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12.9: Zellmotilität - Biologie

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Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie sich eine Zelle von einem Punkt im Raum zu einem anderen bewegen kann. In einem flüssigen Medium kann dieses Verfahren eine Art Schwimmen sein, bei dem die Bewegung der Ziliar- oder Geißelbewegung verwendet wird, um die Zelle anzutreiben. Auf festen Oberflächen funktionieren diese Mechanismen eindeutig nicht effizient und die Zelle durchläuft einen Kriechprozess. In diesem Abschnitt beginnen wir mit einer Diskussion der Ziliar-/Geißelbewegung und betrachten dann die komplizierteren Anforderungen des zellulären Kriechens.

Zilien und Geißeln, die sich hauptsächlich in der Länge und nicht im Aufbau unterscheiden, sind auf Mikrotubuli basierende Organellen, die sich hin und her bewegen. Dies bedeutet „Rudern“ durch die relativ kurzen Flimmerhärchen, aber bei den längeren Geißeln bewirkt die Flexibilität der Struktur, dass sich die Hin- und Herbewegung als Welle ausbreitet, sodass die Geißelbewegung mehr wellenförmig oder peitschenartig ist (beachten Sie, was passiert, wenn Sie einen Gartenschlauch schnell von einer Seite zur anderen wackeln, verglichen mit einem kurzen Stück desselben Schlauchs). Der Kern jeder Struktur wird als Axonem bezeichnet, das aus 9 Mikrotubulus-Dubletts besteht, die durch . miteinander verbunden sind Ziliar-Dynein Motorproteine ​​und umgeben einen zentralen Kern aus zwei separaten Mikrotubuli.

Dies ist als „9+2“-Formation bekannt, obwohl die neun Dubletts nicht mit den beiden zentralen Mikrotubuli identisch sind. Der A-Tubulus besteht aus vollen 13 Protofilamenten, aber der mit ihm verschmolzene B-Tubulus enthält nur 10 Protofilamente. Jeder der zentralen Mikrotubuli besteht aus 13 Protofilamenten. Das 9+2 Axonem verlängert die Länge des Ciliums oder Flagellums von der Spitze bis zur Basis und verbindet sich mit dem Zellkörper durch a Basalkörper, das aus 9 Mikrotubulus-Tripletts besteht, die in einem kurzen Zylinder angeordnet sind, ähnlich wie die Zentriolen, von denen sie abgeleitet sind.

Dieser Abschnitt bezieht sich nur auf Eukaryoten. Einige Prokaryoten haben auch bewegliche Anhängsel, die Flagellen genannt werden, aber sie unterscheiden sich sowohl in der Struktur als auch im Mechanismus völlig. Die Flagellen selbst sind lange helikale Polymere des Proteins Flagellin, und die Basis der Flagellinfasern ist mit einem Rotationsmotorprotein und nicht mit einem Translationsmotor verbunden. Dieser Motor (Abbildung (PageIndex{18})) verwendet Ionen (H+ oder Na+ je nach Spezies) entlang eines elektrochemischen Gradienten, um die Energie bereitzustellen, um bis zu 100000 Umdrehungen pro Minute zu drehen. Es wird angenommen, dass die Rotation durch Konformationsänderungen im Statorring, der in die Zellmembran eingebettet ist, angetrieben wird.

Die ciliaren Dyneine liefern die motorischen Fähigkeiten, aber es gibt noch zwei weitere Bindungsproteine ​​im Axonem. Es gibt nexins die den A-Tubulus eines Dubletts mit dem B-Tubulus seines benachbarten Dubletts verbinden und so den äußeren Ring verbinden. Und da sind radiale Speichen die sich vom A-Tubulus jedes Dubletts bis zum zentralen Mikrotubuli-Paar im Kern des Axonems erstrecken. Beides hat keine motorische Aktivität. Sie sind jedoch entscheidend für die Bewegung von Flimmerhärchen und Geißeln, da sie helfen, eine Gleitbewegung in eine Biegebewegung umzuwandeln. Wenn ciliäres Dynein (das zytoplasmatischen Dyneinen sehr ähnlich ist, aber drei statt zwei Köpfe hat) im Eingriff ist, bindet es einen A-Mikrotubulus auf einer Seite, einen B-Mikrotubulus aus dem benachbarten Dublett und bewegt einen relativ zum anderen. Eine sich gemeinsam bewegende Linie dieser Dyneine würde also ein Dublett relativ zum anderen verschieben, wenn (und es ist ein großes „Wenn“) die beiden Dubletts vollständige Bewegungsfreiheit hätten. Da die Dubletts jedoch durch die Nexin-Proteine ​​miteinander verbunden sind, verbiegt ein Dublett beim Versuch, zu gleiten, stattdessen die verbundene Struktur (Abbildung (PageIndex{17})). Diese Biegung erklärt die Ruderbewegung der relativ kurzen Zilien sowie die Peitschenbewegung der langen Geißeln, die die Biegungsbewegung das Axonem hinunter fortpflanzen.

Obwohl wir uns die Ziliar- und Geißelbewegung als Methoden zum Antrieb einer Zelle vorstellen, wie zum Beispiel das Flagellenschwimmen von Spermien zu einer Eizelle, gibt es auch eine Reihe wichtiger Orte, an denen die Zelle stationär ist und die Zilien zur Bewegung verwendet werden Flüssigkeit an der Zelle vorbei. Tatsächlich gibt es in den meisten wichtigen Organen des Körpers Zellen mit Zilien. Es wurden mehrere Ziliardyskinesien berichtet, von denen die prominenteste, die primäre Ziliardyskinesie (PCD), zu der das Kartagener-Syndrom (KS) gehört, auf eine Mutation des DNAI1-Gens zurückzuführen ist, das eine Untereinheit (Zwischenkette 1) des axonemalen (ziliaren) ) Dynein. PCD ist durch Atemnot aufgrund einer wiederkehrenden Infektion gekennzeichnet, und die Diagnose von KS wird gestellt, wenn auch Situs invers, ein Zustand, bei dem die normale Links-Rechts-Asymmetrie des Körpers (z. B. Magen links, Leber rechts) umgekehrt wird. Das erste Symptom ist auf die Inaktivität der zahlreichen Zilien von Epithelzellen in der Lunge zurückzuführen. Ihre normale Funktion besteht darin, den Schleim in den Atemwegen ständig in Bewegung zu halten. Normalerweise hilft der Schleim, die Lunge feucht zu halten, um die Funktion zu erleichtern, aber wenn der Schleim stillsteht, wird er zu einem Nährboden für Bakterien sowie zu einem Reizmittel und einem Hindernis für einen ordnungsgemäßen Gasaustausch.

Situs inversus ist eine interessante Fehlbildung, da sie in der Embryonalentwicklung auftritt und nur 50% der PCD-Patienten betrifft, da die eingeschränkte Ziliarfunktion eine Randomisierung der Links-Rechts-Asymmetrie und keine Umkehrung verursacht. In sehr einfachen Worten ist die Links-Rechts-Asymmetrie während der frühen Embryonalentwicklung teilweise auf die Bewegung molekularer Signale nach links durch den Embryonalknoten zurückzuführen. Dieser Fluss wird durch das koordinierte Schlagen der Zilien verursacht. Wenn sie also nicht funktionieren, wird der Fluss unterbrochen und es kommt zu einer Randomisierung.

Andere Symptome von PCD-Patienten weisen ebenfalls auf die Arbeit von Zilien und Geißeln im Körper hin. Männliche Unfruchtbarkeit ist aufgrund unbeweglicher Spermien üblich. Weibliche Unfruchtbarkeit, obwohl seltener, kann auch aufgrund einer Funktionsstörung der Zilien des Eileiters und des Eileiters auftreten, die normalerweise die Eizelle vom Eierstock zur Gebärmutter bewegen. Interessanterweise gibt es auch eine geringe Assoziation von Hydrocephalus internus (Überfüllung der Ventrikel des Gehirns mit Liquor cerebrospinalis, was zu ihrer Vergrößerung führt, die das Gehirngewebe um sie herum komprimiert) mit PCD. Dies ist wahrscheinlich auf eine Dysfunktion der Zilien in den Ependymzellen zurückzuführen, die die Ventrikel auskleiden und die den Liquorkreislauf unterstützen, aber anscheinend nicht vollständig notwendig sind. Da angenommen wird, dass der CSF-Massenfluss hauptsächlich durch die systolische/diastolische Änderung des Blutdrucks im Gehirn angetrieben wird, stellen einige die Hypothese auf, dass die Zilien hauptsächlich durch einige der engeren Kanäle im Gehirn involviert sein könnten.

