Information

Wie funktioniert die Proteindenaturierung?

Wie funktioniert die Proteindenaturierung?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich habe mich gefragt, wie die Proteindenaturierung funktioniert.

  1. Sind kovalente Bindungen wie Disulfidbrücken beteiligt oder basiert es ausschließlich auf nicht-kovalenten Bindungen wie Wasserstoffbrücken? Warum ist die Denaturierung in den meisten Fällen irreversibel, wenn nur nicht-kovalente Bindungen beteiligt sind?
  2. Ist es möglich, Protein durch schnelle Änderungen des elektromagnetischen Felds oder Drucks zu denaturieren? (Die Artikel, die ich bisher gelesen habe, erwähnen nur Stressfaktoren wie plötzlicher pH-Wert, Osmolarität, Temperaturänderungen…)
  3. Wie kann ich ein Protein vor Denaturierung schützen? z.B. Bei der PCR verwenden wir eine hitzebeständige DNA-Polymerase, daher könnten bestimmte Aminosäuresequenzen vor Hitzedenaturierung schützen, aber ich brauche diesbezüglich eine Bestätigung.

Wirklich die Frage, wie funktioniert die Proteinfaltung? Aber lassen Sie mich Ihre Fragen beantworten…

1) Sehr wenige Proteine ​​haben Disulfidbindungen (normalerweise sekretierte Proteine) oder wirklich irgendeine kovalente Bindung, die die Aminosäurekette über die Bindungen hinaus stabilisiert, aus denen das Polypeptid selbst besteht. Denaturierung ist tatsächlich nur in relativ wenigen Fällen reversibel. Einige wenige Proteine, normalerweise sehr kleine, können aus einem ungefalteten wieder in einen nativen gefalteten Zustand zurückgeführt werden, und dann wird nur ein Prozentsatz der Probe den gefalteten Zustand wieder erreichen.

2) Sicher. Tatsächlich verändert Druck die wasserstoffgebundene Struktur des Wassers und damit auch die Thermodynamik der Proteinstruktur und wurde verwendet, um die Proteinfaltung zu studieren. Im Allgemeinen beeinflusst das elektromagnetische Feld den Zustand der Proteinfaltung nicht. Ich zitiere die Tatsache, dass viele viele Proteine ​​​​durch Kernspinresonanz untersucht wurden, bei der die Proteine ​​​​in einige der stärksten Magneten eingefügt wurden, die in einen angemessen großen Raum passen. Das heißt nicht, dass das Protein Funktion von einem solchen Feld möglicherweise nicht betroffen sein. Ich bin mir sicher, wenn das Feld groß genug ist, um Wasser oder die Peptidänderung zu ionisieren, würden Sie etwas sehen ... so können Sie immer auch die Dinge bis an die Grenze bringen.

3) Viele Proteine ​​aus thermophilen Organismen sind resistenter gegen Denaturierung und Unternehmen entwickeln Proteine ​​tatsächlich so, dass sie gegen alle Arten von ungeheuerlichen Bedingungen resistent und dennoch gefaltet und funktionsfähig sind. Waschmittel ist voll von kristallisierten Enzymen, die lange Zeit glücklich im Waschmittel sitzen. Ich weiß nicht einmal, ob diese Produkte eine Haltbarkeit haben.

Insgesamt sind Proteine ​​aus gutem Grund anfällig für Denaturierung – die Zelle baut sie ab, wenn sie ihre Funktion nicht benötigt, und kann sie für ihre Aminosäurebestandteile recyceln. Wenn sie alle so robust wären, würde die Zelle schnell verhungern. Wenn ein Protein, das denaturiert wird und sich dann wieder faltet, eine biologische Rolle spielt, dann ist dies nur in extrem seltenen Situationen der Fall. Proteine ​​fallen zum größten Teil nicht auseinander, wenn sie gefaltet sind, und wenn sie es tun, sind sie fertig.

Einige mögliche Ausnahmen: einige antibiotische Peptide, die sich in Poren falten, die ihre Ziele töten, und die Amyloid-Plaque, die im Gehirn eine andere Faltung annimmt, die mit Alzheimer in Verbindung gebracht wird, aber nicht verursachen kann.


Nimmst du ein in vitro Kontext zur Verhinderung der Proteindenaturierung nach der Proteinisolierung aus beispielsweise E coli oder machen dir Proteine ​​im Kontext der ganzen Zelle mehr Sorgen?

Ich bin kein Experte für Proteinfaltungs-/Konformationsstudien, aber wenn Sie eine Denaturierung zu experimentellen Zwecken erreichen möchten, behandeln Sie Ihre Proben mit SDS und hoher Hitze (~ 100 oC für 10 Minuten), um H-Brücken zu eliminieren und Um Disulfidbindungen loszuwerden, verwenden Sie ein Reduktionsmittel wie Beta-ME oder DTT, das häufig in Molekülen wie Ab oder Zelloberflächenrezeptoren wie EGFR vorkommt, also offensichtlich für Western-Blot-Experimente, für die Sie Ihre Disulfidbrücken benötigen konserviert werden, verwenden Sie keine Reduktionsmittel, aber Sie erhitzen Ihre Proben und behandeln sie mit SDS, um die Wasserstoffbrückenbindungen loszuwerden und Ihr Protein zu linearisieren.

Basierend auf dieser Studie, in der BSA und β-Lactoglobulin verwendet wurden, ist die durch hohen Druck verursachte Denaturierung ähnlich der, die durch die Spaltung von Wasserstoffbrücken mit Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid verursacht wird basierten Agenten.

Wenn Sie versuchen, die Proteindenaturierung in einer ganzen Zelle zu verhindern, müssen Sie sie mit Kryokonservierungsmedien behandeln, die normalerweise 10% DMSO wie dieses enthalten. Wenn Sie nur mit Proteinen arbeiten, ist die beste Methode, mit frisch zubereiteten (lysierten usw.) Proben zu arbeiten und wenn Sie Ihre Proteine ​​für die spätere Verwendung isolieren, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 oC. Wenn Ihre Proteine ​​an Perlen wie GST-markierte Proteine ​​gebunden sind, lagern Sie Ihre Perlen in einem Puffer, der Glycerin enthält, und stellen Sie sie bei -20 °C ein. Ich verwende 50% Glycerin (v/v) und es funktioniert gut für mich! Wenn diese Antwort jedoch Ihre spezielle Frage oder Ihr Anliegen nicht beantwortet, bearbeiten und erläutern Sie bitte, worüber Sie sich in Ihrem Arbeitsbereich genau Sorgen machen, und ich werde meine Antwort entsprechend ändern. Hoffe das hat irgendwie geholfen!


Ich habe das Thema auch untersucht, daher hier meine Antwort.

Um die thermodynamische Stabilität von wassergelösten Globulinen oder Membranproteinen (im Folgenden alle Proteine) zu verstehen, müssen wir die Proteinfaltung verstehen. Proteine ​​haben eine 3D-Struktur (zusammengesetzt aus ihren Primär-, Sekundär- und Tertiärstrukturen). Die Struktur der Proteine ​​ändert sich ständig zwischen gefaltetem und ungefaltetem Zustand. Der gefaltete Zustand hat eine niedrigere freie Energie, während der ungefaltete Zustand eine höhere hat. Dazwischen befindet sich eine Freie-Energie-Barriere, die die Geschwindigkeit der Faltung bei einer bestimmten Temperatur bestimmt.

