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Hinzufügen des Propionyl-CoA-Pfads zu E.coli

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Also versuche ich die Produktion von 3-Hydroxypropionsäure mit E.coli über den Propionyl-CoA Pathway zu simulieren. Ich bin mir jedoch nicht wirklich sicher, wie die Produktion im Pfad abläuft. Ich habe folgendes Bild bekommen:

Wenn ich es richtig verstehe, geht der Weg: Acetyl-Coa --> Propionat --> Propionyl-CoA -->… --> 3-HP Wenn diese Reaktionen in Cobra addiert werden, sind die stöchiometrischen Koeffizienten immer nur 1?


Quelle der Abbildung: Luo H, Zhou D, Liu X, Nie Z, Quiroga-Sánchez DL, Chang Y (2016) Production of 3-Hydroxypropionic Acid via the Propionyl-CoA Pathway Using Recombinant Escherichia coli Stämme. PLoS ONE 11(5): e0156286. doi:10.1371/journal. pone.0156286


Wenn ich es richtig verstehe, geht der Weg: Acetyl-CoA --> Propionat --> Proprionyl-CoA -->… --> 3-HP

Nicht genau. Die erste Reaktion ist: $Propionat + Acetyl extrm-CoA ightarrow Propionyl extrm-CoA + Acetat$ Die CoA-Gruppe wird von Acetat auf Propionat übertragen. Die folgenden Reaktionen sind eine Oxidation zu Acryloyl-CoA und eine anschließende Hydratation zu 3-HP-CoA. Zuletzt wird die CoA-Gruppe zurück auf Acetat übertragen.

Propionat ist ein 3-Kohlenstoff-Molekül, ebenso 3-HP. Stöchiometrische Koeffizienten von 1 erscheinen also logisch.


Propionyl-CoA:Succinat-CoA-Transferase

<p>Der Annotations-Score bietet ein heuristisches Maß für den Annotationsinhalt eines UniProtKB-Eintrags oder -Proteoms. Dieser Wert kann <strong>nicht</strong> als Maß für die Genauigkeit der Anmerkung verwendet werden, da wir nicht die 'richtige Anmerkung' für ein bestimmtes Protein definieren können.<p><a href='/help/annotation_score' target='_top'> Mehr. </a></p> - Experimenteller Beweis auf Proteinebene i <p>Dies zeigt die Art des Beweises an, der die Existenz des Proteins unterstützt. Beachten Sie, dass der Nachweis der 'Proteinexistenz' keine Informationen über die Genauigkeit oder Korrektheit der angezeigten Sequenz(en) liefert.<p><a href='/help/protein_existence' target='_top'>Mehr. </a></p>

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Abstrakt

Wir haben bereits berichtet in vivo Biosynthese von 2-Hydroxysäure-haltigen Polyestern einschließlich Polymilchsäure (PLA), Poly(3-hydroxybutyrat-co-Laktat) [P(3HB-co-LA)] und Poly(3-hydroxybutyrat-co-2-Hydroxybutyrat-co-Laktat) [P(3HB-co-2HB-co-LA)] mit metabolisch veränderten Escherichia coli Stämme durch die Einführung von evolved Clostridium propionicum Propionyl-CoA-Transferase (PctCp) und Pseudomonas sp. MBEL 6-19 Polyhydroxyalkanoat (PHA)-Synthase 1 (PhaC1PS6–19). In dieser Studie haben wir weiter entwickelt in vivo PLA-Biosynthesesystem in E coli 2HB-haltiges PHA zu synthetisieren, in dem Propionyl-CoA als Vorstufe für 2-Ketobutyrat verwendet wurde, das durch die sequentiellen Aktionen von . in 2HB-CoA umgewandelt wurde Lactococcus lactis ( d )-2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (PanE) und PctCp und dann wurde 2HB-CoA durch PhaC1 . polymerisiertPS6–19. Die rekombinante E coli XL1-blau drückt die aus phaC1437 Gen, das pct540 Gen, und die Ralstonia eutropha prpE Gen zusammen mit dem Feld Gen konnte auf 0,66 g/l gezüchtet werden und produzierte erfolgreich P(70 mol%3HB-co-18 mol%2HB-co-12 mol%LA) bis zum PHA-Gehalt von 66 Gew.% ab 20 g/L Glucose, 2 g/L 3HB und 1 g/L Natriumpropionat. Entfernung des prpC Gen im Chromosom von E coli XL1-blue konnte den Molanteil von 2HB im Copolymer erhöhen, aber der PHA-Gehalt wurde verringert.

Die hier berichtete metabolische Engineering-Strategie legt nahe, dass Propionyl-CoA erfolgreich als Vorläufer verwendet werden kann, um PHA-Synthase mit 2HB-CoA für die Produktion von PHAs, die 2HB-Monomer enthalten, bereitzustellen.


Poly(3-hydroxypropionat) [poly(3HP)] ist ein vielversprechendes Monomer der Polyhydroxyalkanoat (PHA)-Familie mit ähnlichen Materialeigenschaften wie andere kurzkettige PHAs (SCL) wie Poly(3-hydroxybutyrat) [poly(3HB)]. Es ist ein gut charakterisierter Polyester, biologisch abbaubar, biokompatibel und hat ausgezeichnete mechanische Eigenschaften wie hohe Flexibilität, hohe Zugfestigkeit und hohe Steifigkeit, aber stabiler als Polymilchsäure (Andree෾n et al., 2010, 2014b). Die Biosynthese von Poly(3HP)-Homopolymeren rückte 2010 ins Rampenlicht, wobei Glycerin als Kohlenstoffquelle in einer zweistufigen Fed-Batch-Fermentation verwendet wurde, und erwies sich als vielversprechender alternativer Kunststoff auf petrochemischer Basis.

Innerhalb eines halben Jahrhunderts wurde Glycerin, ein Nebenprodukt der Biodieselproduktion, zu einer gemeinsamen Kohlenstoffquelle für mehrere biotechnologische Forschungen weltweit. Aufgrund der Umweltverschmutzung im Zusammenhang mit der petrochemischen Industrie, die zu Klimawandel und überausgenutzten fossilen Reserven führt, müssen biologische Ansätze durch Metabolic Engineering verwendet werden, um viele Chemikalien aus nicht erneuerbaren Quellen unter Verwendung kostengünstiger und reichlich vorhandener Rohstoffe herzustellen (Keasling, 2010).