Das Zellkriechen (Abbildung (PageIndex{19})) erfordert die koordinierte Neuordnung des Mikrofilament-Netzwerks an der Vorderkante, das sich ausdehnt (sowohl durch Polymerisation als auch durch gleitende Filamente) und dann am neuen vordersten Punkt Adhäsionen bildet. Dies kann die Form von Filopodien oder Lamellipodien annehmen, und oft beides gleichzeitig. Filopodien sind lange und sehr dünne Vorsprünge mit Kernbündeln von parallelen Mikrofilamenten und hohen Konzentrationen an Zelloberflächenrezeptoren. Ihr Zweck besteht in erster Linie darin, die Umwelt zu erfassen. Lamellipodien erstreckt sich oft zwischen zwei Lopodien und ist eher eine breite Rüsche als ein Finger. Intern bildet sich das Aktin mehr zu Maschen als zu Bündeln, und der breitere Rand ermöglicht mehr Adhäsionen an das Substrat. Das Mikrofilament-Netzwerk ordnet sich dann erneut um und öffnet diesmal einen Raum im Zytoplasma, der als Kanal für die Bewegung der Mikrotubuli zur Vorderseite der Zelle dient. Dadurch wird das Transportnetzwerk geschaffen, um intrazelluläres Schüttgut vorwärts zu bewegen. Dabei werden die alten Adhäsionen am Schwanzende der Zelle gelöst. Diese Freisetzung kann durch zwei Hauptmechanismen erfolgen: Endozytose des Rezeptors oder Deaktivierung des Rezeptors durch Signalgebung/Konformationsänderung. Diese Vereinfachung täuscht natürlich über die Komplexität der Koordination und Kontrolle all dieser Aktionen hinweg, um eine gerichtete Bewegung einer Zelle zu erreichen.

Ein Modell der Mikrofilament-Krafterzeugung, das Elastic Brownian Ratchet Model (Mogilner und Oster, 1996), schlägt vor, dass aufgrund der Brownschen Bewegung der Zellmembran, die aus einer kontinuierlichen winzigen thermischen Fluktuation resultiert, die Aktinfilamente, die zu den Rändern der Membran herausgedrückt werden, unterschiedlich stark gebeugt. Ist die Biegung groß genug, kann ein neues Aktinmonomer zwischen Membran und Filamentspitze passen, und wenn sich das nun längere Filament zurückbiegt, kann es einen größeren Druck auf die Membran ausüben. Offensichtlich erzeugt ein einzelnes Filament nicht viel Kraft, aber die koordinierte Dehnung vieler Filamente kann die Membran nach vorne schieben.

Sobald eine Zelle ein Bewegungssignal erhält, besteht die anfängliche Reaktion des Zytoskeletts darin, Aktin zu polymerisieren, wodurch mehr Mikrofilamente gebildet werden, die in die Vorderkante eingebaut werden. Je nach Signal (attraktiv oder abstoßend) kann die Polymerisation vom Punkt der Signalrezeptoraktivierung auf der gleichen oder der gegenüberliegenden Seite der Zelle erfolgen. Bezeichnenderweise kann die Polymerisation von neuem f-Aktin allein ausreichend Kraft erzeugen, um die Membran nach vorne zu bewegen, auch ohne Beteiligung von Myosinmotoren! Modelle der Krafterzeugung werden diskutiert, beginnen aber im Allgemeinen mit dem Einbau von neuem g-Aktin in ein Filament an seiner Spitze; das heißt, an der Filament-Membran-Grenzfläche. Auch wenn das technisch ausreichen mag, in einer lebenden Zelle sind Myosine beteiligt und helfen dabei, Filamente gerichtet zu schieben und anzuordnen, um die neue Vorderkante aufzubauen. Außerdem müssen einige Filamente und Netzwerke schnell durchtrennt und neue Verbindungen hergestellt werden, sowohl zwischen Filamenten als auch zwischen Filamenten und anderen Proteinen wie Adhäsionsmolekülen oder Mikrotubuli.

Wie werden Polymerisation und Aktinumlagerung gesteuert? Die Rezeptoren, die die Zellbewegung signalisieren, können etwas unterschiedliche Wege initiieren, aber viele haben einige Gemeinsamkeiten bei der Aktivierung eines oder mehrerer Mitglieder der Ras-Familie kleiner GTPasen. Diese Signalmoleküle wie Rac, Rho und cdc42 können durch Rezeptor-Tyrosin-Kinasen aktiviert werden (siehe RTK-Ras-Aktivierungswege, Kap. 14). Jeder von ihnen hat eine etwas andere Rolle bei der Zellmotilität: cdc42-Aktivierung führt zur Bildung von Filopodien, Rac aktiviert einen Weg, der Arp2/3 und Cofilin zur Bildung von Lamellipodien umfasst, und Rho aktiviert Myosin II, um die fokale Adhäsion und die Bildung von Stressfasern zu kontrollieren. Eine andere Art von Rezeptorkaskade, die G-Protein-Signalkaskade (auch Kapitel 14), kann zur Aktivierung von PLC und anschließender Spaltung von PIP . führen2 und Erhöhung des zytosolischen Ca2+. Diese Veränderungen können, wie bereits erwähnt, auch Myosin II sowie die Umbauenzyme Gelsolin, Cofilin und Profilin aktivieren. Dies bricht bestehende Aktinstrukturen auf, um die Zelle flüssiger zu machen, während gleichzeitig mehr g-Aktin zur Bildung des neuen Zytoskeletts an der Vorderkante beiträgt.

In vitro Experimente zeigen, dass beim Vorschieben der Membran neue adhäsive Kontakte durch Adhäsionsmoleküle oder Rezeptoren hergestellt werden, die das Substrat binden (oft sind Zellkultur-Objektträger oder -Schalen mit Kollagen, Filaminin oder anderen extrazellulären Matrixproteinen beschichtet). Die Kontakte rekrutieren dann Zytoskelett-Elemente für eine größere Stabilität, um eine fokale Adhäsion zu bilden (Abbildung (PageIndex{20})). Die Bildung von fokalen Adhäsionen scheint jedoch ein Artefakt der Zellkultur zu sein, und es ist unklar, ob die Adhäsionsarten, die sich in vivo bilden, dieselben Arten von Zytoskelettkomponenten rekrutieren.

Der dritte Schritt zur Zellfortbewegung ist die Massenbewegung des Zellinhalts nach vorne. Die Mechanismen für diese Phase sind unklar, aber es gibt einige Hinweise darauf, dass die Mikrotubuli durch Verknüpfungen zwischen dem Aktin-Zytoskelett an der Vorderkante und den vorderen Teilen des Mikrotubulus-Zytoskeletts neu angeordnet werden, um einen effizienten Transportweg für die Massenbewegung zu bilden. Ein weiterer Aspekt könnte ein „korrallierender“ Effekt durch die Aktinnetzwerke sein, die den Raum zur Eintrittskante gerichtet öffnen. Die Mikrotubuli dringen dann leichter in diesen Raum ein, als durch ein enges Aktinnetz zu arbeiten, und erzwingen den Fluss in die richtige Richtung.

Ein Großteil der Arbeit über Mikrotubuli-Aktin-Interaktionen in der Zellmotilität wurde durch die Erforschung des neuronalen Wachstumskegels durchgeführt, der manchmal als Zelle an der Leine bezeichnet wird, da er fast unabhängig wie eine kriechende Zelle auf der Suche nach dem richtigen Weg wirkt um sein Axon vom Zellkörper zu seiner richtigen synaptischen Verbindung zu führen (AW Schaefer et al, Dev. Cell 15: 146-62, 2008).

