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Einfluss des pH-Werts auf Proteinlöslichkeit und Denaturierung

Einfluss des pH-Werts auf Proteinlöslichkeit und Denaturierung


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Ich bin etwas verwirrt über den Einfluss des pH-Werts auf Proteine.
Das Erhöhen oder Senken des pH-Wertes verleiht dem Protein eine positive bzw. negative Nettoladung. Ein niedrigerer pH-Wert oder ein höherer pH-Wert führt jedoch dazu, dass das Protein denaturiert --> mehr hydrophobe Aminosäuren werden frei, um zwischen verschiedenen Proteinen zu interagieren --> weniger Löslichkeit.
lass uns meine frage klären
schau dir die folgende abbildung an:


diese Zahl zeigt an, dass ein niedrigerer oder höherer pH als der Pi die Proteinlöslichkeit erhöht.
In der Einführung zu diesem Artikel werden jedoch beispielsweise Papiere zitiert, die die folgende Aussage unterstützen:

pH-Änderungen lösen nachweislich die Bildung von Amyloidfasern und Aggregation aus

die figur und der artikel sind meiner meinung nach inkonsistent, daher fehlt mir definitiv etwas. Die erste Zahl zeigt an, dass die Proteinlöslichkeit zunimmt, wenn der pH-Wert höher wird (dann der pI). Die Artikelaussage weist jedoch darauf hin, dass eine Erhöhung des pH-Werts dazu führt, dass die Proteine ​​aggregieren, was die Löslichkeit verringert, richtig?


Auswirkungen von pH- und Wärmebehandlungen auf die Struktur und Löslichkeit von Kartoffelproteinen in verschiedenen Zubereitungen

Die löslichen Kartoffelproteine ​​bestehen hauptsächlich aus Patatin und Protease-Inhibitoren. Mittels DSC- und sowohl Fern-UV- als auch Nah-UV-CD-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass sich Kartoffelproteine ​​zwischen 55 und 75 °C entfalten. Eine Erhöhung der Ionenstärke von 15 auf 200 mM führte im Allgemeinen zu einer Erhöhung der Denaturierungstemperatur. Daraus wurde geschlossen, dass sich entweder das dimere Protein Patatin in seinem monomeren Zustand entfaltet oder seine Monomere lose assoziiert sind und sich unabhängig entfalten. Die thermische Entfaltung der Protease-Inhibitoren war mit einer Abnahme der Protease-Inhibitor-Aktivitäten korreliert und führte zu einem von der Ionenstärke abhängigen Verlust der Proteinlöslichkeit. Kartoffelproteine ​​waren bei neutralen und stark sauren pH-Werten löslich. Die Tertiärstruktur von Patatin wurde durch Fällung bei pH 5 irreversibel verändert. Bei leicht saurem pH war die Gesamtlöslichkeit des Kartoffelproteins von der Ionenstärke und der Anwesenheit von ungefaltetem Patatin abhängig.


Abstrakt

Dieser Artikel behandelt den Beitrag der freien Energie ionisierbarer Gruppen zur Proteinstabilität. Es wird eine Methode zur Berechnung der pH-Abhängigkeit der freien Denaturierungsenergie eines Proteins vorgestellt, die Ergebnisse liefert, die direkt mit dem Experiment verglichen werden können. Der erste Behandlungsschritt ist die Bestimmung der durchschnittlichen Ladungen aller ionisierbaren Gruppen sowohl im gefalteten als auch im ungefalteten Protein. Ein Ausdruck von Tanford bezieht dann die pH-Abhängigkeit der sich entfaltenden freien Energie auf die Differenz der Nettoladung zwischen den beiden Zuständen. Um absolute statt relative freie Entfaltungsenergien zu bestimmen, ist es notwendig, den Gesamtbeitrag ionisierbarer Gruppen zur Proteinstabilität bei einem bestimmten Referenz-pH zu berechnen. Dies wird durch eine statistische mechanische Behandlung erreicht, ähnlich derjenigen, die zuvor bei der Berechnung von p . verwendet wurdeKwie. Die Behandlung selbst ist streng, leidet jedoch unter Unsicherheiten in der pKa Berechnungen. Dennoch wird die Gesamtform der experimentell beobachteten Diagramme der freien Denaturierungsenergie als Funktion des pH-Werts durch die Berechnungen einigermaßen gut reproduziert.

Eine Reihe allgemeiner Schlussfolgerungen, die sich aus der Analyse ergeben, sind (1) Kenntnis von Titrationskurven und/oder effektivem pKEin Wert von ionisierbaren Gruppen in Proteinen ist ausreichend, um die pH-Abhängigkeit der freien Denaturierungsenergie in Bezug auf einen Referenz-pH-Wert zu berechnen. Um jedoch den absoluten Beitrag ionisierbarer Gruppen zur Proteinstabilität zu berechnen, muss auch der intrinsische pKa jeder Gruppe. Dies ist definiert als pKa einer Gruppe in einem hypothetischen Zustand des Proteins, in dem alle anderen Gruppen neutral sind. (2) Aufgrund von Desolvatisierungseffekten destabilisieren ionisierbare Gruppen Proteine, obwohl die Wirkung stark vom pH-Wert abhängt. Es gibt jedoch stark stabilisierende paarweise Coulombic auf der Oberfläche von Proteinen. (3) Diagramme der Stabilität gegen den pH-Wert sollten nicht im Hinblick auf eine Gruppe interpretiert werden, deren pKa entspricht dem Titrations-Mittelpunkt, sondern einer Gruppe mit unterschiedlichem pKas (das entspricht ungefähr den Titrationsendpunkten) in jedem Zustand. (4) Jegliche Reststruktur im GuHCl-denaturierten Zustand von Proteinen scheint eine geringe Wirkung auf die pH-Abhängigkeit der Stabilität zu haben. (5) Die pH-abhängige Entfaltung, zum Beispiel zum Zustand "geschmolzene Kügelchen", tritt aufgrund einzelner Gruppen mit anomalem p . aufKals deren Positionen auf der Proteinoberfläche die Natur des entfalteten Zustands bestimmen können.


Arten der Denaturierung

Denaturierung kann basierend auf dem Agens klassifiziert werden, das bewirkt, dass ein Protein seine Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur verliert. Wasserstoffbrücken, ionische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte sind daran beteiligt, diese Strukturen zusammenzuhalten. Solche nicht-kovalenten Wechselwirkungen werden durch eine Reihe von Faktoren gestört, einschließlich Hitze, Strahlung, organische Lösungsmittel, Säuren, Basen und Salze, da sie hydrophobe Wechselwirkungen im Inneren des Proteins verändern, Wasserstoffbrückenbindungen beeinflussen und ionische Wechselwirkungen stören können.

Typ I: Denaturierung durch pH-Änderung

Der pH-Wert einer Lösung hat einen wichtigen Einfluss auf die Proteinstruktur, da er die Anzahl und Art der Wasserstoffbrückenbindungen und ionischen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Aminosäuren verändert. Bei physiologischem pH werden viele Aminosäureseitenketten aufgrund des Verlustes oder der Zunahme eines Wasserstoffions geladen.

Tatsächlich existieren die meisten Aminosäuren als Zwitterion in Zellen.

Zwei Isomere von Alanin, bei denen die Carbonsäuregruppe ein Wasserstoffatom verliert und eine negative Ladung erhält und die Amingruppe ein Proton erhält, um positiv zu werden. Die Nettoladung des Moleküls bleibt null. Neben diesen beiden Ladungen an jeder Aminosäure kann die Seitenkette auch polar oder geladen sein.

Asparaginsäure, Glutaminsäure, Arginin, Histidin und Lysin sind Beispiele für Aminosäuren, die unter physiologischen Bedingungen einen Aufpreis enthalten. Die Ladung dieser Aminosäuren hängt jedoch vom pH-Wert ab. Histidin ist beispielsweise in einer Zelle normalerweise positiv geladen. Es kann jedoch je nach pH-Wert der Lösung in vier verschiedenen Formen auftreten. Aus diesem Grund kann es entweder eine Nettogebühr von -1, 0, +1 oder +2 haben. Dies impliziert, dass der pH-Wert die Art und Anzahl der ionischen Bindungen bestimmt, die ein Histidinrest mit anderen Aminosäuren bilden kann.

Wenn ein Wasserstoffatom kovalent an ein stark elektronegatives Atom wie Sauerstoff oder Stickstoff gebunden ist, erhält es eine positive Teilladung. Aufgrund der geringen Größe des Wasserstoffatoms reicht diese Teilladung aus, um eine hohe Ladungsdichte zu erzeugen, die einen starken Zug auf ein einsames Elektronenpaar auf ein anderes Atom ausüben kann.

Diese Anziehung bildet die Grundlage einer Wasserstoffbrücke. Es reagiert empfindlich auf pH-Änderungen, da eine Änderung der Wasserstoffionenkonzentration die Natur der funktionellen Gruppen verändern kann. Beispielsweise enthalten Aminosäuren wie Asparagin, Cystein oder Tyrosin polare Gruppen in ihren Seitenketten. Diese Atome können aufgrund ihrer räumlichen Nähe und der Orientierung verschiedener Seitenketten über Wasserstoffbrücken miteinander wechselwirken.

