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Wie ist die Zusammensetzung eines Standard-Verdünnungspuffers in einem Leptin-ELISA-Kit?

Wie ist die Zusammensetzung eines Standard-Verdünnungspuffers in einem Leptin-ELISA-Kit?


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Ich versuche, die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers zu finden, der für die Verdünnung einer Human-Leptin-Stammlösung zur Verwendung in einem ELISA-Assay verwendet wird. Der Hersteller des Kits (https://www.thermofisher.com/elisa/product/Leptin-Human-ELISA-Kit/KAC2281) gibt nur an, dass der Puffer 8mM Natriumazid enthält, aber ich kann die genaue Zusammensetzung der Puffer überall im Internet.


Myelom- und Hybridom-Kulturmedium (serumhaltig)

Hybridom-Wachstumsmedium mit Hypoxanthin und Thymidin (serumhaltig)


Wie ist die Zusammensetzung eines Standard-Verdünnungspuffers in einem Leptin-ELISA-Kit? - Biologie

Spiking & Recovery-Ergebnisse

Linearitätsergebnisse

Anwendungshinweise

  • Vorbeschichtete 96-Well-Streifen-Mikrotiterplatte
  • Waschpuffer
  • Lösung stoppen
  • Assay-Verdünnungsmittel
  • Lyophilisierter Standard
  • Biotinylierter Nachweisantikörper
  • Streptavidin-konjugiertes HRP
  • TMB One-Step-Substrat
  • Destilliertes oder entionisiertes Wasser
  • Präzisionspipetten zur Abgabe von 2 &Mikrol bis 1 &Mikrol Volumina
  • Einstellbare 1-25 &Mikrol-Pipetten für die Reagenzienvorbereitung
  • 100 & Mikrol und 1 Liter Messzylinder
  • Röhrchen zur Herstellung von Standard- und Probenverdünnungen
  • Saugfähiges Papier
  • Mikroplatten-Reader zur Messung der Absorption bei 450 nm
  • Log-Log Millimeterpapier oder Computer und Software für die ELISA-Datenanalyse
  1. Bereiten Sie alle Reagenzien, Proben und Standards gemäß den Anweisungen im Handbuch vor.
  2. 100 &mgr;l Standard oder Probe in jede Vertiefung geben.
  3. 2,5 h bei RT oder O/N bei 4°C inkubieren.
  4. Füge 100 &mgr;l des vorbereiteten Biotin-Antikörpers in jede Vertiefung hinzu.
  5. 1 h bei RT inkubieren.
  6. In jede Vertiefung 100 &mgr;l der vorbereiteten Streptavidin-Lösung geben.
  7. Inkubieren Sie 45 min bei RT.
  8. 100 &mgr;l TMB One-Step Substratreagenz in jede Vertiefung geben.
  9. 30 min bei RT inkubieren.
  10. Füge 50 &mgr;l Stopplösung in jede Vertiefung hinzu.
  11. Sofort bei 450 nm ablesen.

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ELISA-Kit für Leptin (LEP)

  • Produkt-Nr. SEA084Eq
  • Organismenarten Equus caballus Equine (Pferd) Gleicher Name, verschiedene Arten.

Besonderheit

Dieser Assay hat eine hohe Sensitivität und ausgezeichnete Spezifität für den Nachweis von Leptin (LEP).
Es wurde keine signifikante Kreuzreaktivität oder Interferenz zwischen Leptin (LEP) und Analoga beobachtet.

Erholung

Die unten aufgeführten Matrices wurden mit einem bestimmten Gehalt an rekombinantem Leptin (LEP) versetzt und die Wiederfindungsraten wurden berechnet, indem der gemessene Wert mit der erwarteten Menge an Leptin (LEP) in den Proben verglichen wurde.

Matrix Erholungsbereich (%) Durchschnitt(%)
Serum(n=5) 88-105 95
EDTA-Plasma (n=5) 86-95 92
Heparinplasma (n=5) 78-101 95

Präzision

Intra-Assay-Präzision (Präzision innerhalb eines Assays): 3 Proben mit niedrigem, mittlerem und hohem Leptin (LEP) wurden jeweils 20 Mal auf einer Platte getestet.
Inter-Assay-Präzision (Präzision zwischen den Assays): 3 Proben mit niedrigem, mittlerem und hohem Leptin (LEP) wurden auf 3 verschiedenen Platten getestet, 8 Replikate in jeder Platte.
CV(%) = SD/MittelwertX100
Intra-Assay: Lebenslauf

GEWINNSPIELE

INKREMENT-DIENSTLEISTUNGEN

  • Einkomponenten-Reagenzien des Assay-Kits
  • Lysepuffer spezifisch für ELISA / CLIA
  • Qualitätskontrolle von ELISA / CLIA
  • Maßgeschneiderter Service für ELISA-Kits
  • Maßgeschneiderter Service für Krankheitsmodelle
  • Seren Maßgeschneiderter Service
  • TGFB1 Aktivierungsreagenz
  • Experimenteller Service für Echtzeit-PCR
  • Streptavidin

Blockieren von Puffern

Das Blockieren ist ein kritischer Schritt für ELISAs und es stehen eine Reihe von Optionen zur Verfügung. Die Wahl des richtigen Blockierungspuffers erhöht die Sensitivität, indem unspezifische Bindungen und Hintergrundgeräusche reduziert werden.

Block-Ass (BUF029)

Block Ace ist 1% BSA überlegen und ist ein leistungsstarker Blockierungspuffer, der auch als Waschpuffer und zum Verdünnen von Antikörpern verwendet werden kann. Im Vergleich zu BSA bietet Block Ace reduzierte Hintergründe und schärfere Standardkurven.