Schließlich muss die Zelle ihre alten Adhäsionen an der Hinterkante lösen. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen. In vitroEs wurde beobachtet, dass sich kriechende Zellen vom Substrat abreißen und dabei winzige Membranstücke und zugehörige Adhäsionsproteine ​​zurücklassen. Es wird angenommen, dass die erzeugte Kraft von Aktin-Myosin-Stressfasern kommt, die von den weiter vorne gelegenen fokalen Adhäsionen ausgehen. Den Zellen stehen jedoch weniger destruktive Mechanismen zur Verfügung. In einigen Fällen kann die Adhäsivität des zellulären Rezeptors für das extrazelluläre Substrat intern reguliert werden, vielleicht durch Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines Rezeptors. Eine andere Möglichkeit ist die Endozytose des Rezeptors, die ihn von der Zelloberfläche ablöst. Es könnte einfach bis zur Vorderkante recycelt werden, wo es benötigt wird (d. h. Transzytose), oder wenn es nicht mehr benötigt oder beschädigt wird, kann es in einem Lysosom abgebaut werden.


Mikrotubuli-Dynamik in mitotischer Spindel, dargestellt durch Polarisationslichtmikroskopie

Die erste Sequenz zeigt eine Endospermzelle der Afrikanischen Blutlilie, Haemanthus katherinae, einer Mitose unterzogen (Abbildung 1). Diese Sequenz, aufgenommen von A.S. Bajer und J. Molé-Bajer wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie in Zellen beobachtet, die zwischen einer Schicht aus Agar und Gelatine abgeflacht worden waren, um ihre Sichtbarkeit zu verbessern (Bajer und Molè-Bajer, 1956, 1986). Die Sequenz zeigt anschaulich die Chromosomen, wie sie sich verdichten und auf der Metaphaseplatte ausrichten (Abbildung 1b). Inzwischen sind die drei großen, dunklen Nukleolen (Abbildung 1a) verschwunden. Dann teilen sich die Chromosomen und bewegen sich in der Anaphase auseinander (Abbildung 1c). Schließlich werden die Chromosomen dekondensiert, wenn sie in der Telophase in zwei Tochterkerne verpackt werden (Abbildung 1d). Zwischen den Kernen erscheinen kleine tanzende Vesikel (Abbildung 1c), richten sich aus und verschmelzen miteinander, um die Zellplatte zu bilden (Abbildung 1d). Die Zellplatte lässt schließlich die Zellwände entstehen und trennt die Pflanzenzelle in zwei Teile.

Abb. 1. Mitose und Zellplattenbildung in einer abgeflachten Endospermzelle der Afrikanischen Blutlilie, Haemanthus katherinae, beobachtet mit Phasenkontrastmikroskopie.

In der nächsten Sequenz sehen wir die Pollenmutterzelle einer Osterlilie,Lilium longiflorum, durchläuft Mitose und Zellteilung (Abbildung 2). Diese Zellen durchlaufen synchron die erste ihrer beiden Teilungen, um vier Pollenkörner zu bilden, wenn die Blütenknospe genau 22,4 mm lang ist (Abbildung 3). Eine Knospe dieser Länge wurde gesammelt und bei ∼1800 × zentrifugiert g für 3 min, um die stark lichtstreuenden Körnchen zu verdrängen und den anderen Zellinhalt besser sichtbar zu machen. Nach dem Ausschneiden einer Anthere aus der zentrifugierten Blütenknospe in 7/8-starker Frosch-Ringer-Lösung wurden die Zellen zwischen gekreuzten Polarisatoren in Gegenwart eines Kompensators beobachtet (Abbildung 4). Auf diese Weise mit einem Polarisationsmikroskop beobachtet, werden Bereiche der Zelle, in denen Moleküle regelmäßig ausgerichtet sind, d. h. doppelbrechende Bereiche, hervorgehoben (Abbildungen 2, 5 und 6).

Abb. 2. Mitose und Zellplattenbildung in zentrifugierten Pollenmutterzellen der Osterlilie, Lilium longiflorum, beobachtet mit Polarisationsmikroskopie. Reproduziert von Die Zeitschrift für Zellbiologie, Bd. 130, 687–700, 1995, mit urheberrechtlicher Genehmigung von The Rockefeller University Press.

Abb. 3. Länge der Blütenknospe von Lilium longiflorum bei der Pollenmutterzellen ihre erste Teilung durchlaufen (nach Erickson, 1948).

Abb. 4. Schema eines Polarisationsmikroskops mit gekreuzten Polarisatoren und einem Kompensator. Reproduziert von Die Zeitschrift für Zellbiologie, Bd. 139, 985–994, 1997, mit urheberrechtlicher Genehmigung von The Rockefeller University Press.

Wie bei der Bajer-Endospermzellserie wurde diese Serie zur Pollenmutterzellmitose zunächst im Zeitraffer auf 16-mm-Ciné-Film aufgenommen. Die verstrichene Zeit vom Aufbrechen der Kernhülle bis zur Bildung der Zellplatte betrug 2 h. Etwa 40 Jahre später wurden die Cinérecords auf Video übertragen.

Die polarisationsmikroskopische Aufnahme der Pollenmutterzellen zeigt deutlich die Spindelfasern, die mit der Phasenkontrastmikroskopie nicht sichtbar waren (für polarisationsmikroskopische Aufnahmen von HämanthusEndospermzellen, siehe Inoué und Bajer, 1961, Inoué, 1964). Die Phasenkontrastmikroskopie zeigt aufgrund ihres höheren Brechungsindexes deutlich das Chromosom und die Nukleolen, nicht jedoch die Spindelfasern, die die Chromosomen zu den Spindelpolen auseinanderführen oder die Phragmoplastenfasern, die die Vakuolen zur Zellplatte bringen. Der Brechungsindex dieser Fasern ist dem des umgebenden Zytoplasmas zu nahe. Dennoch zeigen sie sich in einem gut abgestimmten Polarisationsmikroskop deutlich, da die Fasern doppelbrechend sind und aus einem Bündel regelmäßig ausgerichteter molekularer Filamente bestehen. Diese von Inoué 1950 aufgenommene Sequenz demonstrierte erstmals die Realität von Spindelfasern und Fibrillen in lebenden Zellen (Inoué, 1953, 1964) sowie die hochdynamische, labile Natur der molekularen Filamente (später identifiziert als Mikrotubuli).

Die Mikrotubuli zerlegten sich reversibel, wenn die Zellen Kälte, hohem hydrostatischem Druck oder antimitotischen Medikamenten wie Colchicin ausgesetzt wurden (Übersicht in Inoué, 1964, 1981). Während der langsamen Depolymerisation von Mikrotubuli durch diese Mittel wurden in der Metaphase blockierte Chromosomen zu einem Spindelpol gezogen, der an der Zelloberfläche verankert war. Nach dem Entfernen des Depolymerisationsmittels drückten wachsende Spindelfasern die Chromosomen in Richtung der Metaphaseplatte. So entstand die Vorstellung, dass die Chromosomenbewegung in Richtung der Metaphaseplatte mit dem Zusammenbau und dem Wachstum von Mikrotubuli verbunden (und angetrieben durch) war, während die Bewegung der Chromosomen in Richtung der Spindelpole mit der Demontage und Verkürzung der Mikrotubuli verbunden war (und angetrieben durch) das Kinetochor jedes Schwesterchromosoms (neue Erkenntnisse und Diskussionen zusammengefasst in Inouéand Salmon, 1995).

Diese Polarisationslichtmikroskopie-Studien zur Doppelbrechung sich teilender Zellen zeigten die Zusammenbaueigenschaften von Mikrotubuli und ihre dynamische Funktion in lebenden Zellen, lange bevor die Mikrotubuli selbst entdeckt oder ihre Zusammenbaueigenschaften in vitro charakterisiert wurden (Übersicht in Inoué, 1981).

Die Mikrotubuli, aus denen die Spindelfasern bestehen, und deren Verkürzung in der Anaphase sind in der Folge hochaufgelöster Bilder eines Heuschrecken-Spermatozyten (Pardalophora apiculata Abbildung 5), aufgenommen von Nicklas (1971) mit einem gleichgerichteten Polarisationsmikroskop. Die Entzerrung liefert ein Bild mit höherer Auflösung, stellt die erforderliche Extinktion wieder her und korrigiert den Bildfehler, der bei herkömmlichen Polarisationsmikroskopen bei der Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur gefunden wird (Inoué und Hyde, 1957).

Abb. 5. Primäre Spermatozyten von Pardalophora apiculata beobachtet mit einem gleichgerichteten Polarisationsmikroskop (von Nicklas, 1971). Reproduziert von Fortschritte in der Zellbiologie, Bd. 2, 225–298, Copyright 1971 Appleton-Century-Crofts.