Die Wirksamkeit und der Erfolg der biologischen Produktion einer Plattformchemikalie wie 3-Hydroxyproponsäure (3-HP) hängen von der Entwicklung mikrobieller Zellfabriken ab, was zu intensiven und umfangreichen Forschungen auf verschiedenen Gebieten wie Biosynthese, Genamplifikation, Engineering von Enzyme, Design des genetischen Schaltkreises, Genome Editing, Bioinformatik, adaptive Laborevolution, Multiomics mit geeigneten Wirten und Biosynthesewege von Mikroorganismen durch den Prozess namens �sign-Build-Test-Learn (DBTL)”-Zyklen (Li et al., 2012 Abatemarco et al., 2013 Cheong et al., 2015 Wu et al., 2016). Um diese Prozesse über effektive Biosynthesewege zu kommerzialisieren, um wirtschaftlich rentable Produkte zu erhalten, müssen Biosensoren außerdem auf einem geeigneten Stoffwechselweg konstruiert werden, der optimiert ist, um wünschenswerte Ergebnisse zu erzielen (Liu et al., 2015a).

Um die Ausbeuten an PHAs durch synthetische Biotechnologie und Metabolic Engineering zu erhöhen, wurden Metabolit-Biosensoren verwendet, um einen Zielmetaboliten zu erkennen und zu überwachen in vivo durch Hochdurchsatz-Screening (HTS) (Eggeling et al., 2015). Obwohl in früheren Übersichtsartikeln einige Biosynthesewege, Material- und chemische Eigenschaften von Poly(3HP) diskutiert wurden (Andree෾n et al., 2014b Chang et al., 2018), diskutiert dieser Übersichtsartikel jedoch ausführlich die aktuellen Stoffwechselwege, die zur Herstellung von Poly(3HP) aus Glycerin und Glucose verwendet werden. Der Artikel konzentriert sich auch auf den Produktionswirt, den Einsatz von Malonyl-CoA-Biosensoren zur Ertragsoptimierung, die Lebenszyklusbewertung für die Poly(3HP)-Produktion unter Verwendung von Maisöl als Kohlenstoffquelle sowie die physikalischen und chemischen Eigenschaften. Schließlich werden wir einige Anwendungen von poly(3HP) hervorheben.

Polyhydroxyalkanoate sind Klassen intrazellulärer, linearer hochmolekularer aliphatischer bakterieller Speicherpolyester, die biokompatible Thermoplaste sind und von vielen Mikroorganismen zu Kohlendioxid und Wasser biologisch abbaubar sind (Zhang et al., 2018). Physikalische oder materielle Eigenschaften von PHAs ähneln denen von aus Erdöl gewonnenen Kunststoffen, weisen jedoch einige unterschiedliche Eigenschaften auf, die von Sprödigkeit bis hin zu Flexibilität und Elastizität reichen, wie in Tabelle 1 gezeigt (Muhammadi et al., 2015). PHA-Polymere, die Eigenschaften wie Elastizität, Flexibilität, biologische Abbaubarkeit und Erneuerbarkeit aufweisen, hängen stark von diesen Faktoren ab, nämlich (1) ihren Biosynthesewegen zur Herstellung (Masood et al., 2014), (2) monomerer Zusammensetzung (Luzi et al. , 2019) und (3) chemische Struktur (Bugnicourt et al., 2014).

Tabelle 1. Vergleich der thermodynamischen Eigenschaften von Poly (3-HP) im Vergleich zu anderen PHAs-Copolymeren.

Zudem ist die Herstellung von PHAs im Vergleich zu synthetischen Kunststoffen derzeit nicht wirtschaftlich. Um die Produktion bakterieller PHAs kosteneffektiv zu gestalten, müssen einige kritische Faktoren berücksichtigt werden, wie das Screening und die Auswahl potenzieller Bakterienstämme (Kumar et al., 2016, 2020), Synthesewege, fortschrittliche Werkzeuge und Technologien (Mo៎jko- Ciesielska und Mostek, 2019), Kohlenstoff- und Stickstoffquelle (Zahari et al., 2014) und kosteneffiziente nachgelagerte Prozesse (Koller und Braunegg, 2018). Die gezielte Anwendung der PHAs ist auch ein entscheidender Faktor für deren Bedeutung und Wirtschaftlichkeit (Chen et al., 2017 Cao et al., 2019).

Viele Forscher haben in letzter Zeit ihr Interesse an der Herstellung von PHAs geweckt, aufgrund der kostengünstigen Kohlenstoffquellen als Substrat und des gefährlichen Problems, das mit der Entsorgung von Einweg-Kunststoffabfällen verbunden ist (Chen und Patel, 2012).

Früher war die Ringöffnungspolymerisation (ROP) von β-Propiolacton und 3-HP-Esterkondensation die chemischen Verfahren zur Synthese von Poly(3HP). Es gibt keine Hinweise auf einen natürlichen Organismus, der es synthetisieren kann (Wang et al., 2012, 2013 Heinrich et al., 2013).

Poly(3HP) konnte jedoch nicht in großen Mengen kommerziell hergestellt werden, da β-Propiolacton als Substrat krebserregende Eigenschaften hat (Dunn, 2012 Dunn et al., 2016). 3-HP, das eine geringe Kristallinität aufweist, ist ein idealer Vorläufer, der einen Bestandteil für mehrere Copolymere wie Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxypropionat) [Poly(3HB-co-3HP)] oder Poly(3-hydroxypropionat) bildet. co-4-Hydroxybutyrat) [Poly(3HP-co-4HB)] (Zhou et al., 2011 Wang et al., 2013).

3-Hydroxyproponsäure, Acrylat und 1,3-Propandiol (1,3-PDO) wurden zuvor als abhängige Vorstufen für die Biosynthese von Poly(3HP) und 3-HP-haltigem Copolymer verwendet (Gao et al., 2014). Diese teuren Vorstufen und Vitamin B12 erhöhte Poly(3HP)-Produktionskosten, die es wirtschaftlich nicht durchführbar machen.

Künstliche Wege wurden für die Poly(3HP)-Biosynthese aus kostengünstigen Kohlenstoffquellen wie Glukose und Glycerin ohne Zusatz von Vorstufen konstruiert, um die Herausforderungen aufgrund hoher Produktionskosten zu überwinden (Andree෾n et al., 2010). Dennoch wurden nur 13 mg/L Poly(3HP) durch rekombinantes . produziert Escherichia coli Stamm unter Verwendung von Glukose als Substrat. Andree෾n et al. (2010) produzierten 1,42 mg/L Poly(3HP) durch Glycerinumwandlung unter Verwendung einer rekombinanten E coli Stamm mit Glycerin-Dehydratase von Clostridium buytricum DhaB1Cb, Propionaldehyd-Dehydrogenase von Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 (PduPSe) und das PHA-Synthase-Gen von Ralstonia eutropha HI6 (PhaC1Re) in einem zweistufigen Fed-Batch-Fermentationsprozess (Andree෾n et al., 2010).