Strukturelle Veränderungen durch Umweltfaktoren können diese freien Energien beeinflussen und das Gleichgewicht in den entfalteten Zustand verschieben. Das entfaltete Protein kann irreversible Veränderungen erleiden (Aggregation, Disulfidaustausch, Proteolyse, irreversible Dissoziation von Untereinheiten, chemischer Abbau usw.), sodass die Denaturierung des Proteins reversibel oder irreversibel sein kann.

Beachten Sie, dass dies eine sehr vereinfachte Ansicht ist. Ich denke, es gibt verschiedene Grade der Entfaltung, und so können verschiedene Dinge passieren, wenn sich das Protein in einem von diesen befindet. So kann es beispielsweise bei einem geringen Entfaltungsgrad zu Fehlfaltungen kommen, die zu einem stabilen, aber inaktiven gefalteten Zustand ohne Koagulation führen (dies kann mehr oder weniger reversibel sein). Bei einem höheren Entfaltungsgrad kann es zu einer Koagulation kommen.

Die Faltung hängt hauptsächlich von einer einfachen Regel ab: Alle Wasserstoffbrücken müssen erfüllt sein, da eine nicht erfüllte Wasserstoffbrücke sehr hohe energetische Kosten verursacht. Die Proteine ​​haben polare Oberflächen, die mit dem Wasser Wasserstoffbrückenbindungen bilden, und ein oder mehrere apolare Zentren, die als Rückgrat innere Wasserstoffbrückenbindungen aufweisen. Das Vergraben einer ungepaarten polaren Aminosäure (z.B. nicht erfüllte Wasserstoffbrücke) ist sehr destabilisierend und kommt daher in natürlichen Arbeitsproteinen nicht vor. Andere Faktoren wie Salzbrücken, aromatisch-aromatische Wechselwirkungen, Disulfidbindungen usw. können ebenfalls die Stabilität beeinflussen, aber Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen sind die Hauptfaktoren. Das Gewicht dieser beiden Hauptfaktoren ist höchstwahrscheinlich proteinabhängig (eine Studie ergab 75% und 25%, während weitere 40% und 60%).

Die Wasserstoffbrückenbindungen des Rückgrats sind normalerweise bei Raumtemperatur am stabilsten, so dass die niedrigste freie Energie und die maximale Stabilität bei den meisten Proteinen etwa 20°C beträgt und sowohl das Erhitzen als auch das Kühlen die Stabilität verringern und zu Denaturierung führen können. Hohe Temperaturen (>80 °C) können einen kovalenten Abbau und damit eine irreversible Denaturierung verursachen. Druck hat eine ähnliche Wirkung auf die Wasserstoffbrückenbindungen und die Stabilität wie eine Kaltdenaturierung.

Die Osmolyt-Cosolvens wie Harnstoff oder TMAO tragen unterschiedlich zur freien Energie der gefalteten und ungefalteten Zustände bei und verschieben so das Gleichgewicht zwischen ihnen. zum Beispiel kann Harnstoff eine Denaturierung verursachen, während TMAO das Protein vor Denaturierung schützt. Ich denke, es ist offensichtlich, dass eine Änderung des pH-Werts und der Salzigkeit einen starken Einfluss auf die Ladungen der Aminosäureseitenketten und damit auf die Wasserstoffbrückenbindungen und die Stabilität hat.

Sowohl Ultraschall als auch gepulstes elektrisches Feld (PEF) können eine Denaturierung verursachen. Die Wirkung scheint stark abhängig von den Parametern von Ultraschall/PEF und der Art des Proteins zu sein. Interessant, dass auch PEF die Enzymaktivität steigern kann. Es ist schwer, Studien über die Denaturierungsmechanismen durch diese Methoden zu finden.

Wenn wir die Proteinstabilität erhöhen möchten, kann die Methode, die wir wählen, davon abhängen, wovor wir das Protein schützen möchten. Eine oder mehrere Methoden aus der folgenden Liste können helfen, die Stabilität zu erhöhen:

  • Erhöhung der Kompaktheit und bessere Packung (Minimierung des Oberflächen-Volumen-Verhältnisses)
  • Zunahme elektrostatischer Wechselwirkungen (Bildung zusätzlicher Ionenpaare, z.B. mehr Glutaminsäure)
  • zusätzliche Wasserstoffbrücken
  • zusätzliche Disulfidbrücken
  • zunehmende hydrophobe Wechselwirkungen (größerer Anteil vergrabener hydrophober Reste)
  • Protein-Mikroumgebung ändern (Osmolyte verwenden, pH-Wert ändern, Salzgehalt)
  • glykosyliert die Proteinoberfläche
  • Kettenlänge verringern
  • Oberflächenaminosäuren ändern (der Effekt kann völlig unvorhersehbar sein, aber es gibt Oberflächenrestmuster mit bekannter Auswirkung auf die Stabilität; fügen Sie der Oberfläche mehr ionisierbare Aminosäuren hinzu; begraben Sie hydrophobe Reste; etc…)
  • Proteinfixierung kann auch die Stabilität verändern

Verweise:

Thermodynamische Stabilität eines Proteins, das sich schnell, reversibel, kooperativ und mit einem einfachen Zweizustandsmechanismus entfaltet und umfaltet. Am einfachsten lassen sich die Faltung und Stabilität von Proteinen untersuchen, die diese Art von schneller Reversibilität aufweisen. Sowohl das experimentelle Design als auch die theoretische Behandlung von Daten werden durch reversible Systeme vereinfacht. Daher überrascht es nicht, dass die meisten Literaturberichte über Stabilität diese Art von reversiblen Systemen diskutieren. Die Stabilität des Proteins ist einfach der Unterschied in der freien Gibbs-Energie, dG, zwischen dem gefalteten und dem ungefalteten Zustand. Die einzigen Faktoren, die die Stabilität beeinflussen, sind die relativen freien Energien des gefalteten (Gf) und des ungefalteten (Gu) Zustands. Je größer und positiver Gu ist, desto stabiler ist das Protein gegenüber Denaturierung.

Wenn sich ein Protein reversibel entfaltet, kann es bei hohen Temperaturen vollständig entfaltet und inaktiv sein, aber sobald es auf Raumtemperatur abkühlt, wird es sich neu falten und seine Aktivität vollständig zurückgewinnen. Bei irreversiblen oder sich langsam entfaltenden Proteinen ist die kinetische Stabilität bzw. die Entfaltungsgeschwindigkeit wichtig. Ein kinetisch stabiles Protein entfaltet sich langsamer als ein kinetisch instabiles Protein. In einem kinetisch stabilen Protein ist eine große Barriere der freien Energie für die Entfaltung erforderlich, und die Faktoren, die die Stabilität beeinflussen, sind die relativen freien Energien des gefalteten (Gf) und des Übergangszustands (Gts) für den ersten Schritt auf dem Entfaltungsweg. Der irreversible Verlust der gefalteten Proteinstruktur wird dargestellt durch: F <-> U -> I, wobei I aufgrund von Aggregation, Disulfidaustausch, Proteolyse, irreversibler Dissoziation von Untereinheiten, chemischem Abbau usw. inaktiv ist.

