse, Lysatklärung und Proteinreinigung. Die bakterielle Lyse erfordert typischerweise mehrere zeitaufwendige Schritte, einschließlich Einfrier-/Auftauzyklen und Beschallung, die sich negativ auf die Proteinqualität auswirken und zur Probenvariabilität beitragen können. Um die Proteinaktivität und -integrität aufrechtzuerhalten, werden Lysepuffer auf Detergensbasis verwendet, um mechanische Proteinextraktionsverfahren zu vermeiden. Eine Zentrifugation ist traditionell erforderlich, um unerwünschte Zelltrümmer zu pelletieren und die Gewinnung von geklärtem Lysat zu ermöglichen.

Die Reinigung wird häufig unter Verwendung von Affinitätsmedien durchgeführt, die für exprimierte Epitop-Tags spezifisch sind. Typischerweise werden Medien auf Agarosebasis verwendet, entweder als Aufschlämmung in Mikrozentrifugenröhrchen oder in Säulen gepackt. Die Säulen sind zwar einfacher zu manipulieren, werden jedoch von der Lysatkonsistenz und der Verschleppung von Zelltrümmern beeinflusst, die zu Verstopfungen führen können.

Dieser Artikel wird ein neues Protokoll zur Rationalisierung des traditionellen Arbeitsablaufs zur Reinigung rekombinanter Proteine ​​durch die Kombination der enzymatischen Lyse- und Reinigungsschritte demonstrieren. Dieser Ansatz führt zu deutlich weniger praktischem Zeitaufwand und mehr als zwei Stunden Zeitersparnis gegenüber dem herkömmlichen Workflow (Abbildung 1).

Durch die Aufnahme von magnetischen Beads in das Protokoll entfällt die Notwendigkeit, Lysate durch Zentrifugation zu klären. Magnetische Kügelchen wurden dort eingesetzt, wo Agarosekügelchen verwendet wurden, wodurch die Verarbeitungszeit verkürzt und der Probendurchsatz erhöht wurde. Magnetische Beads werden im Allgemeinen im Batch-Modus verwendet und auf einem Magneten isoliert, um einen Pufferaustausch zu ermöglichen.

Magnetische Beads erleichtern die Automatisierung des Protokolls mit einem Partikelprozessor, was zu einem erhöhten Probendurchsatz führt und gleichzeitig die praktische Verarbeitungszeit auf weniger als 10 Minuten verkürzt. Um den Arbeitsablauf weiter zu verbessern, haben wir das BugBuster® Master Mix Reagenz (EMD Millipore) verwendet, das eine nichtmechanische Extraktion von löslichem Protein aus Bakterienzellen ermöglicht. Dieses Extraktionsreagenz kombiniert die Lyse auf Detergenzienbasis mit dem enzymatischen Wirkstoff Benzonase® Nuklease und dem Enzym rLysozym™ in einer gebrauchsfertigen Formulierung.


Abbildung 1. Die einstufige Lyse in Kombination mit der Aufreinigung (rechts) spart erheblich Zeit im Vergleich zur herkömmlichen rekombinanten Proteinaufreinigung, die separate Lyse-, Lysat-Klärungs- und Aufreinigungsschritte erfordert (links).

Materialen und Methoden

Histidine-tagged recombinant glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) was purified with PureProteome™ Nickel Magnetic Beads (EMD Millipore), using a traditional purification workflow (mechanical lysis) and the new condensed protocol (combined detergent-based lysis and purification). These magnetic beads capture histidine-tagged proteins they isolate recombinant proteins at high purity and can be used manually or on automated systems. We compared the manual processing results with those obtained using the KingFisher® automated particle processor (Thermo Scientific).

Traditional Protein Purification
E coli culture was pelleted into microcentrifuge tubes and the supernatant was discarded. Lysis/wash buffer containing lysozyme was added to each pellet. The pellet was resuspended and incubated with end-over-end mixing, followed by sonication using a microtip. The lysate was frozen, followed by quickly thawing the sonication/freeze-thaw cycle was repeated once more. To reduce viscosity, Benzonase endonuclease was added to the lysate and clarified by centrifugation.

The clarified lysate was added to PureProteome Nickel Magnetic Beads. The beads were incubated with E coli lysate with end-over-end mixing. After removal of the lysate, the beads were washed with lysis/wash buffer by vortexing, capturing the beads on the magnet and removing the buffer by pipette. The wash step was repeated two more times prior to eluting the captured histidine-tagged GAPDH. The beads were mixed, and an additional elution was performed to achieve maximum yield. Both elution fractions were combined into one microcentrifuge tube for future analysis.

