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Fehlerbehebung SDS-PAGE von Trypsin-behandeltem BSA

Fehlerbehebung SDS-PAGE von Trypsin-behandeltem BSA


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Ich arbeite derzeit an der SDS-PAGE-Technik mit 20% Acrylamidkonzentration für hydrolysiertes BSA-Protein. Hier habe ich ein Gelfoto für Trypsinhydrolysiertes BSA angehängt. Ich weiß nicht, ist es ein gutes Ergebnis und wie interpretiere ich dieses Ergebnis?


Ich werde dies als teilweise Hausaufgabenfrage behandeln, aber einige Hinweise geben, wie Sie Ihre Frage möglicherweise angehen und eine solide Theorie haben, um sie zu untermauern. Chymotrypsin spaltet vorzugsweise Peptidamidbindungen, wo die Carboxylseite der Amidbindung (die P1-Position) eine große hydrophobe Aminosäure ist (Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin). Eine Lösung, die von experimentellen Biologen (wie mir), die Massenspektrometrie (MS) durchführen, häufig verwendet wird, besteht also darin, ihre Proteinsequenz (in diesem Fall BSA) in einen Algorithmus wie PeptideCutter (von ExPASy) einzugeben, der eine theoretische Verdauung von . durchführt die Proteinsequenz, nachdem Sie das gewünschte Enzym oder die Kombination von Enzymen ausgewählt haben) und sehen Sie, welche Peptidfragmente voraussichtlich produziert werden, und berechnen Sie deren Länge/Molekulargewicht und vergleichen Sie dies mit Ihren experimentellen Daten.

Nach einem ersten Blick fiel mir auf, dass Ihr Proteinmarker / Ihre Proteinleiter fehlt, was sehr wichtig ist, um die produzierten Peptidgrößen herauszufinden! Und was sind 1-8 Bahnen? Sind die Enzymkonzentrationen unterschiedlich? Wenn ja, dann sieht es für mich in Ordnung aus, denn je höher die Enzymkonzentration von links nach rechts, desto höher ist die Menge an Verdauungsprodukten, die Sie haben. Wenn die erhaltenen Peptidgrößen nicht die erwarteten sind, verlängern oder verkürzen Sie möglicherweise die Verdauungszeit, da Sie je nach unvollständiger oder unspezifischer Verdauung ein Problem haben könnten. Ich denke, da BSA MW ~ 66kDa beträgt, ist Ihre Gelkonzentration angemessen, da Sie ein Problem mit dem 15%-Gel haben, da die Produkte zu klein und zu reichlich sind, um sie zu lösen.


COmplete™ His-Tag-Reinigungssäulenprotokoll und Fehlerbehebung

Komplette His-Tag-Reinigungssäulen (Produkt-Nr. COHISC-RO) sind mit automatisierten Chromatographiesystemen wie ÄKTAexplorer kompatibel.

Reinigung unter nativen Bedingungen

Die Reinigung nativer Proteine ​​sollte unter Verwendung optimaler Pufferbedingungen für das Zielprotein durchgeführt werden. Die in diesem Dokument empfohlenen Puffer sind gut etablierte Beispiele und können angepasst werden, um optimale Bedingungen für ein spezifisches Zielprotein zu erreichen.
Komplette His-Tag-Reinigungssäulen bieten Flexibilität bei der Auswahl der optimalen Pufferbedingungen.
Warnung: Die Bindungskapazität kann erheblich sinken, wenn die Pufferzusammensetzung nicht optimal ist.
Notiz: Um beste Ergebnisse zu erzielen, laden Sie mit einer niedrigen Flussrate, um die Zielproteine ​​effizienter an das Harz zu binden.
Warnung: Vollständige His-Tag-Reinigungssäulen wurden optimiert mit Puffer A und Puffer B in der Tabelle unten angegeben. Andere Puffer könnten ebenfalls funktionieren, müssen aber vor der Verwendung mit cOmplete His-Tag Purification Columns getestet werden.
Puffer A: 50 mM NaH2Bestellung4, pH 8,0 300 mM NaCl
Puffer B: 50 mM NaH2Bestellung4, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM Imidazol
Notiz: Das folgende Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren bei Verwendung eines ÄKTAexplorer 100-Systems (Cytiva) für die FPLC-Reinigung.

  1. Waschen Sie die Pumpe mit 10 bis 20 ml Puffer A Verwendung der Systemwäsche Funktion des ÄKTAexplorer Systems bei einer Flussrate von 10 ml/min. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Luft aus den Pumpen und Schläuchen des Systems verdrängt wird.
  2. Entfernen Sie den Stopfen am Säulenauslass und befestigen Sie ihn am Auslassschlauch des ÄKTAexplorer-Systems. Notiz: Bewahren Sie den Stopfen des Säulenausgangs auf, falls die Säule gelagert werden muss oder wiederverwendet werden soll.
  3. Sobald Puffer A aus dem Einlassschlauch des ÄKTAexplorer Systems läuft, entfernen Sie den oberen Stopfen von der Säule und bringen Sie ihn sofort am Einlassschlauch des ÄKTAexplorer Systems an. Kontinuierlich OD . messen280 Werte auf dem ÄKTAexplorer-System. Notiz: Wenn ein fluoreszierendes Protein gereinigt wird, messen Sie kontinuierlich die OD-Werte am Absorptionsmaximum des Fluoreszenzfarbstoffs z.B., OD485 für GFP (Green Fluorescent Protein) oder OD435 für CFP (cyan fluoreszierendes Protein). Notiz: Bewahren Sie den Stopfen des Säuleneinlasses auf, falls die Säule gelagert werden muss oder wiederverwendet werden soll.
  4. Definieren Sie die Durchflussmenge als 10 ml/min für die 5-ml-Säule oder 2 ml/min für die 1-ml-Säule und äquilibrieren Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina von Puffer A.
  5. Unterbrechen Sie den Lauf. Laden Sie die gelöschte Probe (z.B., nach einem Ultrazentrifugations- oder Filtrationsschritt) auf die Säule mit einem Volumenstrom von 2,5 ml/min für die 5-ml-Säule oder 0,5 bis 1 ml/min für die 1-ml-Säule. Warnung: Um eine Verstopfung der Säule zu vermeiden, entfernen Sie unlösliches Material, bevor Sie die Säule beladen. Warnung: Da die Bindungsspezifität des Harzes hoch ist, ist die Kinetik der Adhäsion des Proteins an das Harz langsamer als bei anderen verfügbaren Harzen. Bei Verwendung hoher volumetrischer Flussraten zum Beladen kann die Proteinausbeute sinken.
  6. Waschen Sie die Säule mit Puffer A, bis die OD280 Wert erreicht das Ausgangsniveau (ungefähr 10 Säulenvolumina).
  7. Eluiere das His-markierte Protein mit einem Gradienten von Puffer A (ohne Imidazol) und Puffer B (250 mM Imidazol). Warnung: Proteinpeaks sind zwischen 25 und 45 mM Imidazol zu erwarten. Aufgrund der spezifischen Eigenschaften von vollständigen His-Tag-Reinigungssäulen kann ein Protein bereits mit ca. 25 mM Imidazol eluiert werden. Warnung: Die benötigte Imidazolmenge im Elutionspuffer zur effizienten Freisetzung des Zielproteins aus dem Harz hängt von verschiedenen Parametern ab, wie zB: • der Länge des His-Tags, • der Zugänglichkeit des His-Tags.
  8. Waschen und für den nächsten Lauf äquilibrieren. Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Reinigungsverfahren. Warnung: Wenn die Säule nicht sofort wiederverwendet wird, reinigen Sie die Säule mit 2 Säulenvolumina 2 M Imidazol, um die unspezifische Bindung von Proteinen zu entfernen. Äquilibrieren Sie die Säule in einer 20%igen Ethanollösung und verschließen Sie die Säule an beiden Gewinden fest mit Stopfen. Bei +2 bis +8 °C lagern, um Zellwachstum zu verhindern.

Notiz:Siehe Abschnitte Optimierung des Reinigungsprozesses und Fehlerbehebung für technische Beratung zur Optimierung der Reinigungsergebnisse.

Reinigung unter denaturierenden Bedingungen

Die Reinigung von denaturierten Proteinen sollte unter Verwendung optimaler Pufferbedingungen für das Zielprotein durchgeführt werden. Die in diesem Dokument empfohlenen Puffer sind gut etablierte Beispiele und können angepasst werden, um optimale Bedingungen für ein spezifisches Zielprotein zu erreichen.
Komplette His-Tag-Reinigungssäulen bieten Flexibilität bei der Auswahl optimaler Pufferbedingungen.
Denaturiere das Protein oder löse die Einschlusskörperchen in einem Puffer auf, der 6 M Guanidinium-HCl oder 8 M Harnstoff enthält.
Warnung:Die Zugabe von Harnstoff zu gepufferten Lösungen führt zu einem Absinken des pH-Werts. Der pH-Wert des Puffers muss nach der Harnstoffzugabe unbedingt mit NaOH eingestellt werden.
Warnung: Die Bindungskapazität kann auch deutlich sinken, wenn die Pufferzusammensetzung nicht optimal ist.
Notiz: Um die besten Ergebnisse zu erzielen, laden Sie mit einer niedrigen Flussrate, um die Zielproteine ​​effizienter an das Harz zu binden.
Warnung: Vollständige His-Tag-Reinigungssäulen wurden optimiert mit Puffer C, Puffer D, Puffer E, und Puffer F in der Tabelle unten angegeben. Andere Puffer könnten ebenfalls funktionieren, müssen aber vor der Verwendung mit cOmplete His-Tag Purification Columns getestet werden.
Puffer C: 100 mM NaH2Bestellung4 10 mM Tris-HCl 8 M Harnstoff pH 8,0
Puffer D: 100 mM NaH2Bestellung4 10 mM Tris-HCl 8 M Harnstoff pH-Wert 6,3
Puffer E: 100 mM NaH2Bestellung4 10 mM Tris-HCl 8 M Harnstoff pH-Wert 5,9
Puffer F: 100 mM NaH2Bestellung4 10 mM Tris-HCl 8 M Harnstoff pH 4,5
Notiz: Das folgende Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren bei Verwendung eines ÄKTAexplorer 100-Systems (Cytiva) für die FPLC-Reinigung.