Wenn sich der pH-Wert ändert, können diese polaren Gruppen jedoch protoniert oder deprotoniert werden, was ihre Fähigkeit zur Bildung von Wasserstoffbrücken ändert. Darüber hinaus beinhaltet die Bildung einer Alpha-Helix oder eines Beta-Faltblatts die Bildung von Wasserstoffbrücken zwischen den Carboxylat- und Amingruppen jeder Aminosäure. Werden viele solcher Interaktionen unterbrochen, entfaltet sich das Protein und wird denaturiert.

Schließlich beeinflusst der pH-Wert die Gesamtladung eines Polypeptids und dies hat einen Einfluss auf die Proteinlöslichkeit. Wenn die Nettoladung eines Proteins null wird, kann es aggregieren und ausfallen.

Typ II: Chemische Denaturierung

Bestimmte Chemikalien und organische Lösungsmittel können eine Proteindenaturierung verursachen. Organische Lösungsmittel stören die Proteinstruktur, weil die meisten Proteine ​​ihre hydrophoben Reste in Richtung des Zentrums des Moleküls sequestrieren, wenn sie sich in ihre einzigartige Form falten.

Im Wesentlichen optimiert die 3-D-Struktur eines Polypeptids die Energie des Moleküls, indem sie die Wechselwirkung hydrophober Seitenketten mit einem wässrigen Medium verringert. Die Anwesenheit von Chemikalien wie Benzol oder Ethanol verändert diese Wechselwirkungen und kann gelegentlich dazu führen, dass das Protein „umkippt“, wobei die inneren Reste mit Verlust von Struktur und Funktion nach außen präsentiert werden.

Auch Waschmittel und andere amphipathische Moleküle können besonders schädlich sein. Diese Moleküle haben den gleichen Effekt, indem sie hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen stören. Die bei der Proteinextraktion im Labor auftretende Schaumbildung sowie der bei Haushaltswaschmitteln auftretende Schaum sind zum Teil auf ihre denaturierende Wirkung auf Proteine ​​zurückzuführen. Schwermetalle und hohe Salzkonzentrationen können die Bildung von ionischen Bindungen beeinträchtigen, während chaotrope Stoffe wie Harnstoff das Wasserstoffbrückennetzwerk stark stören können.

Typ III: Denaturierung durch Hitze und Strahlung

Wenn die Temperatur einer biologischen Probe erhöht wird, führt dies insgesamt zu einer Erhöhung der kinetischen Energie jedes Atoms und einer Erhöhung der Entropie des Systems. Alle Atome und Moleküle beginnen, Kollisionen mit höherer Energie miteinander zu haben, sowie eine erhöhte Translations-, Rotations- und Vibrationsbewegung.

Dies verringert die Stärke von Wasserstoffbrückenbindungen und schwächt den Einfluss unpolarer hydrophober Wechselwirkungen. Dies ist einer der Gründe, warum der Körper hohes Fieber verwendet, um Infektionen zu bekämpfen. Es ist ein Versuch, das Wachstum von Mikroorganismen zu verlangsamen oder zu stoppen, damit das Immunsystem die Krankheitserreger beseitigen kann.

Ein anhaltend hohes Fieber kann jedoch auch für die Proteine ​​​​im Wirt schädlich sein, weshalb Temperaturen über 40 °C als gefährlich gelten. Eine längere Exposition gegenüber Sonnenstrahlung führt auch zu einem Verlust der Proteinstruktur. Sonnenbrände und Katarakte im Auge sind nur zwei Beispiele für seine schädlichen Auswirkungen. Strahlung aus anderen Quellen (wie einem Röntgengerät oder von radioaktiven Materialien) kann auch Proteine ​​​​schädigen und zu einer Reihe von Beschwerden führen.


Physikalische Eigenschaften von Proteinen

  1. Farbe und Geschmack
    Proteine ​​sind farblos und in der Regel geschmacklos. Diese sind homogen und kristallin.
  2. Form und Größe
    Die Form der Proteine ​​reicht von einfachen kristalloiden kugelförmigen Strukturen bis hin zu langen fibrillären Strukturen. Zwei unterschiedliche Formmuster
    wurden erkannt:
    A. Kugelförmige Proteine- Diese sind kugelförmig und kommen hauptsächlich in Pflanzen vor, insbesondere in Samen und in Blattzellen. Dies sind Bündel, die durch Faltung und Zerknitterung von Proteinketten gebildet werden. B. Pepsin, Edestin, Insulin, Ribonuklease usw.
    B. Fibrillenproteine- Diese sind fadenförmig oder ellipsoidförmig und kommen im Allgemeinen in tierischen Muskeln vor. Die meisten Studien zur Proteinstruktur wurden unter Verwendung dieser Proteine ​​durchgeführt. B. Fibrinogen, Myosin usw.
  3. Molekulargewicht
    Die Proteine ​​haben im Allgemeinen große Molekulargewichte im Bereich zwischen 5 × 103 und 1 × 106. Es ist anzumerken, dass die Molekulargewichtswerte vieler Proteine ​​nahe bei oder Vielfaches von 35.000 und 70.000 liegen.
  4. Kolloidale Natur
    Aufgrund ihrer riesigen Größe weisen die Proteine ​​viele kolloidale Eigenschaften auf, wie z. B. Ihre Diffusionsgeschwindigkeit ist extrem langsam und sie können in Lösung eine beträchtliche Lichtstreuung erzeugen, was zu einer sichtbaren Trübung (Tyndall-Effekt) führt.
  5. Denaturierung
    Denaturierung bezeichnet die Veränderung der Eigenschaften eines Proteins. Mit anderen Worten, es ist der Verlust der biologischen Aktivität. In vielen Fällen folgt auf den Denaturierungsprozess eine Koagulation – ein Prozess, bei dem denaturierte Proteinmoleküle dazu neigen, große Aggregate zu bilden und aus der Lösung auszufällen.
  6. Amphotere Natur
    Die Proteine ​​sind wie Aminosäuren amphoter, d. h. sie wirken sowohl als Säuren als auch als Alkalien. Diese wandern in einem elektrischen Feld und die Richtung der Wanderung hängt von der Nettoladung des Moleküls ab. Die Nettoladung wird vom pH-Wert beeinflusst. Jedes Protein hat einen festen Wert des isoelektrischen Punktes (pl), bei dem es sich in einem elektrischen Feld bewegt.
  7. Ionenbindungskapazität
    Die Proteine ​​können aufgrund ihrer Nettoladung sowohl mit Kationen als auch mit Anionen Salze bilden.
  8. Löslichkeit
    Die Löslichkeit von Proteinen wird durch den pH-Wert beeinflusst. Die Löslichkeit ist am isoelektrischen Punkt am niedrigsten und nimmt mit zunehmender Säure oder Alkalinität zu. Dies liegt daran, dass, wenn die Proteinmoleküle entweder als Kationen oder als Anionen vorliegen, die Abstoßungskräfte zwischen den Ionen hoch sind, da alle Moleküle Überschussladungen des gleichen Vorzeichens besitzen. Somit sind sie besser löslich als im isoelektrischen Zustand.
  9. Optische Aktivität
    Alle Proteinlösungen drehen die Ebene des polarisierten Lichts nach links, d. h. diese sind linksdrehend.

Chemische Eigenschaften von Proteinen

  1. Hydrolyse
    Proteine ​​werden durch eine Vielzahl von Hydrolysemitteln hydrolysiert.
    A. Durch saure Mittel: Proteine, bei Hydrolyse mit konz. HCl (6–12N) bei 100–110°C für 6 bis 20 Stunden ergeben Aminosäuren in Form ihrer Hydrochloride.
    B. Durch alkalische Mittel: Proteine ​​können auch mit 2 N NaOH hydrolysiert werden.
  2. Reaktionen mit Beteiligung der COOH-Gruppe
    A. Reaktion mit Alkalien (Salzbildung)
    B. Reaktion mit Alkoholen (Veresterung)
    C. Reaktion mit Aminen
  3. Reaktionen mit Beteiligung der NH2-Gruppe
    A. Reaktion mit Mineralsäuren (Salzbildung): Wenn entweder freie Aminosäuren oder Proteine ​​mit Mineralsäuren wie HCl behandelt werden, werden die Säuresalze gebildet.
    B. Reaktion mit Formaldehyd: Mit Formaldehyd werden die Hydroxy-Methyl-Derivate gebildet.
    C. Reaktion mit Benzaldehyd: Schiffsche ‘sche Basen werden gebildet
    D. Reaktion mit salpetriger Säure (Van-Slyke-Reaktion): Die Aminosäuren reagieren mit HNO2, um N2-Gas freizusetzen und die entsprechenden α-Hydroxysäuren zu erzeugen.
    E. Reaktion mit Acylierungsmitteln (Acylierung)
    F. Reaktion mit FDNB- oder Sanger’s-Reagenz
    G. Reaktion mit Dansylchlorid
  4. Reaktionen, an denen sowohl COOH- als auch NH2-Gruppen beteiligt sind
    A. Reaktion mit Triketohydrindenhydrat (Ninhydrin-Reaktion)
    B. Reaktion mit Phenylisocyanat: Mit Phenylisocyanat entsteht Hydantoesäure, die wiederum in Hydantoin umgewandelt werden kann.
    C. Reaktion mit Phenylisothiocyanat oder Edman-Reagenz
    D. Reaktion mit Phosgen: Mit Phosgen entsteht N-Carboxyanhydrid
    E. Reaktion mit Schwefelkohlenstoff: Mit Schwefelkohlenstoff entsteht 2-Thio-5-thiozolidon
  5. Reaktionen mit Beteiligung der R-Gruppe oder Seitenkette
    A. Biuret-Test
    B. Xanthoproteic-Test
    C. Millon’s Test
    D. Folins Test
    E. Sakaguchi-Test
    F. Pauly-Test
    G. Ehrlich-Test
  6. Reaktionen mit Beteiligung der SH-Gruppe
    A. Nitroprussid-Test: Mit Natriumnitroprussid in verdünnter NH4.OH entwickelt sich eine rote Farbe. Der Test ist spezifisch für Cystein.
    B. Sullivan-Test: Cystein entwickelt eine rote Farbe in Gegenwart von Natrium-1,2-Naphthochinon-4-sulfonat und Natriumhydrosulfit.