One-Step Protein Purification
Manual Processing
E coli culture was pelleted into microcentrifuge tubes and the supernatant discarded. Suspended PureProteome Nickel Magnetic Bead slurry was added. Using the PureProteome Magnetic Stand, the preservative was removed, and the beads were washed with lysis/wash buffer. The beads were collected on the magnet, and the buffer was removed by pipette. The beads were resuspended in BugBuster Master Mix and the suspension was added to each E coli pellet. Each tube was briefly vortexed, then incubated with end-over-end mixing. The unbound fractions were discarded and beads were washed using the PureProteome Magnetic Stand to capture beads. Elution was performed as previously described.

Automated Processing
E coli culture was pelleted into a KingFisher Microtiter Deepwell 96 plate and the supernatant discarded. Reagents and samples were pipetted into the KingFisher Duo plates and the suspended PureProteome Nickel Magnetic Bead slurry was brought up to sufficient volume with wash buffer. Wash buffer was used for both equilibration and wash steps, and the elution buffer was pipetted into the elution strips. The protocol was executed and the plates were loaded into the KingFisher Duo System.

The PureProteome Nickel beads were equilibrated in wash buffer to remove preservatives. The beads were collected, and cell lysis and His-tagged protein capture was performed. The beads were then washed and recombinant protein was eluted. After the run ended, the eluted sample fractions were collected for further analysis.

Protein Analysis
Additional lysates were prepared using the traditional mechanical lysis approach as well as using the BugBuster Master Mix protocol no magnetic beads were added during the lysis step. The lysate was clarified by centrifugation, and total protein concentration was determined with the Direct Detect®
IR spectrometer (EMD Millipore).

A quantitative Bradford assay was also performed to assess the efficiency of lysis and protein purification.

Finally, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed. Purified samples were reduced, denatured and loaded onto NuPAGE® Bis-Tris gels (Life Technologies). Following electrophoresis, the gels were stained with Coomassie® blue to visualize protein bands.

The results demonstrated that the new protocol delivered more total protein in less time and with greater consistency than the traditional method. Traditional mechanical lysis of six samples took about two hours the average total protein collected was 3.54 mg/mL and the CV% was 15.55. In contrast, enzymatic lysis using the new protocol took about 30 minutes the average total protein collected was 4.09 mg/mL and the CV% was 2.05.

The eluted fractions were then tested for protein yield using a Bradford assay. All workflows demonstrated roughly equivalent yields of purified protein. However, the traditional method exhibited greater inter-sample variability than did either condensed protocol. Workflow automation offered the highest degree of reproducibility (Tisch).

Finally, the SDS-PAGE gel showed all workflows provided similar sample purity (Figur 2). As previously noted, greater sample-to-sample variability was observed for the traditional workflow.


Yield of His-tagged GAPDH using the traditional and condensed E coli lysis and purification protocol as determined by Bradford assay.

For extraction of recombinant protein from E coli, traditional mechanical lysis is a time-consuming manual process. Mechanical lysis and manual processing can also result in variable yield due to sample-to-sample variations in the sonication step. By combining gentle nonmechanical lysis with magnetic affinity capture beads for His-tagged protein purification, the traditional recombinant protein purification workflow has been condensed.

Even when samples were manually processed, a one-step lysis and purification protocol reduced processing time by 75% without sacrificing yield or purity. Due to reduced sample manipulation, the simplified protocol also provides greater sample-to-sample consistency. Moreover, by eliminating centrifugation requirements, the condensed workflow can be automated using particle processors to further reduce sample variability and increase throughput while reducing hands-on time to less than 10 minutes.


Figure 2. SDS-PAGE analysis of His-tagged GAPDH purified using the traditional and condensed recombinant protein purification workflows. The condensed protocol was performed manually as well as on the KingFisher Duo System. (Molecular weight standards are included in the rightmost lane.)


E coli

NEB offers two protein expression systems in E coli. The pMAL&trade Protein Fusion & Purification System (NEB #E8200) is used to express an MBP-fusion protein which is then purified by affinity purification. This system enhances solubility and results in reliable E coli expression in either the cytoplasm or periplasm.

The IMPACT&trade Kit (NEB #E6901) allows fusion of a tag consisting of the intein and the chitin binding domain (CBD), to either the C-terminus (pTXB1) or the N-terminus (pTYB21) of the target protein. In the presence of thiols, such as DTT, the intein undergoes specific self-cleavage which releases the target protein from the chitin-bound intein tag resulting in purification in a single chromatographic step with no need for proteases.

pMAL&trade and IMPACT&trade are trademarks of New England Biolabs, Inc.