BSA-Block (BUF032)

Minimieren Sie die unspezifische Bindung in Sandwich- und Antigen-Down-ELISAs mithilfe des BSA-Blocks. Dieser auf BSA basierende Puffer verfügt über einen proprietären Proteinstabilisator, der eine langzeitstabile Umgebung für die Beschichtung von Antigenen oder Capture-Antikörpern schafft.

Ultrablock (BUF033)

Ein Puffer, der proprietäre Nicht-Säugetierproteine ​​von Fischen enthält, die entwickelt wurden, um unspezifische Bindungen zu reduzieren. Mit zusätzlicher Blockierungsstärke ist es für den Einsatz in Antigen-Down- und Sandwich-ELISAs mit hohem Hintergrund und bei der Arbeit mit Human-, Rinder- und Schweineserumproben geeignet. Ultrablock kann unspezifische Bindungsstellen beschichten, die für herkömmliche Blocker sterisch unzugänglich sind.

Synblock (BUF034)

Für maximale Blockierungsstärke verwenden Sie Synblock, eine neuartige nicht-proteinblockierende Formulierung für Antikörper-beschichtete und Sandwich-ELISAs. Dieses synthetische, inerte Blockierungsmittel bietet eine maximale Reduzierung von Interferenzen und eliminiert unspezifische Hintergrundgeräusche.


Blogeinträge

Normalerweise verwenden wir einen Stabilisator für vorbeschichtete Platten. Der zusätzliche Waschschritt dient dazu, diese Komponenten zu entfernen, bevor Sie den Assay starten. Wenn Sie das Waschen nicht durchführen, ist die Auswirkung auf die Testleistung vernachlässigbar.

Welche Antikörperklone werden in Ihren ELISA-Kits verwendet?

Informationen zu den in unseren Kits verwendeten Antikörperklonen sind urheberrechtlich geschützt. Die Klonalität (polyklonal oder monoklonal) und die Wirtsspezies der Antikörper können jedoch auf Anfrage bereitgestellt werden.

Sollte ich Serum- oder Plasmaproben für mein ELISA-Experiment verwenden?

Dies hängt davon ab, welche Ziele Sie analysieren und welche Besonderheiten Ihre Studie hat. Idealerweise empfehlen wir, den Unterschied zwischen Serum und Plasma für die interessierenden Targets zu bestimmen und sich für den Probentyp zu entscheiden, der für die Quantifizierung verwendet werden soll. Abhängig von den Targets kann es zu Konzentrationsunterschieden der Targets zwischen Serum und Plasma kommen. Der wichtigste Faktor bei der Vorbereitung von Plasma- oder Serumproben ist die Konsistenz der Vorbereitung, um präzise Messungen zu gewährleisten. Im Allgemeinen sollten Plasma-/Serumproben frei von Partikeln sein, keine überschüssigen Lipide enthalten und keine Hämolyse aufweisen.

Diese Arten von Verunreinigungen tragen zum Hintergrund bei und beeinflussen die Genauigkeit des Assays nachteilig. Der Schlüssel ist, die Probe jedes Mal auf die gleiche Weise vorzubereiten. Das heißt, das Zentrifugieren von Proben mit der gleichen Geschwindigkeit zur gleichen Zeit, das Entfernen des Serums oder Plasmas unmittelbar nach der Zentrifugation und das gleichzeitige Aliquotieren und Einfrieren der Proben. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen.

Meine Probe kann sehr niedrige Analytkonzentrationen aufweisen. Welche Methoden kann ich verwenden, um die Erkennung zu verbessern?

Für unsere Formate LEGEND MAX&trade und ELISA MAX&trade Deluxe empfehlen wir, das mitgelieferte Protokoll zu befolgen. Bei Abweichungen vom Protokoll können wir die Leistung des Kits nicht garantieren. Nachfolgend finden Sie allgemeine Vorschläge, wenn Sie unser ELISA MAX&trade Standard-Format verwenden:

  • Kontrollieren Sie Hintergrundgeräusche, indem Sie die Anzahl der Wäschen und die Einweichzeit zwischen den Wäschen erhöhen.
  • Präzision des Kontrollassays. Seien Sie beispielsweise beim Pipettieren vorsichtiger und gleichmäßiger, verwenden Sie frische Papiertücher zum Klopfen von Platten, um eine Kontamination von Avidin-HRP zu vermeiden und das Waschvolumen zu erhöhen.
  • Inkubationszeiten erhöhen. Beachten Sie, dass dies in der Regel auch den Hintergrund erhöht, sodass die Assay-Empfindlichkeit nicht unbedingt zunimmt.
  • Konzentrieren Sie Ihre Probe, wenn möglich.
  • Verwenden Sie eine logistische Kurvenanpassungsmethode mit fünf Parametern, um die Probenkonzentration am unteren Ende der Standardkurve genauer zu berechnen.

In vielen Fällen kann die Probe einfach nur sehr geringe bis nicht nachweisbare Konzentrationen des Analyten enthalten. Unabhängig davon, wie Sie den Assay manipulieren, können Sie möglicherweise immer noch keine nachweisbaren Konzentrationen erhalten.

In unserem ELISA-Kit ging der Capture/Detection-Antikörper aus. Können wir einen eigenständigen/einzelnen Antikörper verwenden, um ihn zu ersetzen?

Nein, wir empfehlen keine eigenständigen Reagenzien zum Ersetzen von Kitkomponenten und können die Leistung des Kits nicht garantieren, wenn Sie Reagenzien verschiedener Kits/Hersteller ersetzen oder kombinieren.

Wie viele Proben kann ich mit Ihrem Kit ausführen?

Dies hängt davon ab, ob Ihre Proben doppelt oder dreifach analysiert werden. Nach dem Hinzufügen der Standards können Sie beispielsweise 80 Proben ohne Replikate oder 40 Proben in Duplikaten usw. ausführen.