ERGEBNISSE

Identifizierung des mutmaßlichen Mesaconyl-CoA-Hydratase-Gens.

Frühere Arbeiten zum neuartigen Weg der Acetatassimilation in R. sphaeroides ein essentielles Gen identifiziert, das für ein Enzym des (R)-Enoyl-CoA-Hydratase-Familie (2). Ähnliche Gene wurden in anderen Bakterien gefunden, die mit R. sphaeroides das Fehlen eines funktionellen Glyoxylatzyklus für die Acetatassimilation. Die Gesamtsequenzidentität dieser Proteine ​​mit dem charakterisierten Mitglied dieser sogenannten MaoC- oder FkbR2-Familie, und R-spezifische 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase aus Aeromonas caviae (18), liegt nur im Bereich von 20%. Darüber hinaus beträgt die erwartete Molekülmasse des kodierten Enzyms etwa 38 kDa, was größer ist als die Massen normaler Enoyl-CoA-Hydratasen (14 bis 28 kDa). Ein ähnliches Gen wurde gefunden in C. aurantiacus neben dem Gen, das für l-Malyl-CoA/β-Methylmalyl-CoA-Lyase kodiert. Die Genprodukte von C. aurantiacus und R. sphaeroides hatte 58% identische Aminosäuresequenzen. Sie zeigten zwei Hydratasedomänen, die auf Aminosäureebene nur 25% Identität aufwiesen. Normalerweise enthalten Enoyl-CoA-Hydratasen nur eine solche Domäne. Dies deutet auf eine Genduplikation hin und erklärt auch die größere Größe der Untereinheiten im Vergleich zu anderen Enoyl-CoA-Hydratasen.

Klonen und Ausdruck.

Die vermeintlichen 1,06-kb Chloroflexus Mesaconyl-CoA-Hydratase-Gen, das für ein 38-kDa-Protein (352 Aminosäuren) kodiert, und die 1,02-kb Rhodobakterien Gen kodiert für ein 37-kDa-Protein (343 Aminosäuren). Die Gene beider Bakterien wurden amplifiziert und die erwarteten PCR-Produkte wurden in den Expressionsvektor pET16b kloniert, was zur Codierung für N-terminales His . führte10-markierte Proteine ​​mit veränderten Molekulargewichten von etwa 40 kDa. Beide Plasmide wurden in transformiert E coli DH5α und dann umgewandelt in E coli BL-21(DE3) zur Expression. Als Kontrolle wurde auch der Expressionsvektor ohne Insert transformiert. Beide Gene wurden heterolog exprimiert und die Enzyme waren löslich, wie aus einer induzierten Proteinbande um 40 kDa in der SDS-PAGE der löslichen Zellfraktion abgeleitet wurde (Abb. ​ (Abb.2).

Denaturierende PAGE (12,5%) verschiedener Reinigungsschritte von heterolog exprimierter Mesaconyl-CoA-Hydratase von C. aurantiacus und R. sphaeroides aus Extrakten von 3 g E coli Zellen. Bahnen 1 und 7, Molekulargewichtsstandards, Bahnen 2 bis 4, Chloroflexus Enzymspur 2, Extrakt (100.000 × g Überstand) von induziertem E coli Zellen (45 μg Protein) Bahn 3, Hitzepräzipitationsfraktion (20 μg Protein) Bahn 4, Affinitätschromatographiefraktion (8 μg Protein) Bahnen 5 und 6, Rhodobakterien Enzymspur 5, Extrakt (100.000 × g Überstand) von induziertem E coli Zellen (30 μg Protein) Spur 6, Affinitätschromatographie-Fraktion (8 μg Protein). Das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt.

Spektrophotometrischer Enzymassay.

Die rekombinante l - Malyl-CoA/β-Methylmalyl-CoA-Lyase aus C. aurantiacus wurde in einem gekoppelten spektrophotometrischen Assay verwendet, um Propionyl-CoA und Glyoxylat enzymatisch zu β-Methylmalyl-CoA umzuwandeln, dem Substrat der postulierten Mesaconyl-CoA-Hydratase/β-Methylmalyl-CoA-Dehydratase. Die weitere Umwandlung von β-Methylmalyl-CoA in andere Coenzym-A-Thioester wurde getestet mit E coli Extrakte, die überproduzierte mutmaßliche Mesaconyl-CoA-Hydratase enthalten. Beide Extrakte, die entweder die Chloroflexus oder der Rhodobakterien Genprodukt, katalysierte eine Reaktion, die mit einem Anstieg der Extinktion über 260 nm mit einem Maximum bei etwa 284 nm verbunden war. Da die Proteinabsorption bei dieser Wellenlänge interferierte, verwendeten wir 290 nm, um die Reaktion spektrophotometrisch zu verfolgen (Abb. ​ (Abb.3). 3 ). Die Reaktion war abhängig von Propionyl-CoA, Glyoxylat und l-Malyl-CoA/β-Methylmalyl-CoA-Lyase. Im Gegensatz dazu sind Extrakte von Wildtyp E coli Oder von E coli das Plasmid ohne Insert trug, waren inaktiv.

UV-Spektren von Coenzym A ( .._.. ), Propionyl-CoA (—), β-Methylmalyl-CoA (—) und das Produkt der Hydratase-Reaktion, Mesaconyl-CoA ( ……. ). Die Spektren wurden in 40 mM K . aufgenommen2HPO4/Ameisensäurepuffer, pH 4,2, und wurden auf die gleiche Absorption bei 260 nm normiert.

Bestätigung einer β-Methylmalyl-CoA-transformierenden Enzymaktivität.