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  • Schematic Illustration of the IMPACT™ System
  • Expression and Purification of E coli Maltose-Binding Protein (MBP) Using the pTXB1 Vector (pMXB10)
  • T7-Controlled Expression of a Non-Toxic Protein in E coli Hosts
  • Western Analysis of 6-His-tagged Brugia malayi Protein
  • Overnight Expression of a Membrane Protein - PhoA fusion
  • Disulfide Bond Formation
  • PfCHT1 Chitinase Activity Assayed from Crude Lysates
  • Improved Purity of His-tagged Proteins with NiCo21(DE3)
  • NiCo21 (DE3) Two-Step Purification
  • Optimization of YidC-GFP Expression with Lemo21(DE3)
  • Lemo21(BE3) vs. BL2(DE3)
  • Rechtsinformation

Feature-Artikel

Read how to avoid common obstacles in protein expression that prevent interactions with cellular machinery.

Cell-free protein synthesis has the potential to become one of the most important high throughput technologies for functional genomics and proteomics.

Broschüren

Auswahlwerkzeuge

Lane 1: uninduced cell extract.
Lane 2: induced cell extract showing expressed fusion protein.
Lane 3: MBP fractions eluted after inducing cleavage overnight at 4°C.
Lane 4: MBP ligated to a peptide containing an N-terminal cysteine. Marker M is the Protein Ladder (NEB #P7703).

Protein expression with Lemo21(DE3) is very similar to BL21(DE3), with only a few minor changes.

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Beispiel 4

Improvement in the Expression Level and Cellular In Vivo Folding of the Recombinant HSA with the Assistance of Molecular Chaperone System

Recombinant E coli origami DE3 cells co-transformed with both the plasmids (pETHSA and pTF16) were inoculated in the primary culture of 5 mL LB medium containing both the antibiotics-ampicillin (100-300 μg/mL) and chloramphenicol (20-40 μg/mL). They were then inoculated from primary culture into a secondary culture in ZY autoinduction growth medium containing both ampicillin (100-300 μg/mL) and chloramphenicol (20-40 μg/mL) antibiotics. The secondary culture was grown at a temperature between 30-40° C. and the samples were collected and checked for optical density at regular time intervals. The growth of the cells was monitored and the cells were induced with L-Arabinose (Final conc. 0.3-0.6 mg/mL) when the OD600 reached 0.2 to 0.5 (which took between 6-12 hours) and left to grow again until the OD600 reached 0.6-1.0.

Δt this point, the incubation temperature of the recombinant host cell culture was lowered to a temperature in the range of 10-20° C. and cells were harvested after 8-12 hours of induction.

In order to obtain the expressed protein, the cells were resuspended in the lysis buffer containing the osmolyte trehalose in the concentration range of 0.5-1.0M. Cell lysate was obtained after the lysis step using conventional means. To summarize the steps above briefly, induced E coli Origami2 (DE3) cells expressing both the Trigger factor (chaperone) and rHSA were harvested and pelleted down by centrifugation. The cell pellet obtained was resuspended in cell lysis buffer and incubated for 15-30 minutes. The resuspended cells in lysis buffer were then exposed to an ultrasonic cell disruptor to release the intracellular components in the lysis buffer. The sonicated cell lysate was fractionated by high speed centrifugation. The supernatant containing soluble fraction of rHSA was carefully aspirated without disturbing the pellet which contained the insoluble aggregated fraction of rHSA. Cells were then fractionated and analyzed for solubility and activity assay and was compared with the rHSA production in E coli without Trigger factor expression (chaperone assistance).

Overall, the present disclosure provides a process for obtaining soluble and functional rHSA protein, in the presence of the molecular chaperone Trigger Factor. The process results in 1.5-2.0 fold increase in expression level of rHSA protein as compared to protein levels obtained without the presence of the molecular chaperone. Further, it is observed that though the soluble fraction of the rHSA expressed in the E coli remains same in both the conditions (with or without chaperone assistance) i.e. 60%, there exists marked difference in the activity of the soluble fraction's functional content (FIG. 5). As has been demonstrated, the present process leads to 20-30% increase in functionally active soluble rHSA protein in the soluble fraction of rHSA when co-expressed along with the molecular chaperones as compared to when expressed alone in the E coli host system (Recently filed patent application, IP no. 201611027096).

The enhancement in the activity is credited to the employment of trigger factor system for rHSA production as Trigger factor (molecular chaperone) acts to prevent misfolding and aggregation reaction by transiently shielding the hydrophobic regions exposed in non-native polypeptides during and after translation. (Agashe et al., Cell (2009) 117:199-209).

Although the subject matter has been described with reference to specific embodiments, this description is not meant to be construed in a limiting sense. Various modifications of the disclosed embodiments, as well as alternate embodiments of the subject matter, will become apparent to persons skilled in the art upon reference to the description of the subject matter. It is therefore contemplated that such modifications can be made without departing from the spirit or scope of the present subject matter as defined.


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