Die letzte Videosequenz zeigt einen sich teilenden Molch (Taricha granulosa) Lungenepithelzelle (Abbildung 6), aufgezeichnet von R. Oldenbourg, P.T. Tran und E. D. Lachs mit dem neuen Pol-Scope. Beim Pol-Scope wird jedes Bild von einem Bildverarbeitungscomputer aus vier Videobildern erzeugt, die in schneller Folge mit unterschiedlichen Einstellungen von zwei elektronisch gesteuerten Flüssigkristallkompensatoren aufgenommen wurden. In den so vom Computer angezeigten Bildern ist die Helligkeit jedes Pixels streng proportional zur Doppelbrechung des Probenpunkts und unabhängig von der Orientierung der Doppelbrechungsachse (Oldenbourg, 1996). Somit bietet Oldenbourgs neues Pol-Scope nicht nur Displays mit außergewöhnlich hoher Auflösung und Auflösung, sondern auch hochempfindliche, dynamische Bildinformationen zur molekularen Ausrichtung, die streng quantitativ sind.

Abb. 6. Mitose in Gewebe-kultivierten Lungenzellen eines Molches,Taricha granulosa, aufgenommen mit dem neuen Pol-Scope. Reproduziert von Die Zeitschrift für Zellbiologie, Bd. 139, 985–994, 1997, mit urheberrechtlicher Genehmigung von The Rockefeller University Press.

Abgesehen davon, dass sie von historischem Interesse ist, sollte der überlegte Einsatz der Polarisationslichtmikroskopie weiterhin viel über das Verhalten der molekularen und feinen Strukturdynamik auf nicht-invasive Weise bei sich teilenden, sich entwickelnden und anderweitig aktiv funktionierenden lebenden Zellen aufdecken (Oldenbourg, 1998).


Progesteron (P4) Rezeptormembrankomponente 1 (PGRMC1) ist ein Cytochrom b5-verwandtes Häm-bindendes Protein mit mehreren Funktionen, einschließlich Interaktion mit Cytochrom-P450-Enzymen. Kurz gesagt (der Leser wird auf frühere Übersichten verwiesen) umfassen nicht-umfassende PGRMC1-Funktionen Membrantransport, P4-Reaktionsfähigkeit und Steroidogenese, Fertilität, Lipidtransport, neurale Axonmigration, synaptische Funktion und Anti-Apoptose. Seine subzelluläre Lokalisation kann zytoplasmatisch, nukleär/nukleolär, mitochondrial, endoplasmatisches Retikulum, zytoplasmatische Vesikel oder extrazellulär sein [1,2,3]. Es ist an Zellzyklusprozessen am G1-Checkpoint und während der Mitose beteiligt [4,5,6,7,8,9], und eine erhöhte PGRMC1-Expression wurde bei mehreren Krebsarten mit einer schlechten Prognose in Verbindung gebracht [2, 10,11, 12,13,14,15].

Vorhergesagte Bindungsstellenmotive für Src-Homologie-2-(SH2)- und Src-Homologie-3-(SH3)-Proteine ​​in PGRMC1 können möglicherweise durch Phosphorylierung an benachbarten Caseinkinase-2-(CK2)-Konsensusstellen negativ reguliert werden [2, 16, 17]. Während jedoch der CK2-Knockdown zu einer reduzierten Phosphorylierung der entsprechenden C-terminalen CK2-Stelle von PGRMC2 führt, wurde die PGRMC1-Phosphorylierung an S181 durch den CK2-Knockout in C2C12-Maus-Myoblastenzellen nicht beeinflusst [18]. Diese und Y180 können alle in vivo phosphoryliert werden und bilden ein potenziell reguliertes Signalmodul [19].

Wir stellten die Hypothese auf, dass PGRMC1 ein Signal-Hub-Protein mit weitreichenden Auswirkungen auf die Zellbiologie ist [2, 19, 20, 21]. Das hochkonservierte Motiv der Y180/S181-Phosphorylierung entstand früh in der Tierevolution gleichzeitig mit dem embryologischen Organisator der Gastrulation (z. B. Spemann-Mangold-Organisator) und vor der Evolution der Deuterostome [20, 22]. Da alle Nachkommen des Organismus, der zuerst S181 erworben hat, eine bilaterale Körpersymmetrie aufweisen, war diese Mutation älter als die Regeln für das Zellwachstum und die Zellteilung, was zu einem bilateralen Körperplan und mehr Gewebearten führte. Die Mechanismen, die zell- und gewebeartige Differenzierungszustände erzeugen und aufrechterhalten, sind bei Krebs sehr oft gestört [23]. Daher könnte die PGRMC1-Tyrosinphosphorylierung möglicherweise die Funktion und den Differenzierungsstatus von Säugetierzellen stark beeinflussen.

Diese vorliegende Studie wurde durch unsere Entdeckung des unterschiedlichen PGRMC1-Phosphorylierungsstatus zwischen Östrogenrezeptor-positivem und -negativem Brustkrebs veranlasst [24]. PGRMC1 wurde in der hypoxischen Zone duktaler Karzinom-in-situ-Brustläsionen genau zu dem Zeitpunkt und an dem Ort induziert, an dem die Zellen einen Wechsel zum glykolytischen Metabolismus benötigen, der als Warburg-Effekt bekannt ist, was uns eine Warburg-vermittelnde Rolle für PGRMC1 vorhersagt. Darüber hinaus ermöglichte eine PGRMC1-S57A/S181A-Doppel-CK2-Stellenmutante (DM, Abb. 1a) das Überleben der Peroxidbehandlung [24]. Sabbir [25] berichtete kürzlich, dass PGRMC1 eine P4-abhängige metabolische Veränderung induziert, die dem Warburg-Effekt in HEK293-Zellen ähnelt und mit Veränderungen der PGRMC1-Stabilität, posttranslationalen Modifikationen und subzellulären Lokalisationen einhergeht. Die PGRMC1-Regulierung des Glukosestoffwechsels wird durch seine implizierte Vermittlung der plazentaren P4-abhängigen Verschiebung vom aeroben zum anaeroben Glukosestoffwechsel bei Gestationsdiabetes [26], die Assoziation mit dem Insulinrezeptor und Glukosetransportern [27] und der wahrscheinlichen Beteiligung (basierend auf AG -205 Sensitivität) bei P4-vermitteltem Anstieg der neuronalen Glykolyse [28].

Die Morphologie der MIA PaCa-2-Pankreaskrebszellen wird durch den Phosphorylierungsstatus von PGRMC1 beeinflusst. ein Für diese Figur konstruierte PGRMC1-HA-Proteine. TMH: Transmembranhelix. HA: das C-terminale 3x Hämagglutinin-Tag. B Nachweis exogener PGRMC1-Expressionsniveaus durch Western-Blot (oberes Feld). Gleiche Beladung wird durch Quantifizierung von Beta-Aktin (unteres Feld) kontrolliert. Die Ergebnisse zeigen drei völlig unabhängige stabil transfizierte Zelllinien pro Plasmid aus (A). Offener Pfeil: Exogenes PGRMC1-HA (Bsp.). Schattierter Pfeil: endogenes PGRMC1 (Ende). Gefüllter Pfeil: Beta-Aktin. Die Molekulargewichtsleiter ist Bio-Rad 1610377 Dual Xtra Standards. C Boxplot-Quantifizierung von Replikatgelen von (B) mit Signalen, die auf Beta-Aktin aus den gleichen jeweiligen Bahnen normalisiert sind. n = 4 Spuren für MP und n = 6 für WT, DM und TM (Replikate der jeweiligen Zeilen 1-3 pro Bedingung). Es gab keine signifikanten Unterschiede (ns) mit Ausnahme der exogenen Bande in MP (ANOVA, post-hoc Dunnet’s T3). D Western-Blot-Quantifizierung von HA-markiertem exogenen PGRMC1, nach B, aber Nachweis von PGRMC1 mit Anti-HA-Antikörper. Die Molekulargewichtsleiter ist Abcam ab116028 Prestained Protein Ladder. e Die Expression des mutierten Proteins PGRMC1 verändert die Zellmorphologie von MIA PaCa-2. PGRMC1-HA-exprimierende stabile Zellen (entsprechende Linien 1 von B) oder MP-Zellen wurden mit einem FITC-markierten Anti-HA-Antikörper (Anti-HA) gefärbt und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. DNA wurde mit DAPI gefärbt. Zellen wurden auch im Differentialinterferenzkontrast (DIC)-Mikroskopiemodus abgebildet. Die jeweiligen linken Felder zeigen zusammengeführte Bilder aller 3 Kanäle. F Der abgerundete Phänotyp der Doppel- und Dreifachmutante (E) wurde nach 125 μM ROCKI-Zugabe in einen verlängerten Phänotyp umgekehrt, jedoch nicht durch Zugabe von DMSO-Vehikelkontrolle