Die HPLC-Analyse ergab, dass β-Methylmalyl-CoA fast vollständig verbraucht wurde und ein neues Produkt gebildet wurde (Abb. ​ (Abb.4). 4). Im Gleichgewicht lag das Verhältnis der Konzentrationen von β-Methylmalyl-CoA zum Produkt nahe 1:10. Das Produkt wies immer noch das 260 nm Adeninnukleotid-Absorptionsmaximum auf, das für CoA, Propionyl-CoA oder β-Methylmalyl-CoA charakteristisch ist. Es hatte jedoch bei längeren Wellenlängen eine zusätzliche Extinktionsschulter (Abb. ​ (Abb.3). 3 ). Der geschätzte molare 290-nm-Absorptionskoeffizient dieses Produkts (höchstwahrscheinlich Mesaconyl-CoA) betrug 2.350 M 𢄡 cm 𢄡 , der des Substrats β-Methylmalyl-CoA betrug 200 M 𢄡 cm 𢄡 , und die von Propionyl-CoA betrug ungefähr 200 M 𢄡 cm 𢄡 . Diese Schätzung basiert auf der Annahme, dass die molaren Absorptionskoeffizienten bei 260 nm (ɛ260) des Substrats und des Produkts sind denen von normalen CoA-Estern, wie Acetyl-CoA (16.400 M 𢄡 cm 𢄡 zum Vergleich, die ɛ260 des CoA beträgt 16.800 M 𢄡 cm 𢄡 ) (11). Die Δɛ290 (Mesaconyl-CoA minus β-Methylmalyl-CoA) von 2.150 M 𢄡 cm𢄡 wurde verwendet, um den β-Methylmalyl-CoA-Verbrauch und die Produktbildungsreaktion im spektrophotometrischen Assay zu quantifizieren.

HPLC-Trennung von [ 14 C]Mesaconyl-CoA als Produkt der Mesaconyl-CoA-Hydratase aus [ 14 C]β-Methylmalyl-CoA und [ 14 C]Propionyl-CoA. [ 14 C]β-Methylmalyl-CoA wird enzymatisch aus [ 14 C]Propionyl-CoA und Glyoxylat mit rekombinanter l-Malyl-CoA/β-Methylmalyl-CoA-Lyase gebildet. CoA und seine Derivate wurden bei 260 nm nachgewiesen. Freie Säuren der entsprechenden CoA-Thioester wurden zwischen 2 und 5 min eluiert. (A) Vor der Zugabe von Glyoxylat zum Assay-Gemisch. (B) Zehn Minuten nach Zugabe von Glyoxylat. (C) Bildung von Mesaconyl-CoA nach weiteren 10 Minuten Inkubation mit rekombinanter Mesaconyl-CoA-Hydratase. Die Empfindlichkeiten der 14 C-Detektion durch Festphasen-Szintillationszählung in den verschiedenen Durchläufen waren gleich, und daher können die Signale direkt verglichen werden. Zu den Bedingungen siehe Materialien und Methoden.

Enzymaktivität im Zellextrakt von C. aurantiacus.

Verwendung von überschüssigen Mengen an rekombinanter l-Malyl-CoA/β-Methylmalyl-CoA-Lyase aus C. aurantiacus, Sättigungskonzentrationen von [ 14 C]Propionyl-CoA und einem Überschuss an Glyoxylat, die spezifische Aktivität des Enzymsystems, das markiertes Mesaconyl-CoA aus markiertem Propionyl-CoA in Zellextrakt von . produzierte C. aurantiacus geschätzt werden konnte (55ଌ). Die spezifische Enzymaktivität in Extrakten autotroph gewachsener Zellen betrug je nach Zellcharge 20 bis 30 nmol min 𢄡 mg Protein 𢄡 . Die spezifische Enzymaktivität war in heterotroph gewachsenen Zellen 10- bis 15-fach geringer.

Reinigung rekombinanter Enzyme.

Das meiste Protein wird überproduziert in E coli befand sich in der löslichen Zellfraktion, und die Reinigung begann mit den 100.000 × g Überstand. Für die rekombinante Chloroflexus Enzym, E coli Extrakt wurde für 10 min auf 70ଌ erhitzt, das Enzym aus diesem moderaten Thermophilen blieb aktiv und im Überstand (Abb. ​ (Abb.2). 2 ). Der Überstand (oder Zellextrakt im Fall der rekombinanten) Rhodobakterien Enzym) wurde dann auf einer Ni-Sepharose Hochleistungs-Affinitätssäule chromatographiert. Ab 3 g E coli Zellen (Nassgewicht), 6,4 mg Chloroflexus Enzym mit einer Ausbeute von 87% oder 4 mg Rhodobakterien Enzym mit einer Ausbeute von 52% erhalten (Tabelle ​ (Tabelle11).

TABELLE 1.

Reinigung von rekombinanter His-markierter Mesaconyl-CoA-Hydratase von C. aurantiacus und R. sphaeroides ab 3 g E coli Zellen ein

ReinigungsschrittGesamtenzymaktivität (μmol min 𢄡 )Gesamtprotein (mg)Sp akt (μmol min 𢄡 mg Protein 𢄡 )Wiederherstellung (%)Reinigung (falten)
Zellextrakt−/10,500106−/99−/100−/1
Hitzeniederschlag9.300/−16.5/−560/−100/−1−
Ni-Sepharose Hochleistungs8,100/5,5006.4/4.01,300/1,40087/522.3/14.0

Eigenschaften von Mesaconyl-CoA-Hydratasen.

Die besondere Tätigkeit der Chloroflexus Enzym bei 55ଌ war 1.300 μmol min 𢄡 mg 𢄡 , und das der Rhodobakterien Enzym bei 30ଌ betrug 1.400 μmol min 𢄡 mg 𢄡 . Der Enzymumsatz pro dimerem Enzym basierend auf spezifischen Aktivitäten für die Chloroflexus Enzym war 1.700 s 𢄡 , und das für die Rhodobakterien Enzym war 1.900 s 𢄡 . Beide Enzyme zeigten optimale Aktivität bei pH 7,5 und halbmaximale Aktivität bei pH 6,5 und 8,5 (Daten nicht gezeigt). Die UV-Spektren der Enzyme zeigten nur Absorptionen bei 280 nm. SDS-PAGE zeigte, dass die Enzyme aus ungefähr 40-kDa-Untereinheiten zusammengesetzt waren. Gelfiltration zeigte eine Molekularmasse der nativen Enzyme von etwa 80 kDa an, was auf eine homodimere Struktur schließen lässt.

Isolierung und Strukturaufklärung des Produkts der Umwandlung von 13 C-markiertem β-Methylmalyl-CoA als Mesaconyl-CoA.

Das 13 C-angereicherte Produkt der Umwandlung von [1,2, 3- 13 C]Propionyl-CoA und Glyoxylat durch rekombinante l-Malyl-CoA/β-Methylmalyl-CoA-Lyase und rekombinante Mesaconyl-CoA-Hydratase von C. aurantiacus oder R. sphaeroides wurde durch HPLC-MS analysiert. Das Produkt hatte eine virtuelle Molekülmasse von 877,9 Da, bestimmt durch ESI-MS (negativer Ionenmodus). Dies entspricht einer Molekülmasse von 878,9 Da, was nahe am erwarteten Wert von 878,6 Da für Mesaconyl-CoA liegt.