  • 1996 - Die Quelle der Stabilität in Proteinen
  • 2009 - Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen im denaturierten Zustand beeinflussen die Faltungskinetik der Ribonuklease Sa
  • 2006 - Warum werden Proteine ​​aufgeladen? Netzwerke von Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen in Proteinen, gemessen durch Ladungsleitern und Kapillarelektrophorese

Beweise von Proteinen und Peptiden unterstützen die Schlussfolgerung, dass intrapeptidische Wasserstoffbrückenbindungen die gefaltete Form von Proteinen stabilisieren. Paradoxerweise stützen Beweise von kleinen Molekülen die gegenteilige Schlussfolgerung, dass intrapeptidische Wasserstoffbrücken weniger günstig sind als Peptid-Wasser-Wasserstoffbrücken. Ein verwandtes Thema – das in dieser Debatte über den Vergleich von Peptid-Peptid- mit Peptid-Wasser-Wasserstoffbrücken oft verloren geht – betrifft die energetischen Kosten einer nicht erfüllten Wasserstoffbrücke. Hier stimmen Experiment und Theorie überein, dass das Aufbrechen einer Wasserstoffbrücke zwischen 5 und 6 kcal/mol kostet. Dementsprechend ist die Wahrscheinlichkeit, eine nicht erfüllte Wasserstoffbrücke in einem Protein zu finden, unbedeutend. Diese Erkenntnis stellt eine leistungsfähige Regel zur Bewertung von Proteinkonformationen auf.

Pauling et al. (1951) behaupteten, dass die Energie der NH•••O=C-Wasserstoffbrücke des Peptids in der Größenordnung von -8 kcal/mol liegt und dass „aus dem Fehlen der Bildung dieser Bindungen eine solche Instabilität resultieren würde, dass wir ihrer Anwesenheit sicher sein können .“ Paulings frühere Schätzung der gesamten Protein-Wasserstoffbindungsenergie betrug -5 kcal/mol (Mirsky und Pauling 1936). Aus Lösungsstudien von Harnstoffdimeren schätzte Schellman, dass eine intrapeptidische Wasserstoffbrücke gegenüber einer Peptid-Wasser-Wasserstoffbrücke um ~1,5 kcal/mol enthalpisch begünstigt wäre (Schellman 1955). Diese und ähnliche frühe Studien führten zu dem Schluss, dass die Peptid-Wasserstoffbrücke ein wesentlicher Faktor bei der Stabilisierung von Proteinkonformationen ist.

Diese Ansicht änderte sich dramatisch nach einem berühmten Aufsatz von Kauzmann (1959), der sich auf die Thermodynamik kleiner Modellverbindungen berief, um zu argumentieren, dass die Stabilisierung des gefalteten Zustands eines Proteins fast ausschließlich auf den hydrophoben Effekt zurückzuführen ist. Bald nach Kauzmanns Vorschlag stellten Klotz und Franzen (1962) fest, dass die Enthalpie der Interamid-Wasserstoffbrücke von N-Methylacetamid in Wasser null ist und schlussfolgerten, dass „die intrinsische Stabilität von Interpeptid-Wasserstoffbrücken in wässriger Lösung gering ist“. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass Wasserstoffbrückenbindungen mit einem anderen kleinen Molekül, Epsilon-Caprolactam, in verdünnter Lösung vernachlässigbar sind (Susi und Ard 1969). Kauzmanns Vorschlag, gestützt durch diese späteren Studien, führte zu der weit verbreiteten Ansicht, dass der hydrophobe Effekt den größten energetischen Beitrag zur Proteinstabilität leistet, wobei Wasserstoffbrücken wenig oder vielleicht sogar gegenläufig zum Faltungsprozess beitragen. Siehe Baldwin (2003) für eine aktuelle Diskussion dieser Fragen.

Protein-Wasserstoffbrücken sind allgegenwärtig, gerichtet und weitgehend lokal, wodurch die Polypeptidkette in Alpha- und 3_10-Helices, Beta-Faltblatt und Beta-Turns aufgeteilt wird. Zusammen machen diese wasserstoffgebundenen Rückgratstrukturen im Durchschnitt mindestens 75 % der Konformation aus, wobei verbleibende Reste sowohl an zusätzlichen intramolekularen Wasserstoffbrücken als auch an Wasserstoffbrücken zu Wasser teilnehmen. Ungesättigte polare Rückgratgruppen sind energetisch so teuer, dass sie fast nie vorkommen.

Kraftmessungen zwischen Oberflächen, die mit Lipiden mit Wasserstoffbrücken-Kopfgruppen (NTA-, A-, T- und MeT-Lipiden) funktionalisiert sind, führen zu einem reproduzierbaren Wert der Energie einer einzelnen Wasserstoffbrücke in reinem Wasser: ~0.5 kcal/mol. Sie zeigt, dass es für die Kopfgruppen energetisch günstiger ist, untereinander Wasserstoffbrückenbindungen einzugehen als Wasserstoffbrückenbindungen mit Wassermolekülen. Dies steht im Einklang mit früheren Studien zur Proteinstabilität, die zeigten, dass intramolekulare Wasserstoffbrücken in einem gefalteten Protein energetisch günstiger sind als Bindungen mit Wassermolekülen in einem ungefalteten Protein mit einer durchschnittlichen Stabilisierung von ~1 kcal/mol pro intramolekularer Wasserstoffbrücke.

  • 1996 - Kräfte, die zur Konformationsstabilität von Proteinen beitragen.
  • 2005 - Bilden alle polaren Rückgratgruppen in Proteinen Wasserstoffbrücken?
  • 2011 - Rückgrat-getriebener Kollaps in ungefalteten Proteinketten
  • 2006 - Hydrophober Kollaps der (in silico) Proteinfaltung
  • 2002 - Thermodynamische Folgen der Einlagerung von polaren und unpolaren Aminosäureresten im Proteininneren
  • 2003 - Thermodynamik der Wärmeaktivierung einzelner Capsaicin-Ionenkanäle VR1
  • 2003 - Temperaturbereich der thermodynamischen Stabilität für den nativen Zustand von reversiblen Zwei-Zustands-Proteinen
  • 2009 - Proteinkaltdenaturierung aus Sicht des Lösungsmittels
  • 2010 - Aufbau von Peptoiden mit allen Trans-Amid-Rückgraten und Peptoid-Reverse Turns durch den taktischen Einbau von N-Aryl-Seitenketten, die zur Wasserstoffbindung fähig sind
  • 2002 - Energie von Wasserstoffbrückenbindungen durch die Adhäsion funktionalisierter Lipidschichten
  • 2012 - Wie, wann und warum Proteine ​​kollabieren: die Beziehung zur Faltung
  • 2011 - Umkehrung des Gleichgewichts zwischen hydrophoben und Wasserstoffbrückenbindungsinteraktionen bei der Proteinfaltung und -aggregation
  • 2011 - Membranproteinfaltung: Wie wichtig sind Wasserstoffbrücken?

Die Hauptdeterminante der Kaltdenaturierungstendenz ist wahrscheinlich die Abnahme der Stabilität von Wasserstoffbrücken im Rückgrat bei niedrigen Temperaturen, die wiederum durch die Packungsart des hydrophoben Kernclusters beeinflusst wird

Mit einer neu entwickelten Druckzelle haben wir nun druck- und temperaturabhängige Veränderungen von 31 Wasserstoffbrücken in Ubiquitin durch die Messung von HBCs mit sehr hoher Präzision abgebildet. Wasserstoffbrückenbindungen mit kurzer Reichweite werden nur mäßig gestört, aber viele Wasserstoffbrücken mit großen Sequenzabständen (hohe Kontaktordnung) zeigen größere Veränderungen. Im Gegensatz dazu bleiben andere Wasserstoffbrückenbindungen hoher Kontaktordnung praktisch unbeeinflusst.