Wie sind die Platten nach der Beschichtung zu lagern?

Wenn beschichtete Platten nicht sofort verwendet werden können, sollten sie versiegelt und über Nacht bei 4°C gelagert werden.

Ich habe mehrere LEGEND MAX™ ELISA-Kits, die ich gleichzeitig ausführen möchte. Kann ich für alle Kits denselben Waschpuffer verwenden?

Der Waschpuffer, der in allen unseren LEGEND MAX&trade-Kits enthalten ist, ist gleich und die Teilenummern auf den Waschpufferflaschen in diesen Kits sollten identisch sein. Für ELISA MAX&trade Deluxe und ELISA MAX&trade Standard Sets bieten wir ein Rezept für den Waschpuffer auf jedem technischen Datenblatt des Kits an. Dieses Rezept ist für alle ELISA MAX&trade Sets gleich.

Ich verwende das Biotin- und das gereinigte Format desselben Antikörperklons, um zu versuchen, meinen eigenen ELISA aufzubauen, aber ich habe keinen Erfolg.

Wenn Sie den gleichen Klon sowohl für den Nachweis- als auch für den Fänger-Antikörper verwenden, kann das Epitop bereits von einem der Antikörper besetzt sein und die Bindung des anderen verhindern. Wir empfehlen, verschiedene Klone für Ihre Fang- und Nachweisantikörper auszuwählen.

Wo finde ich Tipps zur Fehlerbehebung für ELISA-Assays?

Wann sollte ich LEGEND MAX™ ELISA-Kits mit vorbeschichteten Platten verwenden?

LEGEND MAX&trade Kits sind gebrauchsfertig, einfach zu handhaben und minimieren den Aufwand für die Beschichtung der ELISA-Platten und die Vorbereitung von Pufferverdünnungen. Wir empfehlen LEGEND MAX&trade Kits für Benutzer, die neu bei ELISAs sind.

Welche Art von Beschichtungspuffer sollte ich für meinen ELISA verwenden?

Generell empfehlen wir die Verwendung von PBS (pH 7,4) oder Carbonatpuffer (pH 9,5). Der genaue Beschichtungspuffer, den Sie wählen, kann vom nachgewiesenen Zytokin abhängen.

Warum empfehlen wir, kein Azid in ELISA-Puffern zu verwenden?

Azid ist ein irreversibler HRP-Inhibitor.

Wie hoch ist die Sensitivität Ihrer ELISA-Kits?

Wenn Sie das LEGEND MAX&trade- oder ELISA MAX&trade Deluxe-Format verwenden, konsultieren Sie bitte das jeweilige Kit&rsquos-Handbuch für weitere Informationen zur Empfindlichkeit. Wir liefern diese Informationen nicht für die ELISA MAX&trade Standard Sets, aber theoretisch sollten sie denen des ELISA MAX&trade Deluxe Formats entsprechen, wenn Sie alle BioLegend&rsquos Reagenzien verwenden.

Wie lange sind BioLegend ELISA-Produkte haltbar?

Die LEGEND MAX&trade Kits von BioLegend haben eine Garantie von 3 Monaten ab Erhalt. ELISA MAX&trade Sets haben eine Garantie von 12 Monaten ab Erhalt. Ein chargenspezifisches Verfallsdatum finden Sie auf dem Kartonetikett auf jedem Produkt.

Kann ich den mit dem Kit gelieferten rekombinanten Standard für den Bioassay verwenden?

Nein, wir empfehlen nicht, den rekombinanten Proteinstandard für andere Anwendungen zu verwenden. Die im Kit enthaltenen Proteinstandards sind für die Verwendung als ELISA-Standard kalibriert und wurden nicht auf Bioaktivität getestet. Darüber hinaus können ELISA-Proteinstandards andere Trägerproteine ​​enthalten und wurden nicht denselben Sterilitätstests unterzogen wie unsere bioaktiven rekombinanten Proteine.

Kann ich sterile Platten in Gewebekulturqualität für ELISA verwenden?

Nein. Gewebekulturplatten sind für Zellkulturzwecke konzipiert und haben normalerweise keine hohe Proteinbindungskapazität. Für ELISAs empfehlen wir die Verwendung von Platten mit hoher Proteinbindung wie zB Nunc Maxisorp&trade-Platten (Kat.-Nr. 423501).

Kann ich den als Teil eines ELISA-Kits bereitgestellten Erfassungs- und Nachweisantikörper für andere Anwendungen wie die durchflusszytometrische Färbung verwenden?

Die in unseren ELISA-Kits verwendeten Antikörper wurden für ihre Verwendung in ELISA-Assays validiert und wir können nicht garantieren, dass sie in anderen Anwendungen wie der Durchflusszytometrie funktionieren. Stattdessen empfehlen wir Ihnen, für diese Experimente durchflusszytometrisch validierte Antikörper zu verwenden.

Kann ich Ihre ELISA-Kits für meine Gewebeproben verwenden?

Generell können die ELISA-Produkte von BioLegend&rsquo für Gewebe- oder Zellextrakte/Homogenate verwendet werden, sofern die Proben so aufbereitet werden, dass sie mit der Immunreaktivität kompatibel sind. Dazu empfehlen wir die folgenden Richtlinien:

  • Gewebe/Zellen sollten in einem neutralen pH-Puffer, der keine denaturierenden Chemikalien (wie Harnstoff, Thioharnstoff, SDS) enthält, lysiert oder homogenisiert werden.
  • Keine oder nur minimale Mengen an Reinigungsmittel (wie SDS, Triton&Trade X-100).
  • Keine übermäßige Ionenstärke (Salzkonzentration größer als die physiologische Ionenstärke).
  • Die Puffer sollten ausreichend Protease-Inhibitor-Cocktails enthalten, um die Zielproteine ​​vor dem proteolytischen Abbau durch aus den Zellen freigesetzte Enzyme zu bewahren.