  1. Waschen Sie die Pumpe mit 10 bis 20 ml Puffer C Verwendung der Systemwäsche Funktion des ÄKTAexplorer Systems bei einer Flussrate von , z.B., 10ml/min. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Luft aus den Pumpen und Schläuchen des Systems verdrängt wird.
  2. Entfernen Sie den Stopfen am Säulenauslass und befestigen Sie ihn am Auslassschlauch des ÄKTAexplorer-Systems. Notiz: Bewahren Sie den Stopfen des Säulenausgangs auf, falls die Säule gelagert oder wiederverwendet werden soll.
  3. Sobald Puffer C aus dem Einlassschlauch des ÄKTAexplorer Systems läuft, entfernen Sie den oberen Stopfen von der Säule und bringen Sie ihn sofort am Einlassschlauch des ÄKTAexplorer Systems an. Kontinuierlich OD . messen280 Werte auf dem ÄKTAexplorer-System. Notiz: Wenn ein fluoreszierendes Protein gereinigt wird, messen Sie kontinuierlich die OD-Werte am Absorptionsmaximum des Fluoreszenzfarbstoffs z.B., OD485 für GFP (Grün fluoreszierendes Protein oder OD435 für CFP (cyan fluoreszierendes Protein). Notiz: Bewahren Sie den Stopfen des Säuleneinlasses auf, falls die Säule gelagert oder wiederverwendet werden muss.
  4. Definieren Sie die Durchflussmenge als 10 ml/min für die 5-ml-Säule oder 2 ml/min für die 1-ml-Säule und äquilibrieren Sie die Säule mit 10 Säulenvolumina von Puffer C.
  5. Unterbrechen Sie den Lauf. Laden Sie die gelöschte Probe (z.B., nach einem Ultrazentrifugations- oder Filtrationsschritt) auf die Säule mit einem Volumenstrom von 2,5 ml/min für die 5-ml-Säule oder 0,5 bis 1 ml/min für die 1-ml-Säule. Warnung: Um eine Verstopfung der Säule zu vermeiden, entfernen Sie unlösliches Material, bevor Sie die Säule beladen. Warnung: Da die Bindungsspezifität des Harzes hoch ist, ist die Kinetik der Adhäsion des Proteins an das Harz langsamer als bei anderen verfügbaren Harzen. Bei Verwendung hoher volumetrischer Flussraten zum Beladen kann die Proteinausbeute sinken.
  6. Waschen Sie die Säule mit Puffer C bis zum OD280 Wert erreicht das Ausgangsniveau (ungefähr 10 Säulenvolumina).
  7. Waschen mit 10 bis 20 Säulenvolumina Puffer D.
  8. Waschen mit 10 bis 20 Säulenvolumina Puffer E.
  9. Eluieren Sie das His-markierte Protein mit 10 bis 20 Säulenvolumina von Puffer F. Notiz: Alternativ kann die Elution auch mit einem Gradienten bis 200 mM Imidazol-Lösung unter Verwendung von Puffer A und Puffer B anstelle der pH-Shift-Option (siehe Elutionsschritt in Abschnitt Reinigung unter nativen Bedingungen).
  10. Waschen und für den nächsten Lauf unter denaturierenden Bedingungen äquilibrieren mit Puffer C oder waschen mit Puffer A um die Denaturierungsmittel zu entfernen, wenn die Säule das nächste Mal unter nativen Bedingungen verwendet wird. Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Reinigungsverfahren. Warnung: Wenn die Säule nicht sofort wiederverwendet wird, reinigen Sie die Säule mit 2 Säulenvolumina 2 M Imidazol, um die unspezifische Bindung von Proteinen zu entfernen. Äquilibrieren Sie die Säule in einer 20%igen Ethanollösung und verschließen Sie die Säule an beiden Gewinden fest mit Stopfen. Bei +2 bis +8 °C lagern, um Zellwachstum zu verhindern.

Notiz: Siehe Abschnitt Optimierung des Reinigungsprozesses und Fehlerbehebung für technische Beratung zur Optimierung der Reinigungsergebnisse.

Reinigungsverfahren

Vollständige His-Tag-Reinigungssäulen können ohne Verlust der Bindungskapazität mehrmals verwendet werden. Im Laufe der Zeit können sich jedoch einige Proteinaggregate ansammeln, was zu einer Abnahme der Effizienz des Harzes in den Säulen führt. Dies ist an einer langsameren Durchflussrate oder einem höheren Gegendruck zu erkennen.
Die Reinigungsverfahren entfernen Aggregate für eine weitere effiziente Nutzung der Säulen. Je nach Anwendung können unterschiedliche Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Nach Abschluss des Reinigungsvorgangs sollte das Harz in 20% Ethanol überführt werden.

Strenge native Reinigung

Dieses Verfahren ist geeignet, wenn nicht-aggregierende Proteine ​​gereinigt wurden und wenn die Säule erneut zur Reinigung desselben Proteins verwendet wird.

  • Waschen mit 10 Säulenvolumina 1 M Imidazol/HCl, pH 7,5,
  • Waschen mit 10 Säulenvolumina 4 M Imidazol/HCl, pH 7,5,
  • Äquilibrieren Sie die Säule mit Bindungspuffer und fahren Sie mit der nächsten Reinigungsrunde fort oder übertragen Sie das Material auf 20 % Ethanol.

Denaturierende Reinigung mit SDS

Dieses Verfahren ist geeignet, um aggregierte Proteine ​​und Lipide zu entfernen.
Warnung: Dieser Reinigungsvorgang muss bei +15 bis +25 °C durchgeführt werden, da die Löslichkeit von SDS bei dieser Temperatur besser ist als bei +2 bis +8 °C.
Notiz: Der SDS-Puffer kann auch 50 mM DTT enthalten.
Warnung:Vermeiden Sie die Verwendung von K + in diesem Puffer, um eine Ausfällung mit SDS zu verhindern.

  • Waschen mit 10 Säulenvolumina 1 M Imidazol/HCl, pH 7,5,
  • 2-mal mit 10 Säulenvolumina 1 M Imidazol/HCl, pH 7,5, 20 % Ethanol, 2 bis 4 % SDS, waschen,
  • Entfernen Sie SDS mit 3 mal 10 Säulenvolumina 20 % Ethanol.

Denaturierende Reinigung mit Guanidinium-HCl

Dieses Verfahren ist geeignet, um aggregierte Proteine ​​zu entfernen.
Notiz:Der Guanidinium-HCl-Puffer kann auch 50 mM DTT enthalten.

  • Waschen mit 10 Säulenvolumina 1 M Imidazol/HCl, pH 7,5,
  • Waschen Sie zweimal mit 10 Säulenvolumina 6 M Guanidinium-HCl, 1 M Imidazol, pH 7,5,
  • Zweimal mit 10 Säulenvolumen 20 % Ethanol waschen.

Notiz: Im Allgemeinen hängt die Wahl der Reinigungsmethode von der Proteinart ab.
Notiz: Das denaturierende Reinigungsverfahren mit Guanidinium-HCl weist weniger Einschränkungen auf als das denaturierende Reinigungsverfahren mit SDS.

Optimierung des Reinigungsprozesses

Die Parameter, die die maximale Proteinausbeute und -reinheit ermöglichen, können in Abhängigkeit von den Eigenschaften eines bestimmten Zielproteins erheblich variieren. Um das Proteinreinigungsverfahren für höchste Proteinreinheit zu optimieren, bestimmen Sie die optimalen Betriebsbedingungen für das spezifische Zielprotein. Sowohl Reinheit als auch Ausbeute einer Proteinpräparation hängen von der Probenmenge ab. Wenn die Probenmenge zu hoch ist, reicht die Bindungskapazität des Harzes möglicherweise nicht aus, um das gesamte Zielprotein zu binden, und dies führt zu einer suboptimalen Proteinausbeute. Wenn die Probenmenge zu gering ist, können die verbleibenden Bindungsstellen auf dem Harz eine Hintergrundbindung von Lysatkomponenten ermöglichen. Optimale Ergebnisse werden erhalten, wenn die Menge des Zielproteins mit der Harzmenge in den Säulen übereinstimmt. Die Kapazität für ein bestimmtes Zielprotein hängt von mehreren Faktoren ab, wie der Größe des Zielproteins, der Konformation, dem Multimerisierungsstatus, der Länge und Zugänglichkeit des His-Tags, dem Expressionsniveau und der Löslichkeit des His-Tag-Proteins, der Lysatkonzentration sowie dem Puffer pH-Wert und Zusammensetzung. Um beste Ergebnisse zu erzielen, bestimmen Sie das optimale Verhältnis des Volumens von Lysat und Harz innerhalb der Säulen, das für die Aufreinigung eines spezifischen Proteins von Interesse erforderlich ist, das von der Expressionsrate des Proteins abhängt:

  • Inkubieren Sie die Säulen mit unterschiedlichen Volumina an Lysaten in parallelen Testexperimenten,
  • Waschen Sie die Säulen und eluieren Sie die gebundenen Proteine,
  • Bestimmen Sie die Menge an Zielprotein in den ungebundenen Fraktionen und im Eluat durch SDS-PAGE,
  • Das Lysatvolumen ist optimal, wenn nur noch eine geringe Menge Zielprotein im Durchfluss verbleibt und die maximale Proteinmenge in den Eluatfraktionen nachgewiesen wird.