Kleiner Rückblick Wichtige Faktoren, die die Proteinkristallisation beeinflussen

Die Lösung des Kristallisationsproblems wurde vor etwa zwanzig Jahren mit der Einführung von Kristallisations-Screening-Methoden eingeführt. Hier wurden einige der Faktoren beschrieben, die die Proteinkristallisation, Löslichkeit, Konzentration des Fällungsmittels, Konzentration des Makromoleküls, Ionenstärke, pH, Temperatur und Organismenquelle der Makromoleküle, reduzierende oder oxidierende Umgebung, Additive, Liganden, Anwesenheit von Substraten, Inhibitoren, Coenzymen beeinflussen , Metallionen und Gleichgewichtsgeschwindigkeit. Das Ziel dieser Arbeit ist es, sehr hilfreiche Ratschläge für die Kristallisation zu geben.

Einführung

Röntgenkristallographie hat 3D-Strukturen von Tausenden von Proteinen geliefert. Trotz dieser Fortschritte sind viele Faktoren weiterhin ein Problem, die zu einer erfolglosen Proteinkristallisation führen können. Wir kennen immer den theoretischen pI, das Molekulargewicht und die Aminosäurezusammensetzung, während pH und Salzkonzentration einige der Variablen sind, die von anderen ähnlichen bekannten Strukturen erwartet werden können. Das Verhalten eines Proteins hängt jedoch stark von der Umgebung ab, in der es sich befindet.

Proteine ​​liegen in einer biologischen Probe im Allgemeinen in ihrem nativen Zustand vor. Sie sind sehr oft mit anderen Proteinen assoziiert und in große Komplexe integriert. In den meisten Fällen sind sie nach der Isolierung in ihrem angeborenen Zustand nicht löslich, da sie denaturiert werden müssen, um die Solubilisierung und Kristallisation zu unterstützen. Anfängliche Proteinkristalle müssen im Allgemeinen Bedingungen unter möglichst wenig Verwendung durchmustern, um die Optimierungsverfahren für die Proteinkristallisation zu verbessern.

Kristallisation ist ein thermodynamischer Prozess. Nach dem Start wird unter kinetischer Kontrolle fortgesetzt, bis die Übersättigung verloren geht. Der Kristallisationsprozess wird von den physikalischen Bedingungen der Lösung, der Löslichkeit der Lösung, dem Vorhandensein von Verunreinigungen, der Keimbildung, der Sättigung der Lösung und dem Grad der Übersättigung, dem Kristallwachstum, einschließlich der Zusammensetzung der Lösung, dem pH-Wert und der Temperatur, beeinflusst und ist bis heute nicht vollständig verstanden.

Die Vorhersage von Sekundärstruktur, Löslichkeit, Domänenorganisation, Stabilität, Signalpeptid, Hydrophobie und pH kann nützliche Informationen für Kristallisationsstrategien und Salzvorhersagewerkzeuge liefern, die entwickelt werden müssen. im Allgemeinen haben Proteine ​​ein niedriges Molekulargewicht, das leichter zu kristallisieren ist als ein hohes Molekulargewicht, eine Einzeldomäne, die leichter zu kristallisieren ist als eine Multidomäne, und ein Multimer im oligomeren Zustand kristallisiert eher als ein Monomer mit hohem Molekulargewicht.

Puffer ist der einfachste Weg, um ein Kristallisationsproblem durch das Proteinverhalten zu verursachen. Es gibt viele Regeln und verschiedene Proteinkristallisationsmethoden, von denen einige in den letzten Jahren entwickelt wurden. Allerdings stellt die Proteinkristallisation immer noch eine große Herausforderung für die Biokristallographie dar. Die Kumulation von Kristallisationsinformationen in Kristallisationsdatenbanken und in Strukturartikeln ermöglicht es uns, Kristallisationsexperimente in Abhängigkeit vom Charakter des Proteins zu entwerfen. Da es für die Kristallisation kein ideales Verfahren gibt, geht unser Artikel auf das Kristallisationsproblem ein, um die Zusammensetzung der Kristallisation zu vereinfachen und einige Lösungsvorschläge zu geben.

Proteinlöslichkeit

Proteinlöslichkeit ist ein häufiges komplexes Interaktionsproblem zwischen der physiochemischen Natur der Proteine, der Geschwindigkeit der Proteinsynthese, der Aminosäurezusammensetzung, der Proteinkonzentration, der Art des im Puffer vorhandenen Salzes, der Konzentration des verwendeten Salzes, Ionenstärke, pH, Temperatur , osmotischer Druck, zellulärer Ort der Expression und zelluläre Werkzeuge oder Chaperone sind alle für die Proteinlöslichkeit wichtig. Die Proteinlöslichkeit kann in Gegenwart von Komplexen mit Lipiden, Nukleinsäuren oder anderen Nichtproteinen abnehmen.

Es ist wichtig, eine bessere Option für die Markierung in den Zielproteinen auszuwählen. Leider gibt es kein konsolidiertes System für ein schnelles Screening, um das beste Tag zu unterscheiden.

Die Zugabe von L-Arg und L-Glu bei 50 mM zum Puffer kann die Löslichkeit um das 8,7-fache erhöhen, da sie die Proteinaggregation und -präzipitation verhindern sowie die Langzeitstabilität erhöhen können, auch spezifische Proteinproteine ​​​​und Protein-RNA-Wechselwirkungen [1].

Normalerweise, wenn es Probleme mit der Löslichkeit gibt, müssen wir zuerst die Pufferzusammensetzung, den unterschiedlichen pH-Wert und die Salzstärke überprüfen. Dies kann einen großen Unterschied für die Löslichkeit machen. Dann versuchen Sie es mit Lösungsvermittlern, z. B. NDSBs oder Detergenzien. Die Proteinlöslichkeit kann verbessert werden, indem nur eine lösliche Domäne zur Expression ausgewählt wird und die hydrophobe Domäne entfernt wird. Darüber hinaus gibt es im Internet Tools zur Vorhersage der Löslichkeit, die nützlich sein können.

Um sicherzustellen, dass das Zielprotein löslich ist, muss die Kultur lysiert werden (Lysozim 1 mg/ml auf Eis 1 Stunde, sollte nicht denaturiert werden) und bei 35000 x g zentrifugiert werden. dann verwenden Sie ein Aliquot des Überstands für SDS-PAGE. Im Falle von Protein ist gut löslich im Überstand gefunden.

Reinigungsmittel

Reinigungsmittel werden üblicherweise in Konzentrationen von 1 bis 4 % verwendet. Es ist nützlich bei der Solubilisierung, indem es hydrophobe Wechselwirkungen zwischen und innerhalb von Proteinen stört. Das zur Solubilisierung verwendete Detergens muss für die Reinigung und Kristallisation nicht dasselbe sein, auch die Anwesenheit verschiedener Detergenzien hemmt möglicherweise die Aktivität verschiedener Proteasen. Wenn es trotz aller Bemühungen nicht funktioniert, muss das Zielprotein denaturiert und löslich gemacht werden. Dies geschieht durch ein Denaturierungsmittel, z.B. Guanidin oder Harnstoff unter reduzierenden Bedingungen (

20 mM DVB-T). Ein für den Überstand notwendiger Western-Blot vor und nach der Hochgeschwindigkeitszentrifugation gibt einen Hinweis darauf, wie viel Detergens im Überstand (Membran) wirksam war.

Reduktionsmittel

Reduktionsmittel werden im Allgemeinen bei der Probenvorbereitung verwendet, um Disulfidbindungen zu spalten DTT, DTE und β-ME sind häufiger verwendete Reduktionsmittel. Das Ziel der Verwendung dieser Mittel ist, Proteine ​​vor Ausfällung und Aggregation durch oxidative Vernetzung zu schützen und Proteinaggregation zu reduzieren, die die Kristallisation hemmen kann. Reduktionsmittel können mit Metallen in der Proteinprobe interagieren, was in diesem Fall für die Kristallisation nicht gut ist. BME ist besonders empfindlich gegenüber Kobalt, Kupfer und vielen Phosphatpuffern, während DTT gegenüber Nickel empfindlich ist. Aber bis jetzt zeigt kein spezifischer Artikel einen Unterschied zwischen DTT, DTE und β-ME sowie, in welchem ​​Kristallisationsschritt besser zu verwenden ist.