Das Produkt wurde durch HPLC isoliert und durch ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie analysiert. Mesaconyl-CoA wurde durch Protonen-NMR-Signale bei 0,87 ppm (s, 3H, 10″ CH3), 1,10 (s, 3H, 11″ CH3), 2,26 (ddd, J = 130,0 Hz, 5,8 Hz, 1,5 Hz, 3H, ʬH3 [Mesaconyl]), 2.46 (m, 2H, H6″), 3.13 (q, J = 6,5 Hz, 2H, H9″), 3,40 (t, J = 6,4 Hz, 2H, H8″), 3,51 (t, J = 6,8 ​​Hz, 2H, H5″), 3,64 (m, 1H, H1𠌺), 4,06 (m, 1H, H1𠌻), 4,11 (s, 1H, H3″), 4,32 (s, br, 2H, H5′), 4.51 (s, br, 1H, H4′), 4.91 (m, 1H, H2′), 5.01 (s, br, 1H, H3′), 6.16 (d, J = 5,8 Hz, 1H, H1′), 6,70 (“t,” br, J = 8,0 Hz, 1H [Mesaconyl]), 8,24 (s, 1H, H2), 8,61 (s, 1H, H8). Die 13 C-angereicherten Kohlenstoffe (C1, C2 und α-Methyl) von Mesaconyl-CoA gaben Signale bei 14,3 ppm (dd, J = 42,6 Hz, 2,3 Hz), 149,4 (dd, J = 55,5 Hz, 42,6 Hz) und 195,3 (dd, J = 55,5 Hz, 2,3 Hz), was auf den Einbau der intakten Propionyl-13 C-angereicherten Kohlenstoffkette hinweist. Das entsprechende Signal im Protonen-NMR bei 2.26 ppm der 13 C-angereicherten α-Methylgruppe ( 13 C-NMR, 14.3 ppm) wurde durch ein heteronukleares Einzelquantenkohärenz-Gradientenexperiment identifiziert. Darüber hinaus zeigte das Signal bei 6,70 ppm (Protonen-NMR, β-CH) einen Kreuzpeak zu den drei Signalen bei 14,3, 149,4 und 195,3 ppm ( 13 C-NMR) im heteronuklearen Mehrfachbindungs-Korrelationsexperiment, was die Mesaconyl-CoA-Struktur. Das CH2 Gruppe bei 3,13 ppm (Protonen-NMR) ergab einen Kreuzpeak mit dem 13 C-angereicherten Carbonyl-C bei 195,3 ppm ( 13 C NMR) im heteronuklearen Mehrfachbindungskorrelationsexperiment, was bestätigt, dass der CoA-Rest an C-1 . gebunden war von Mesaconyl-CoA.


Abstrakt

Die Escherichia coli Genom kodiert sieben Paraloge der Crotonase (Enoyl-CoA-Hydratase)-Superfamilie. Vier von ihnen haben unbekannte oder ungewisse Funktionen, ihre Existenz war vor Abschluss des Projekts unbekannt E coli Genomsequenzierungsprojekt. Das Gen, das eines davon kodiert, YgfG, befindet sich in einem Vier-Gen-Operon, das Homologe von Methylmalonyl-CoA-Mutasen (Sbm) und Acyl-CoA-Transferasen (YgfH) sowie eine mutmaßliche Proteinkinase (YgfD/ArgK) kodiert. Wir haben festgestellt, dass YgfG Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase ist, YgfH Propionyl-CoA:Succinat-CoA-Transferase ist und Sbm Methylmalonyl-CoA-Mutase ist. Diese Reaktionen reichen aus, um einen Stoffwechselzyklus zu bilden, durch den E coli kann die Decarboxylierung von Succinat zu Propionat katalysieren, obwohl der metabolische Kontext dieses Zyklus unbekannt ist. Die Identifizierung von YgfG als Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase erweitert das Spektrum der von Mitgliedern der Crotonase-Superfamilie katalysierten Reaktionen.

Diese Forschung wurde von der Universität Karlsruhe, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Fonds der Chemischen Industrie (an J.R.) und den NIH Grants GM-40570 und GM-52594 (an J.A.G.) unterstützt.

Adresskorrespondenz an diesen Autor. Telefon: 217-333-3945. Fax: 217-265-0385. E-Mail: [E-Mail protected]


Schlussfolgerungen und Zukunftsperspektiven

Die Kommerzialisierung von Produktionsmethoden für gasförmige Brennstoffe aus biologischen Quellen ist von entscheidender Bedeutung, um die globalen Herausforderungen bei der Realisierung erneuerbarer Energiequellen und der Reduzierung des CO2-Fußabdrucks und anderer Schadstoffe zu bewältigen. Weitere Forschung ist erforderlich, um eine abstimmbare Alkanproduktion über das gesamte Spektrum kurz- bis sehr langkettiger Kohlenwasserstoffe zu entwickeln, die Mikroorganismen effektiv in die „Ölfelder der Zukunft“ umwandeln. Damit wird die Nachfrage nach einer Beimischung oder sogar zum Ersatz der derzeitigen Abhängigkeit von erdölbasierten Kraftstoffen und synthetischen Vorprodukten gestillt.

Der Übergang von der „Proof-of-Principle“-Forschung zur erfolgreichen Kommerzialisierung erfordert ein detailliertes Verständnis der technisch-ökonomischen Faktoren, die mit der Skalierung biologischer Prozesse verbunden sind. Eine kürzlich durchgeführte Studie zum kommerziellen Potenzial der fermentativen Alkangasproduktion identifizierte Schlüsselparameter, die optimiert werden mussten, um eine kostengünstige Kraftstoffproduktion zu ermöglichen, und schlug Gegenmaßnahmen vor, um diese Hindernisse zu überwinden [6]. Zu diesen Maßnahmen gehörten der Übergang zu robusten industriellen Mikroorganismen, die drastisch reduzierte Kapital- und Betriebskosten erfordern, die Beschaffung kostengünstiger und erneuerbarer Energiequellen und die Erhöhung der Gasproduktionstiter. Letzteres ist besonders wichtig für die biologische Alkanproduktion, da angenommen wird, dass der terminale ADO/CvFAP-abhängige Deformylierungs-/Decarboxylierungsschritt der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist.