Notiz: Die Ausbeute des Zielproteins kann optimiert werden, indem man dem Protein mehr Zeit lässt, an das Harz zu binden. Dies kann durch Verringern der Flussrate während des Ladeschritts der Chromatographiereinigung durchgeführt werden.
Notiz: Die optimale Konzentration von Imidazol während der Bindungs-, Wasch- und Elutionsschritte kann auch in Vorversuchen bestimmt werden.
Notiz: Optimale Ergebnisse können typischerweise mit Puffern erzielt werden, die eine hohe Salzkonzentration (300 mM) bei pH 8,0 für Zielproteine ​​enthalten, die mit diesen Bedingungen kompatibel sind.


Übertragung von hochmolekularen Proteinen - (14. November 2008)

Hi
Ich versuche, nach einem Komplex mit hohem Molekulargewicht zu suchen, erhalte jedoch keinen konsistenten Nachweis. Ich verwende Gradientengele und PVDF-Membranen, um meinen 350 kDa-Komplex zu untersuchen. Oftmals ist der Hintergrund immens, obwohl die Bands auch präsent sind. Irgendwelche Vorschläge bitte??

Stellen Sie sicher, dass es in Gel läuft und nicht in der Vertiefung feststeckt.
-Gradient ist gut.
-Länger laufen.
- Kochen oder nicht kochen, je nachdem, was funktioniert.

Stellen Sie sicher, dass die Übertragung vollständig ist.
-PVDF ist gut.
-bestätigen Sie durch Färben des Gels. PonceauS für Membran.
-Verwenden Sie dünneres Gel.
-Längere Transferzeit.
-Denken Sie daran, dem Übertragungspuffer zusätzliche SDS hinzuzufügen.
-Erhöhter Methanolgehalt im Transferpuffer kann ebenfalls hilfreich sein.

Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, ist das Hintergrundproblem so gut wie bei jedem Western.
-Beziehen Sie sich auf die Diskussionen zur Reduzierung des Hintergrunds.

Blot kühl (4 Grad C) und lang (über Nacht -24 Stunden). Es ist am besten, wenn Sie mehrere Male versuchen, um zu sehen, was für Sie am besten funktioniert.

Ich arbeite mit einem hochmolekularen Protein (MW 512kDa). Für den Proteinnachweis habe ich 5% SDS PAGE Gel ausprobiert, aber das Protein blieb an der Grenzfläche zwischen dem Stapeln und dem Laufgel stecken. Ich verwende 1% SDS (TGS-basiert) zum Laufen des Gels und 1% SDS und 20% Methanol im Transferpuffer. Wenn jemand Erfahrung mit solch hochmolekularen Proteinen hat, bitte ich um Vorschläge.

Scheint irgendwie offensichtlich, aber Sie müssen keinen Stapler verwenden. Sie sind nicht unbedingt notwendig, insbesondere für Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht, obwohl sie kleine Proteine ​​gleichmäßiger laufen lassen. Ich hätte auch gesagt, dass 5% für ein 500-kDa-Protein etwas hoch sind, Sie müssen möglicherweise auf ein anderes Gelsystem umsteigen.

Ich würde auch die Methanolkonzentration bei Ihrem Transfer senken, es verringert die Mobilität während des Transfers.

reduziere die sds in deinem transferpuffer. mehr als 0,05% stören die Bindung.

Die 20% Methanol helfen dabei, SDs vom Protein zu entfernen, um die Bindung zu unterstützen. Sie können es in Ruhe lassen, wenn Sie möchten (Sie können die Transferzeit bei Bedarf verlängern).

wir verwendeten ein 3,5-5% Gradientengel für Proteine ​​mit hohem Molekulargewicht (mit einem 8M-0 Harnstoffgradienten, um die Banden zu schärfen).

Oh toll, viele riesige Proteinfans hier. ich brauche auch deine hilfe

Ich versuche ein 310 kDa Protein nachzuweisen. Bisher habe ich 6 % Auflösungsgel, 5 % Stapelgel und ein Tris-Glycin-Puffersystem verwendet.
Ich habe das Gel gefärbt und es scheint, dass es Proteine ​​​​> 250 kDa auf meinem Gel gibt (das ist das größte Protein meines Markers). Ich habe die PVDF-Membran nach dem Transfer nicht angefärbt, da ich gelesen habe, dass dies die Erkennung später beeinträchtigen könnte (richtig? falsch?), aber ich werde es das nächste Mal tun. Ich hatte Probleme mit der Blockierung und ich bekam einen sehr schönen sekundären Antikörper, der bis zu 250 kDa bindet, aber nicht darüber hinaus. Also ich denke mein Hauptproblem ist der Transfer.

Sie haben erwähnt, dass keine Stapelgele verwendet werden - gilt dies auch, wenn ich keine Verlaufsgele verwenden kann? Würden Sie 5 % oder 6 % Gele vorschlagen? Oder noch weniger?

Für den Transfer habe ich eine Semi-Dry-Blotting-Einheit verwendet, aber da ich gelesen habe, dass dies suboptimal sein könnte, habe ich eine Tank-Blot-Einheit bestellt. Haben Sie Vorschläge für einen guten Transferpuffer? Ist SDS im Transferpuffer notwendig? Meins hat nur Methanol, aber kein SDB.

Und eine Frage zum Blockieren: Wir verwenden normalerweise 5% BSA in TBS-T. Im Datenblatt meines Primärantikörpers schlagen sie 5% Milchpulver in TBS-T vor. Wie sterilisiere ich diese Lösung? Mir wurde gesagt, ich solle es nicht autoklavieren, aber die Filtration war es. ein bisschen. unwirksam

Oh toll, viele riesige Proteinfans hier. ich brauche auch deine hilfe

Ich versuche ein 310 kDa Protein nachzuweisen. Bisher habe ich 6 % Auflösungsgel, 5 % Stapelgel und ein Tris-Glycin-Puffersystem verwendet.
Ich habe das Gel gefärbt und es scheint, dass es Proteine ​​​​> 250 kDa auf meinem Gel gibt (das ist das größte Protein meines Markers). Ich habe die PVDF-Membran nach dem Transfer nicht angefärbt, da ich gelesen habe, dass dies die Erkennung später beeinträchtigen könnte (richtig? falsch?), aber ich werde es das nächste Mal tun. Ich hatte Probleme mit der Blockierung und ich bekam einen sehr schönen sekundären Antikörper, der bis zu 250 kDa bindet, aber nicht darüber hinaus. Also ich denke mein Hauptproblem ist der Transfer.

Sie haben erwähnt, dass keine Stapelgele verwendet werden - gilt dies auch, wenn ich keine Verlaufsgele verwenden kann? Würden Sie 5 % oder 6 % Gele vorschlagen? Oder noch weniger?

Für den Transfer habe ich eine Semi-Dry-Blotting-Einheit verwendet, aber als ich gelesen habe, dass dies suboptimal sein könnte, habe ich eine Tank-Blot-Einheit bestellt. Haben Sie Vorschläge für einen guten Transferpuffer? Ist SDS im Übertragungspuffer erforderlich? Meins hat nur Methanol, aber kein SDB.

Und eine Frage zum Blockieren: Wir verwenden normalerweise 5% BSA in TBS-T. Im Datenblatt meines Primärantikörpers schlagen sie 5% Milchpulver in TBS-T vor. Wie sterilisiere ich diese Lösung? Mir wurde gesagt, ich solle es nicht autoklavieren, aber die Filtration war es. ein bisschen. unwirksam

Wenn Sie mit 5-6% im Trenngel beginnen, benötigen Sie kein Sammelgel, wenn es verwendet wird, sollte es niedriger als <5% sein

Sie benötigen ein Referenzprotein >/= 310 kDa

Warum eine sterile Milchlösung verwenden? durch es weg nach Gebrauch.

Wenn Sie mit 5-6% im Trenngel beginnen, benötigen Sie kein Sammelgel, wenn es verwendet wird, sollte es niedriger als <5% sein

Sie benötigen ein Referenzprotein >/= 310 kDa

Warum eine sterile Milchlösung verwenden? durch es weg nach Gebrauch.

Ich warte immer noch auf die neue Blotting-Einheit, aber dann werde ich ein 6% Gel und einen Puffer mit SDS ausprobieren.

Referenzprotein. Hm. Ich möchte nur Größenunterschiede zeigen und die zweite Form des Proteins liegt im Bereich meines Markers und ich habe eine Positivkontrolle (Zelllinie).

Ich dachte, eine sterile Milchlösung könnte besser sein, wenn sich im Pulver etwas befindet (Fasern oder was auch immer), das den Blot stören könnte. Aber du hast recht, ich bereite es einfach frisch zu, das ist der einfachste Weg.


Leitfaden zur Fehlerbehebung bei Restriktionsenzymen

Der folgende Leitfaden kann zur Fehlerbehebung bei Restriktionsenzymverdauungen verwendet werden. Sie könnten auch daran interessiert sein, zusätzliche Tipps zur Optimierung von Verdauungsreaktionen zu lesen.

Wir freuen uns, Ihnen mitteilen zu können, dass wir dabei sind, alle Reaktionspuffer auf BSA-frei umzustellen. Ab April 2021 wird NEB unsere aktuellen BSA-haltigen Reaktionspuffer (NEBuffer&trade 1.1, 2.1, 3.1 und CutSmart ® Buffer) auf rekombinantes Albumin (rAlbumin)-haltige Puffer (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 und .) umstellen rCutSmart&Trade-Puffer). Wir gehen davon aus, dass dieser Wechsel bis zu 6 Monate dauern kann. Die Abkehr von tierischen Produkten sehen wir als einen Schritt in die richtige Richtung und können diese Verbesserung zum gleichen Preis anbieten. Weitere Informationen finden Sie unter www.neb.com/BSA-free.