Isoelektrischer Punkt (pI), pH & Temperatur

Der pH-Einfluss auf die Proteinlöslichkeit, verschiedene Proteine ​​sind bei verschiedenen pH-Werten löslich, bei hohem pH proteinlöslich (deprotoniert), bei niedrigem pH proteinlöslich (protoniert) und am isoelektrischen Punkt: Proteinaggregate. Saure Proteine ​​haben einen pI von weniger als 7, kristallisieren eher um eine pH-Einheit über ihrem pI, während basische Proteine ​​eher niedriger als ihr pI um 1,5–3 pH-Einheiten kristallisieren [2]. Im Allgemeinen Proteinaggregation oder Präzipitation, wenn die Löslichkeit bei pH nahe dem isoelektrischen Punkt (pI) abnimmt. Es ist besser, den pH-Wert vom pI wegzubewegen, um die Proteinlöslichkeit und Supersättigung zu erhöhen. Bei niedriger Salzkonzentration nehmen die elektrostatischen Abstoßungen gut ab, wenn der pH-Wert vom pI abweicht, was sehr wahrscheinlich dazu führt, dass PEG eine Verarmungsanziehung bewirkt. Die Verarmungsanziehung aufgrund des Polymers ist wirksamer, wenn die Nettoladung des Proteins niedriger ist.

Um die Anziehungskraft zwischen Makromolekülen und Proteinladungen zu screenen, ist es besser, die Ionenstärke zu erhöhen oder den pH-Wert sanft näher an den pI heranzuführen. Das Wichtigste ist, dass wir sicherstellen müssen, dass das Protein eine Nettoladung nahe Null hat und löslich ist, und dies hängt von einigen Papierratschlägen ab.

Tatsächlich ist die Temperatur ein wichtiger Parameter für die Kristallisation, sie sollte besser gescreent werden. Die Temperatur beeinflusst das Kristallwachstum und die Keimbildung, indem sie die Übersättigung sowie die Löslichkeit der Probe ändert. Zum Beispiel ist der pH-Wert von Tris-Puffer anfällig für Temperaturänderungen. Die Temperatur kann jedoch bei niedrigen Ionenstärken durch die verstärkten Effekte nützlich sein. Proteine ​​zeigen sehr oft mehrere Kristallpolymorphe infolge unterschiedlicher Temperatur. Durch das Absenken der wachstumsinduzierenden Temperatur wird die Proteinsyntheserate verringert und normalerweise wird mehr lösliches Protein erhalten. Da die Temperatur die Löslichkeit beeinflussen kann, ist es besser, die Kristalllösungen zu kühlen, um den Proteinabbau zu verhindern.

Optimale Salzkonzentration

Zur Kristallisation wurden unterschiedliche NaCl-Konzentrationen mit unterschiedlichen pH-Werten verwendet. Die Wirksamkeit der Salzkonzentration in einer Kristallisationslösung kann vor der Durchführung des Experiments vorhergesagt werden, da sie vom Puffer-pH und dem pI des Proteins abhängt. Für eine erfolgreiche Kristallisation ist es wichtig, die Salzkonzentrationen in der Proteinlösung weder zu niedrig noch zu hoch zu halten, hohe Salzkonzentrationen können den Proteinpuffer stabilisieren oder die Proteinlöslichkeit verringern und zu Ausfällungen führen. Im Tropfen erfolgt dann eine Kristallisation, in der sich die Komponenten durch Wasserverlust anreichern. Wenn sowohl die ursprünglichen Proteine ​​als auch die Reservoirlösung nicht genügend Salz enthalten, erreicht die Konzentration im Tropfen nicht die Grenzkonzentration.

Üblicherweise ist die Erhöhung der Fällungsmittelkonzentration in Kristalllösungen eine wirksame Technik, die zur Verringerung der Löslichkeit von Proteinen verwendet wird. Das Salz, das es kann, stabilisiert die Wasserstruktur (Kosomtrop) oder stört die Wasserstruktur (Chaotrop). Außerdem sinkt die Löslichkeit der Proteine ​​bei hohen Salzkonzentrationen sowie die Löslichkeit der Proteine ​​bei niedrigen Salzkonzentrationen. Die optimale Salzkonzentration wird unseren Tropfen langsam entwässern und die Konzentration unseres Proteins langsam erhöhen.

Die marginale Ionenstärke wird hoch, wenn der Unterschied zwischen dem pI der Proteine ​​und dem pH-Wert des Puffers groß ist, was mit der Idee des elektrostatischen Schirmeffekts eines Salzes übereinstimmt [3].

Proteine ​​mit mehreren Untereinheiten oder Viren sind große Makromoleküle, hohe Salzkonzentrationen sind nicht wirksam, um genügend Wechselwirkungen zu fördern, um die Kristallisation zu induzieren, während Polyethylenglykol (PEG) ein häufig als Fällungsmittel bei der Proteinkristallisation verwendetes Mittel ist, um die Kristallisation zu induzieren.

Kristallisation von Eisenprotein unter anaeroben Bedingungen kann zu Fällungsproblemen führen, wenn die Oxidation des Proteins, das die Fällung verursacht, versuchen, Natriumdithionit hinzuzufügen, um den reduzierten Zustand zu erhalten, ist es auch besser, das Verhältnis im Kristallisationsabfall um eine höhere Menge des Fällungsmittels zu ändern .

Ausdruckssystem

E coli ist für Strukturbiologen die erste Wahl, um Proteine ​​für die Röntgenkristallographie herzustellen, aber manchmal ungeeignet, um Membranproteine ​​in bakteriellen Expressionssystemen zu exprimieren, da das System die posttranslationalen Modifikationen, die Faltungsmaschinerie und die spezifische Lipidumgebung nicht bereitstellen kann. Für eukaryontische Membranproteine, die besser in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Sf9-Insektenzellen [4] und humanen embryonalen Nieren exprimiert werden können.

Verbessern Sie das Ausdrucksniveau

Bei schlechter Expression muss sichergestellt werden, dass das Protein für die Zelle nicht toxisch ist. Die Wahl eines kleineren Fragments des Zielproteins kann das Expressionsniveau und die Löslichkeit verbessern, da E. coli sehr große Proteine ​​> 70 kDa möglicherweise nicht gut exprimiert. Die Verwendung von Stämmen, die Mutationen tragen, die die Produktion von Proteasen verhindern, kann gelegentlich die Akkumulation durch Verminderung des proteolytischen Abbaus verstärken, auch eine Verringerung der Wachstumstemperatur führt zu einem langsameren, aber gleichzeitig langsameren proteolytischen Abbau des Proteins. Mit speziellen Medien, die Spurenmetalle enthalten (Kulturmedien mit hoher Dichte), kann es die Proteinausbeute um das 10-fache gegenüber LB erhöhen.

Co-Expression von Foldasen-Proteinen, z.B. Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIs), Disulfid-Oxidoreduktase (DsbA), Disulfid-Isomerase (DsbC) und Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) mit dem Zielprotein können zu einer hohen Proteinlöslichkeit führen. Die anderen Vorteile dieser Enzyme unterstützen die Bildung von Disulfidbrücken, die in der reduzierenden Umgebung nicht auftritt, sowie eine reduzierte Proteolyse

Eine allgemein herausfordernde und wichtige Aufgabe, die Proteinaggregation und -fällung, findet häufig statt, wenn die Proteinkonzentration im Puffer auf das erforderliche Niveau erhöht wird.

Größenausschlusschromatographie

Ist für die weitere Reinigung nützlich, aber es ist besser, eine neue Säule für die Reinigung zu verwenden. Die Form des Chromatogramms und die Retentionszeit liefern.

Hohe Homogenität und Reinheit der Probe sind entscheidend für eine erfolgreiche Kristallisation, das Vorhandensein verschiedener Aggregate oder oligomerer Formen in der Proteinlösung wirkt sich gut aus, wir müssen dynamische Lichtstreuung (DLS) verwenden, um dies zu überprüfen oder Kleinwinkel X -Strahlenstreuung (SAXS).

Faltung und Stabilität

„Nativ ungefaltete“ Proteine ​​sind einige Proteine, die unter physiologischen Bedingungen entfaltet werden, und diese Art kann besser mit anderen Proteinen kokristallisieren. UN-Faltung, während Stränge mit hohem Beta-Faktor eher Amyloid-ähnliche Aggregate bilden, aber beide können PDB (1aos-1by3) kristallisieren. Es besteht keine direkte Korrelation zwischen dem Prozentsatz der Helix-Sekundärstruktur sowie dem Beta-Strang und der Stabilität. Allerdings sind Proteine ​​mit hohem alpha-helikalem Protein gewöhnlich weniger problematisch. Es gibt mehr hydrophobe Kontakte in Beta-Faltblättern, Fehlfaltungen oder Mutationen können zur Exposition hydrophober Rückstände führen. In diesem Fall aggregieren Proteine, um eine hydrophobe Exposition zu hemmen sowie eine Entropiestrafe zu vermeiden. Beta-Faltblätter werden durch Wasserstoffbrückenbindungen sowie hydrophobe Kontakte stabilisiert, während Alpha-Helices überwiegend durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert werden. Somit ist das Blatt in puncto Stabilität etwas unterlegen.