Wir untersuchen die Stabilität von globulären Proteinen als Funktion von Temperatur und Druck durch NPT-Simulationen eines grobkörnigen Modells. Wir reproduzieren die elliptische Stabilität von Proteinen und zeigen einen vereinheitlichenden mikroskopischen Mechanismus für Druck- und Kältedenaturierungen auf. Der Mechanismus beinhaltet die Solvatation unpolarer Reste mit einer dünnen Wasserschicht. Diese solvatisierten Zustände haben im Vergleich zu anderen Konformationen unpolarer gelöster Stoffe ein geringeres Volumen und eine niedrigere Wasserstoffbrückenenergie. Daher sind diese solvatisierten Zustände bei hohem Druck und niedriger Temperatur günstig und erleichtern die Proteinentfaltung unter diesen thermodynamischen Bedingungen.

Wir stellen außerdem fest, dass es die Änderungen der hydrophoben Hydratation mit abnehmender Temperatur sind, die die Kälteentfaltung antreiben, und dass der Gesamtprozess enthalpisch getrieben ist, während die Wärmedenaturierung entropisch getrieben ist.

Als Folge einer schwächeren Penetration bei Druckbeaufschlagung zeigte sich, dass der druckdenaturierte Zustand gegenüber dem hitzedenaturierten Zustand teilweise entfaltet war. Der Mechanismus der Druckdenaturierung stand im Zusammenhang mit der Zerstörung des Wasserstoffbrückennetzwerks von Wasser auf einer Reihe von Clustern, die durch verstärkte OH-Wechselwirkungen gekennzeichnet sind, was zu einer Verhärtung der Proteindynamik führt. Der Mechanismus ist dem beim Erhitzen beobachteten entgegengesetzt, d. h. die Erweichung des Wasserstoffbrückennetzwerks von Wasser führt zu einer weicheren Proteindynamik.

Wir können daraus schließen, dass die Haupttriebkraft der Proteindenaturierung bei hohen Drücken die Abnahme des hydrophoben Effekts als Folge der Veränderungen der Wasserstruktur ist, ohne den aktuellen Theorien zum hydrophoben Effekt zu widersprechen.

Für die Druckdenaturierung ist die Abschwächung der hydrophoben Wechselwirkung zwischen den sperrigen Seitenketten bei niedrigeren Temperaturen entscheidend, was bei erhöhten Drücken zu einer offensichtlichen Destabilisierung der gefalteten Rückgratstruktur führt.

  • 2013 - Molekulardynamiksimulation, die auf Kaltdenaturierung von Beta-Haarnadeln hindeutet.
  • 2012 - Kälteinduzierte Veränderungen im Protein Ubiquitin
  • 2008 - Mikroskopischer Mechanismus zur Kaltdenaturierung
  • 2009 - Hydrophobie bei niedrigen Temperaturen und Kältedenaturierung eines Proteins
  • 2012 Schlüsselstabilisierende Elemente der Proteinstruktur durch Druck- und Temperaturstörung des Wasserstoffbrückennetzwerks identifiziert
  • 2012 - Vereinheitlichender mikroskopischer Mechanismus für Druck- und Kältedenaturierungen von Proteinen
  • 2012 - Rolle der hydrophoben Hydratation bei der Proteinstabilität: Ein 3D-Wasser-Explicit-Proteinmodell, das Kälte- und Hitzedenaturierung zeigt
  • 2011 - Molekulare Mechanismen der anormalen thermischen Aggregation von grün fluoreszierendem Protein
  • 2011 - Analyse des Mechanismus der Lysozym-Druckdenaturierung aus Raman-Spektroskopie-Untersuchungen und Vergleich mit thermischer Denaturierung
  • 2008 - Kälte- und druckinduzierte Dissoziation von Proteinaggregaten und Amyloidfibrillen
  • 2009 - Das Verhalten des hydrophoben Effekts unter Druck und Proteindenaturierung
  • 2004 - Reversible Temperatur- und Druckdenaturierung eines Proteinfragments: Eine molekulardynamische Simulationsstudie zum Austausch von Replikaten

Es wurde gefunden, dass die Energetik der Wasserstoffbrückenbindungen im Rückgrat diese Verschiebungen der Proteinstabilität fast vollständig kontrolliert, wobei Osmolyt-Cosolvens einfach zwischen Lösungsmittel-Rückgrat- und Rückgrat-Rückgrat-Wasserstoffbrücken als Funktion der Lösungsmittelqualität wählen.

  • 2008 - Struktur und Energetik des Wasserstoff-gebundenen Rückgrats in der Proteinfaltung
  • 2008 - Harnstoff, aber nicht Guanidinium, destabilisiert Proteine ​​durch Bildung von Wasserstoffbrücken zur Peptidgruppe
  • 2011 - Beiträge zu Rückgrat und Seitenkette bei der Proteindenaturierung durch Urea
  • 2009 - Zum Mechanismus der SDS-induzierten Proteindenaturierung
  • 1995 - Wasserstoffbrücken und die pH-Abhängigkeit der Stabilität der dritten Domäne von Ovomucoid
  • 2004 - Auswirkungen chaotroper und kosmotroper Cosolventien auf die druckinduzierte Entfaltung und Denaturierung von Proteinen:? Eine FT-IR-Studie zur Staphylokokken-Nuklease
  • 2002 - Die Hydratationsstruktur von Guanidinium- und Thiocyanationen: Implikationen für die Proteinstabilität in wässriger Lösung

Insgesamt hatte der Beschallungsprozess nur geringe Auswirkungen auf die Struktur der Proteine ​​in WPC-Lösungen, was für die Erhaltung der funktionellen Eigenschaften während der Ultraschallverarbeitung von Molkereiprodukten auf Molkeproteinbasis entscheidend ist.

Die hier präsentierten Daten legen nahe, dass das Fibrinogen unter den Proteinen fibrinolytischer Systeme eines der empfindlichsten Proteine ​​gegenüber der Wirkung von Ultraschall ist. Es wurde in vitro gezeigt, dass Ultraschall die Bildung von Fibrinogenaggregaten induzierte, die durch den Verlust der Gerinnungsfähigkeit und eine höhere Plasminolyserate als natives Fibrinogen in verschiedenen Modellsystemen und unter verschiedenen Ultraschallbehandlungsarten gekennzeichnet sind.

  • 2011 - Auswirkungen von Ultraschall auf die thermischen und strukturellen Eigenschaften von Proteinen in rekonstituiertem Molkenproteinkonzentrat
  • 2011 - Auswirkungen von niederfrequentem Ultraschall auf einige Eigenschaften von Fibrinogen und seiner Plasminolyse

Die mit den verschiedenen Versuchsprotokollen erhaltenen Ergebnisse zeigen jedoch, dass das Konformationsgleichgewicht von GrpE im getesteten Frequenz- und Feldstärkebereich gegenüber elektromagnetischen Feldern unempfindlich ist.