Wir haben zuvor beobachtet, dass MIA PaCa-2-Pankreaskrebszellen (MP) [29,30,31,32] deutliche morphologische und metabolische Veränderungen aufwiesen, wenn das DM-Protein exprimiert wurde [33]. MP-Zellen existieren in Kultur als gemischte adhärente Population mit verlängerter „fibroblastenförmiger“ Morphologie, eine Minderheitspopulation mit abgerundeter Morphologie mit blasenartigen Vorsprüngen und einigen mehrzelligen Klumpen sowie einigen runden Suspensionszellen. Sie haben einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen [34] und können weiter einen mesenchymal-amöboiden Übergang (MAT) durchlaufen, der eine Rho-Kinase-(ROCK)-abhängige morphologische Veränderung von „länglichen“ mesenchymalen Zellen zu abgerundeten amöboiden Zellen erfordert [35].

Hier haben wir mutagen die Auswirkungen eines veränderten PGRMC1-Phosphorylierungsstatus auf MP-Zellen untersucht, um Einblicke in die PGRMC1-abhängige Signalgebung in vitro zu gewinnen, was eine wichtige Rolle für Y180 aufzeigt. Unser Ziel war es, zunächst die Auswirkungen von Mutationen an den beiden mutmaßlich negativen regulatorischen Phosphorylierungsstellen von DM, S57 und S181, auf die Zellbiologie zu charakterisieren sowie die Mutation von Y180, das das Zentrum eines mutmaßlichen SH2-Zielmotivs bildet, um die Hypothese zu testen, dass die DM Effekt erforderlich Y180. Wichtig ist, dass diese Untersuchung auf ein In-vivo-System, insbesondere ein subkutanes Maus-Xenotransplantat-Tumorgenesemodell, ausgeweitet wurde, um den Bedarf von Y180 für die Tumorentwicklung in einer komplexen Umgebung zu adressieren. In einer Begleitpublikation [36] beschreiben wir Unterschiede im Metabolismus, genomischen Mutationsraten und epigenetischen genomischen CpG-Methylierungsniveaus im Zusammenhang mit den in dieser Studie beschriebenen PGRMC1-Phosphorylierungsmutanten.


MATERIALEN UND METHODEN

Erzeugung von Zelllinien

Rat1-Fibroblasten wurden unter Verwendung von LipofectAMINE PLUS (Life Technologies, Rockville, MD) nur mit 1,05 µg pPUR (Clontech, Palo Alto, CA) transfiziert oder mit 0,05 µg pPUR und 1,0 µg pKH3-p190RhoGAP oder pKH3-p190RhoGAP . cotransfiziert R1283A (Tatsis et al., 1998) und dann in 10 µg/ml Puromycin (Sigma, St. Louis, MO) selektiert. Klonlinien wurden etabliert und auf Expression durch Immunblotting mit monoklonalen Antikörpern gegen Hämagglutinin-Epitop (HA Covance, Richmond, CA) und p190RhoGAP (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY) gescreent. Zehn pPUR-Klone (Mock), fünf HA-p190RhoGAP R1283A-Klone (p190-RA) und drei HA-p190RhoGAP-Klone (wt-p190) mit ähnlichen Expressionsniveaus wurden gepoolt. Die Zellen wurden in DMEM gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum (Life Technologies), Antibiotika und 10 &mgr;g/ml Puromycin ergänzt war.

Für alle Experimente wurden die Zellen am Tag vor den Experimenten in Abwesenheit von Puromycin erneut plattiert, trypsiniert, zweimal in DMEM gewaschen und dann vor dem Plattieren für 1 h in DMEM und 0,5% fettsäurefreiem Rinderserumalbumin (Sigma) suspendiert. Die Beschichtungsoberflächen wurden über Nacht bei 4°C mit 20 μg/ml Fibronektin (Life Technologies) beschichtet, gefolgt von einer Blockierung für 1 h mit 0,5% fettsäurefreiem Rinderserumalbumin. RhoA-Hemmung wurde durch Einführung von C3-Transferase erreicht, wie zuvor beschrieben (Renshaw et al., 1996). Kurz gesagt, 12 μg (Spreading-Assays) oder 34 μg (RhoA-Assays) C3-Transferase oder Glutathion S-Transferase (GST als Negativkontrolle) wurden mit 25 µl LipofectAMINE und 200 µl DMEM für 15 min gemischt und dann zu einer 10-cm-Schale mit subkonfluenten Zellen in 5 ml DMEM für 90 min gegeben. RhoA wurde durch Transfektion von Zellen mit 0,5 µg PAX142-LscD4-HA (Whitehead et al.(1996), einen Expressionsvektor, der eine konstitutiv aktive Mutante des RhoA-Austauschfaktors Lsc codiert. Als Negativkontrolle für die Transfektion wurden Zellen mit pEGFP-C1 (Clontech) transfiziert.

RhoA-Aktivitätsassay

Die RhoA-Aktivität wurde mit einer ähnlichen Technik wie der von Ren . beschriebenen Methode gemessen et al. (1999). Kurz gesagt wurden die Zellen in 300 ul 50 mM Tris, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;2, 500 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 0,5 % Desoxycholat, jeweils 10 &mgr;g/ml Aprotinin und Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 200 &mgr;M Vanadat. Lysate (500–750 μg) wurden bei 16.000 × . geklärt g für 5 min, und der Überstand wurde für 30 min rotiert mit 30 µg GST-RBD (GST-Fusionsprotein, das die RhoA-bindende Domäne [Aminosäuren 7–89] von Rhotekin enthält) gebunden an Glutathion-Sepharose-Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Die Proben wurden dreimal in 50 mM Tris, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;2, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 und Inhibitoren und dann mit monoklonalen RhoA-Antikörpern (BD Transduction Laboratories) immungeblottet. Ganzzelllysate wurden auch auf RhoA als Beladungskontrollen immungeblottet.

Immunfluoreszenz

Zellen auf Deckgläsern wurden 15 min in 3,7 % Formaldehyd fixiert und dann 5 min in 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert. Texas Red-Phalloidin und Hoechst 33342 von Molecular Probes (Eugene, OR) wurden verwendet, um F-Aktin bzw. Kerne zu markieren. Monoklonale Antikörper gegen HA (Covance) oder GM130 (BD Transduction Laboratories) wurden verwendet, gefolgt von einer Inkubation mit Fluoresceinisothiocyanat-Esel-Anti-Maus-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Die Bilder wurden auf einem Axiophot-Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) unter Verwendung einer MicroMAX 5-MHz-gekühlten ladungsgekoppelten Gerätekamera (Princeton Instrument, Trenton, NJ) und der Metamorph Image-Software (Universal Imaging, West Chester, PA) aufgenommen. .

Ausbreitungsassay

Suspended cells were plated on fibronectin-coated coverslips for 10, 20, 30, 45, 60, and 180 min. Coverslips were fixed and stained with Coomassie blue (2% Brilliant Blue [Sigma], 45% methanol, and 10% acetic acid) for 10 min and then washed with water and mounted. The relative areas of individual cells from Metamorph images were quantified with the use of National Institutes of Health Image software. Data from these and all other experiments were considered significantly different if the p values, as determined by two-tailedT-tests, were <0.05.

Migration Assay

The top and bottom surfaces of 8-μm pore, 6.5-mm polycarbonate Transwell filters (Corning Costar, Corning, NY) were coated with fibronectin. Cells (2.0 × 10 4 ) were seeded on the upper surface of the filters and migration was allowed to proceed for 3 h. Cells were fixed, stained with Coomassie blue, and the number of cells per 25× field on the lower surface of the filters was counted. For some experiments Rho kinase was inhibited with 3 μM Y-27632 (Uehata et al., 1997b Welfide, Osaka, Japan).