Die Zugabe von Co-Faktoren oder prostethischen Gruppen (wie Vitamin, Lipid oder anorganischen wie Metallionen), die für die Proteinstabilität oder für die richtige Faltung unerlässlich sind, aber den pH-Wert im Medium während des Wachstums nicht schwanken dürfen, führt zu die Akkumulation des Zielproteins Osmoprotectants in der Zelle, die die Proteinstruktur stabilisieren.

Biophysikalische Methoden wie CD-Spektroskopie und andere Differential Scanning Fluorometry (DSF) können verwendet werden, um die Stabilität des Proteins in verschiedenen Puffern, pH-Werten und in Gegenwart verschiedener Liganden zu charakterisieren, um sicherzustellen, dass das Protein korrekt gefaltet ist. Es gibt mehrere Websites zur Faltungserkennung (FOLDpro, RF-Fold, SSHMM, THREADER, BLASTLINK, SSEARCH, PSI-BLAST und HMMER), die verwendet werden, um die Proteinfaltung vorherzusagen.

Mutation

Wenn das native Protein nicht kristallisiert gegen

300500 Kristallisationsbedingungen Es wurde vorgeschlagen, genetisch veränderte Proteine, sei es durch Trunkierungen oder Punktmutationen, besser zur Kristallisation zu bringen.

Mutanten von Tyr →Phe und Thr→Val sind stabiler als das Wildtyp-Protein, haben aber wenig Einfluss auf die Konformation des Proteins [5]. Es wurde jedoch berichtet, dass Punktmutationen das Ausmaß der Aggregatbildung in einer Reihe von Proteinsystemen spektakulär beeinflussen, darunter Interferon-γ, P22 Tailspike-Protein, Colicin A, einkettige Antikörper, Immunglobulindomänen und Interleukin-1β [6] . Es ist jedoch noch nicht klar, welche Mutationen bei der Kristallisation wahrscheinlich hilfreich sind (Abbildung 1).

Abbildung 1:

Superdex 75 A. Neuer Superdex 75 B. Alter Superdex 75, wie wir sehen können, trennt der neue Superdex 75 das Protein in drei Picks, eines ist Aggregationsprotein, zwei sind Dimerproteine, drei sind Monomer, während das alte Superdex 75 sie nicht trennen kann und in in diesem Fall ist es schwierig, kristallin zu sein, da die Kristallbedingung für das Dimer nicht die gleiche wie die Monomerbedingung ist, sondern dass die Aggregation kristallin sein kann.

Cystein und Histidin reagieren überwiegend mit Reagenzien, die für die anderen und auch für andere Aminosäureseitenketten vorbereitet wurden, weshalb dies bei der Kristallisation problematisch ist. Einige Domänen und Klonen wirken sich auf die Löslichkeit dieser Überprüfung aus, bevor Zeit für die Pufferoptimierung aufgewendet wird.

Nukleation

Manchmal kann ein Protein verschiedene Kristalle bilden, aber das bedeutet nicht, dass alle stabil sind, es kann nur kinetisch begünstigt sein. There is two kind of nucleation: heterogeneous is the most common, occurs by interface of different composition and homogeneous as high purity crystal. The nucleation rates it can be increased by increasing the super saturation, solubility, viscosity and decreases temperature and solid–liquid interfacial tension.

Ethanol

In ethanol, the assist of peptide group burial to protein stability would be increase and the contribution of non-polar group burial would be decrease. Because α-helices are expected to be stable structures in ethanol, ethanol used to increase α-helix formation in proteins and peptides [7], also ethanol and methanol can lowers the thermal denaturation temperature.

Glycerin

Often use in crystallization to protect the proteins as cryosolvent because antifreeze properties and to enhance their solubility by stabilizing the conformation, sugar protein specially affected by glycerol because of ribonuleotides bonds. But some time glycerol work as an antinucleation agent in crystallization.

TRIS & HEPES buffers

The differences in the influence of the buffers could be attributed neither to disparity in the amounts of de-protonated buffer ions nor to disparity in ionic strength. Tris and HEPES being positively charged at pH 7.0. Protein activity increased in different buffer by following order: citrate MES > HEPES > TRIS > phosphate [8]. Tris as well as HEPES prevent the auto-oxidation. HEPES accelerated the degeneration rate of the oxidant and peroxynitrite. The exist of as much as 100 mM NaCl enhance the reversibility and stability of unfolding transitions in Hepes buffer. The crystal structure obtain from HEPES buffer was more similar to the active conformation.

Proteins in L-arginine and Tris buffer at pH 7.4 stay stable against aggregation for longer periods of time. Tris is Good’s buffers bind to the DNA not only by electro static interactions but also by hydrogen bonds primarily to the pyrimidine or purine rings [9]. Tris decrease the metal ion–catalyzed oxidation of Cys, consequently, Cys being available for interaction with the other reagent.

Abschluss

In this review presents important factors that affect protein crystallization and ways to improve the results, but more needs to be done to better understand. Some proteins have ability to make crystal within initial concentration less than 1 mg per ml. Right working sequence and buffer well make all the difference.

Danksagung

This work was supported by Ministry of Science and Technology of China and the CAS-TWAS President’s PhD Fellowship. All authors declare no conflict of interests.


Diskussion

Comparing protein solubility in PEG-8000 and ammonium sulfate

To compare the solubility measured using PEG-8000 with that measured using ammonium sulfate, we evaluated the log S0-values from the two fits. Fig.ਅ shows the plot of log S0 ∗ obtained with ammonium sulfate (log S0 ∗ (NH4)2SO4) versus log S0 obtained with PEG-8000 (log S0 PEG). A remarkably strong correlation between the solubility results for ammonium sulfate and those for PEG-8000 is seen. This suggests that log S0 ∗ (NH4)2SO4 is a parameter that is related to protein solubility in the absence of precipitant. Because log S0 PEG can be used to estimate solubility in the absence of buffer, the correlation of log S0 PEG with log S0 ∗ (NH4)2SO4 suggests that log S0 (NH4)2SO4 can be used qualitatively to determine differences in solubility.

Comparison of the solubility data obtained in ammonium sulfate and PEG-8000. Log S0-values obtained from PEG-8000 precipitations are plotted against Log S0 ∗ -values from ammonium sulfate precipitations for all of the proteins. The data correlate strongly, suggestingਊ relationship between solubility results obtained with PEG-8000 and ammonium sulfate. α-Lactalbumin is shown as an open diamond and is excluded from the fit.

The solubility of α-lactalbumin warrants further discussion. In the case of PEG precipitation, α-lactalbumin is predicted to have the highest solubility of the proteins used in this study. This is not surprising given that α-lactalbumin is present in high concentrations in bovine milk (49) and the fact that we are able to make stock concentrations of α-lactalbumin that are in excess of 100 mg/mL. α-Lactalbumin has a β-value in PEG-8000 that is intermediate of the slopes observed for the other proteins. In the case of ammonium sulfate, α-lactalbumin is predicted to have the lowest solubility among the proteins studied, and the slope observed with α-lactalbumin is a clear outlier. It is the smallest slope observed: 13-fold lower than the average slope, and fivefold lower than the next-closest slope in ammonium sulfate. This suggests that ammonium sulfate is not as effective as a precipitant for α-lactalbumin as it is for the other proteins. This may be due in part to the high surface charge on α-lactalbumin: two thirds of the exposed surface residues carry a charge at pH 7 (data not shown) and nearly a third of the accessible surface area is charged (see Table 3 , column 9). We previously suggested that ammonium sulfate may underestimate the contribution of charged surface residues to protein solubility (16). This likely is related to the mechanism by which ammonium sulfate lowers protein solubility (i.e., increasing surface tension and competing for waters with the protein surface). The high level of charged surface area on α-lactalbumin (roughly equal amounts positive and negative) likely affects the ability of ammonium sulfate to act as a precipitant. The kosmotropic carboxylates on the protein surface compete strongly for water molecules with the sulfate ions, and the chaotropic amino and guanidino groups may lower the water surface tension at the protein water interface, partially opposing the effect of ammonium sulfate. Due to the unique nature of the salting-out curve of α-lactalbumin, the ammonium sulfate data were fit without α-lactalbumin in subsequent correlations.

Tisch 3

Protein properties and surface properties used for correlations

ProteinMolecular mass (kDa)Amino acidspI ∗ Charge ∗ Absolute charge ∗ Fraction of ASA †
UnpolarPolarChargedPositivNegative
A-chymotrypsin25.224183.13.10.520.480.180.120.06
Lysozym14.3129107.97.90.480.520.230.180.05
Human serum albumin66.55856�.212.20.590.410.270.120.14
RNaseSa10.5963.5𢄦.66.60.560.440.140.060.08
α-Lacalbumin14.21235𢄦.66.60.500.500.300.140.15
Fibrinogen16014246.8𢄣.73.70.580.420.190.110.09
Ovalbumin42.83855.3�.510.50.520.480.210.090.12

In an attempt to determine the intrinsic factors that influence protein solubility, we looked at several intrinsic protein properties and examined them with respect to protein solubility by comparing them with log S0-values obtained in this study. We looked at fundamental properties of the protein, such as size (molecular mass) and net charge. We also looked at properties of the surface of the protein, including polarity and charge, by determining the fraction of the surface area of the protein that was polar, nonpolar, charged, negatively charged, or positively charged. By looking at the correlation of these properties with protein solubility, we were able to determine their relative importance for determining protein solubility.