Die Identifizierung der wichtigen Hindernisse für den kommerziellen Erfolg kann dazu beitragen, weitere Forschungen zu fokussieren, beispielsweise um die biokatalytische Effizienz in vivo zu verbessern, indem Enzymevolution oder Redesign-Strategien angewendet werden, um Reaktionsgeschwindigkeiten, Stabilität und Expression innerhalb eines ausgewählten Chassis zu erhöhen. Das Aufkommen von Techniken der synthetischen Biologie ermöglicht eine tiefergehende Optimierung der Prozessentwicklung über das traditionelle Enzym-Redesign hinaus. Produktivitätssteigerungen können durch Optimierung von DNA-regulatorischen Teilen [74] sowohl auf transkriptioneller als auch translationaler Ebene [75, 76], metabolisches Engineering von Hilfsversorgungswegen zur Linderung von Engpässen und Eliminierung oder Herunterregulierung konkurrierender Nebenreaktionen erreicht werden. Dies sind wichtige Bereiche der Prozessoptimierung, die durch Bioengineering realisiert werden, aber die Gesamtprozessoptimierung wird über die Notwendigkeit hinaus, mikrobielle Zellfabriken für die Bioalkangasproduktion zu verbessern, wesentlich sein.

Die beispiellose Einschränkung der weltweiten Wirtschaftstätigkeit und Mobilität Anfang 2020 aufgrund der Covid-19-Pandemie hat den weltweiten Energiebedarf gegenüber dem gleichen Zeitraum im Jahr 2019 um 3,8 % gesenkt [77]. Trotzdem bleiben die Vorräte an fossilen Brennstoffen begrenzt und nicht erneuerbar, und die Nachfrage bleibt auf hohem Niveau. Die Entwicklung einer (endlich) nachhaltigen Bioherstellung von gasförmigen Kohlenwasserstoffen ist daher zeitgemäß, wobei der Erfolg an der Fähigkeit gemessen wird, in Preis und Fülle mit bestehenden nicht erneuerbaren und kommerziellen Syntheserouten zu konkurrieren.


Materialen und Methoden

Stämme und Medien

Medien und Wachstumsbedingungen für E coli wurden zuvor von Sambrook und Russell (2001) beschrieben, die für Y. lipolytica wurden zuvor von Barth und Gaillardin (1997) beschrieben. Rich-Medium (YPD) und Minimal-Glucose-Medium (YNB) wurden wie an anderer Stelle beschrieben hergestellt (Milckova et al., 2004). Das YNB enthielt 0,17 % (w/v) Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, YNBww), 0,5 % (w/v) NH4Cl, 50 mM KH2Bestellung4-N / A2HPO4 (pH 6,8) und 2% (w/v) Glucose. Um die Stamm-Auxotrophien zu ergänzen, wurden nach Bedarf 0,1 g/l Uracil oder Leucin zugegeben. Um auf Hygromycinresistenz zu screenen, wurden 250 μg/ml Hygromycin zum YPD gegeben. Feste Medien wurden durch Zugabe von 1,5% (w/v) Agar hergestellt.

Konstruktion von Plasmiden und Stämmen (E coli und Y. lipolytica)

Wir verwendeten molekulargenetische Standardtechniken (Sambrook und Russell, 2001). Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) bezogen. Die PCR-Amplifikation wurde in einem Eppendorf 2720 Thermal Cycler mit entweder Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) oder GoTaq DNA Polymerasen (Progema, WI, USA) durchgeführt. PCR-Fragmente wurden mit einem PCR Purification Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) gereinigt und Plasmide wurden mit einem Plasmid Miniprep Kit (Macherey-Nagel) gereinigt.

Die in dieser Studie verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung von Golden Gate Assemblierung konstruiert, wie in Celinska et al. (2017). Die Gene im A-, T- und H-Modul wurden mittels PCR unter Verwendung der genomischen DNA von gewonnen Y. lipolytica W29. Interne BsaI-Erkennungsstellen wurden mittels PCR unter Verwendung der in Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Primer entfernt. Die Plasmide für jedes Modul enthielten die Zeta-Sequenz, die URA3 ex Marker und Genexpressionskassetten, die die TEF1 Promoter und LIP2 Terminator.

Für den zytosolischen PDH-Komplex wurden alle Gene synthetisiert und in das Plasmid pUC57 von GenScript Biotech (New Jersey, USA) kloniert. Zytosolisch PDX1 wurde unter Verwendung der BamHI- und AvrII-Restriktionsstellen in das Expressionsplasmid (JME2563) kloniert. Die anderen vier Gene wurden in zwei Plasmide (JME4774 und JME4775) unter Verwendung von Golden Gate Assembly kloniert.

Zu stören PHD1, wurden die Kassetten so konstruiert, dass sie einen Promotor (pPHD1), Ein Marker (URA3 oder LEU2) und ein Terminator (TPHD1), die die Entfernung des ORF-Gens durch homologe Rekombination ermöglichte, wie in Papanikolaou et al. (2013).

Genexpressions- und Disruptionskassetten wurden durch NotI-Verdau hergestellt und in Y. lipolytica Stämme unter Verwendung des Lithiumacetat-Verfahrens, wie zuvor beschrieben (Barth und Gaillardin, 1997). Die Genintegration und -unterbrechung wurden mittels Kolonie-PCR unter Verwendung der in Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Primer verifiziert. Das replikative Plasmid, das die Cre Gen (JME547 Tabelle 1) wurde zur Markerrettung verwendet (Fickers et al., 2003). Nach der Transformation mit dem Cre Expressionsplasmid wurde der Verlust des Markergens auf YNB mit/ohne Uracil verifiziert. Der Verlust des replikativen Plasmids wurde mittels Replika-Plating auf YPD mit/ohne Hygromycin nach 24-stündiger Kultivierung auf YPD überprüft. Um den prototrophen Stamm zu konstruieren, a LEU2 Fragment von Plasmid JMP2563 wurde transformiert. Alle in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1. Die in dieser Studie verwendeten Plasmide und Stämme.

Kulturbedingungen für die Lipidbiosyntheseexperimente

Die Experimente zur Lipidbiosynthese wurden in Minimalmedien durchgeführt und die Kulturen wie folgt hergestellt: Eine erste Vorkultur wurde durch Animpfen von 10 ml YPD-Medium in 50 ml Erlenmeyerkolben hergestellt. Dann wurde die Vorkultur über Nacht bei 28ଌ und 180 U/min inkubiert. Die resultierende Zellsuspension wurde mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und zum Animpfen von 50 ml Minimalmedium YNBD6 verwendet, das 0,17 % (Gew./Vol.) Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, YNBww, Difco), 0,15 % (Gew./Vol.) enthielt ) NH4Cl, 50 mM KH2Bestellung4-N / A2HPO4 Puffer (pH 6,8) und 6% (w/v) Glucose. Dieses Medium wurde in 250 ml Erlenmeyerkolben gegeben. Die Kulturen wurden dann bei 28°C und 180 U/min inkubiert.