Während dieser Übergangszeit erhalten Sie möglicherweise ein Produkt mit BSA- oder rAlbumin-haltigen Puffern. NEB hat beide rigoros getestet und bei der Verwendung beider Puffer keinen Unterschied in der Enzymleistung festgestellt. Beide Puffer können mit Ihrem Enzym verwendet werden. Alle Website-Inhalte werden im April umgestellt, um die Änderungen widerzuspiegeln, obwohl Sie den neuen Puffer möglicherweise nicht sofort mit Ihrem Produkt erhalten.

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Restriktionsenzym-Verdauungsproblem: DNA-Abstrich auf Agarose-Gel

Erfahren Sie mehr darüber, was dieses häufige Problem verursacht und wie die Enzyme von NEB einer QC unterzogen werden, um ein Verschmieren der DNA zu vermeiden.

Warum schneidet mein Restriktionsenzym die DNA nicht?

Bekommen Sie nicht das Dekolleté, das Sie erwartet haben? Lassen Sie sich von einem NEB-Wissenschaftler bei der Fehlersuche bei Ihrer Reaktion helfen.

Restriktionsenzym-Verdauungsproblem: Zu viele DNA-Banden

Finden Sie unerwartete Banden in Ihrer Verdauungsreaktion? Hier sind einige Tipps, die Ihnen helfen, die Ursache zu ermitteln.

Restriktionsenzymverdauungsprotokoll: Nah am DNA-Ende schneiden

Wenn Sie nahe am Ende eines DNA-Moleküls schneiden, stellen Sie sicher, dass Sie wissen, wie viele Basen Sie an die Enden Ihrer PCR-Primer hinzufügen müssen.

ZEITSPAREND & Handelsprotokoll für Restriktionsenzymverdauungen

Benötigen Sie ein Protokoll, um schnell und vollständig zu verdauen? Versuchen Sie dieses Protokoll für Time-Saver&trade-qualifizierte Enzyme von NEB.

Reduzieren Sie die Sternaktivität mit High-Fidelity-Restriktionsenzymen

NEB hat HF®-Enzyme entwickelt, um die Sternaktivität zu eliminieren. Erfahren Sie, wie und was dies für Ihre Verdauung bedeutet.

Standardprotokoll für Restriktionsenzymverdau

Lassen Sie sich von einem der Restriktionsenzym-Experten von NEB dabei helfen, Ihre Technik zu verbessern und häufige Fehler beim Verdau-Setup zu vermeiden.

  • Überprüfen Sie die Methylierungsempfindlichkeit des Enzyms/der Enzyme, um festzustellen, ob das Enzym durch Methylierung der Erkennungssequenz blockiert wird
  • Verwenden Sie den empfohlenen Puffer, der mit dem Restriktionsenzym geliefert wird
  • Reinigen Sie die DNA, um alle Verunreinigungen zu entfernen, die das Enzym hemmen könnten
  • Stellen Sie beim Verdauen eines PCR-Fragments sicher, dass zwischen der Erkennungsstelle und dem Ende des DNA-Moleküls mindestens 6 Nukleotide liegen
  • Reduzieren Sie die Anzahl der Einheiten
  • Fügen Sie SDS (0,1&ndash0,5%) zum Ladepuffer hinzu, um das Enzym von der DNA zu dissoziieren, oder verwenden Sie Gel Loading Dye, Purple (6X) (NEB #B7024)
  • Verwenden Sie frischen, sauberen Laufpuffer
  • Verwenden Sie ein frisches Agarosegel
  • Bereinige die DNA (NEB #T1030)
  • Überprüfen Sie die Methylierungsempfindlichkeit des Enzyms/der Enzyme, um festzustellen, ob das Enzym durch Methylierung der Erkennungssequenz blockiert wird
  • DNA, die aus einer bakteriellen Quelle isoliert wurde, kann durch Dam- und Dcm-Methylierung blockiert werden
  • Wenn das Enzym durch Dam- oder Dcm-Methylierung gehemmt wird, züchten Sie das Plasmid in a dam-/dcm- Stamm (NEB #C2925)
  • DNA, die aus eukaryotischen Quellen isoliert wurde, kann durch CpG-Methylierung blockiert werden
  • Enzyme mit geringer Aktivität in salzhaltigen Puffern (NEBuffer r3.1) können salzempfindlich sein. Reinigen Sie daher die DNA (NEB #T1030) vor dem Verdau
  • DNA-Reinigungsverfahren, die Spin-Säulen verwenden, können zu hohen Salzkonzentrationen führen, die die Enzymaktivität hemmen. 1 Um dies zu verhindern, sollte die DNA-Lösung nicht mehr als 25 % des gesamten Reaktionsvolumens ausmachen.
  • Reinigen Sie das PCR-Fragment vor dem Restriktionsverdau (NEB #T1030)
  • Verwenden Sie den empfohlenen Puffer, der mit dem Restriktionsenzym geliefert wird
  • Verwenden Sie mindestens 3&ndash5 Enzymeinheiten pro &mgr;g DNA
  • Erhöhen Sie die Inkubationszeit
  • Einige Enzyme haben eine geringere Aktivität auf superkollysierte DNA. Erhöhen Sie die Anzahl der Enzymeinheiten in der Reaktion.
  • Einige Enzyme können eine langsamere Spaltung zu bestimmten Stellen hin zeigen. Erhöhen Sie die Inkubationszeit, normalerweise sind 1 und 2 Stunden ausreichend.
  • Einige Enzyme erfordern das Vorhandensein von zwei Erkennungsstellen, um effizient zu schneiden
  • Assay-Substrat-DNA in Gegenwart einer Kontroll-DNA. Kontroll-DNA wird nicht gespalten, wenn ein Inhibitor vorhanden ist. Mini-Prep-DNA ist besonders anfällig für Verunreinigungen.
  • Reinigen Sie die DNA mit einer Spin-Säule (NEB #T1030) oder erhöhen Sie das Volumen, um die Verunreinigungen zu verdünnen
  • Verringern Sie die Anzahl der Einheiten in der Reaktion
  • Fügen Sie dem Ladepuffer SDS (0,1&ndash0,5%) hinzu, um das Enzym vom Substrat zu dissoziieren
  • Verwenden Sie den empfohlenen Puffer, der mit dem Restriktionsenzym geliefert wird
  • Verringern Sie die Anzahl der Enzymeinheiten in der Reaktion
  • Stellen Sie sicher, dass die zugesetzte Enzymmenge 10 % des Gesamtreaktionsvolumens nicht überschreitet. Dadurch wird sichergestellt, dass die Gesamtglycerinkonzentration 5 % v/v . nicht überschreitet
  • Verringern Sie die Inkubationszeit. Die Verwendung der minimalen Reaktionszeit, die für einen vollständigen Aufschluss erforderlich ist, hilft, die Sternaktivität zu verhindern.
  • Versuchen Sie es mit einem High-Fidelity (HF) Restriktionsenzym. HF-Enzyme wurden für eine reduzierte Sternaktivität entwickelt.
  • Enzyme mit geringer Aktivität in salzhaltigen Puffern (z. B. NEBuffer r3.1) können salzempfindlich sein. Stellen Sie sicher, dass die DNA (NEB #T1030) vor dem Verdau gereinigt wird.
  • DNA-Reinigungsverfahren, die Spin-Säulen verwenden, können zu hohen Salzkonzentrationen führen, die die Enzymaktivität hemmen. 1 Um dies zu verhindern, sollte die DNA-Lösung nicht mehr als 25 % des gesamten Reaktionsvolumens ausmachen.
  • Reinigen Sie das PCR-Fragment vor dem Restriktionsverdau (NEB #T1030)
  • Verwenden Sie den empfohlenen Puffer, der mit dem Restriktionsenzym geliefert wird
  • Verwenden Sie mindestens 5&ndash10 Einheiten Enzym pro &Becher DNA
  • Verdauen Sie die DNA für 1&ndash2 Stunden


1 Monarch Kits (NEB #T1010, NEB #T1020 und NEB #T1030) verwenden Säulen, die entwickelt wurden, um die Salzverschleppung in die eluierte DNA zu minimieren.


Quantifizierung

Von allen verfügbaren Methoden zur Proteinquantifizierung (einschließlich UV-Spektroskopie bei 280 nm, kolorimetrische farbstoffbasierte Assays und Elektrophorese in Kombination mit Bildaufnahmeanalyse) ermöglicht nur die Proteinquantifizierung durch Elektrophorese die Bewertung von Reinheit, Ausbeute oder prozentualer Wiederfindung einzelner Proteine ​​in komplexe Probenmischungen.

Zwei Arten der Quantifizierung sind möglich: relative Quantifizierung (Quantifizierung einer Proteinspezies relativ zur Menge einer anderen) und absolute Quantifizierung (Quantifizierung eines Proteins unter Verwendung einer Eichkurve, die durch einen Bereich bekannter Konzentrationen dieses Proteins erzeugt wird). Da Proteine ​​unterschiedlich mit Proteinfärbungen interagieren, kann die Färbeintensität verschiedener Proteine ​​bei identischer Proteinbeladung sehr unterschiedlich sein, sodass in den meisten Fällen nur relative quantitative Werte bestimmt werden können. Absolute Proteinmessungen können nur durchgeführt werden, wenn das zu untersuchende Protein in reiner Form vorliegt und als Kalibriersubstanz verwendet wird.