Correlation of molecular mass and net charge with solubility measurements

To investigate the contribution of intrinsic factors to protein solubility (see Table 3 , columns 1𠄶), we plotted log S0-values for PEG-8000 and ammonium sulfate versus molecular mass ( Fig.ਆ , EIN und B), net charge ( Fig.ਆ , C und D), and the absolute value of the net charge ( Fig.ਆ , E und F). Linear fits were made to the data, and R 2 values are given. Because the mechanism of PEG precipitation is related to the excluded volume, solubility may increase with protein size or molecular mass however, no correlation with molecular mass was observed. In general, the solubility of a given protein is at a minimum near the isoelectric point (pI) and increases with the absolute value of the net charge (13,50). To assess whether net charge plays a role in determining the solubility of a group of proteins, we plotted the net charge and absolute value of net charge versus log S0. A weak correlation was observed in all four cases. In the case of the absolute value of net charge, a weak positive correlation was observed, suggesting that with an increasing positive or negative net charge, protein solubility increases. For net charge versus pH, a weak negative correlation was observed. This suggests that, on average for this set of proteins, negatively charged proteins are more soluble than positively charged proteins however, more data points are required to determine whether this is true for a larger set of proteins.

Correlation of molecular mass and net charge with PEG-8000 and ammonium sulfate solubility measurements. Log S0-values versus molecular mass (EIN und B), net charge (C und D), and absolute net charge (E und F) werden gezeigt. The lines and R 2 values are from linear least-squares fits. α-Lactalbumin is shown as open diamonds and is excluded from the ammonium sulfate fits.

Correlation of the intrinsic properties of the accessible surface area with protein solubility

Because protein solubility is influenced largely by interactions between water and the protein surface, we investigated the correlation between solubility and the intrinsic properties of the surface of the proteins. The accessible surface areas (ASAs) of all atoms in the proteins were determined and the fractions that were polar, nonpolar, charged, positively charged, and negatively charged were calculated (see Table 3 , columns 7�). Fig.ਇ depicts protein solubility as a function of fraction ASA that is polar or nonpolar for PEG-8000 ( Fig.ਇ , EIN und B) and ammonium sulfate ( Fig.ਇ , C und D). For PEG-8000, the correlation of the percentage of polar and nonpolar surface residues with protein solubility is very poor, although the correlation is positive for polar residues and negative for nonpolar residues, as might be predicted. This suggests that the surface polarity makes a minimal contribution to protein solubility in PEG-8000. For ammonium sulfate, a better correlation was observed, but the correlation with polar and nonpolar surface residues is negative and positive, respectively, which is the opposite of what we would have expected and what was observed in PEG-8000.

Correlation of fractions of polar and nonpolar ASAs with PEG-8000 and ammonium sulfate solubility measurements. The ASA for all atoms was calculated using PDB files and either pfis (31) or NACCESS (32). Carbon and sulfur atoms are considered nonpolar, and nitrogen and oxygen atoms are considered polar. Log S0-values versus fraction polar ASA (EIN und C) and fraction nonpolar ASA (B und D) werden gezeigt. The lines and R 2 values are from linear least-squares fits. α-Lactalbumin is shown as open diamonds and is excluded from the ammonium sulfate fits.

The contribution of the ASA that is charged, positively charged, and negatively charged was evaluated (see Table 3 , columns 9�). Fig.ਈ depicts the correlations of PEG-8000 and ammonium sulfate with the fraction of charged ( Fig.ਈ , EIN und B), positively charged ( Fig.ਈ , C und D), and negatively charged ( Fig.ਈ , E und F) ASA. We find a strong correlation between solubility in PEG-8000 and fraction of charged ASA and a more moderate correlation for ammonium sulfate. A correlation between solubility and the fraction of positively charged ASA was not observed for either PEG-8000 or ammonium sulfate however, a very strong correlation was observed between solubility and the fraction of negatively charged ASA in both PEG-8000 and ammonium sulfate. This strong correlation suggests that negatively charged surface area plays a significant role in determining protein solubility. This is supported by our previous findings that aspartic and glutamic acids contribute more favorably to protein solubility than do any of the other 18 amino acids (16). To understand the difference in contribution to protein solubility of negative versus positive charges, one needs to understand the properties of negatively and positively charged groups in proteins. Negatively charged groups in proteins include the kosmotropic carboxylate groups of aspartic acid and glutamic acid residues. Positively charged groups include the chaotropic amino and guanidino groups of lysine and arginine. In studies on ions in solution, Collins (26,51�) described a Hofmeister series dependence for hydration of ions in solution. Collins showed that kosmotropes are highly hydrated and bind water more tightly than water binds itself, whereas chaotropes bind water more weakly than water binds itself and remain largely unhydrated in solution. Therefore, the differential contribution to the solubility of negative and positive groups on the protein surface appears to be due to the differential hydration of the carboxylates that bind water tightly and the amino and guanidino groups that bind water weakly.

Correlation of the fraction of ASA that is charged (EIN und B), positively charged (C and D), and negatively charged (E und F) at pH 7.0 with PEG-8000 and ammonium sulfate solubility measurements. The ASA for all atoms was calculated using PDB files and either pfis (31) or NACCESS (32). The oxygen atoms glutamic acid and aspartic acid side chains and the C-terminus are considered negatively charged, and the nitrogen atoms from arginine and lysine side chains and the N-terminus are considered positively charged at pH 7. The lines and R 2 values are from linear least-squares fits. α-Lactalbumin is shown as open diamonds and is excluded from the ammonium sulfate fits.


3.4 Proteins

Proteine ​​sind eines der am häufigsten vorkommenden organischen Moleküle in lebenden Systemen und haben das vielfältigste Funktionsspektrum aller Makromoleküle. Proteine ​​können strukturell, regulatorisch, kontraktil oder schützend sein, sie können beim Transport, der Lagerung oder als Membran dienen oder sie können Toxine oder Enzyme sein. Each cell in a living system may contain thousands of proteins, each with a unique function. Ihre Strukturen sind ebenso wie ihre Funktionen sehr unterschiedlich. Sie alle sind jedoch Polymere von Aminosäuren, die in einer linearen Abfolge angeordnet sind.

Types and Functions of Proteins

Enzymes , which are produced by living cells, are catalysts in biochemical reactions (like digestion) and are usually complex or conjugated proteins. Jedes Enzym ist spezifisch für das Substrat (ein Reaktant, der an ein Enzym bindet), auf das es einwirkt. Das Enzym kann bei Abbau-, Umlagerungs- oder Synthesereaktionen helfen. Enzyme, die ihre Substrate abbauen, werden als katabole Enzyme bezeichnet, Enzyme, die komplexere Moleküle aus ihren Substraten aufbauen, werden als anabole Enzyme bezeichnet, und Enzyme, die die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen, werden als katalytische Enzyme bezeichnet. Es sollte beachtet werden, dass alle Enzyme die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und daher als organische Katalysatoren angesehen werden. Ein Beispiel für ein Enzym ist die Speichel-Amylase, die ihr Substrat Amylose, einen Bestandteil der Stärke, hydrolysiert.

Hormones are chemical-signaling molecules, usually small proteins or steroids, secreted by endocrine cells that act to control or regulate specific physiological processes, including growth, development, metabolism, and reproduction. Insulin ist beispielsweise ein Proteinhormon, das hilft, den Blutzuckerspiegel zu regulieren. The primary types and functions of proteins are listed in Table 3.1.

Protein Types and Functions
TypBeispieleFunktionen
VerdauungsenzymeAmylase, Lipase, Pepsin, TrypsinHilfe bei der Verdauung von Nahrung durch Abbau von Nährstoffen in monomere Einheiten
TransportHämoglobin, AlbuminTransportieren von Substanzen aus dem Blut oder der Lymphe durch den Körper
StrukturAktin, Tubulin, KeratinKonstruieren Sie verschiedene Strukturen, wie das Zytoskelett
HormoneInsulin, ThyroxinKoordiniere die Aktivität verschiedener Körpersysteme
VerteidigungImmunglobulineSchützen Sie den Körper vor fremden Krankheitserregern
KontraktilAktin, MyosinEffekt Muskelkontraktion
LagerungHülsenfrucht-Speicherproteine, Eiweiß (Albumin)Bieten Nahrung in der frühen Entwicklung des Embryos und des Sämlings

Proteine ​​haben unterschiedliche Formen und Molekulargewichte, einige Proteine ​​sind kugelförmig, während andere faserförmig sind. Hämoglobin ist beispielsweise ein kugelförmiges Protein, aber Kollagen, das in unserer Haut vorkommt, ist ein faseriges Protein. Die Form des Proteins ist entscheidend für seine Funktion, und diese Form wird durch viele verschiedene Arten chemischer Bindungen aufrechterhalten. Changes in temperature, pH, and exposure to chemicals may lead to permanent changes in the shape of the protein, leading to loss of function, known as denaturation . Alle Proteine ​​bestehen aus unterschiedlichen Anordnungen der gleichen 20 Arten von Aminosäuren.