Lipidbestimmung

Lipide wurden aus 10 bis 20 mg gefriergetrockneten Zellen extrahiert und unter Verwendung des von Browse et al. beschriebenen Verfahrens in FA-Methylester (FAMEs) umgewandelt. (1986). Die FAMEs wurden dann mittels Gaschromatographie (GC) analysiert, die mit einem Varian 3900-Gerät mit Flammenionisationsdetektor und einer Varian FactorFour vf-23ms-Säule durchgeführt wurde, wobei die Blutungsspezifikation bei 260 °C 3 pA (30 m .) beträgt , 0,25 mm, 0,25 μm). Die FAMEs wurden durch Vergleiche mit kommerziellen Standards (FAME32, Supelco) identifiziert und mit der Methode des internen Standards quantifiziert, die die Zugabe von 100 μg kommerzieller Dodecansäure (Sigma-Aldrich) beinhaltet. Kommerzielle ungeradkettige FAs (Odd Carbon Straight Chains Kit mit 9 FAs, OC9, Supelco) wurden in ihre FAMEs umgewandelt, wobei das gleiche Verfahren wie bei den Hefeproben verwendet wurde. Anschließend wurden sie mittels GC identifiziert und mit den ungeradkettigen FAs aus den Hefeproben verglichen.

Um das Trockenzellgewicht (DCW) zu bestimmen, wurden 2 ml der Kultur aus den Kolben entnommen, gewaschen und in einem vorgewogenen Röhrchen lysophilisiert. Die Massenunterschiede entsprachen den mg Zellen, die in 2 ml Kultur gefunden wurden.


Abstrakt

Die Escherichia coli Genom kodiert sieben Paraloge der Crotonase (Enoyl-CoA-Hydratase)-Superfamilie. Vier von ihnen haben unbekannte oder ungewisse Funktionen, ihre Existenz war vor Abschluss des Projekts unbekannt E coli Genomsequenzierungsprojekt. Das Gen, das eines davon kodiert, YgfG, befindet sich in einem Vier-Gen-Operon, das Homologe von Methylmalonyl-CoA-Mutasen (Sbm) und Acyl-CoA-Transferasen (YgfH) sowie eine mutmaßliche Proteinkinase (YgfD/ArgK) kodiert. Wir haben festgestellt, dass YgfG Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase ist, YgfH Propionyl-CoA:Succinat-CoA-Transferase ist und Sbm Methylmalonyl-CoA-Mutase ist. Diese Reaktionen reichen aus, um einen Stoffwechselzyklus zu bilden, durch den E coli kann die Decarboxylierung von Succinat zu Propionat katalysieren, obwohl der metabolische Kontext dieses Zyklus unbekannt ist. Die Identifizierung von YgfG als Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase erweitert das Spektrum der von Mitgliedern der Crotonase-Superfamilie katalysierten Reaktionen.

Diese Forschung wurde von der Universität Karlsruhe, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Fonds der Chemischen Industrie (an J.R.) und den NIH Grants GM-40570 und GM-52594 (an J.A.G.) unterstützt.

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Diskussion

Several examples of unusual type I modular PKS extender units have been reported over the past half-decade. In all cases, these are assembled via a common final biosynthetic step, involving reductive carboxylation of an α, β-unsaturated CoA thioester by a CCRC homologue. The data reported here reveal an alternative mechanism for assembly of unusual type I modular PKS extender units. This employs a unique YCC β-subunit (MccB) that, in partnership with the primary metabolic YCC α-subunit, is able to directly carboxylate medium chain acyl-CoA thioesters. X-ray crystallographic analysis revealed the structural basis for substrate recognition by MccB, allowing a homologue likely involved in the biosynthesis of butylmalonyl-CoA and other unusual extender units incorporated into the primycin complex of clinically-used antibiotics to be identified.

These findings inspired the precursor-directed biosynthesis of novel azide- and alkyne-containing stambomycin analogues. Several biosynthetic engineering approaches have recently been utilized to introduce alkyne-terminated extender units containing 5–8 carbons into erythromycin and antimycin analogues 26,27,28 . Feeding of 8-nonynoic acid to S. ambofaciens resulted in the production of a stambomycin analogue containing a 9-carbon alkyne-terminated extender unit in comparable quantities to the natural products. Thus, MccB, the AT domain from module 12 of the stambomycin PKS and the medium chain acyl-CoA synthetase encoded by samR0482 are useful additions to the synthetic biology toolkit for bio-orthogonal tagging of polyketides.


Methoden

Microbial strains and media

Table 1 lists the various strains and plasmids used in this study. Die E coli LS5218 strain [fadR, atoC(Con)], which constitutively expresses the enzymes of fatty acid β-oxidation pathway, allows expression of various pathway genes cloned into pTrc99a and pBBR1MCS2 vectors upon induction with isopropyl-β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) [38]. The IPTG was added when the cells had reached an optical density at a wavelength of 600 nm (OD600) of 0.6. The PHA-producing strain LZ05 with deletion of the genes ptsG, tesB und yciA was described previously [23]. Die E coli DH5α strain served as the host strain for subsequent construction and propagation of various PHA-producing plasmids. During the recombinant plasmid construction, strains were cultivated in Luria–Bertani (LB) medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl). For gene knockout, SOB medium (20 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 0.5 g/L NaCl, 10 mM MgCl2 and 2.5 mM KCl) was utilized.

Plasmidkonstruktion

For the even-chain monomer supply, the construction of plasmid pQQ05 has been previously described [23]. Briefly, the genes yqeF, fadB, phaJ1Pa, ter und phaC2Pa were all cloned and ligated into the corresponding sites of pTrc99a which were cut with the same restriction enzymes stepwise to generate plasmid pQQ05.