Die Auswirkungen einer Behandlung mit gepulsten elektrischen Feldern (PEF) (0-547 µs und 0-40 kV/cm) auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Sojabohnenproteinisolaten (SPI) wurden untersucht. Löslichkeit, oberflächenfreie Sulfhydryle (SHF) und Hydrophobie von SPI-Dispersionen (20 mg/ml) nahmen mit zunehmender PEF-Stärke und Behandlungszeit bei konstanter Pulsbreite 2 µs, Pulsfrequenz 500 Pulse pro Sekunde (pps) und Probenflussrate zu (1ml/s). Wenn die PEF-Stärke und die Behandlungszeit über 30 kV/cm und 288 µs lagen, nahmen Löslichkeit, Oberflächen-SHF und Hydrophobie von SPI aufgrund von Denaturierung und Aggregation von SPI durch hydrophobe Wechselwirkungen und Disulfidbindungen ab. Größenausschlusschromatographie und Laserlichtstreuungsanalysen zeigten ferner, dass eine stärkere PEF-Behandlung die Dissoziation, Denaturierung und Reaggregation von SPI induzierte. Die Circulardichroismus-Analyse zeigte, dass die PEF-Behandlung keine signifikanten Veränderungen der Sekundärstruktur von SPI hervorrief.

Ein kompaktes und kostengünstiges Tischgerät zur Behandlung mit gepulsten elektrischen Feldern wurde entworfen und entwickelt. Die Einheit bestand aus einem Hochspannungs-Impulsgenerator (~ 30 kV) und einer Behandlungskammer mit ? 148ml Fassungsvermögen. Über den eingestellten Spannungsbereich von 4–26 kV wurden 30 Pulse (mit sofortiger Umladung) an acht verschiedene Enzymlösungen mit einem Elektrodenabstand von 0,3 cm, einem Feld von 13–87 kV/cm, einer Pulsfrequenz von 0,5 Hz angelegt , 2 µs Pulsbreite und 20 °C Prozesstemperatur. Bei einigen Enzymen waren die Aktivitäten nach den Pulsbehandlungen reduziert: Lipase, Glucoseoxidase und hitzestabile &bgr;-Amylase zeigten eine enorme Reduktion von 70-85%; Peroxidase und Polyphenoloxidase zeigten eine mäßige 30-40%ige Reduktion, während alkalische Phosphatase unter den verwendeten Bedingungen nur eine leichte 5%ige Reduktion zeigte. Andererseits waren die Enzymaktivitäten von Lysozym und Pepsin unter einem bestimmten Spannungsbereich erhöht. Das elektrische Pulsprofil (sofortige Ladungsumkehr) spielte eine sehr wichtige Rolle bei der Verringerung der Aktivitäten verschiedener Enzyme.

Die Auswirkungen von gepulsten elektrischen Hochspannungsfeldern (PEF) auf native oder thermisch denaturierte Enzymaktivitäten wurden untersucht. Wenn PEF auf verschiedene native Enzyme angewendet wurde, wurden 105-120% der anfänglichen Enzymaktivitäten nach der PEF-Behandlung beobachtet. Es wurde vorgeschlagen, dass eine Aktivierung des Enzyms durch eine PEF-Behandlung möglich wäre. Wir versuchten eine Rückfaltung von thermisch denaturiertem Enzym unter Verwendung von PEF. Wenn PEF auf denaturierte Peroxidase aufgetragen wurde, wurde die Enzymrückfaltung in PEF beschleunigt und 60 % der anfänglichen Aktivität wurden nach 12 kV/cm und 30 s PEF-Behandlung beobachtet, obwohl die spontane Rückfaltung dieses Enzyms zu 40 % der anfänglichen Aktivität führte. Andererseits wurde bei Anwendung von PEF auf thermisch denaturierte Lactatdehydrogenase (LDH) eine weitere PEF-induzierte Inaktivierung beobachtet. Es wurde vermutet, dass der Einfluss von PEF von der Art des Enzyms abhängt.

  • 2014 - Echtzeitbewertung möglicher elektromagnetischer Felder induzierter Änderungen der Proteinkonformation und thermischen Stabilität
  • 2007 - Auswirkungen gepulster elektrischer Felder auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Sojaproteinisolaten
  • 1997 - Auswirkungen von elektrischen Hochfeldimpulsen auf die Aktivität ausgewählter Enzyme
  • 2007 - Einfluss gepulster elektrischer Felder auf verschiedene Enzymaktivitäten

In Halophilen werden die Proteinstabilität und -funktion durch eine erhöhte Ionenbindung und einen erhöhten Glutaminsäuregehalt aufrechterhalten, was es dem Proteininventar ermöglicht, bei hohem Salzgehalt um Wasser zu konkurrieren. Acidophile und Alkalophile zeigen einen neutralen intrazellulären pH-Wert; Proteine, die den äußeren Extremwerten des pH-Wertes gegenüberstehen, besitzen ungewöhnlich hohe Gehalte an ionisierbaren Aminosäuren.

Diese Tatsachen legen nahe, dass globuläre Proteine ​​bei Raumtemperatur maximal stabil sein sollten. 26 davon sind einzigartig, und 20 der 26 sind bei Raumtemperatur maximal stabil, unabhängig von ihren strukturellen Eigenschaften, der Schmelztemperatur oder der Lebenstemperatur ihrer Ursprungsorganismen. Ihre durchschnittliche Temperatur maximaler Stabilität beträgt 293 ± 8 K (20 ± 8 °C). Der durchschnittliche energetische Beitrag der einzelnen Aminosäuren zur Proteinstabilität nimmt mit zunehmender Proteingröße ab.

Hinsichtlich ihres Einflusses auf die Proteinstruktur analysiert, lassen sich die Wege, auf denen thermophile Organismen ihre Proteine ​​relativ stabilisieren, wie folgt einteilen:

  • Erhöhung der Kompaktheit und bessere Verpackung
  • Zunahme elektrostatischer Wechselwirkungen
  • zusätzliche Wasserstoffbrücken
  • zusätzliche Disulfidbrücken
  • zunehmende hydrophobe Wechselwirkungen
  • Protein Mikroumgebung
  • Glykosylierung

Die rationale Modifikation der Proteinstabilität ist ein wichtiges Ziel des Proteindesigns. Elektrostatische Wechselwirkungen von Proteinoberflächen sind evolutionär nicht auf Stabilität optimiert und sind ein attraktives Ziel für die rationale Neugestaltung von Proteinen. Wir zeigen, dass Oberflächenladungsmutanten auf unterschiedliche und unerwartete Weise stabilisierende Effekte ausüben können, einschließlich solcher, die von bestehenden Methoden nicht vorhergesagt werden können, selbst wenn nur lösungsmittelexponierte Stellen gezielt werden. Eine individuelle Mutation von drei lösungsmittelexponierten Lysinen in der Unterdomäne des Villin-Kopfstücks stabilisiert das Protein signifikant, aber der Mechanismus der Stabilisierung ist in jedem Fall sehr unterschiedlich. Eine Mutation destabilisiert elektrostatische Wechselwirkungen im nativen Zustand, hat jedoch einen größeren destabilisierenden Effekt auf den denaturierten Zustand, eine zweite beseitigt den Desolvatationsnachteil des geladenen Rests, während die dritte unerwartete Wechselwirkungen im nativen Zustand einführt, aber die Elektrostatik nicht verändert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass selbst scheinbar intuitive Mutationen ihre Wirkung durch unvorhergesehene und komplexe Wechselwirkungen entfalten können.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass Oberflächenladungs-Ladungs-Wechselwirkungen für die Proteinstabilität wichtig sind und dass eine rationale Optimierung von Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche eine praktikable Strategie zur Verbesserung der Proteinstabilität sein kann.