Wir empfehlen nicht, Proben wiederzuverwenden. Für genaue Ergebnisse sollten die Proben aliquotiert und nur für den einmaligen Gebrauch aufbewahrt werden. Wenn Sie sich entscheiden, eine Probe wiederzuverwenden, müssen Sie zusätzliche Validierungsexperimente durchführen, um sicherzustellen, dass Sie genaue Messwerte erhalten. Dies würde durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst, einschließlich der Probenstabilität.

Kann ich Ihre passenden ELISA-Antikörperpaare mit einem Proteinstandard einer anderen Firma verwenden?

Wenn die Antikörper als Teil eines Kits bereitgestellt wurden, empfehlen wir nicht, Reagenzien aus verschiedenen ELISA-Kits zu kombinieren. Wir können die Leistung des Kits nicht garantieren, wenn Sie Reagenzien von mehreren Kits oder Herstellern kombinieren. Wenn Sie einzelne Antikörper gekauft haben und einen eigenen ELISA entwickeln, ist dies möglicherweise möglich, muss jedoch getestet werden. Antikörper können den Proteinstandard möglicherweise nicht erkennen oder eine schlechte Bindung an diesen zeigen, wenn das zur Erzeugung dieser Antikörper verwendete Immunogen sich in Bezug auf Sequenz oder Struktur vom Proteinstandard unterscheidet.

In welchem ​​Schritt kann ich mein ELISA-Verfahren um einige Tage verschieben? Kann ich meine Platten zur späteren Verwendung einfrieren?

Es ist am besten, das empfohlene Protokoll ohne zusätzliche Verzögerungen zu befolgen. Wenn Sie das Experiment jedoch unterbrechen möchten, empfehlen wir, den Vorgang beim Blockierungsschritt (nach dem Beschichten mit dem Fänger-Antikörper) zu verzögern. Sie können 200 &mgr;L Blockierungspuffer in die Wells geben und die Platten über Nacht bei 4°C (minimaler oder kein Signalverlust) aufbewahren oder bei -20°C für einige Tage einfrieren (dies kann einen gewissen Einfluss auf das Signal haben). Eine Verzögerung des Verfahrens im ersten Schritt (Beschichtung mit Capture-Antikörper über 16-20 Std. bei 4°C) ist nicht ratsam, da dies zu einem hohen Hintergrund führen kann.

Mir sind einige Komponenten des ELISA-Kits ausgegangen, kann ich sie separat kaufen?

Es ist möglich, einige Kit-Komponenten einzeln zu erwerben. Bitte kontaktieren Sie unseren technischen Service und geben Sie Chargeninformationen des Kits und seiner Komponenten an, um festzustellen, ob dies machbar ist.

Kann ich Reagenzien aus verschiedenen ELISA MAX™ Sets mischen oder für andere Anwendungen verwenden?

Dies wird nicht empfohlen. Die ELISA MAX&trade Reagenzien sind für eine bestimmte Charge optimiert und wurden nicht für andere Anwendungen als ELISA qualitätsgeprüft.

Kann die Beschichtung mit Fängerantikörper länger als über Nacht durchgeführt werden?

Im Allgemeinen wird eine Beschichtung für 16-20 Stunden bei 4°C empfohlen. Eine längere Inkubationszeit kann die Menge des an die Platten gebundenen Capture-Antikörpers erhöhen und dies kann das Hintergrundrauschen erhöhen.

Kann ich am oberen Ende der Standardkurve einen zusätzlichen Standard hinzufügen, um eine höhere Konzentration des Analyten zu berechnen?

Wir empfehlen diese Praxis nicht. Die Sensitivität eines Kits hängt von den einzelnen Komponenten und ihrer gemeinsamen Validierung als Kit ab und ändert sich nicht durch das Hinzufügen zusätzlicher Punkte zur Standardkurve.

Kann ich am unteren Ende der Standardkurve einen zusätzlichen Standard hinzufügen, um die Sensitivität meines Assays zu erhöhen?

Obwohl dies möglich ist, kann es bei höheren Konzentrationen des Standards zu einem Signalplateau kommen. Es wird generell empfohlen, den im Benutzerhandbuch empfohlenen Konzentrationsbereich zu verwenden.

Stört Phenolrot im Medium einen ELISA-Test?

Nein, Phenolrot in Zellkulturmedien beeinträchtigt die Messwerte eines ELISA-Tests nicht.

Warum müssen meine Serumproben bei einigen Ihrer ELISA-Kits mit Assay-Puffer verdünnt werden?

In einigen Fällen ist eine Verdünnung mit Assaypuffer erforderlich, um den Matrixunterschied zwischen den Proben und den Standards zu minimieren und eine bessere Genauigkeit zu erzielen.

Wie kann ich ein besseres Signal und eine bessere Sensitivität für meinen ELISA-Test erzielen?

&bull Inkubationszeiten erhöhen (mit Proben, Nachweisantikörpern oder Avidin-HRP- oder TMB-Substrat). Bitte beachten Sie, dass dies auch den Hintergrund in Ihrem Assay erhöhen kann und die Empfindlichkeit möglicherweise nicht erhöht wird.
&bull Platten während der Inkubationsschritte schütteln.
&bull Stellen Sie sicher, dass der Standard vor der Verwendung vollständig rekonstituiert ist.
&bull Erhöhtes Waschen und Einweichen zwischen den Waschgängen, um den Hintergrund weiter zu verringern.
&bull Wenn möglich, lesen Sie die Platte bei 450-570 (oder am nächsten) nm für die Hintergrundsubtraktion ab.
&bull Verbessern Sie doppelte CV%, indem Sie Pipettierfehler kontrollieren oder mit einem größeren Volumen an Waschpuffer waschen.
&bull Verwenden Sie eine 5-PL- oder 4-PL-Kurvenanpassungsmethode anstelle einer linearen Kurvenanpassung. Dies wird normalerweise mit einer Kurvenanpassungssoftware durchgeführt und bietet eine bessere Berechnung am unteren Ende der Kurve.