The construction of odd-chain monomer generation pathway was as follows. The codon-optimized prpP gene was cloned into the pBBR1MCS2 vector between the KpnIch und BamHI sites to construct the plasmid of pZQ01. Later, in order to form the plasmid pBBR1MCS2-acs, namely pZQ02, the acs gene amplified via polymerase chain reaction (PCR) using E coli MG1655 genomic DNA (gDNA) as template was also inserted into the pBBR1MCS2. Die prpE und pct fragments amplified from R. eutropha H16 gDNA with primers prpE-F/prpE-R and pct-F/pct-R were separately ligated into the pBBR1MCS2 to yield the plasmids pZQ03 and pZQ04. Subsequently, co-expression of two genes prpP und acs, prpP und prpE, prpP und pct in the pBBR1MCS2 was utilized to form the plasmids pZQ05, pZQ06 and pZQ07, respectively. All of the genes were under the control of the lac promoter with separated ribosomal binding site located upstream of each gene to facilitate the translation. Die R. eutropha H16 template used for these PCR reactions was isolated using the TIANamp Bacterial DNA Kit (TIANGEN BIOTECH, China). The primers used to amplify different fragments for cloning reactions are listed in Additional file 1: Table S1.

In all cases, PCR was performed using an S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). PrimeSTAR HS DNA polymerase was purchased from Takara (Tokyo, Japan), restriction endonucleases were from Fermentas/Thermo Scientific (Pittsburgh, USA), and T4 DNA ligase was from New England Biolabs (Ipswich, USA). Propagated plasmids were prepared by TIANGEN Plasmid Mini Extraction Kit (TIANGEN BIOTECH, China), and restriction enzyme-digested products were purified using an E.Z.N.A.™ Gel Extraction Kit (Omega, USA). DNA sequencing of all constructed plasmids were performed by Liuhe BGI Tech Co. Ltd (Beijing, China). All of the constructed plasmids were transformed into the strain LZ05 and the optimum double plasmids were then transformed into the strain LZ08 according to standard procedures [39].

Gene knockout

Das Gen pflB which encodes pyruvate formate lyase was knocked out by the one-step inactivation method as described previously [40] and PockenB encoding pyruvate oxidase was knocked out by linearized DNA fragments with extending homologous sequence [41]. First, the linerized DNA fragments with the FLP recognition target sites and 39 bp homologous sequences were obtained via PCR using pKD4 (Km R ) as a template and pflB-F/pflB-R as primers. After the DNA gel extraction, the purified PCR product was electroporated into the host cells which carried the plasmid pKD46, and then E coli LZ05 was induced by 0.3% (w/v) l -arabinose to express the λ Red system. The positive transformants were selected and identified by colony PCR using the primers pflB-test-F/pflB-test-R. Regarding the PockenB deletion, primers poxB-F/poxB-R and chromosomal DNA of the strain QZ1111 were applied to amplify the linearized DNA fragments for PockenB. The deletion procedure of PockenB gene was as follows. After DpnI digestion, the PCR products were then purified and electroporated into the competent strain E coli LZ05 containing the plasmid pKD46. Transformant cells were selected in solid LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, and 1.5% agar powder) containing chloramphenicol (Cm R ). Candidate clones were screened by PCR employing primers poxB-F/poxB-R. The PCR products were ultimately sequenced in Liuhe BGI Tech Co. Ltd (Beijing, China) if necessary. After removing pKD46, the corresponding Km R or Cm R cassette was removed with the helper plasmid pCP20. The plasmids pKD46 and pCP20 were eliminated by overnight cultivation at 42 °C. Finally, the strain LZ08 with the above two gene inactivation was generated.

Cultivation condition

The medium of shake flask study contains 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 30 mM NH4Cl, 5 mM (NH4)2SO4, 1.48 mM Na2HPO4, and 100 μM FeSO4 supplemented with 125 mM MOPS.

For all shake flask experiments, single colony was inoculated into 5 mL LB broth and grown at 37 °C overnight. 0.5 mL pre-culture was inoculated to 300 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL LB and cultivated for 8 to 10 h and then 1% (v/v) seed inoculum for shake flask cultivation was incubated in 50 mL fermentation medium. When all liquid fermentation medium (50 mL) was incubated in 300 mL conical flasks at 37 °C with an agitation of 250 rpm to an optical density at 600 nm (OD600) of 0.6–0.8, 1 mM IPTG was added to the culture broth as an inducer. After induction, 30 g/L glucose was supplied as the sole carbon source at the appropriate time and then fermented for 72 h at 30 °C with shaking at 250 rpm. When necessary, ampicillin (100 μg/mL), kanamycin (50 μg/mL) or chloramphenicol (25 μg/mL) was added to the medium to maintain the stability of the plasmids. After cultivation, cells were gathered by centrifugation at 12,000 rpm for 15 min, washed with water twice and treated with ethanol once and then lyophilized.

PHA production analysis

The content and monomer compositions of intracellular accumulated PHA were analyzed by gas chromatography (GC) as described previously [42]. PHA content was defined as the percent ratio of PHA concentration to CDW. Liquid culture was centrifuged to obtain the supernatant and cellular biomass. 15 mg lyophilized cells were subjected to methanolysis in the presence of 1 mL of chloroform and 1 mL of 3% (v/v) sulfuric acid in methanol for 1 h at 100 °C. The samples were cooled to room temperature and then 1 mL of distilled water was added in order to extract the cell debris that is soluble in the aqueous phase. 10 mg/mL pentadecanoic acid in ethanol was added as an internal standard. The mixture was vortexed and centrifuged at 12,000 rpm for 10 min. After the layer separation, the organic (chloroform) phase (500 μL) was transferred to another new vial and analyzed using a Shimadzu GC2010 gas chromatograph (Kyoto, Japan) equipped with an AOC-20i auto-injector and a RestekRxi ® -5 column. PHA standard samples were dissolved in chloroform and also analyzed according to the method above by GC. The temperature program used was as follows: 80 °C hold for 1 min, ramp from 60 to 230 °C at 10 °C per min and a final hold at 230 °C for 10 min [23].

Cell growth, glucose consumption and acetate assimilation analyses

Cell growth was monitored by measuring OD600 utilizing a spectrophotometer (Shimazu, Japan). Glucose and acetate were quantitatively analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) (Shimazu, Japan) which equipped with a refractive index detector (RID-10A) and an Ion Exclusion column (Bio-Rad, HPX-87H). The samples were first centrifuged at 12,000 rpm for 10 min, and then the supernatant was filtrated with a 0.22 μm filter membrane. 5 mM sulfuric acid was utilized as the mobile phase of HPLC with the flow rate of 0.6 mL/min and the utilized column temperature was 65 °C.

Statistische Analysen

All data examined were expressed as mean ± SD. Statistical analyses of the data were carried out using two-tailed Student’s t-test between two groups, and one-way ANOVA followed by the post hoc Tukey’s test for multiple groups. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. The * denotes P < 0.05, the *** denotes P < 0,001.


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