Aminosäuren

Amino acids are the monomers that make up proteins. Each amino acid has the same fundamental structure, which consists of a central carbon atom, also known as the alpha (α) carbon, bonded to an amino group (NH2), a carboxyl group (COOH), and to a hydrogen atom. Every amino acid also has another atom or group of atoms bonded to the central atom known as the R group (Figure 3.22).

The name "amino acid" is derived from the fact that they contain both amino group and carboxyl-acid-group in their basic structure. As mentioned, there are 20 amino acids present in proteins. Nine of these are considered essential amino acids in humans because the human body cannot produce them and they are obtained from the diet. For each amino acid, the R group (or side chain) is different (Figure 3.23).

Kunstverbindung

Which categories of amino acid would you expect to find on the surface of a soluble protein, and which would you expect to find in the interior? What distribution of amino acids would you expect to find in a protein embedded in a lipid bilayer?

The chemical nature of the side chain determines the nature of the amino acid (that is, whether it is acidic, basic, polar, or nonpolar). For example, the amino acid glycine has a hydrogen atom as the R group. Amino acids such as valine, methionine, and alanine are nonpolar or hydrophobic in nature, while amino acids such as serine, threonine, and cysteine are polar and have hydrophilic side chains. The side chains of lysine and arginine are positively charged, and therefore these amino acids are also known as basic amino acids. Proline has an R group that is linked to the amino group, forming a ring-like structure. Proline is an exception to the standard structure of an animo acid since its amino group is not separate from the side chain (Figure 3.23).

Amino acids are represented by a single upper case letter or a three-letter abbreviation. For example, valine is known by the letter V or the three-letter symbol val. Just as some fatty acids are essential to a diet, some amino acids are necessary as well. They are known as essential amino acids, and in humans they include isoleucine, leucine, and cysteine. Essential amino acids refer to those necessary for construction of proteins in the body, although not produced by the body which amino acids are essential varies from organism to organism.

The sequence and the number of amino acids ultimately determine the protein's shape, size, and function. Each amino acid is attached to another amino acid by a covalent bond, known as a peptide bond , which is formed by a dehydration reaction. The carboxyl group of one amino acid and the amino group of the incoming amino acid combine, releasing a molecule of water. The resulting bond is the peptide bond (Figure 3.24).

The products formed by such linkages are called peptides. As more amino acids join to this growing chain, the resulting chain is known as a polypeptide. Each polypeptide has a free amino group at one end. This end is called the N terminal, or the amino terminal, and the other end has a free carboxyl group, also known as the C or carboxyl terminal. While the terms polypeptide and protein are sometimes used interchangeably, a polypeptide is technically a polymer of amino acids, whereas the term protein is used for a polypeptide or polypeptides that have combined together, often have bound non-peptide prosthetic groups, have a distinct shape, and have a unique function. After protein synthesis (translation), most proteins are modified. These are known as post-translational modifications. They may undergo cleavage, phosphorylation, or may require the addition of other chemical groups. Only after these modifications is the protein completely functional.

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Click through the steps of protein synthesis in this interactive tutorial.

Evolution-Verbindung

Die evolutionäre Bedeutung von Cytochrom c

Cytochrom c ist ein wichtiger Bestandteil der Elektronentransportkette, ein Teil der Zellatmung, und wird normalerweise in der Zellorganelle, dem Mitochondrium, gefunden. Dieses Protein hat eine prothetische Hämgruppe, und das Zentralion des Häms wird während des Elektronentransfers abwechselnd reduziert und oxidiert. Because this essential protein’s role in producing cellular energy is crucial, it has changed very little over millions of years. Protein sequencing has shown that there is a considerable amount of cytochrome c amino acid sequence homology among different species in other words, evolutionary kinship can be assessed by measuring the similarities or differences among various species’ DNA or protein sequences.

Wissenschaftler haben festgestellt, dass das menschliche Cytochrom C 104 Aminosäuren enthält. Für jedes bisher sequenzierte Cytochrom-c-Molekül aus verschiedenen Organismen erscheinen 37 dieser Aminosäuren in allen Cytochrom-c-Proben an derselben Position. Dies deutet darauf hin, dass es möglicherweise einen gemeinsamen Vorfahren gab. Beim Vergleich der Proteinsequenzen von Mensch und Schimpanse wurde kein Sequenzunterschied gefunden. Beim Vergleich der Sequenzen von Mensch und Rhesusaffen wurde der einzige Unterschied in einer Aminosäure gefunden. In einem anderen Vergleich zeigt die Sequenzierung von Mensch zu Hefe einen Unterschied in der 44. Position.

Proteinstruktur

As discussed earlier, the shape of a protein is critical to its function. For example, an enzyme can bind to a specific substrate at a site known as the active site. Wenn dieses aktive Zentrum aufgrund lokaler Veränderungen oder Veränderungen der gesamten Proteinstruktur verändert wird, kann das Enzym möglicherweise nicht an das Substrat binden. Um zu verstehen, wie das Protein seine endgültige Form oder Konformation erhält, müssen wir die vier Ebenen der Proteinstruktur verstehen: primär, sekundär, tertiär und quaternär.

Primärstruktur

The unique sequence of amino acids in a polypeptide chain is its primary structure . For example, the pancreatic hormone insulin has two polypeptide chains, A and B, and they are linked together by disulfide bonds. The N terminal amino acid of the A chain is glycine, whereas the C terminal amino acid is asparagine (Figure 3.25). The sequences of amino acids in the A and B chains are unique to insulin.

The unique sequence for every protein is ultimately determined by the gene encoding the protein. A change in nucleotide sequence of the gene’s coding region may lead to a different amino acid being added to the growing polypeptide chain, causing a change in protein structure and function. In sickle cell anemia, the hemoglobin β chain (a small portion of which is shown in Figure 3.26) has a single amino acid substitution, causing a change in protein structure and function. Specifically, the amino acid glutamic acid is substituted by valine in the β Kette. What is most remarkable to consider is that a hemoglobin molecule is made up of two alpha chains and two beta chains that each consist of about 150 amino acids. The molecule, therefore, has about 600 amino acids. The structural difference between a normal hemoglobin molecule and a sickle cell molecule—which dramatically decreases life expectancy—is a single amino acid of the 600. What is even more remarkable is that those 600 amino acids are encoded by three nucleotides each, and the mutation is caused by a single base change (point mutation), 1 in 1800 bases.

Because of this change of one amino acid in the chain, hemoglobin molecules form long fibers that distort the biconcave, or disc-shaped, red blood cells and assume a crescent or “sickle” shape, which clogs arteries (Figure 3.27). This can lead to myriad serious health problems such as breathlessness, dizziness, headaches, and abdominal pain for those affected by this disease.

Sekundärstruktur

Durch die lokale Faltung des Polypeptids in einigen Regionen entsteht die Sekundärstruktur des Proteins. Die gebräuchlichsten sind die α-Helix und β-pleated sheet structures (Figure 3.28). Beide Strukturen sind die α-Helix-Struktur – die Helix, die durch Wasserstoffbrücken in Form gehalten wird. Die Wasserstoffbrückenbindungen bilden sich zwischen dem Sauerstoffatom in der Carbonylgruppe in einer Aminosäure und einer anderen Aminosäure, die vier Aminosäuren weiter entlang der Kette liegt.

Every helical turn in an alpha helix has 3.6 amino acid residues. Die R-Gruppen (die Variantengruppen) des Polypeptids ragen aus dem α-Helix-Kette. In dem β-pleated sheet, the “pleats” are formed by hydrogen bonding between atoms on the backbone of the polypeptide chain. Die R-Gruppen sind an die Kohlenstoffe gebunden und erstrecken sich oberhalb und unterhalb der Falten der Falte. Die gefalteten Segmente sind parallel oder antiparallel zueinander ausgerichtet und es bilden sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem teilweise positiven Stickstoffatom in der Aminogruppe und dem teilweise negativen Sauerstoffatom in der Carbonylgruppe des Peptidrückgrats. Die α-Helix und β-plissierte Blattstrukturen werden in den meisten globulären und faserigen Proteinen gefunden und spielen eine wichtige strukturelle Rolle.

Tertiärstruktur

The unique three-dimensional structure of a polypeptide is its tertiary structure (Figure 3.29). Diese Struktur ist teilweise auf chemische Wechselwirkungen an der Polypeptidkette zurückzuführen. In erster Linie erzeugen die Wechselwirkungen zwischen den R-Gruppen die komplexe dreidimensionale Tertiärstruktur eines Proteins. Die Art der in den beteiligten Aminosäuren vorkommenden R-Gruppen kann der Bildung der für Standard-Sekundärstrukturen beschriebenen Wasserstoffbrückenbindungen entgegenwirken. Zum Beispiel werden R-Gruppen mit gleichen Ladungen voneinander abgestoßen und solche mit ungleichen Ladungen werden voneinander angezogen (ionische Bindungen). Bei der Proteinfaltung liegen die hydrophoben R-Gruppen unpolarer Aminosäuren im Inneren des Proteins, während die hydrophilen R-Gruppen außen liegen. Die erstgenannten Wechselwirkungen werden auch als hydrophobe Wechselwirkungen bezeichnet. Die Wechselwirkung zwischen Cysteinseitenketten bildet in Gegenwart von Sauerstoff Disulfidbrücken, die einzige kovalente Bindung, die sich während der Proteinfaltung bildet.