Wir haben eine neue Eigenschaft von einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) entdeckt, nämlich ihre Fähigkeit, Proteine ​​bei erhöhten Temperaturen und in organischen Lösungsmitteln stärker zu stabilisieren als herkömmliche flache Träger. Experimentelle Ergebnisse und theoretische Analysen zeigen, dass die Stabilisierung auf die Krümmung von SWNTs zurückzuführen ist, die ungünstige laterale Protein-Protein-Wechselwirkungen unterdrückt. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass das Phänomen nicht nur bei SWNTs auftritt, sondern auf andere Nanomaterialien ausgeweitet werden könnte. Die Protein-Nanotube-Konjugate stellen eine neue Generation aktiver und stabiler katalytischer Materialien mit potenziellem Einsatz in Biosensoren, Diagnostik und bioaktiven Filmen und anderen Hybridmaterialien dar, die biotische und abiotische Komponenten integrieren.

Es wurde jedoch gefunden, dass die Salzbrücke von Hauptkette zu Seitenkette zwischen dem N-Terminus und Glu 14 PFRD-XC4 um 1,5 kcal mol-1 stabilisiert. Die entropischen Kosten für die Herstellung einer Oberflächensalzbrücke, die das Rückgrat des Proteins einbezieht, werden reduziert, da das Rückgrat bereits bei der Proteinfaltung immobilisiert wurde.

  • 2000 - Stabilität und Stabilisierung von globulären Proteinen in Lösung
  • 2002 - Maximale Stabilitäten reversibler Zwei-Zustands-Proteine
  • 2014 - Enzymthermostabilisierung: der Stand der Technik
  • 2012 - Rationale Modifikation der Proteinstabilität durch gezieltes Targeting von Oberflächenstellen führt zu komplizierten Ergebnissen
  • 2012 - Disulfidbrücken in der Proteinbiophysik
  • 2011 - Methanol stärkt Wasserstoffbrückenbindungen und schwächt hydrophobe Wechselwirkungen in Proteinen - Eine kombinierte Molekulardynamik- und NMR-Studie
  • 2011 - Beitrag hydrophober Wechselwirkungen zur Proteinstabilität
  • 1997 - Thermische Stabilität von Proteinen, Wasserstoffbrücken und Ionenpaare
  • 2005 - Thermische Stabilität von Proteinen.
  • 2004 - Proteinstruktur, Stabilität und Löslichkeit in Wasser und anderen Lösungsmitteln.
  • 2000 - Rationale Modifikation der Proteinstabilität durch die Mutation geladener Oberflächenreste
  • 2006 - Proteinstabilität und Oberflächenelektrostatik:? Eine aufgeladene Beziehung
  • 2003 - Beitrag von Salzbrücken an der Oberfläche zur Proteinstabilität: Leitlinien für das Protein-Engineering
  • 2000 - Einfluss von Saccharose auf die thermische Denaturierung, Gelierung und Emulsionsstabilisierung von Molkenproteinen
  • 2006 - Erhöhung der Proteinstabilität durch Kontrolle der nanoskaligen Umgebung
  • 2000 - Beitrag von Salzbrücken an der Oberfläche zur Proteinstabilität
  • 2003 - Elastische Kopplung der integralen Membranproteinstabilität an die Kräfte der Lipiddoppelschicht

Proteindenaturierung in Schaum

Das Ziel dieser Studie war es, den Mechanismus aufzuklären, durch den Proteinmoleküle in Schaum denaturiert werden. Es wurde festgestellt, dass die Beschädigung des Proteins hauptsächlich auf eine Oberflächendenaturierung an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche zurückzuführen ist. Ein Teil der adsorbierten Moleküle faltet sich bei der Desorption nicht in ihren nativen Zustand zurück. Es zeigte sich, dass der Denaturierungsgrad direkt mit der Grenzflächenexposition korreliert, die bei mobilen oder teilmobilen Grenzflächen durch Drainage erhöht wird. Experimente mit zwei verschiedenen Proteinen zeigten, dass unter den Testbedingungen etwa 10 % der an der Oberfläche adsorbierten BSA-Moleküle bei der Desorption denaturiert blieben. Für Pepsin lag der Wert bei etwa 75 %. Es wurde festgestellt, dass die Oxidation, die zuvor als Hauptursache für Proteinschäden im Schaum galt, minimal ist. Neither do the high shear stresses in the liquid bulk encountered during bubble bursting cause denaturation, because energy is dissipated at a much greater length scale than that of the protein molecule. Copyright 1999 Academic Press.


Denaturation of Proteins (with Denaturing Agents)

Denaturation may be defined as the disruption of the secondary, tertiary and quarternary structure of the native protein resulting in the alterations of the physical, chemical and biological characteristics of the protein by a variety of agents.

The native proteins are said to be the proteins occurring in animal and plant tissues. They pos­sess many characteristic properties such as solubil­ity, viscosity, optical rotation, sedimentation rate, electrophoretic mobility etc. For an oligomeric protein, denaturation may involve dissociation of the protomers with or with­out subsequent unfolding or with or without un­dergoing changes in protomer conformation.

Denaturing Agents:

Heat, surface action, ul­traviolet light, ultrasound, high pressure etc.

Acids, alkalis, heavy metal salts, urea, ethanol, guanidine de­tergents etc. Urea and guanidine probably interfere with the hydrogen bonds between peptide linkages. Acids and alkalis probably attack directly the hy­drogen bonds in the secondary and tertiary struc­ture of proteins.

Physical Alterations:

Many proteins, especially of the globular type, can be crystallized in the native state. But dena­tured proteins cannot be crystallized.

Chemical Alterations:

The denatured protein is greatly decreased in solubility at its isoelectric point. The chemical groups are exposed to chemical reactions and more readily detected as a result of the unfolding proc­ess in denaturation. Among these are sulphydryl group of cysteine, the disulphide group of cystine and the phenolic group of tyrosine.

Biological Alterations:

The digestibility of certain denatured proteins by proteolytic enzymes is increased. Enzymatic or hormonal activity is usually destroyed by dena­turation. The antigenic or antibody functions of proteins are frequently altered.

If the denaturation is severe, the protein mol­ecules become insoluble and precipitation results as well as the changes in the properties of the pro­teins are permanent and “irreversible”. In case of mild denaturation, there is “reversible denatura­tion” leading to the slight changes in the proper­ties of the protein which can be restored to the na­tive state after suitable treatment.

1. The precipitation of the native protein as a result of denaturation is used to advan­tage in the clinical laboratory.

2. Blood or serum samples to be analysed for small molecules (e.g., glucose, uric acid, drugs) generally are first treated with ac­ids such as trichloroacetic acid, phosphotungstic acid or phosphomolybdic acid to precipitate most of the proteins present in the sample. This is removed by cen­trifugation and the protein-free supernatant liquid is then analysed.

3. Denaturation is used to know the enzyme catalysed reaction of an extract at the loss of the enzyme activity when boiled or acidified.

Denaturation and Renaturation of Proteins:

Bovine ribonuclease of single polypeptide chain of 124 amino acid residues with small molecular weight contains four disulphide bonds. When it is treated with β-mercaptoethanol in 8 M. urea, the disulphide bonds are reduced to -SH groups as a result of the denaturation of the en­zyme and the enzyme activity is also lost.