Was ist der Unterschied zwischen Ihren ELISA-Kits und -Sets?

Die Hauptunterschiede zwischen diesen Kits sind die im Kit oder Set enthaltenen Reagenzien.

LEGEND MAX&trade: Vollständig validierte und gebrauchsfertige Kits. Sie enthalten alle erforderlichen Reagenzien, einschließlich einer 96-Well-Streifenplatte, die mit Fängerantikörper vorbeschichtet ist.

RAPID MAX&trade: Verkürzen Sie die Testzeit auf weniger als 90 Minuten. Jedes Kit ist vollständig validiert und enthält eine 96-Well-Streifenplatte, die vorbeschichtet wurde, um den Capture-Antikörper zu immobilisieren.

ELISA MAX&trade Deluxe: Eine kostengünstigere Option mit den meisten Puffern, vortitrierten Antikörpern, rekombinanten Standards und Substraten. Platten sind in diesem Kit nicht enthalten und müssen separat erworben werden.

ELISA MAX&trade Standard: Bietet die Grundkomponenten zur Durchführung eines ELISAs, einschließlich eines rekombinanten Proteinstandards, Erfassungs- und Nachweisantikörper und Avidin-HRP. Dieses Set erfordert einige Optimierungen und ist perfekt für diejenigen, die ihr Budget sprengen möchten, indem sie ihre eigenen Puffer und Platten bereitstellen.

Werden die ELISA MAX™ Deluxe Sets mit Platten geliefert?

Nein, ELISA MAX&trade Deluxe Sets werden nicht mit Platten geliefert. Beschichtungspuffer und Assay-Verdünnungsmittel (zum Blockieren und Verdünnen) sind in diesen Sets enthalten. Platten können separat bestellt werden (Kat.-Nr. 423501) und Anweisungen zum Beschichten der Platten finden Sie in den Produkthandbüchern der Sets.

Kann ich für meinen ELISA verschiedene Komponenten verschiedener Hersteller verwenden?

Verschiedene Hersteller verwenden in ihren Kits oft unterschiedliche Antikörperklone. Die Spezifität der Antikörper bestimmt teilweise, wie viel Signal detektiert wird.

Außerdem können verschiedene Kits rekombinante Proteinstandards verwenden, die unter Verwendung verschiedener Verfahren exprimiert und gereinigt wurden. Rekombinante Proteine, die in E. coli exprimiert werden, können zum Beispiel unterschiedliche Immunreaktivitäten zeigen, hauptsächlich aufgrund von Inkonsistenzen bei der Rückfaltung. Kit-Standards werden hergestellt und gegen unterschiedliche Referenzen zwischen Herstellern kalibriert, was es schwierig macht, Komponenten aus verschiedenen Kits zu vergleichen. Jedes BioLegend ELISA Kit wurde mit Reagenzkonzentrationen und Protokollen entwickelt und validiert, die auf analytische Robustheit optimiert sind. Jegliche Änderungen an den Reagenzien (Standards, Antikörper, passende Matrizen) und Protokollen wirken sich auf die endgültige Testleistung aus.

Warum unterscheiden sich die Zytokinkonzentrationen meiner Probe bei Verwendung von LEGEND MAX™-Kits von anderen ELISA-Kits?

Es ist sehr schwierig, beim Vergleich verschiedener Zytokin-Kits von verschiedenen Herstellern exakt die gleichen Probenkonzentrationen im pg/ml-Bereich zu erhalten, zum Teil, weil die Lieferanten möglicherweise unterschiedliche Reagenzien (einschließlich Antikörperklone) verwenden, die eine unterschiedliche Immunreaktivität gegenüber dem Zielprotein aufweisen. Es ist nicht ungewöhnlich, dass die Zytokinkonzentration zwischen den Kits ein paar Mal variieren kann.

Im Allgemeinen, insbesondere für Zytokine im pg/ml-Bereich, ist es wichtiger, übereinstimmende biologische Trends zu haben, als absolute Konzentrationen. Das heißt, das gleiche Zytokin, das mit verschiedenen Kits von verschiedenen Anbietern gemessen wird, sollte bei relevanten Behandlungen das gleiche Muster biologischer Veränderungen zeigen.

Wie hoch ist die zu erwartende Konzentration eines bestimmten Analyten in biologischen Proben (z. B. in Serumproben naiver Tiere oder normaler Menschen)?

Da jede Probe einzigartig ist, ist eine Vorhersage schwierig, da dies von der Probenvorbereitung und der Art des Analyten abhängen kann. Wenn Sie ein LEGEND MAX&trade Kit verwenden, lesen Sie bitte das entsprechende Handbuch für weitere Informationen.


Wie ist die Zusammensetzung eines Standard-Verdünnungspuffers in einem Leptin-ELISA-Kit? - Biologie

Das Western Blotting ist eine in der Molekularbiologie gut etablierte Technik, um spezifische Proteine ​​aus einem komplexen Gemisch von Proteinen, die aus Gewebe oder Zellen extrahiert wurden, nachzuweisen. Es werden synthetische oder tierische Antikörper hergestellt, die mit einem spezifischen Zielprotein reagieren. Das Probenmaterial wird einer Proteindenaturierung unterzogen, gefolgt von einer Gelelektrophorese. Als nächstes wird die Elektrophoresemembran in einer Lösung gewaschen, die den spezifischen Antikörper enthält. Anschließend wird der überschüssige Antikörper abgewaschen und ein zweiter Antikörper, der mit dem ersten Antikörper reagiert, zugegeben. Durch verschiedene Methoden wie Färbung, Immunfluoreszenz und Radioaktivität kann der sekundäre Antikörper dann die Visualisierung des Proteins ermöglichen.