Probendenaturierung

Für SDS-PAGE wurden verschiedene Probenpuffer verwendet, aber alle verwenden die gleichen Prinzipien, um Proben zu denaturieren. Wir erreichen eine gute Denaturierung, indem wir eine Probe auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml Protein mit 1 % SDS, 10 % Glycerin, 10 mM Tris-Cl, pH 6,8, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), einem Reduktionsmittel wie z B. Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol, und eine Prise Bromphenolblau als Tracking-Farbstoff (

Wir bereiten ein 2x Konzentrat aus Probenpuffer bestehend aus 2% SDS, 20% Glycerin, 20 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 160 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 mg/ml Bromphenol blaue Farbe. Ich bevorzuge DTT gegenüber 2-Mercaptoethanol, weil letzteres einen viel stärkeren unangenehmen Geruch hat und unsere Blutfraktionen nicht sehr gut denaturiert. Ein Teil des Problems ist, dass unsere Wasserbäder den Siedepunkt nicht erreichen und ein Kochen mit 2-Mercaptoethanol erforderlich sein kann. Wir bereiten alle unsere Unbekannten auf die gleiche Konzentration vor und mischen dann 1 Volumen vorbereitete Probe mit 1 Volumen 2x Puffer.

Was also tun die verschiedenen Komponenten? EDTA ist ein Konservierungsmittel, das zweiwertige Kationen chelatisiert, wodurch die Aktivität proteolytischer Enzyme reduziert wird, die Calcium- und Magnesiumionen als Cofaktoren benötigen. Das Tris fungiert als Puffer, was sehr wichtig ist, da der Stapelprozess bei der diskontinuierlichen Elektrophorese einen bestimmten pH-Wert erfordert. Glycerin macht die Probe dichter als der Probenpuffer, sodass die Probe am Boden einer Vertiefung verbleibt, anstatt herauszuschwimmen. Der Farbstoff ermöglicht es dem Untersucher, den Fortschritt der Elektrophorese zu verfolgen.

SDS, DTT und Hitze sind für die eigentliche Denaturierung der Probe verantwortlich. SDS bricht die zwei- und dreidimensionale Struktur der Proteine ​​auf, indem den Aminosäuren eine negative Ladung hinzugefügt wird. Da sich ähnliche Ladungen abstoßen, werden die Proteine ​​mehr oder weniger begradigt, wodurch sie sofort funktionslos werden. Eine gewisse Quartärstruktur kann aufgrund von Disulfidbindungen (kovalent) und aufgrund kovalenter und nichtkovalenter Bindungen an andere Arten von Molekülen verbleiben. Ein anderer Name für SDS ist übrigens Laurylsulfat. Ihr Shampoo kann Laurylsulfat enthalten – weckt das nicht Vertrauen in das Produkt?

Viele Proteine ​​haben signifikante hydrophobe Eigenschaften und können durch hydrophobe Wechselwirkung eng mit anderen Molekülen wie Lipiden verbunden sein. Durch Erhitzen der Proben auf mindestens 60 °C werden die Moleküle geschüttelt, sodass SDS in den hydrophoben Regionen binden und die Denaturierung abschließen kann.

Die Aminosäure Cystein enthält eine Sulfhydrylgruppe (-SH), die unter normalen intrazellulären Bedingungen spontan eine Disulfidbindung (-S-S-) mit einer anderen Sulfhydrylgruppe bildet. Die Disulfidbindung ist kovalent und wird durch SDS nicht gestört. DTT ist ein starkes Reduktionsmittel. Seine spezifische Rolle bei der Denaturierung von Proben besteht darin, das letzte Bit der Tertiär- und Quartärstruktur durch Reduktion von Disulfidbrücken zu entfernen.

Die meisten Probenpuffer entfernen keine kovalent gebundenen Kohlenhydrat- oder Phosphatgruppen, und einige Assoziationen mit anderen Makromolekültypen sind schwer zu zerstören. Polypeptide enthalten unterschiedliche Mengen an basischen und sauren Aminosäuren, die den Molekülen Ladung verleihen, und einzelne Aminosäuren variieren im Molekulargewicht, obwohl sie SDS mit der gleichen Affinität binden können. Daher wird das Verhältnis von Ladung zu Masse und die relative Mobilität vieler Proteine ​​von anderen Faktoren als dem reinen Molekulargewicht beeinflusst. SDS-PAGE liefert sehr effektiv reproduzierbare Ergebnisse, aber verlassen Sie sich nicht auf genaue Werte für die MW-Bestimmung.


6 wichtige FAQs zu Rinderserumalbumin (BSA)

Rinderserumalbumin (BSA) ist im Labor universell einsetzbar und wird in Western Blot, Zellgewebekultur, PCR und mehr verwendet, aber die Vielseitigkeit von BSA hat Forscher dazu veranlasst, viele häufige Fragen zu stellen. Anstatt Antworten durch das Internet zu jagen, haben wir 6 sehr häufige Fragen zu BSA identifiziert und einige sehr detaillierte Antworten als hilfreiche Anleitung bereitgestellt.

1. Welche Art von BSA sollte ich für mein Experiment verwenden?

In unserem früheren Artikel zu genau diesem Thema haben wir uns dieser Frage tatsächlich genauer angenommen. Diese Frage taucht oft auf, weil es so viele Arten von BSAs gibt, die auf eine breite Palette von Laboranwendungen ausgerichtet sind, wobei jede Eigenschaften aufweist, die sie für eine Labortechnik besser optimieren. Zum Beispiel möchten Sie möglicherweise ein IgG-freies BSA, wenn Sie ein Blockierungsmittel benötigen.

Die Entscheidung, welches BSA zu verwenden ist, basiert auf dem Typexperiment, das Sie durchführen, und Ihren spezifischen Bedürfnissen. Nach einem Blick auf den oben genannten Artikel und seine Auswahlhilfetabelle ist es immer noch gut, auf andere Quellen wie ResearchGate zu verweisen, um weitere Informationen und eine maßgeschneiderte Antwort zu erhalten.

2. Wie funktioniert BSA als Blockierungsmittel?

Blocker sollen die unspezifische Bindung Ihrer Antikörper verhindern. Solange ein Protein keine Affinität zu Ihrer Sonde hat, kann es theoretisch als Blockierungsmittel verwendet werden. Wenn Sie jedoch zufällig etwas auswählen, wird Ihr Experiment wahrscheinlich ineffizient sein. Daher gibt es bestimmte Proteine, die für diese Art von Arbeit bestimmt sind. Diese Proteine ​​binden konsistenter an die Membran, verbessern die Assay-Empfindlichkeit und reduzieren Hintergrundstörungen.

Warum dann BSA? Zunächst einmal wollen Sie nicht irgendein BSA. Viele Arten von BSAs enthalten IgGs (ok für andere Anwendungen), die zu unspezifischer Bindung führen können. Das Ziel ist es, mit einem Protein zu arbeiten, das Ihr Experiment unter optimalen Bedingungen hält. Im Falle eines Blockers, insbesondere BSA, sollten Sie also Typen in Betracht ziehen, die frei von Immunglobulinen sind.

3. Sollte ich BSA oder Milch für meinen Western Blot verwenden?

Die beiden am häufigsten verwendeten Blocker in Labors sind fettarme Milch und BSA. Und jedes hat Vor- und Nachteile. Milch ist im Vergleich zu BSA in der Regel kostengünstiger und leichter aus Pulver zuzubereiten. Milch ist jedoch nicht gut in Avidin-Biotin-Systemen zu verwenden, da Milch Biotin enthält und Milch nicht für phosphorylierte Proteine ​​​​verwendet werden sollte.

Bei der Arbeit mit phosphorylierten Proteinen tendiert BSA in der Regel dazu, besser als Blockierungsmittel zu wirken. Dies liegt daran, dass Milch eine Vielzahl von Proteinen enthält, darunter das Phosphoprotein Casein, das zu einem höheren Hintergrund führt. Natürlich gibt es bei allen Ratschlägen auch Sonderfälle. Die beste Faustregel bei der Arbeit mit phosphorylierten Proteinen ist um mit BSA zu beginnen, und dann von dort aus optimieren.

4. Warum erfordert die Schätzung der Proteinkonzentration normalerweise BSA?

Um die Proteinkonzentration einer unbekannten Probe abzuschätzen, müssen Sie diese mit einer Referenz vergleichen, die Ihrer Probe am ähnlichsten ist. Dies ist jedoch nicht immer leicht zu finden, daher spielt BSA die Rolle der Referenz. Es gibt einige Faktoren, die BSA zu einer geeigneten Referenz für die Verwendung machen: Es ist sehr reichlich vorhanden, es ist sehr erschwinglich, es ist sehr stabil und es hat keinen großen Einfluss auf biochemische Reaktionen.

5. Ist Rinderserumalbumin (BSA) und fetales Rinderserum (FBS) dasselbe?

Nö. Es ist nicht das gleiche. Fetales Rinderserum ist ein häufig verwendetes Serumergänzungsmittel für eukaryotische Zellkulturen. Der Vorteil von FBS für die Zellkultur sind seine niedrigeren Antikörperspiegel und höheren Wachstumsfaktorspiegel. Rinderserumalbumin (BSA) wird in einer Vielzahl von Laboranwendungen verwendet, einschließlich seiner Funktion als Proteinkonzentrationsstandard, seiner Funktion als Zellnährstoff und seiner Fähigkeit, Enzyme während der Restriktionsverdauung zu stabilisieren. Die wichtige Erkenntnis hier ist jedoch, dass sie zwar oft in Google-Suchen auftauchen, wenn Sie nur nach dem einen oder anderen suchen, und sich sehr ähnlich klingen, aber sie sind tatsächlich unterschiedlich.