Denatured ribonuclease, when freed from urea and β-mercaptoethanol by dialysis, slowly regains enzymic activity as the SH groups are oxidized by oxygen of air to form S-S bonds. But if the reduced ribonuclease in 8 M. urea solution is re-oxidized it loses its enzymic activity almost completely as wrong disulphide bonds are formed resulting in ‘scrumbled’ ribonuclease.

Similarly, when egg albumin is heated till it is coagulated, the denaturation is irreversible and the secondary and tertiary structure of the proteins are completely lost resulting in a mixture of ran­domly arranged polypeptide chains.


Odorant Binding and Chemosensory Proteins

Nadja Hellmann , in Methods in Enzymology , 2020

3.1 Equilibrium conditions and the issue of reversibility

Strictly speaking, when investigating protein denaturation , thermodynamic equilibrium means that the fractions of protein in the various states (native, intermediate, denatured) are only determined by the conditions (e.g., denaturant concentration, temperature) and not by the path which led to this state (e.g., per unfolding or per refolding). Thus, unfolding and refolding curves should not show any hysteresis, but should overlap. Then the process is reversible, and both curves are in equilibrium.

To achieve equilibrium conditions, as indicated by a temporally stable spectroscopic signal, it might take a while: for chemical denaturation of OBPs often incubation times of 24 h were employed. The refolding process might take even longer and often displays considerable hysteresis ( Stepanenko et al., 2014, 2016b ). Typically, the refolding curve is the one which does not represent equilibrium conditions.

In thermal denaturation studies, different results might be obtained for different heating rates. If denaturation is slower than the change in temperature, the denatured fraction lags behind and the curves obtained do not represent equilibrium conditions.

Irreversible aggregation of the denatured protein tends to occur in thermal denaturation ( Parisi et al., 2005 ). If the temperature at which aggregation starts (Tagg) is considerably higher than the denaturation temperature (Tm), it is possible to separate the two processes, and restrict the analysis to the range below Tagg. Not unfrequently, however, both processes take place within a narrow temperature range, and the obtained value of Tm might be distorted.


How Does Denaturation Affect the Function of a Protein?

Denaturation causes a protein to lose its biological function. For example, a denatured enzyme would no longer be able to catalyze a reaction.

Denaturation does not alter the protein's structure, nor does it hydrolyze the peptide bonds. While it causes the protein's structure to unfold, the amino acids forming it remain. Following denaturation, a protein cannot fulfill its biological role. This means an enzyme can no longer catalyze its target reaction, and insulin cannot target molecules to aid the movement of glucose into cells. When using heat to denature a protein, there are some instances where cooling it down can restore its function. However, in most cases the alteration is permanent.

There are several ways to denature a protein. Using salt, urea, acids and bases and heat interrupts the bonds between hydrogen and amides, which in turn causes it to lose its structure. When it comes to tertiary proteins, this may mean losing a hydrogen bond, disulfide bond, salt bridge and non-polar covalent bonds. Because of this, there is a broad number of substances that lead to denaturation. Heat can be used to break non-polar covalent bonds and hydrogen bonds. It is because of this that heat is a useful tool for sterilizing medical supplies and food preparation areas.


Proteindenaturierung

When a solution of a protein is boiled, the protein frequently becomes insoluble—i.e., it is denatured—and remains insoluble even when the solution is cooled. The denaturation of the proteins of egg white by heat—as when boiling an egg—is an example of irreversible denaturation. The denatured protein has the same primary structure as the original, or native, protein. The weak forces between charged groups and the weaker forces of mutual attraction of nonpolar groups are disrupted at elevated temperatures, however as a result, the tertiary structure of the protein is lost. In some instances the original structure of the protein can be regenerated the process is called renaturation.

Denaturation can be brought about in various ways. Proteins are denatured by treatment with alkaline or acid, oxidizing or reducing agents, and certain organic solvents. Interesting among denaturing agents are those that affect the secondary and tertiary structure without affecting the primary structure. The agents most frequently used for this purpose are urea and guanidinium chloride. These molecules, because of their high affinity for peptide bonds, break the hydrogen bonds and the salt bridges between positive and negative side chains, thereby abolishing the tertiary structure of the peptide chain. When denaturing agents are removed from a protein solution, the native protein re-forms in many cases. Denaturation can also be accomplished by reduction of the disulfide bonds of cystine—i.e., conversion of the disulfide bond (―S―S―) to two sulfhydryl groups (―SH). This, of course, results in the formation of two cysteines. Reoxidation of the cysteines by exposure to air sometimes regenerates the native protein. In other cases, however, the wrong cysteines become bound to each other, resulting in a different protein. Finally, denaturation can also be accomplished by exposing proteins to organic solvents such as ethanol or acetone. It is believed that the organic solvents interfere with the mutual attraction of nonpolar groups.

Some of the smaller proteins, however, are extremely stable, even against heat for example, solutions of ribonuclease can be exposed for short periods of time to temperatures of 90 °C (194 °F) without undergoing significant denaturation. Denaturation does not involve identical changes in protein molecules. A common property of denatured proteins, however, is the loss of biological activity—e.g., the ability to act as enzymes or hormones.

Although denaturation had long been considered an all-or-none reaction, it is now thought that many intermediary states exist between native and denatured protein. In some instances, however, the breaking of a key bond could be followed by the complete breakdown of the conformation of the native protein.

Although many native proteins are resistant to the action of the enzyme trypsin, which breaks down proteins during digestion, they are hydrolyzed by the same enzyme after denaturation. The peptide bonds that can be split by trypsin are inaccessible in the native proteins but become accessible during denaturation. Similarly, denatured proteins give more intense colour reactions for tyrosine, histidine, and arginine than do the same proteins in the native state. The increased accessibility of reactive groups of denatured proteins is attributed to an unfolding of the peptide chains.

If denaturation can be brought about easily and if renaturation is difficult, how is the native conformation of globular proteins maintained in living organisms, in which they are produced stepwise, by incorporation of one amino acid at a time? Experiments on the biosynthesis of proteins from amino acids containing radioactive carbon or heavy hydrogen reveal that the protein molecule grows stepwise from the N terminus to the C terminus in each step a single amino acid residue is incorporated. As soon as the growing peptide chain contains six or seven amino acid residues, the side chains interact with each other and thus cause deviations from the straight or β-chain configuration. Depending on the nature of the side chains, this may result in the formation of an α-helix or of loops closed by hydrogen bonds or disulfide bridges. The final conformation is probably frozen when the peptide chain attains a length of 50 or more amino acid residues.


Online Literature:

  1. K. A. Dill and J. L. MacCallum, The protein folding problem, 50 years on, Science 338, 1042-1046 (2012). (PDF) (Full Text Online) (podcast)
  2. Southall, N.T., K.A. Dill, and A.D.J. Haymet. A View of the Hydrophobic Effect. Journal of Physical Chemistry B 106: 521-533 (2002). (PDF)
  3. Summary of studies from small molecules (N-methyacetamide and benzene)

It is clear that proteins are not all that stable, and many contributions of varying magnitudes must sum to give the proteins marginal stability under physiological conditions. Hydrophobic interaction, defined in the new sense, must play a major role in stability. Also, since proteins are so highly packed compared to a lose denatured state, London Forces must also play a significant part. (Remember dispersion forces are short range and become most significant under conditions of closest packing.) Opposing folding is the chain conformational entropy just described. Since proteins are so marginally stable, even one unpaired buried ionic side chain, or 1-2 unpaired buried H bond donors and acceptors in the protein may be enough to "unravel" the native structure, leading to the denatured state.