A. Probenvorbereitung

1. Proteinextraktion

Verbessert gegenüber dem basischen RIPA-Puffer, der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthält.

Klassische Formulierung, geeignet für die meisten immunologischen Experimente zur Protein-Protein-Interaktion

Das Protein aus dem Lysat ist aktiv und behält die Eigenschaften und Funktionen richtig bei. Es ist für Co-IP geeignet. Durch die Proteinspaltung unter nicht-denaturierenden Bedingungen behält das Produkt die Proteineigenschaften und -funktionen in dem für co-IP maximal geeigneten Umfang.

Hinweis: Das Detergens enthaltende Proteinextraktionsreagenz ist nicht für das Bradford Assay Kit (PC0010) geeignet. Bitte wählen Sie BCA Protein Assay Kit (PC0020) oder Lowry Protein Assay Kit (PC0030) .

2. Messung der Proteinkonzentration

Der Proteingehalt wird durch Vergleich der Extinktion der Probe mit dem aus einer Standardkurve bestimmten Absorptionskoeffizienten bestimmt. Eine Standardkurve wird erstellt, indem die Extinktion von Proben aufgetragen wird, die bekannte Konzentrationen des Standardproteins enthalten.

Bei der Wahl der Methode der Proteinquantifizierung soll der Einfluss von Faktoren wie Proteinstruktur (Standardprotein) und Störsubstanzen in Proteinlösung berücksichtigt werden.

Gemessen bei 595 nm. Geringer Störfaktor s, die Bestimmung wird nicht durch Tris, Kohlenhydrat, Glycerin, β-Mercaptoethanol, Ammoniak, EDTA, etc.

Gemessen bei 562 nm. Die  Bestimmung wird nicht durch das Waschmittel  gestört.

Gemessen bei 650 nm. Dieses Kit ist für Proben mit hohem Lipidgehalt geeignet. In bestimmten Bereichen wird es nicht durch Reinigungsmittel beeinflusst

B. WB-Experiment-Verfahren

1. Gel P Wiedergutmachung

A. Trenngel entsprechend dem Molekulargewicht des Proteins vorbereiten. Langsam schütteln, um sich vollständig zu vermischen, bei starkem Schütteln Sauerstoff vermeiden. Gießen Sie das gemischte Gel zwischen zwei Glasscheiben und injizieren Sie wasserfreien Ethylalkohol darüber, um eine Sauerstoffbeeinflussung der Polymerisation zu vermeiden.

Konzentration des Trenngels ( % )

B. Bereiten Sie eine Gellösung vor (Wählen Sie eine der folgenden beiden Optionen)

Gel-Vorbereitungstabelle 1

4 × Trennpuffer ( PH8.8 )

30% Acrylamid/Bis-Lösung, 29:1

Gelvorbereitungstabelle 2

30% Acrylamid/Bis-Lösung, 29:1

Für Ihre Bequemlichkeit, unser SDS-PAGE Gelvorbereitungskit (P1200) und Tris-Tricine-SDS-PAGE Gelvorbereitungskit (P1320) einschließlich aller Reagenzien für die Gelvorbereitung.

Um Ihnen Zeit zu sparen, bieten wir Precast-Gel an, um den Schritt der Gelvorbereitung zu überspringen und die Elektrophorese direkt durchzuführen.

1) Unser Precast-Gel ist sowohl für die denaturierende Gelelektrophorese als auch für die nicht denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese geeignet.

2) Im Vergleich zu Tris-Gly Precast-Gel kann das Tris-Hepes Precast-Gel klarere Bänder und eine höhere Auflösung ausführen.

3) Bitte bereiten Sie den Elektrophorese-Puffer vor Verwenden Sie die bereitgestellte Leistung, schlagen Sie nicht vor, den Tris-Gly-Puffer zu verwenden.

Der Ladepuffer wird sowohl für Native-PAGE (P1017, P 1027) als auch für SDS-PAGE (P1015, P1016, P1017, P1018) verwendet, die alle Ihre Anforderungen erfüllen.

Wir haben auch Proteinmarker mit unterschiedlichen Spezifikationen und Verwendungsmöglichkeiten für Ihre Bedürfnisse.

1) Alle diese drei Methoden sind für die Gelfärbung geeignet.

2) Die Silberfärbungsmethode (G7210) ist empfindlicher als die Coomassie Brilliant Blue-Methode (P1300 & P1305) und eignet sich für Proben mit niedriger Proteinkonzentration.

3) P1300 hat eine kürzere Färbezeit als P1305

Der Transfer von Proteinen oder Nukleinsäuren auf mikroporöse Membranen wird als "Blotting" bezeichnet und dieser Begriff umfasst sowohl "Spotting" (manuelle Probenabscheidung) als auch den Transfer von planaren Gelen. Proteine, die auf SDS-PAGE aufgelöst werden, werden typischerweise unter dem Einfluss eines elektrischen Stroms in einem Verfahren, das als Western-Blotting (WB) oder Protein-Blotting bekannt ist, auf adsorbierende Membranträger übertragen.

Das Western-Blot-Nachweissystem umfasst auch HRP-konjugierte Sekundärantikörper und ein chromogenes Mittel. Sola r bio bietet Reagenzien und Kits für DAB und ECL.

P0012 Ponceau S Solution,10× kann verwendet werden, um die Membrantransfereffizienz, insbesondere für die NC-Membran, zu bestimmen.

Wir bieten einen Stripping Buffer ( SW3020) an, der die Membran vollständig reinigen und einen anderen Antikörper in derselben Membran testen kann.