6. Warum ist es wichtig, dass BSA in den USA hergestellt wird?

Die Bedeutung der Beschaffung Ihres BSA aus den USA oder Australien ist auf die Besorgnis über die Prioneninfektion der bovinen spongiformen Enzephalitis (BSE) zurückzuführen. In den Vereinigten Staaten hat es keinen Ausbruch gegeben, der diese Produkte vertrauenswürdiger macht. GoldBio betont insbesondere, dass ihr BSA in den Vereinigten Staaten in einem geschlossenen Kreislauf aus USDA-inspizierten Tieren hergestellt wird und als BSE/TSE-frei zertifiziert ist.


2-D-Elektrophorese-Workflow

Der 2-D-Elektrophorese-Workflow bietet eine umfassende Auswahl an Produktlösungen und Schulungsressourcen, die Ihnen bessere Ergebnisse für die Entdeckung von Biomarkern, die Proteincharakterisierung und die Entwicklung von HCP-Assays liefern.

Probenvorbereitung

Elektrophorese der ersten Dimension

Elektrophorese der 2. Dimension

Färbung, Bildgebung und Analyse

2-D-Elektrophoresegeräte und Reagenzien

Komplette Systeme für die 2D-Elektrophorese, einschließlich Zellen der ersten Dimension isoelektrischer Fokussierung (IEF), "2DE" Puffer und Reagenzien, vorgefertigte Gele und Mini-, Midi- und großformatige Elektrophoresezellen der zweiten Dimension.

Präparative Elektrophorese

Die präparativen Elektrophoresesysteme von Bio-Rad können Nanogramm-zu-Gramm-Mengen von Proteinen oder Nukleinsäuren durch Elektrophorese oder kontinuierliche Elektroelution aus Gelen fraktionieren und reinigen.


Relative Aktivität von Restriktionsenzymen in Universal- und Basalpuffern

Unsere Restriktionsenzyme werden mit einem optimalen Universalpuffer geliefert (einer von fünf Universalpuffern, die in der folgenden Tabelle blau markiert sind). Die relative Aktivität in jedem der anderen Universalpuffer wird auf den optimalen Puffer normalisiert, wobei die Aktivität jedes Enzyms im optimalen Puffer als 100 % ausgedrückt wird. Werte in ( ) zeigen Puffer an, die wahrscheinlich von der Sternaktivität beeinflusst werden. Um diese Effekte zu vermeiden, wird die Verwendung von blau oder rosa hervorgehobenen Puffern empfohlen.

Einige spezifische Enzyme (AccIII, BalI, BcnI, BglI, Bpu1102I, Cfr10I, Eco52I, NruI, PshBI, SnaBI, SspI, TaqI und VpaK11BI) werden jeweils mit einem auf das jeweilige Enzym spezialisierten Basalpuffer geliefert. Die Zusammensetzungen dieser Basalpuffer variieren je nach Enzym.

Restriktionsenzym Relative Aktivitäten (%)
LmhKT + BSABasal***
AatII <20 <20 <20 <20 100 120
AccI 20 100 <20 (<20) 160 80
AccII (260) 100 <20 20 200 160
AccIII (<20) (<20) 20 (80) (<20) 100
AfaI 60 60 40 60 100 100
AflII 20 80* <20 <20 140 120
AluI 100 100 <20 40 200 120
Aor13HI <20 20 <20 80 * 80 100
Aor51HI 80 100 <20 20 120 120
ApaI 100 <20 <20 <20 <20 120
ApaLI 100 20 <20 <20 120 120
AvaI (<20) 100 20 40 100 120
AvaII 80 100 <20 20 100 100
BalI 20 20 <20 <20 40 100
BamHI (<20) <20 40 100 (<20) 80
BanII (120) (120) 100 80 (100) 100
BcnI <20 20 40 60 60 100
BglI <20 <20 20 40 <20 100
BglII <20 20 100 (100) (60) 100
BlnI <20 20 40 100 20 120
BmeT110I <20 <20 20 100 <20 140
BmgT120I <20 <20 100 40 <20 240
Bpu1102I <20 <20 <20 40 60 100
BspT104I 100 60 <20 <20 100 120
BspT107I <20 20 80 100 20 100
Bsp1286I 100 20 <20 <20 60 100
Bsp1407I 20 60 20 20 100 100
BssHII 100 100 60 20 140 100
BstPI (<20) (60) 100 (100) (100) 100
BstXI <20 40 100 <20 <20 120
Bst1107I (<20) 60 100 100 40 100
Cfr10I (<20) (<20) (<20) 40 (20) 100
ClaI 40 100 120 100 60 100
CpoI <20 <20 80 100 <20 100
DraI 100 100 60 100 80 80
EaeI 60 100 <20 <20 120 160
EcoO65I (20) (60) 60 * 40 40 100
EcoO109I 100 60 <20 <20 100 160
EcoRI (20) (100) 100 (120) (80) 120
EcoRV (<20) (40) 100 (120) (40) 100
EcoT14I (<20) (40) 100 120 (60) 100
EcoT22I <20 20 100 (140) (20) 120
Eco52I <20 <20 <20 <20 <20 100
Eco81I <20 100 <20 <20 100 160
FbaI (<20) (<20) (80) 100 (20) 100
FokI (20) (60) <20 <20 (200) 100
HaeII 80 100 <20 80 140 100
HaeIII 60 100 100 60 100 100
HapII 100 60 <20 <20 100 80
HaI 80 100 100 120 120 100
HincII 20 100 20 40 100 80
HindIII (60) 100 <20 200 (100) 80
HinfI 80 100 100 160 60 100
Hin1I 40 80* <20 20 60 160
HpaI <20 (40) 20 100 (80) 100
KpnI 100 60 <20 <20 (100) 80
MboI 20 40 60 100 40 100
MboII 100 60 <20 <20 60 100
MflI 100 80 <20 <20 80 100
MluI 60 60 100 (100) 60 100
MspI 80 80 <20 100 100 80
MunI (200) 100* <20 <20 160 100
MvaI (<20) (40) 80 100 (20) 120
NaeI 100 <20 <20 <20 100 120
NcoI (40) (60) 20 60* (60) 160
NdeI <20 40 100 100 80 100
NheI (120) 100 <20 <20 (160) 100
Nicht ich (<20) (<20) 20** <20 (<20) 100
NruI 0 <20 20 20 <20 100
NsbI 40 20 <20 60 100 100
PmaCI 100 80 <20 <20 100 100
PshAI 20 40 <20 100 60 160
PshBI (20) (40) 20 40 40 100
Psp1406I 20 60 <20 <20 100 100
PstI (<20) (60) 100 80 (20) 80
PvuI (<20) (20) (40) 80* (40) 120
PvuII (80) 100 40 <20 (40) 100
SacI 100 60 <20 <20 80 80
SacII 40 20 <20 <20 100 40
SalI <20 <20 100 (20) <20 120
Sau3AI (60) 80 100 <20 (80) 100
ScaI (<20) (<20) 100 (60) (<20) 100
SfiI (40) 100 <20 <20 100 100
SmaI <20 <20 <20 <20 100 100
Lächeln <10 <20 100 40 <10 100
SnaBI (20) (40) <20 <20 (40) 100
SpeI (80) 100 80 100 (80) 100
SphI (20) (40) 100 120 (20) 100
Sse8387I (120) 60* <20 <20 (60) 100
SspI (<20) (60) 40 (100) (80) 100
StuI 60 100 60 80 140 100
TaqI 40 80 60 60 80 100
Tth111I (20) 80 40 100 (80) 120
Van91I <20 (20) 60 100 (60) 100
VpaK11BI <20 <20 60 (40) <20 100
XbaI <20 80* 20 <20 120 120
XhoI <20 60 100 160 60 100
XspI <20 60 <20 100 160 100

Blau: Puffer, der mit dem Restriktionsenzym geliefert wird
Pink: alternativer Puffer für die Verwendung empfohlen

*+0,01% BSA &rarr 100% AflII, EcoO65I, FokI, Hin1I, MunI, NcoI, PvuI, SplI, Sse8387I, XbaI
**+0,01 % BSA + 01 % Triton X-100 &rarr 100 % NotI
*** Die Zusammensetzungen der Basalpuffer sind enzymspezifisch.


Fehlerbehebung SDS-PAGE von Trypsin-behandeltem BSA - Biologie

auf einer Mission, Biochemie Spaß zu machen und für alle zugänglich zu machen

Könnte das ein massives Protein sein, das ich sehe? Wir können Proteine ​​nach Größe trennen, indem wir sie durch ein SDS-PAGE-Gel schicken, aber um unseren Proteinschatz zu finden, müssen wir einige Schatzsucher schicken. Und der, den wir am häufigsten verwenden, ist ein Farbstoff namens Coomassie Brilliant Blue (CBB), entweder auf klassische Weise oder in Form schnellerer kolloidaler Färbungen (oft als geschützte Version von &ldquoinstant blue&rdquo beworben).

Hinweis: Dieser Beitrag wurde vom September 2019 überarbeitet, vor etwa 300 SDS-Seiten (wörtlich, nicht übertrieben &ndash heute habe ich meine 732., 733. und 734. ausgeführt!)

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate &ndash PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) ist eine Technik, die wir verwenden, um Proteine ​​​​in einer Mischung nach Größe (Well, Länge) zu trennen, indem wir Strom verwenden, um die Proteine ​​durch ein Gelnetz zu schicken. Das Ziel hier ist nicht, die Proteine ​​zu reinigen, sondern nur zu sehen, was da drin ist. Aber Proteine ​​sind für das bloße Auge unsichtbar, also brauchen wir eine Art Farbstoff, um Proteine ​​auszuspionieren.