Alle diese Wechselwirkungen, schwach und stark, bestimmen die endgültige dreidimensionale Form des Proteins. Wenn ein Protein seine dreidimensionale Form verliert, ist es möglicherweise nicht mehr funktionsfähig.

Quartäre Struktur

In nature, some proteins are formed from several polypeptides, also known as subunits, and the interaction of these subunits forms the quaternary structure . Weak interactions between the subunits help to stabilize the overall structure. For example, insulin (a globular protein) has a combination of hydrogen bonds and disulfide bonds that cause it to be mostly clumped into a ball shape. Insulin starts out as a single polypeptide and loses some internal sequences in the presence of post-translational modification after the formation of the disulfide linkages that hold the remaining chains together. Silk (a fibrous protein), however, has a β-pleated sheet structure that is the result of hydrogen bonding between different chains.

The four levels of protein structure (primary, secondary, tertiary, and quaternary) are illustrated in Figure 3.30.

Denaturation and Protein Folding

Each protein has its own unique sequence and shape that are held together by chemical interactions. If the protein is subject to changes in temperature, pH, or exposure to chemicals, the protein structure may change, losing its shape without losing its primary sequence in what is known as denaturation. Denaturation is often reversible because the primary structure of the polypeptide is conserved in the process if the denaturing agent is removed, allowing the protein to resume its function. Sometimes denaturation is irreversible, leading to loss of function. One example of irreversible protein denaturation is when an egg is fried. The albumin protein in the liquid egg white is denatured when placed in a hot pan. Not all proteins are denatured at high temperatures for instance, bacteria that survive in hot springs have proteins that function at temperatures close to boiling. The stomach is also very acidic, has a low pH, and denatures proteins as part of the digestion process however, the digestive enzymes of the stomach retain their activity under these conditions.

Protein folding is critical to its function. It was originally thought that the proteins themselves were responsible for the folding process. Only recently was it found that often they receive assistance in the folding process from protein helpers known as chaperones (or chaperonins) that associate with the target protein during the folding process. They act by preventing aggregation of polypeptides that make up the complete protein structure, and they disassociate from the protein once the target protein is folded.

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For an additional perspective on proteins, view this animation called “Biomolecules: The Proteins.”


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Forschungsergebnis : Beitrag zu Zeitschrift › Artikel › peer-review

T1 - Solubility and digestibility of milk proteins in different forms of infant formulas

N2 - Heat processing is necessary to extend the shelf-life of commercially manufactured infant formulas. Heat treatment causes protein denaturation and may thereby affect protein digestibility. Currently, there are several fundamentally different technologies to produce infant formulas such as sterilization which used for production of liquid formulas, and spray-drying which is used for production of powdered formulas. Infant formula (liquid concentrated, powdered, ready-to-feed), prepared according to the manufacturers' instructions were centrifuged at 14,000 g at 4°C for 1 h. Fractions [lipid layer, soluble fraction (whey) and pellet (casein)] were separated. Total N and N in fractions were determined by micro-Kjeldahl analysis and non-protein nitrogen (NPN) after precipitation of proteins. Protein solubility was determined after centrifugation and ranged from 5790%. To simulate the infant gut, in vitro digestion was used. Formulas were adjusted to pH 4.5 with 0.1 N HC1 and pepsin was added (lmg/ml). Pancreatin (0.4 g/100 ml of 0. l M NaHCO3) was added to each sample, which was then incubated at 37°C. Digested formulas were immediately placed in boiling water for 4 min. to inactivate enzymes. True protein content ranged from 12.5-17.5 g/L. Protein digestibility calculated as (NPN after digestionNPN before digestion) x 6.25 x 100/true protein ranged from 49-68%. Protein digestibility was generally highest for powdered formula, while it was slightly higher from liquid concentrate than from ready-to-feed formula. These results suggest that protein utilization by infants may be affected by the type of processing used.

AB - Heat processing is necessary to extend the shelf-life of commercially manufactured infant formulas. Heat treatment causes protein denaturation and may thereby affect protein digestibility. Currently, there are several fundamentally different technologies to produce infant formulas such as sterilization which used for production of liquid formulas, and spray-drying which is used for production of powdered formulas. Infant formula (liquid concentrated, powdered, ready-to-feed), prepared according to the manufacturers' instructions were centrifuged at 14,000 g at 4°C for 1 h. Fractions [lipid layer, soluble fraction (whey) and pellet (casein)] were separated. Total N and N in fractions were determined by micro-Kjeldahl analysis and non-protein nitrogen (NPN) after precipitation of proteins. Protein solubility was determined after centrifugation and ranged from 5790%. To simulate the infant gut, in vitro digestion was used. Formulas were adjusted to pH 4.5 with 0.1 N HC1 and pepsin was added (lmg/ml). Pancreatin (0.4 g/100 ml of 0. l M NaHCO3) was added to each sample, which was then incubated at 37°C. Digested formulas were immediately placed in boiling water for 4 min. to inactivate enzymes. True protein content ranged from 12.5-17.5 g/L. Protein digestibility calculated as (NPN after digestionNPN before digestion) x 6.25 x 100/true protein ranged from 49-68%. Protein digestibility was generally highest for powdered formula, while it was slightly higher from liquid concentrate than from ready-to-feed formula. These results suggest that protein utilization by infants may be affected by the type of processing used.


Proteins are large molecules found in our bodies and food, consisting of many smaller components called amino acids. Proteins have the properties they do because of the shape and arrangement of their amino acids. A weak bond, known as a hydrogen bond, forms between a hydrogen atom and an oxygen atom in the amino acids. This gives the protein its shape.

What is denaturing and how does it happen?
A protein becomes denatured when its normal shape gets deformed because some of the hydrogen bonds are broken. Weak hydrogen bonds break when too much heat is applied or when they are exposed to an acid (like citric acid from lemon juice). As proteins deform or unravel parts of structure that were hidden away get exposed and form bonds with other protein molecules, so they coagulate (stick together) and become insoluble in water. Curing salmon using lemon and lime juice (eg. to make a gravadlax or ceviche) is an example of protein acid denaturation.


Washing the plate

The two most commonly used wash buffers in ELISA applications are Tris-buffered saline (TBS) and phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.05% (v/v) Tween 20. To wash a plate, wells should be repeatedly filled and emptied by either aspiration or plate inversion (i.e., dumping and flicking solution into a suitable receptacle). Generally at least 3 x 5 minute washes should be applied after the incubation of coating antibody, sample, and detection antibody 6 x 5 minute washes should be given after incubation with the enzyme conjugate. It is not necessary to wash after the blocking step, although this is not detrimental to the assay. Wash buffers should be used in sufficient volumes to completely wash the wells. For example, 400 μL is generally used for each well of a 96-well plate.

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Select products

Antibodies are a key part of any ELISA workflow. For an antibody to work successfully in ELISA, it should react specifically with the antigen but not cross-react with any other component of the assay. Not all antibodies can be used successfully in ELISA applications, individual antibodies must be evaluated. For sandwich assays, where two different antibodies are required, it is essential that the two antibodies react with different epitopes on the antigen or an epitope that appears several times on the antigen.

For example, if the antigen is immobilized on the plate through the capture antibody, then the detection antibody must be able to interact with its own epitope without steric hindrance from the first antibody. In ELISA applications where a secondary antibody is used as part of the detection complex it is also essential that the capture and detection antibodies be raised in different animal species so that the secondary antibody does not react with the coating antibody. Antibodies that work well together are generally known as “matched pairs”. Most commercially-available ELISA kits use validated matched antibodies pairs, and these pairs are often available for purchase individually or as “Antibody Pair Kits”.

In addition, antibody concentrations should be considered when setting up a new ELISA. Each antibody being used will require optimization. The optimal range is partially determined by the form and origin of the antibody and also by the substrate used for signal generation. When diluting antibodies, detection antibody and enzyme conjugate, working solutions should be prepared in blocking solution to reduce non-specific interactions. For recommended coating and detection antibody concentrations see below.

Table 2. Recommended concentration ranges for coating and detection antibodies for ELISA optimization. The use of non-purified antibodies will work but may result in higher background. It is generally recommended to use affinity purified antibodies for optimal signal-to-noise ratio. Concentrations are guidelines only for best results optimize each component individually.


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Bemerkungen:

  1. Luiginw

    Können wir es herausfinden?

  2. Zutaxe

    Ich denke, dass Sie sich irren. Lass uns diskutieren. Schreib mir per PN, wir reden.

  3. Drago

    Seltsame Dialog stellt sich heraus.

  4. Salih

    Ich gratuliere, die bewundernswerte Antwort ...

  5. Tajin

    Meiner Meinung nach ist dies ein sehr interessantes Thema. Ich schlage vor, Sie besprechen es hier oder in PM.

  6. Zafir

    Auch so. Obwohl es viel zu diesem Thema schreibt. Aber wirklich neues Nichts.



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