Stripping Buffer kann den Antikörper abwischen, ohne das Antigen in der Membran zu beeinträchtigen. Tatsächlich sind Membranmuster, Art und Konzentration des Antikörpers und Eigenschaften von Antigenen für die Elutionseffizienz von Bedeutung.

H inweis: Geeignet für den Western-Nachweis von ECL und ähnlichen chemilumineszenten Reagenzien. Nicht geeignet für Western-Detektion mit nicht-chemilumineszenten Reagenzien wie DAB, NBT/BCIP.


ELISA-Kit für Aspartat-Aminotransferase (AST)

  • Produkt-Nr. SEB214Ra
  • Organismenarten Rattus norvegicus (Ratte) Gleicher Name, verschiedene Arten.

Besonderheit

Dieser Assay hat eine hohe Sensitivität und ausgezeichnete Spezifität für den Nachweis von Aspartat-Aminotransferase (AST).
Es wurde keine signifikante Kreuzreaktivität oder Interferenz zwischen Aspartataminotransferase (AST) und Analoga beobachtet.

Erholung

Die unten aufgeführten Matrices wurden mit einer bestimmten Menge an rekombinanter Aspartat-Aminotransferase (AST) versetzt und die Wiederfindungsraten wurden berechnet, indem der gemessene Wert mit der erwarteten Menge an Aspartat-Aminotransferase (AST) in den Proben verglichen wurde.

Matrix Erholungsbereich (%) Durchschnitt(%)
Serum(n=5) 98-105 101
EDTA-Plasma (n=5) 91-99 96
Heparinplasma (n=5) 84-92 88

Präzision

Intra-Assay-Präzision (Präzision innerhalb eines Assays): 3 Proben mit niedriger, mittlerer und hoher Aspartat-Aminotransferase (AST) wurden jeweils 20 Mal auf einer Platte getestet.
Inter-Assay-Präzision (Präzision zwischen den Assays): 3 Proben mit niedrigen, mittleren und hohen Aspartat-Aminotransferase (AST)-Werten wurden auf 3 verschiedenen Platten getestet, 8 Replikate in jeder Platte.
CV(%) = SD/MittelwertX100
Intra-Assay: Lebenslauf

GEWINNSPIELE

INKREMENT-DIENSTLEISTUNGEN

  • Einkomponenten-Reagenzien des Assay-Kits
  • Lysepuffer spezifisch für ELISA / CLIA
  • Qualitätskontrolle von ELISA / CLIA
  • Maßgeschneiderter Service für ELISA-Kits
  • Maßgeschneiderter Service für Krankheitsmodelle
  • Seren Maßgeschneiderter Service
  • TGFB1 Aktivierungsreagenz
  • Experimenteller Service für Echtzeit-PCR
  • Streptavidin

ELISA: Glossar der Begriffe

Der ELISA-Grundlagenleitfaden enthält die richtige Menge an Details, die Ihnen bei der Planung Ihres Experiments und einem erfolgreichen ELISA helfen.

Adsorption - die passive Anlagerung einer Flüssigkeit an eine feste Oberfläche, wodurch ein dünner Film entsteht.

Antigen - Substanzen, Proteine, chemische Verbindungen oder Viren, die eine Immunantwort auslösen können, gegen die Antikörper gebildet werden.

AP (alkalische Phosphatase) - Phosphatase-Enzym, das eine Phosphatgruppe von einem Substrat entfernt. In ELISAs ist das Substrat p-Nitrophenylphosphat (pNPP).

Assayverdünner (siehe auch Puffer) - Pufferlösung, in der die zu analysierende Probe verdünnt wird.

Assay-Empfindlichkeit - ein Maß für die Fähigkeit des ELISA, zwischen kleinen Konzentrationsänderungen zu unterscheiden.

Hintergrund - die Signalanzeige, die allen Reagenzien mit Ausnahme des Analyten zuzuordnen ist. Sollte niedrig sein.

Blockieren - Anwendung von Reagenzien, im Allgemeinen Puffern, um den Hintergrund durch Bindung an die potentiellen unspezifischen Bindungsstellen von Antikörpern und Enzymkonjugaten zu senken.

Puffer - Lösungen, die Verbindungen, im Allgemeinen Proteine, enthalten, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu reduzieren, die beim Blockieren verwendet werden, um den Hintergrund zu reduzieren.

Kreuzreaktivität - ein Antikörper, der an ein Ziel bindet, das dem beabsichtigten Zielanalyten sehr ähnlich, aber nicht dem beabsichtigten Zielanalyten ist, d. h. ein eng verwandtes Molekül mit strukturellen Ähnlichkeiten mit dem Zielantigen.

Nachweisgrenze - Die kleinste Analytmenge, die mit dem ELISA-Test zuverlässig gemessen werden kann, wird oft auf 2 Standardabweichungen (2 SD) über dem Hintergrundniveau eingestellt.

Verdünnung - Zugabe eines Puffers zu einer Proteinlösung, um sie weniger konzentriert zu machen, wird zur Optimierung der Antikörperkonzentration verwendet, aber auch auf Proben angewendet, um Messwerte innerhalb des dynamischen Bereichs des Assays zu erhalten.

Dynamikbereich - Bereich im ELISA, über den die Extinktion linear ansteigt und der Analyt zuverlässig gemessen werden kann.

Randeffekt - das Ergebnis von Inkonsistenzen bei der Herstellung von ELISA-Multiwell-Platten oder wenn Assay-Bedingungen wie das Stapeln von Platten dazu führen, dass sich die äußeren Wells unterschiedlich verhalten. Infolgedessen können in den äußeren Bohrlöchern unerwartete Werte auftreten, die möglicherweise nicht mit benachbarten Bohrlöchern übereinstimmen. Dies kann am besten kontrolliert werden, indem für alle Proben Duplikate oder Triplikate verwendet werden und große Abweichungen in den Ergebnissen für eine bestimmte Probe festgestellt werden.