Monolayer Wound Healing and Polarity Assay

Cells (4.0 × 10 5 ) in serum-free medium were seeded on fibronectin-coated coverslips in 24-well plates and allowed to adhere for 1 h. The monolayer was then wounded with a rubber policeman. Cells were washed once, fresh serum-free media was added, and the cells were allowed to invade the wound for 2 h (polarity assay) or 3 h (morphology assay) before fixation. Nuclei, F-actin, and the Golgi were labeled as described above with Hoechst 33342, phalloidin, and GM130 antibodies, respectively. Cells bordering the wound were considered polarized if the Golgi was orientated toward the wound-side of the nucleus (Kupfer et al., 1982).


Novel insights into how autophagy regulates tumor cell motility

Metastasis requires tumor cells to overcome a series of challenges to successfully travel to and colonize new microenvironments. As an adaptive (or maladaptive) response to stress, macroautophagy/autophagy has garnered increasing interest with respect to cancer metastasis, supported by clinical observations of increased autophagic flux in distant metastases relative to primary tumors. Recently, we identified a new role for autophagy in tumor cell motility through the turnover of focal adhesions, large multi-protein structures that link extracellular matrix-bound integrins to the cytoskeleton. The disassembly of focal adhesions at the cell rear is critical to forward movement and successful migration/invasion. We demonstrated that the focal adhesion protein PXN (paxillin), which serves as a crucial scaffolding and signal integrator, binds directly to LC3B through a conserved LC3-interacting region (LIR) motif to stimulate focal adhesion disassembly and metastasis and that this interaction is further promoted by oncogenic SRC.

We identified a specific requirement for autophagy in cell motility during metastasis that is independent of effects on proliferation or viability using an orthotopic murine model of metastatic mammary cancer. Unlike in many other models, the inhibition of autophagy has no effect on primary tumor growth, possibly due to the highly aggressive nature of the tumor model employed. However, autophagy-deficient cells are unable to metastasize from the primary tumor due to the inability to disassemble focal adhesions as the result of increased levels of PXN. Reducing PXN levels restores both focal adhesion morphology and motility, demonstrating that the motility defects in autophagy-deficient cells are due to the inability to degrade PXN and thus properly regulate focal adhesion dynamics.

The interaction of cargo destined for autophagic degradation with LC3/Atg8-related molecules at the elongating phagophore is mediated through LIR motifs characterized by the conserved sequence [W/F/Y]-xx-[L/I/V]. We have added to the ever-growing list of LIR-containing proteins with the identification of an evolutionarily conserved LIR motif at residues 40� (YQEI) in the N-terminal region of PXN. In vitro binding assays demonstrated a direct interaction between LC3B and PXN, and the PXN LIR motif is required for LC3B-PXN colocalization and co-immunoprecipitation in metastatic cells. Contrary to other reports, we observed no requirement for the SQSTM1/p62 or NBR1 cargo receptors in PXN degradation.

Given the utility of autophagy for degrading large macromolecular structures and PXN's role as a scaffolding protein within focal adhesions, our work suggests that PXN acts as an autophagy cargo receptor for focal adhesions, forming a bridge between phagophore-bound processed LC3B and focal adhesion proteins. Indeed, other groups have also observed elongating phagophores at focal adhesions. Alternatively, autophagy may siphon PXN from focal adhesions to promote focal adhesion disassembly, although ongoing work in our lab suggests that PXN localization at focal adhesions is required for interaction with LC3B, possibly because of additional direct or receptor-mediated interactions between phagophores and other focal adhesion proteins, including autophagy-regulated proteins such as SRC. Whether autophagic degradation of PXN represents a unique method of regulation in metastatic cells or a general requirement in cell motility remains to be determined.

Interactions of LIR-containing proteins with LC3 can be regulated by post-translational modifications, including phosphorylation both around (e.g., in the cases of OPTN and BNIP3) and within (e.g., in the case of FUNDC1) the LIR motif. The +1 residue of the PXN LIR motif, Y40, is an experimentally validated but previously uncharacterized target of SRC, a known modulator of PXN and focal adhesion turnover. We demonstrated that oncogenic SRC strongly promotes the PXN-LC3B interaction in a manner dependent on Y40 but independent of canonical SRC phosphorylation at Y31 and Y118. In conjunction with observations that the interaction is dependent on SRC kinase activity, these data suggest that phosphorylation of the LIR Y40 residue promotes the PXN-LC3B interaction, in contrast to negative SRC regulation of the FUNDC1-LC3 interaction. Interestingly, we observed that a Y40E phosphomimetic PXN mutant is highly unstable in cells, consistent with increased autophagic turnover of PXN phosphorylated on Y40. However, we cannot exclude the possibility that the SRC effect on focal adhesion disassembly involves the phosphorylation of other sites or proteins. Most intriguingly, the ability of oncogenic SRC to promote migration/invasion was completely abrogated in the absence of intact autophagy, which represents the first suggestion that autophagy may be critical to SRC-mediated motility ( Fig. 1 ).

Novel role for autophagy downstream of oncogenic SRC in promoting focal adhesion disassembly and tumor cell motility. Analyses from primary human cancers and data from genetically engineered mouse models link autophagy to tumor progression to metastasis. However, the molecular mechanisms by which autophagy promotes metastasis are relatively unknown. Our work contributes to a greater understanding of how autophagy promotes metastasis by identifying a critical role for autophagy in metastatic breast and melanoma cells in stimulating focal adhesion disassembly and tumor cell motility. This was achieved through autophagic targeting and degradation of PXN, a critical focal adhesion protein that we show interacts directly with LC3B at the phagophore. Significantly in terms of tumorigenesis, this direct protein-protein interaction between PXN and LC3B is strongly enhanced by oncogenic SRC and, indeed, we also showed that functional autophagy is required for SRC-induced migration and invasion by metastatic tumor cells.

SRC is frequently activated or overexpressed in solid tumors. Although not a primary driver of tumorigenesis, SRC has been suggested to play a critical role in bone metastases in breast cancer. Thus, SRC inhibitors such as dasatinib may represent an effective means of halting metastasis of breast and other cancers, and improved SRC inhibitors with increased selectivity and efficacy are currently being developed. Although clinical trials indicate that SRC inhibitor monotherapy may be ineffective in cancer therapy, our work suggests that autophagy inhibitors may potentiate SRC therapy by targeting a specific requirement for autophagy in SRC-regulated focal adhesion turnover. The potential to prevent tumor cell metastasis could prove to be highly useful within the context of ductal carcinoma in situ (DCIS) and other isolated primary tumors.

Our work has focused on the role of autophagy in focal adhesion turnover in metastatic cells ( Fig. 1 ). There is a growing body of work linking autophagy to different stages of the metastatic cascade, including the secretion of pro-migratory factors, epithelial-to-mesenchymal acquisition, and anoikis resistance. With respect to migration, autophagy exhibits reciprocal regulation of the RHO family of GTPases and cytoskeletal dynamics, and may be involved in the intracellular degradation of extracellular matrix components. As in primary tumor growth, the effect of autophagy on motility is likely to differ among cell types, and our work indicates that SRC status may dictate which cells rely on autophagy for turnover of focal adhesions. It will be interesting to determine whether autophagic focal adhesion turnover and the requirement for intact autophagy in SRC-stimulated motility are required during nonpathological wound healing or immune cell migration. Indeed, autophagy is well-positioned to act as a key regulatory node that allows cells to respond to extracellular or intracellular conditions by balancing cell movement to nutrient-replete areas or metastatic niches with motility arrest, and prosurvival autophagy or cellular death. Future work exploring autophagy in the context of physiological and pathological cell migration will likely reveal many more connections between autophagy and cell motility.


Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

Howard Hughes Medical Institute, Children's Hospital, Harvard Medical School, Enders 1309, 320 Longwood Avenue, Boston, 02115, Massachusetts, USA

Dejian Ren, Betsy Navarro, Alexander C. Jackson, Shyuefang Hsu, Qing Shi & David E. Clapham

Massachusetts General Hospital and Department of Obstetrics, Vincent Center for Reproductive Biology, Gynecology and Reproductive Biology, Harvard Medical School, Boston, 02114, Massachusetts, USA


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Interferon-Inducible Protein 9 (CXCL11)-Induced Cell Motility in Keratinocytes Requires Calcium Flux-Dependent Activation of μ-Calpain

FEIGE. 1. IP-9expressed in wounded keratinocytes induces motility of undifferentiatedkeratinocytes (HEKn cells) (a) and immortalized keratinocytes(HaCaT cells) (b) expressing both calpain isoforms (c). (a)Early-passage human keratinocytes were tested for induced motility inan in vitro wound healing assay. Cells were treated with EGF (1 nM) orIP-9 (50 ng/ml) and a pharmacological inhibitor of calpain, calpaininhibitor 1 (5 μM), throughout the assay. The values are shownas the ratio of EGF (1 nM)-induced cell motility. The values are means±standard error of the mean of three independent studies eachperformed in triplicate. Statistical analysis was performed byStudent's T Prüfung. (b) Human immortalized keratinocytes,HaCaT cells, were treated with EGF (1 nM) or IP-9 (50 ng/ml)and calpain inhibitor 1 (5 μM) throughout the assay. The valuesare mean ± standard error of the mean of three independentstudies, each performed in triplicate. Statistical analysis wasperformed by Student's T Prüfung. (c) Casein zymographydemonstrates that both HEKn and HaCaT keratinocytes possesspotential calpain activity from both ubiquitous isoforms. Proteins(approximately 40 μg) from both HEKn and HaCaTkeratinocytes were electrophoresed into a casein gel and subsequentlyincubated in buffer containing 20 mM MOPS, pH 7.5-5 mM2-mercaptoethanol and calcium (5 mM). Shown here are the Coomassieblue-stained casein gels. Purified porcine M- and μ-calpains (1μg each) served as controls. Images are representative of threeseparate experiments. The data presented in part a are independentlyderived but similar to those publishedbefore(42) the data areprovided herein forcontext. FEIGE. 2. IP-9and EGF activate calpain in undifferentiated keratinocytes.Undifferentiated keratinocytes (HEKn cells) (a) and immortalizedkeratinocytes (HaCaT cells) (b) were tested for calpainactivity following stimulation by IP-9 (50 ng/ml) for 120 min or EGF (1nM) for 10 min by intracellular cleavage of the synthetic substrateBoc-LM-CMAC and subsequent fluorescence, as shown by a representativeexperiment of three to five experiments. (a) The calpain inhibitorcalpain inhibitor 1 (5 μg/ml) and the second calpain inhibitorZ-LLY-FMK (10 μM) were added for 30 min prior to the additionof ligand. (c) The involvement of calpain was confirmed by ex vivo MAP2cleavage in HEKn cells as described. Shown is MAP2 fluorescence overunstimulated cells of two experiments performed in triplicate.Statistical analysis was performed by Student's T test.The Boc-LM-CMAC fluorescence is not cell size dependent, and theaddition of the substrate Boc-LM-CMAC to the cells does not change cellsize or shapesignificantly. FEIGE. 3 . Molecularinterventions downregulate ubiquitous calpains in an isoform-specificmanner. siRNAs targeted against either μ-calpain (a)or M-calpain (b) were transfected into HaCaT cells, and theprotein level of the isoforms was determined 48 h later byisoform-specific immunoblotting. Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) staining demonstrates equal cell loading. Shownis one of up to four similar immunoblots for eachanalysis. FEIGE. 4. IP-9requires μ-calpain for calpain activity. (a and b)IP-9 activates μ-calpain, whereas EGF triggers M-calpain.Undifferentiated primary keratinocytes (HEKn cells) were treated withIP-9 (50 ng/ml) or/and EGF (1 nM) in the presence or absence ofantisense oligonucleotides (20 μM) to M- and μ-calpainor a scrambled oligonucleotide for 8 h to deplete endogenouscalpain (17). IP-9 andEGF were removed, and the oligonucleotides were replenished for anadditional 12 h. Cells were then again stimulated with IP-9or EGF for 120 min and 10 min, respectively, and calpain cleavage ofthe substrate Boc-LM-CMAC was observed. Representative experimentimages (of three experiments) are shown in a and quantified in b.Values are means ± standard errors of the means of twoindependent studies, each performed in duplicate. Statistical analysiswas performed by Student's T Prüfung. (c) siRNAelimination of μ-calpain limits IP-9 induction of BOCfluorescence in HaCaT cells 48 h after transfectionwith isoform-specific siRNA or GFP-targeted siRNA,HaCaT cells were exposed to IP-9 or EGF for 120 min and 10min, respectively, and calpain cleavage of the substrate Boc-LM-CMACwas observed. Representative experiment images (of two experiments) areshown. FEIGE. 5. IP-9requires μ-calpain for cell migration and cell de-adhesion. (a)Antisense downregulation of μ-calpain but not M-calpain blocksIP-9-induced motility of HEKn keratinocytes in an in vitro woundhealing assay. Cells were treated in the presence or absence of EGF (1nM) or IP-9 (50 ng/ml) in the presence of antisense oligonucleotidesdirected against the initiation codon regions of M- andμ-calpain or a scrambled oligonucleotide (not shown) for24 h. Cell motility was calculated as a percentage ofEGF-induced responses in the absence of oligonucleotide exposure.Values are means ± standard errors of the means of threeindependent studies, each performed in triplicate. (b and c)siRNA downregulation of μ-calpain but not M-calpainblocks IP-9-induced motility and siRNA downregulation of M-calpain but not μ-calpain blocks EGF induced motility ofHaCaT cells 48 h after transfection, HaCaTcells were exposed to EGF or IP-9 in an in vitro wound healing assay.The values are shown as the ratio of EGF (1 nM)-induced cell motility.Values are means ± standard errors of the means of threeindependent studies, each performed in duplicate. (d) Antisensedownregulation of μ-calpain blocks IP-9 induced de-adhesion andantisense downregulation of M-calpain blocks EGF induced deadhesion inundifferentiated keratinocytes. Cells were treated with EGF (1 nM) andIP-9 (50 ng/ml) and antisense oligonucleotides specific for M-calpainor μ-calpain for 8 h, recovered in the presence ofantisense oligonucleotides for 14 h, and then stimulated withIP-9 or EGF for 2 h and 30 min, respectively. Values arecalculated as a percentage of precentrifugation cells remainingadherent. Values are means ± standard errors of the means oftwo independent studies, each performed in duplicate. Statisticalanalyses were performed with Student's TPrüfung. FEIGE. 6. IP-9and EGF induce disassembly of vinculin aggregates. HaCaTkeratinocytes were exposed to EGF or IP-9 for 60 min prior to fixingand staining for vinculin by immunofluorescence (a time coursedemonstrated loss of aggregates starting by 30 min data not shown).One subset of cells was exposed to calpain inhibitor 1 during thefactor exposure. In another series of experiments, the keratinocyteswere treated with isoform-specific siRNA to target M- orμ-calpain independently. Vinculin staining was imaged byconfocal microscopy, and representative cells are shown (threeindependent experiments were performed for each inhibitorychallenge). FEIGE. 7. IP-9-inducedFAK cleavage is μ-calpain-dependent. EGF (10 nM) and IP-9 (200ng/ml) stimulation resulted in the appearance of a ≈84-kDacleavage product of FAK as detected by immunoblotting. The appearanceof this fragment was maximal at 30 to 60 min (shown are 30-minchallenges). Concomitant treatment with calpain inhibitor 1 (a) orisoform-specific siRNA (b) reduced the level of this cleavageproduct of FAK. Shown is one of three similar immunoblots for eachsituation. FEIGE. 8. Calciumflux elicited by IP-9 was inhibited by intracellular calcium chelatorBAPTA-AM. (a) Intracellular calcium concentration rose in response toIP-9 stimulation in HaCaT cells. The frames shown were taken60 s after addition of IP-9 or diluent (Notx) BAPTA-AM wasadded 40 min prior to IP-9. HEKn cells demonstrated asimilar, BAPTA-AM-quenchable rise in calcium concentration upon IP-9exposure (data not shown). (b) Representative graph of a single celltrace of fluorescence showing average intracellular calcium in controlcells (middle line) and calcium traces in specific cells showingtransients in IP-9-stimulated cells (top line). No calcium fluxes wereobserved when IP-9 was added along with BAPTA-AM (bottomline). The mean intracellular calcium concentration of all IP-9-treatedcells was greater on average from the control cells (see panel a andalso the movie in the supplemental material), but the average rise incalcium concentration is not provided due to expected temporal offsetsof the peaks in intracellular calcium concentration. Shown is arepresentative experiment of three, each done in triplicate, for bothHaCaT and HEKncells. FEIGE. 9. Intracellularcalcium is required for IP-9-induced calpain activity. Undifferentiatedkeratinocytes were treated in the presence orabsence of IP-9 (50 ng/ml) for 120 min or EGF (1 nM) for 10min and visualized (a) and quantitated (mean ± standard errorof the mean of >15 cells/experiment) (b) for calpainactivity. BAPTA-AM, a membrane-permeant acetoxymethyl ester of anintracellular calcium chelator, was used to determine the requirementof intracellular calcium for IP-9-induced calpain activity. BAPTA-AM (5μM) was loaded 30 min prior to Boc-LM-CMAC and in the presenceor absence of EGF and IP-9. This experiment was performed three times.Statistical analysis was performed by Student's T test.(c) A similar experiment was performed in human immortalizedkeratinocytes (HaCaT cells) to reproduce the results obtainedwith undifferentiatedkeratinocytes. FEIGE. 10. ERKis required for EGF-induced cell migration. a) EGF (1 nM, 10 min) butnot IP-9 (50 ng/ml, 120 min) induces ERK MAP kinase in undifferentiatedkeratinocytes. Forskolin (25 μM, 15 min prior to ligand) servedas an independent activator of cyclic AMP. Activation of ERK wasdetermined by immunoblotting equal protein lysates for phospho-ERK. (b)Pharmacological inhibition of MAP kinase kinase with PD98059 (2μM, 30 min prior to ligand) prevents EGF-induced calpaincleavage of the Boc-LM-CMAC substrate. Images are representative ofthree experiments. (c) PD98059 (2 μm) blocked cell migration inundifferentiated keratinocytes induced by EGF (1 nM) but not IP-9 (50ng/ml) (n =3). Statistical analysis was performed byStudent's TPrüfung. FEIGE. 11. IP-9-inducedcell migration requires PLC-dependent calpain activation. (a)Pharmacological inhibition of all PLC isoforms by U-73122 (2μM) blocked both EGF- and IP-9-induced cell motility inundifferentiated keratinocytes. The values are shown as ratios of theEGF (1 nM)-induced cell motility. Thevalues are means ± standard errors of the means of sixindependent studies, each performed in triplicate.Statistical analysis was performed by Student'sT Prüfung. (b) Undifferentiated keratinocytes were tested forcalpain activity following stimulation by IP-9 (50 ng/ml) for 120 minor EGF (1 nM) for 10 min. The pan-PLC inhibitor ET-18-OCH3 (100 nM) andthe phospholipase D inhibitor propranolol (100 μM) (as anonspecific control in addition to molecular downregulation) were addedfor 30 min prior to the addition of ligand. Calpain activity wasmonitored by intracellular cleavage of the syntheticsubstrate Boc-LM-CMAC and subsequent fluorescence. Shown isa representative experiment of three to fiveexperiments. FEIGE. 12 . PLC-β3signaling is required for IP-9 induced calpain activation and motility.Undifferentiated keratinocytes were grown in the presence orabsence of antisense oligonucleotides (20 μM) to PLC-β3(or PLC-γ1) for 48 h in quiescence medium. After thistime, cells were stimulated with IP-9 (50 ng/ml) or EGF (1nM) for 120 min or 10 min, respectively, and calpain cleavage of thesubstrate Boc-LM-CMAC was ob served. Representativeexperiment images (of three experiments) are shown (a) and quantified(mean ± standard error of the mean of >15cells/experiment) (b). Statistical analysis was performed byStudent's T Prüfung. (c) PLC-β3 levels were assessedby immunoblotting cells exposed to specific (antisense PLC-β3)or irrelevant (trnfx control) oligonucleotides. Shown is arepresentative of at least three such immunoblots. trnfx,transfection.