Hinweis: Das Blau, das Sie sehen, während das Gel läuft, ist nur ein Tracker-Farbstoff im Probenladepuffer, der Ihnen hilft zu wissen, wann Sie den Strom ausschalten und mit der Färbung beginnen müssen.

Sie können sich die SDS-PAGE-Gel-Matrix als Labyrinth vorstellen, in dem Protein überall versteckt ist. Im Gegensatz zu den Proteinen, die sich gerade nach unten im Gel bewegen, weil das elektrische Feld sie auf diese Weise zwang, erfolgt der Färbeschritt, nachdem Sie den Strom abgeschaltet und Ihr Gel von seinem Plattensandwich in eine Färbebox übertragen haben. Hier gibt es keine Ausrichtung auf die Bewegung der Dinge, also bewegt sich die Farbe, wohin sie will! (obwohl das Protein durch chemisch induziertes Verklumpen an Ort und Stelle bleibt, wie wir sehen werden).

Der Farbstoff wandert durch Diffusion zufällig durch das Gellabyrinth (die Moleküle bewegen sich zufällig herum und prallen von den Dingen ab, auf die sie stoßen, mit dem NETTOERGEBNIS, dass sie sich von Bereichen hoher Konzentration zu Bereichen niedriger Konzentration bewegen). Wenn es einen Proteinschatz findet, rastet es ein. Und da der Farbstoff blau ist, sagt er uns, wo sich das Protein befindet.

Aber es ist wirklich schwer, Schätze zu finden, die zu entkommen versuchen! Also müssen wir den Schatz dazu bringen, an Ort und Stelle zu bleiben &ndash der FIXATION-Schritt verwendet einen Alkohol und / oder eine Säure, damit das Protein ausfällt (klumpt), damit es an Ort und Stelle bleibt, damit unser Schatzsuchfarbstoff ihn finden kann. Wir müssen auch auf übereifrige Schatzsucher achten, die sich an &ldquofool&rsquos Gold&rdquo festklammern (das Gel selbst beflecken), was einen hohen Hintergrund verursacht. Dies führt zu einem umfassenden Schema der Schatzsuche von:

  1. GEL-ELEKTROPHORESE &ndash trennt Proteine ​​nach Größe, indem man sie entfaltet, sie mit negativ geladenem Detergens (SDS) beschichtet und diese negative Ladung verwendet, um sie zu motivieren, durch ein Polyacrylamid-Gel-Netz in Richtung einer positiven Ladung zu wandern. Die größeren (längeren) Proteine ​​verheddern sich mehr, so dass sie sich langsamer bewegen und weniger fortgeschritten sind (also höher auf dem Gel), wenn Sie den Strom ausschalten. Mehr hier: http://bit.ly/2GZc3tG
  2. WASH &ndash entfernt kostenlose Sicherheitsdatenblätter usw.
  3. FIX &ndash den Schatz einfangen &ndash das Gel muss Proteinen erlauben sich zu bewegen, wenn Sie es wollen, aber nicht zu leicht &ndash Idealerweise bewegen sie sich nur, wenn sie eingeschaltet sind, aber Moleküle bewegen sich gerne und wenn sie können, werden sie dies auch tun (besonders die kleinen Einsen) können auch dann abwandern, wenn der Strom ausgeschaltet ist). Um dieses Wandern zu verhindern, fügen Sie Alkohol und / oder Säure hinzu, damit sie verklumpen und an Ort und Stelle stecken bleiben.
  4. FLECK &ndash schicke die Schatzsucher &ndash klebe das Gel in ein Färbebad &ndash der Farbstoff dringt ein, rastet auf dem Protein ein und bleibt auch stecken (dieser Schritt wird oft mit dem Fixierschritt kombiniert)
  5. DESTAIN &ndash die Jagd abbrechen &ndash die schatzlosen Schatzsucher zum Gehen bringen, damit Sie besser sehen können, wo die schatzvollen sind (einige schnelle Flecken haben einen niedrigen Hintergrund & Sie entfärben einfach in Wasser und lassen den Farbstoff ausdiffundieren, aber einige Methoden verwenden komplexere Entfärbungen)

Wie ich bereits erwähnt habe, gibt es viele verschiedene Formulierungen, darunter &ldquoClassic Coomassie&rdquo, das wirklich eifrige Schatzsucher hat, die winzige Mengen an Schätzen finden können, aber auch dumm & gold-glücklich &ndash it&rsquos super empfindlich sind und dir schließlich schöne knackige Bänder geben, aber es dauert viel destaining, um sie zu enthüllen. Alternative &ldquoKolloidale Coomassie&rdquo-Rezepte werden immer häufiger, weil sie schneller & umweltfreundlicher sind &ndash diese Formen Gruppen von Schatzsuchern außerhalb des Gels hängen lassen und sie nach und nach einsenden, bis alle Schätze gefunden und gebunden sind.

Schauen wir uns unseren Schatzsucher Coomassie Brilliant Blue (CBB) genauer an. Die meisten wissenschaftlichen Reagenzien haben langweilige (wenn auch beschreibende) Namen, so dass Sie sich vielleicht fragen, wie Coomassie Brilliant Blue (CBB) zu seinem Namen kam. Wenn Sie ein bisschen nerdig sind, können Sie es nachschlagen. Und wenn Sie noch nerdiger sind wie ich, (umarmen Sie es!), dann können Sie anderen Leuten davon erzählen!

&ldquoCoomassie&rdquo ist eigentlich ein Markenname &ndash im Besitz einer Firma, die ihn nicht einmal mehr &ndash & einen Stadtnamen macht (heute Kumasi, Ghana). CBB wurde dort entdeckt oder produziert, nein, ein britisches Unternehmen hielt es für eine gute Geschäftsstrategie, sein Produkt nach der Hauptstadt des Ashanti-Imperiums zu benennen, das es kürzlich erobert hatte. Das macht mich wütend, also nenne ich es die meiste Zeit CBB.

&ldquoCoomassie&rdquo wurde ursprünglich verwendet, um eine breite Palette von Wollfarbstoffen zu vermarkten, wobei CBB erstmals 1913 hergestellt wurde und erstmals in den 1960er Jahren zum Färben von Proteinen verwendet wurde. Färben, um mehr über den Farbstoff selbst zu erfahren? Es hat eine windradartige chemische Struktur und wird als Triphenylmethanfarbstoff charakterisiert. Im Gegensatz zu dem gebräuchlichen Namen, den ein Unternehmen einem Produkt geben wollte, ist dies ein Beispiel für einen funktionellen Namen &ndash er beschreibt die chemische Zusammensetzung &ndash in diesem Fall drei (Tri)phenylmethangruppen &ndash Phenyl ist eine Art resonanzstabilisierter Ring (ein Ring oder Atome, die Elektronen in einer delokalisierten Weise teilen, wodurch sie Licht gut absorbieren und dadurch die Dinge farbig aussehen lassen) &ndash und Methyl ist eine -CH₃ Gruppe.

Es gibt 2 Hauptformen dieses &ldquotriphenylmethan&rdquo-Farbstoffs, R-250 & G-250. Beide sind blau, aber R&rsquos &ldquoreddish&rdquo & G&rsquos &ldquor &ldquogreenish&rdquo (obwohl die Farbe vom pH-Wert abhängt und ob und woran es gebunden ist, weshalb es verwendet werden kann, um Proteinkonzentrationen in einem sogenannten &ldquoBradford-Assay&rdquo zu messen http://bit. ly/bradforduv ). &ldquo250&rdquo war ursprünglich ein Reinheits-/Stärkeindikator. R-250 ist empfindlicher, aber G-250 kann mit schnelleren Protokollen in Formen gebracht werden, die einen niedrigeren Hintergrund erzeugen.

Wir erhalten die auf G-250 basierende &ldquoquick-Färbung&rdquo, die wir meistens verwenden, vorgefertigt, aber wir stellen unsere eigene &ldquoClassic&rdquo-R-250-Färbung her. Es ist ein wirklich einfaches Rezept &ndash nur 4 Zutaten: Wasser, Essigsäure (AcOH), Methanol (MeOH), & CBB &ndash aber es dauert eine Weile,&hellip mehr hier: http://bit.ly/2QJNwLy

Aber all das spielt keine Rolle, wenn der Farbstoff nicht dort ist, wo Sie ihn haben möchten, und nur dort, wo Sie ihn haben möchten. Wo wir wollen, klebt es an unserem Protein (das selbst in unserem Gel steckt). Und wo wir es nicht wollen, ist überall im Gel kein Protein. Wie haftet es an unserem Protein, aber nicht am Gel? Der unbeholfene Biochemiker ist hier, um es zu erzählen!

CBB hat Schwefelsäuregruppen, die je nach pH-Wert negativ oder neutral sein können. Unter den Bedingungen der Färbelösung hat es eine Gesamtladung ➖ (anionisch), sodass es (reversibel) an ➕-geladene Teile von Proteinen (basische Aminosäuren wie Arg, Lys und His) durch elektrostatische Wechselwirkungen bindet (Gegenteile ziehen sich an) ). Hinweis: Diese Seitenketten sind nicht immer positiv, aber wir färben das Gel unter sauren Bedingungen, wo sie wahrscheinlicher sind &ndash mehr hier: http://bit.ly/30qzHH6

CBB bindet auch an ungeladene Proteinteile (insbesondere die ring-y (auch bekannt als aromatische) Aminosäuren wie Phe, Tyr und Trp) &ldquogenerisch&ldquo durch &ldquoVan-der-Waals&rdquo-Wechselwirkungen, die eine Verschiebung von Elektronen beinhalten, wenn sich Moleküle nähern. Diese Interaktionen sind einzeln schwach, aber sie summieren sich (sie ermöglichen es Geckos, Wände hochzulaufen!). Proteine ​​mit ungewöhnlich hohen Anteilen an ringförmigen Aminosäuren neigen dazu, besser zu färben. Ein Beispiel ist BSA (Bovine Serum Albumin), das pro Proteingewicht doppelt so viele Schatzsucher rekrutiert als Ihr durchschnittliches Protein.