Heterophile Interferenz - stammt aus Antikörpern, die in der durch den ELISA analysierten Probe gefunden werden, bindet diese Antikörper an den im Assay verwendeten Nachweisantikörper. Das bekannteste Beispiel für heterophile Interferenzen ist HAMA (humaner Anti-Maus-Antikörper), der bei einigen Patienten vorkommt, wo er die genaue Analytbestimmung stört und falsch positive Messwerte anzeigt.

HRP (Meerrettich-Peroxidase) - ein Enzym, das Wasserstoffperoxid zu Wasser abbaut und eine Peroxidase bildet. Chromogene Substrate wie TMB dienen als Indikatoren für diese Enzymaktivität.

Hook-Effekt - verursacht durch sehr hohe Antigenkonzentrationen in der Probe. Infolgedessen reicht die spezifische Bindung des Antigens durch den Antikörper nicht aus, um den Analytspiegeln zu entsprechen, und das Signal ist niedriger als erwartet. Der beste Weg, dieses Problem zu vermeiden, besteht darin, mehrere Verdünnungen jeder Probe zu testen.

Immunoassay - jede Art von Assay, der Antikörper verwendet, um die Konzentration eines Analyten in einer Probe zu messen.

Störung - Effekte auf den Immunoassay, die die genaue Messung des Analyten stören (z. B. Matrixeffekt, heterophile Interferenz).

Matrixeffekt - die Wirkung von Verbindungen in der Probe auf die Messung des Analyten.

pNPP (para-Nitrophenylphosphat) - kolorimetrisches Substrat für alkalische Phosphatase, fällt es als gelbe Substanz aus.

Proteinstabilisatoren - Reagenzien, die die Aufrechterhaltung der nativen Struktur von Proteinen während der Adsorption an die Assay-Oberfläche fördern.

Substrat - Verbindung wie pNPP und TMB, die verwendet wird, um den Analyten in einem Immunoassay zu messen.

TMB - ein kolorimetrisches Substrat für Meerrettichperoxidase, das sich nach Abschluss der enzymatischen Reaktion blau färbt.


ELISA-Kit für 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3)

  • Produkt-Nr. CEA915Ge
  • Organismenarten Pan-Arten (allgemein) Gleicher Name, verschiedene Arten.

Besonderheit

Dieser Assay hat eine hohe Sensitivität und ausgezeichnete Spezifität für den Nachweis von 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3).
Es wurde keine signifikante Kreuzreaktivität oder Interferenz zwischen 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) und Analoga beobachtet.

Erholung

Die unten aufgeführten Matrices wurden mit einem bestimmten Gehalt an 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) versetzt und die Wiederfindungsraten wurden berechnet, indem der gemessene Wert mit der erwarteten Menge an 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) in den Proben verglichen wurde.

Matrix Erholungsbereich (%) Durchschnitt(%)
Serum(n=5) 99-105 102
EDTA-Plasma (n=5) 78-89 85
Heparinplasma (n=5) 93-105 98

Präzision

Intra-Assay-Präzision (Präzision innerhalb eines Assays): 3 Proben mit niedrigem, mittlerem und hohem 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) wurden jeweils 20 Mal auf einer Platte getestet.
Inter-Assay-Präzision (Präzision zwischen den Assays): 3 Proben mit niedrigem, mittlerem und hohem 25-Hydroxyvitamin D3 (HVD3) wurden auf 3 verschiedenen Platten getestet, 8 Replikate in jeder Platte.
CV(%) = SD/MittelwertX100
Intra-Assay: Lebenslauf

GEWINNSPIELE

INKREMENTE DIENSTLEISTUNGEN

  • Einkomponenten-Reagenzien des Assay-Kits
  • Maßgeschneiderter Service für ELISA-Kits

SARS-CoV-2-Nukleoprotein-ELISA-Kit

Dieser Assay verwendet die quantitative Sandwich-Enzym-Immunoassay-Technik. Ein monoklonaler Antikörper, der für SARS-CoV-2-Nukleoprotein spezifisch ist, wurde auf eine Mikrotiterplatte vorbeschichtet. Standards und Proben werden in die Vertiefungen pipettiert, und dann wird ein Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Nachweisantikörper, der für SARS-CoV-2-Nukleoprotein spezifisch ist, in die Vertiefungen gegeben, wodurch ein Antikörper-Antigen-Antikörper-"Sandwich-Komplex" entsteht. Nach den Inkubations- und Waschschritten wird ein Substrat zugegeben. Im Verhältnis zur Menge des in der Probe vorhandenen SARS-CoV-2-Nukleoproteins entsteht ein gefärbtes Produkt. The reaction is terminated by the addition of acid and absorbance is measured at 450nm. A standard curve is prepared from six SARS-CoV-2 Nucleoprotein standard dilutions and SARS-CoV-2 Nucleoprotein sample concentration determined.

TARGET INFORMATION

Coronaviruses are enveloped viruses with a positive-sense RNA genome and with a nucleocapsid of helical symmetry. Coronavirus nucleoproteins localize to the cytoplasm and the nucleolus, a subnuclear structure, in both virus-infected primary cells and in cells transfected with plasmids that express N protein. Coronavirus N protein is required for coronavirus RNA synthesis and has RNA chaperone activity that may be involved in template switch. Nucleocapsid protein is the most abundant protein of coronavirus. During virion assembly, N protein binds to viral RNA and leads to the formation of the helical nucleocapsid. Nucleocapsid protein is a highly immunogenic phosphoprotein also implicated in viral genome replication and in modulating cell signaling pathways. Because of the conservation of the N protein sequence and its strong immunogenicity, the N protein of coronavirus is chosen as a diagnostic tool.