Materialen und Methoden

Algal culture and experimental setup

For the experiments, cultures of the unicellular photosynthetic freshwater flagellate Chlamydomonas nivalis (F. A. Bauer) Wille 1903 are used. They are grown by inoculating 1 ml of a logarithmic phase culture into 50 ml of Bold's basal medium + 5% sterilized soil extract. The culture is kept at 23.4°C under a light of about 6000 lux=8.8 W m –-2 from cool, white-tone fluorescent lights turned on for 16 h a day. Measurements are performed 2 weeks after the inoculation of the culture. Microscopic observation shows that the diameter of an individual cell in these cultures lies in the range 3–5 μm.

The experimental setup used is generally similar to the one described in Vladimirov et al. (2000), see Fig. 1A. An argon ion laser with a wavelength of 514 nm (green) and light intensity of 1400 W m –2 is the only light source in the experiments. Laser light passes through a cylindrical lens and a diaphragm, which produces a vertically oriented light sheet with a cross-section of 14 mm×1.5 mm. The laser sheet is directed along the plane of symmetry of the vertically positioned test tube of rectangular cross-section(Fig. 1B) containing medium and algal cells. A mirror is placed behind the test tube to make the cells'illumination symmetric, thus avoiding bias in their self-swimming. Images are acquired with a Kodak Megaplus 1.4 CCD camera, resolution of 1316×1034 pixels 2 . The laser, optical system and acquisition system belong to a Particle Image Velocimetry (PIV) System (TSI Inc., Shoreview, MN, USA).


Motility, the ability of an organism to move independently, using metabolic energy, [2] [3] can be contrasted with sessility, the state of organisms that do not possess a means of self-locomotion and are normally immobile. Motility differs from mobility, the ability of an object to be moved. Der Begriff vagility encompasses both motility and mobility sessile organisms including plants and fungi often have vagile parts such as fruits, seeds, or spores which may be dispersed by other agents such as wind, water, or other organisms. [4]

Motility is genetically determined, [5] but may be affected by environmental factors such as toxins. The nervous system and musculoskeletal system provide the majority of mammalian motility. [6] [7] [8]

In addition to animal locomotion, most animals are motile, though some are vagile, described as having passive locomotion. Many bacteria and other microorganisms, and multicellular organisms are motile some mechanisms of fluid flow in multicellular organs and tissue are also considered instances of motility, as with gastrointestinal motility. Motile marine animals are commonly called free-swimming, [9] [10] [11] and motile non-parasitic organisms are called free-living. [12]

Motility includes an organism's ability to move food through its digestive tract. There are two types of intestinal motility – peristalsis and segmentation. [13] This motility is brought about by the contraction of smooth muscles in the gastrointestinal tract which mix the luminal contents with various secretions (segmentation) and move contents through the digestive tract from the mouth to the anus (peristalsis). [14]

At the cellular level, different modes of movement exist:

    , a swimming-like motion (observed for example in spermatozoa, propelled by the regular beat of their flagellum, or the E coli bacterium, which swims by rotating a helical prokaryotic flagellum) , a crawling-like movement, which also makes swimming possible [16][17] , a form of motility used by bacteria to crawl over surfaces using grappling hook-like filaments called type IV pili. , enabling movement of the axonalgrowth cone[18]

Many cells are not motile, for example Klebsiella pneumoniae und Shigella, or under specific circumstances such as Yersinien pestis at 37 °C. [ Zitat benötigt ]

Events perceived as movements can be directed:

  • along a chemical gradient (see chemotaxis)
  • along a temperature gradient (see thermotaxis)
  • along a light gradient (see phototaxis)
  • along a magnetic field line (see magnetotaxis)
  • along an electric field (see galvanotaxis)
  • along the direction of the gravitational force (see gravitaxis)
  • along a rigidity gradient (see durotaxis)
  • along a gradient of cell adhesion sites (see haptotaxis)
  • along other cells or biopolymers

Muscles give the ability for voluntary movement, and involuntary movement as in muscle spasms and reflexes). At the level of the muscular system, motility is a synonym for locomotion. [19] [20]

Most sperm have a single flagellum to help them swim. The cervical, uterine, and fallopian linings of the female reproductive system play a more important role in transporting sperm to ova.

The record speeds cheetahs hold are owed in large to their muscle motility.

The shoots of plants move by growing towards light. This is known as positive phototropism. The roots grow away from light. This is known as negative phototropism.

Monocytes and macrophages of the immune system engulf Bacteria by extending their pseudopodia. Note that this cartoon is not an accurate representation of phagocytosis.

Motility at the sub-cellular level. This depicts translation - a motile nanoscale molecular process using protein dynamics.