Apropos Gewicht, verschiedene Proteine ​​haben unterschiedliche Gewichte, weil sie unterschiedliche #s von Aminosäurebuchstaben haben. Wir sprechen gewöhnlich über Proteingewichte in Bezug auf „Molekulargewicht (MW)&rdquo und Einheiten von „KiloDalton&rdquo (kDa). Das Molekulargewicht von BSA beträgt 66,5 kDa, was bedeutet, dass 1 Mol (6 × 10 ^ 23) BSA-Moleküle 66,5 kg wiegen würde. Mehr zu Maulwürfen hier: http://bit.ly/2KQLw4k

Aber das Entscheidende hier ist, dass größere Proteine ​​in den Augen von CBB „mehr zu lieben&rdquo haben &ndash, dass sie mehr Bindungsstellen bieten und somit mehr BSA pro Proteinmolekül produzieren als ein kleineres Protein. Ihre Banden würden also für größere Proteine ​​dunkler aussehen als für kleinere Proteine, wenn Sie die gleiche Anzahl von Proteinmolekülen von jedem laufen ließen.

Die Proteinbindungsfähigkeit von CBB macht es auch zu einem guten Wollfarbstoff, da Wolle voll von einem Protein namens Keratin ist. Und diese keratinbindende Fähigkeit, die es gut macht, Wolle zu färben, macht es auch gut zum Färben Ihrer Haut. Tragen Sie also Handschuhe und vermeiden Sie Spritzer. CBB kann auch SDS binden (das Detergens, das wir früher verwendet haben, um die Proteine ​​zu solubilisieren und negativ aufzuladen), was die Ergebnisse verfälschen kann. Sie möchten Ihr Gel also vor dem Färben in Wasser waschen, um das Sicherheitsdatenblatt zu entfernen.

Die klassische CBB-Methode geht ungefähr so ​​(Entschuldigung für die kritzeltartige Formatierung)&hellip

  1. Wasser waschen -> Pufferkomponenten aus dem Gel diffundieren lassen -> mit einem &ldquosauberen Schiefer beginnen&rdquo
  2. Fixierung/Färbung -> Gel in eine Färbelösung eintauchen (CBB + Methanol (MeOH) + Essigsäure (AcOH)) (einige umweltfreundlichere Methoden verwenden Ethanol)
    • wir lösen CBB in einer MeOH/AcOH-Lösung, um die Fixierungs- und Färbeschritte zu kombinieren. Hinweis: Es dauert sehr, sehr lange, bis sich das CBB-Pulver aufgelöst hat, also lassen Sie es mehrere Stunden auf einer Magnetrührplatte rühren und filtern Sie dann durch einen Kaffeefilter, um ungelöstes Material zu entfernen
    • Fixierung: Protein fällt aus und wird in der Gelmatrix eingeschlossen
    • Fleck: Farbstoff diffundiert in Gel
      • wenn Farbstoff auf Protein trifft -> Farbstoff bindet -> wird eingeschlossen, weil das Protein eingeschlossen ist
      • wo kein Protein vorhanden ist, füllt der Farbstoff immer noch die Poren des Gels, aber er ist nicht eingeschlossen (er kann ein- und ausfließen, aber an diesem Punkt fließt er hauptsächlich ein, weil die Farbstoffkonzentration ([Farbstoff] im Fleck höher ist als in) das Gel).
      • Wenn [Farbstoff außerhalb des Gels] = [Farbstoff innerhalb des Gels] erreicht ist, ist das Gleichgewicht erreicht , damit Sie alles sagen können, was sich ändert.
  3. entfärben -> Färbelösung durch Entfärbelösung ersetzen (MeOH + AcOH aber KEIN CBB) -> nicht proteingebundenes CBB entfernen
    1. Der Fleck kann in den Abfluss gehen und stattdessen sammeln wir ihn in Sondermüllbehältern, die unsere Mitarbeiter für Umweltschutz und Sicherheit (EH & S) ordnungsgemäß entsorgen
    2. am Anfang gibt es hohes CBB im Gel, KEIN CBB im Bad -> CBB diffundiert aus dem Gel in das Bad
    3. dadurch steigt die CBB-Konzentration im Bad -> weniger Unterschied zwischen Gel und Bad -> CBB diffundiert langsamer

    Wie Sie hoffentlich auf den Bildern sehen können, färbt Classic CBB zunächst Ihr gesamtes Gel blau, sodass Sie die Bänder sehen können, bis Sie sie entfärben und entblauen, was nicht blau sein soll. Denn um kleine Schätze zu finden, entfesseln Sie eine Menge Schatzsucher, die aus dem Färbebad, wo eine hohe Farbstoffkonzentration vorhanden ist, in die Poren des Gels rennen, wo mehr Platz und hoffentlich Protein vorhanden ist! Aber sie schnüffeln weiter, auch wenn kein Protein mehr zu finden ist, da Sie innerhalb und außerhalb des Gels hohe Konzentrationen an freiem Farbstoff haben.

    Aber kolloidales CBB erfordert genauso viel Entfärbung (obwohl es hilft, die Bänder knackiger zu machen), denn anstatt eine Menge Schatzsucher zu schicken, die Sie dann rausschmeißen müssen, hängen Gruppen von Jägern außerhalb des Gels und gehen nur hinein benötigt&rdquo

    Ein Kolloid ist eine Lösung, bei der Sie, anstatt einzelne Moleküle überall verteilt zu haben, „Klumpen&rdquo dieser Moleküle haben, aber immer noch gleichmäßig verteilt sind, wie in einer „normalen&rdquo-Lösung. Und diese Klumpen sind wirklich „aufgelöst&rdquo (sie werden „aufgelöst&rdquo, wenn Sie die Lösung einwirken lassen).

    Die Kolloide sind zu groß, um in das Gel einzudringen, so dass Sie nicht "überfärben". ABER die FREIEN Moleküle können nach Belieben aus dem Gel kommen und gehen - und das tun sie, genau wie zuvor, außer dass sie jetzt in einer niedrigeren Konzentration vorliegen. Wie bekommt man also genug, um das Protein zu färben? Kein Problem &ndash, die freie CBB-Population kann ständig aus kolloidalen &ldquostock-Räumen&rdquo aufgefüllt werden (Sie haben eine Art Gleichgewicht zwischen freiem & kolloidalem).

    Das Ergebnis? Anstatt das Gel mit Farbstoff zu überfluten (wie bei der &ldquoklassischen&rdquo-Methode) liefern Sie einen stetigen, milden Fluss von CBB-Molekülen &ndash genug, um den Proteindurst zu stillen, aber nicht so viel, dass es am Gel haften bleibt.

    Somit können Sie die Bänder auch ohne Entfärben sehen. Es hilft auch, dass, obwohl wir CBB als Blau betrachten, seine Farbe von seiner Ladung abhängt. Bei niedrigem pH-Wert wird CBB G-250 bräunlich, aber wenn es Proteine ​​bindet, wird es im blauen Zustand stabilisiert, sodass Sie Hintergrundbraun von Schatzblau unterscheiden können. http://bit.ly/bradforduv

    Zumindest war der Fleck, den wir früher bekamen, eher braun. Dieser Fleck ist seit Monaten im Rückstand. Und Monate. Und Monate. Wir haben also mit einigen anderen Formulierungen experimentiert, aber sie scheinen blauer zu beginnen und einen höheren Hintergrund zu ergeben.

    Apropos Farbe, eine tolle Sache an Coomassie-Färbungen ist, dass wir im Gegensatz zu DNA-Gelen, die fluoreszierende Farbstoffe verwenden, auf ein UV-Tablett kleben müssen, http://bit.ly/2zjHH0K. CBB ist &ldquocolorimetric&rdquo &ndash, die Anzeige ist farbig, so dass die Ergebnisse buchstäblich direkt zu sehen sind, keine spezielle Ausrüstung erforderlich (es sei denn, Sie zählen das Auge, was ein ziemlich spektakuläres Werkzeug ist!) (und die Lichtschale hilft auch 🙂 ).

    Eine weitere kolorimetrische Proteinfärbung ist die Silberfärbung, die empfindlicher, aber auch wählerischer ist. http://bit.ly/2JGHuto

    Es gibt auch fluoreszierende Proteinflecken. CBB und Silberfärbung sind beides &ldquoalle Proteinfärbungen&rdquo &ndash sie färben alle Proteine ​​(wenn auch manchmal nicht gleich gut). Es gibt auch fluoreszierende alle Proteinflecken. Aber die wirklich coolen fluoreszierenden Farbstoffe färben nur spezifisch modifizierte Proteine ​​wie Glykoproteine ​​(mit denen Zuckerketten hinzugefügt wurden) oder Phosphoproteine ​​(mit denen Phosphatgruppen hinzugefügt wurden).

    einige Quellen zur CBB-Geschichte und -Nutzung:

    mehr zu den genannten Themen (und anderen) #365DaysOfScience Alle (mit aufgeführten Themen) 👉 http://bit.ly/2OllAB0

    #scicomm #biochemie #molekularbiologie #biologie #sciencelife #science #realtimechem


    Schau das Video: SDS-PAGE 5: Interpreting Results from a Protein Gel periplasmic extract from E. coli (Kann 2022).