Odorant Binding and Chemosensory Proteins

Nadja Hellmann , in Methods in Enzymology , 2020

3.1 Equilibrium conditions and the issue of reversibility

Strictly speaking, when investigating protein denaturation , thermodynamic equilibrium means that the fractions of protein in the various states (native, intermediate, denatured) are only determined by the conditions (e.g., denaturant concentration, temperature) and not by the path which led to this state (e.g., per unfolding or per refolding). Thus, unfolding and refolding curves should not show any hysteresis, but should overlap. Then the process is reversible, and both curves are in equilibrium.

To achieve equilibrium conditions, as indicated by a temporally stable spectroscopic signal, it might take a while: for chemical denaturation of OBPs often incubation times of 24 h were employed. The refolding process might take even longer and often displays considerable hysteresis ( Stepanenko et al., 2014, 2016b ). Typically, the refolding curve is the one which does not represent equilibrium conditions.

In thermal denaturation studies, different results might be obtained for different heating rates. If denaturation is slower than the change in temperature, the denatured fraction lags behind and the curves obtained do not represent equilibrium conditions.

Irreversible aggregation of the denatured protein tends to occur in thermal denaturation ( Parisi et al., 2005 ). If the temperature at which aggregation starts (Tagg) is considerably higher than the denaturation temperature (Tm), it is possible to separate the two processes, and restrict the analysis to the range below Tagg. Not unfrequently, however, both processes take place within a narrow temperature range, and the obtained value of Tm might be distorted.


Protein

Proteine ​​bestehen aus Aminosäureresten (mehr als 100 Aminosäuren), die durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind, chemisch ist die Polymerisation von Aminosäuren zu Protein eine Dehydratisierungsreaktion, sie haben ein hohes Molekulargewicht (mehr als 5000) kolloidaler Natur, dialysierbar und hitzelabil. Jedes Protein hat eine einzigartige, genau definierte Aminosäuresequenz, Aminosäuresequenzen sind aus mehreren Gründen wichtig:

  • Die Kenntnis der Aminosäuresequenz von Proteinen hilft bei der Klärung ihres Wirkmechanismus (z. B. der katalytische Mechanismus des Enzyms).
  • Eine Veränderung der Aminosäuresequenz kann eine abnormale Funktion und Krankheit hervorrufen, z.B. Sickle cell disease.

Proteinstruktur

Für die Proteinstruktur verantwortliche Bindungen sind:

I. Kovalente Bindungen

  1. Peptidbindungen (Amidbindungen):Die Carboxylgruppe einer Aminosäure verbindet sich mit der Aminogruppe einer anderen Aminosäure (unter Entfernung eines Wassermoleküls). Dies ist eine starre Bindung, stark, es kann keine Rotation des Proteinmoleküls um diese Bindung (die C- und N-Atome verbindet) stattfinden, also stabilisiert sie die Proteinstruktur, diese Bindung tritt in Transformation auf und alle 4 Atome liegen in derselben Ebene (dh sind koplanar).Peptidbindungen werden bei der Denaturierung von Proteinen nicht gebrochen, d.h. bei Hitze- oder Röntgenstrahlung oder beim Schütteln können sie durch enzymatische Wirkung oder durch starke Säuren oder Basen bei erhöhter Temperatur aufgebrochen werden.
  2. Disulfidbrücken (-S-S-):Sie treten zwischen 2 Cysteinresten in der gleichen Polypeptidkette oder in verschiedenen Polypeptidketten auf, es ist eine sehr stabile Bong, die den für Proteindenaturierungen üblichen Bedingungen widersteht.

II. Nicht kovalente Bindungen

Dies sind schwache Bindungen, die leicht getrennt werden können, jedoch addieren sich die vielen dieser Bindungen im Proteinmolekül zu den Kräften, die die Proteinfaltung begünstigen.

  1. Wasserstoffbrückenbindungen werden gebildet, wenn eine gemeinsame Nutzung von Wasserstoffatomen zwischen dem Wasserstoff der -NH-Gruppe und dem Carbonylsauerstoff verschiedener Peptidbindungen auftritt, Wasserstoffbrückenbindungen können zwischen polaren ungeladenen R-Gruppen gebildet werden, z. -OH miteinander oder mit Wasser.
  2. Hydrophobe Wechselwirkungen:The non-polar side chains of neutral amino acids tend to be introduced to the inside of the protein molecule exposed to water, they are not true bonds but interactions that help to stabilize the protein structure.
  3. Electrostatic bonds (ionic interaction or salt bridge): These bonds occur between the charged group of side chains of amino acids, (NH3 + of basic amino acids and COO¯ of acidic amino acids)
    They are either:
    A. Repulsive: If the interactions between the side chains are of the same sign, [both are (+) or both are (-)].
    B. Attractive: If the interactions occur between side chains of different charges [i.e. one is (+) and the other is (-)].
The conformation of proteins (Orders of protein structure)

In its native form, protein molecule has a characteristic three-dimensional shape (primary, secondary, tertiary structure), which is required for its specific biological function or activity, proteins formed of two or more polypeptide chains have a quaternary structure.

Proteinstruktur

1- Primary structure of proteins

This refers to the number and sequence of amino acids in the polypeptide chain or chains linked by peptide bonds, understanding of primary structures of proteins is important because many genetic diseases result with abnormal amino acid sequences. The amino acids sequences are read from N-terminal (amino acid number 1) to C-terminal ends of the peptide, the primary structure of proteins determines the secondary and tertiary structures which are essential for protein functions.

2- Secondary structure of proteins

Coiling, folding, or bending of the polypeptide chain leading to specific structure kept by interactions of amino acids close to each other in the sequence of the polypeptide chain, there are two main regular forms of secondary structure: α-helix and β-pleated sheets, other forms may be found.

3- Tertiary structure of proteins

It is the three-dimensional structure of each polypeptide chain, there are two main forms of tertiary structure: fibrous and globular types.

Domains are the functional and three-dimensional structural units of a polypeptide, folding of the peptide chain within a domain is independent of folding in other domains, thus each domain has the characteristics of a small compact globular protein, polypeptides that are greater than 200 amino acids generally consist of two or more domains,

The domains are usually connected with relatively flexible areas of protein. Interactions stabilizing tertiary structure include disulfide bonds, hydrophobic interactions, hydrogen bonds, and ionic interactions.

4- Quaternary structure of proteins

Certain polypeptides will aggregate to form one functional protein, proteins possess quaternary structure if they consist of 2 or more polypeptide chains, structurally identical, or totally unrelated united by non-covalent bonds (hydrogen, electrostatic bonds, and hydrophobic interaction), such proteins are termed oligomers, and the individual polypeptide chain is termed monomer or subunit, this protein will lose its function when the subunits are dissociated.
z.B. Hemoglobin is an example of protein present in the quaternary structure, it is a tetramer having 2α chains and 2β chains.

Denaturierung von Proteinen

It is the loss of native structure (natural conformation) of protein by many physical or chemical agents leading to changes in the secondary, tertiary, and quaternary structure of proteins due to rupture of the non-covalent bonds (hydrogen bonds, hydrophobic bonds, and electrostatic bonds and may be disulphide, but not peptide bonds), with loss of biological activity. Denaturation disrupts all orders of protein structure except the primary structure.


What is the Role of SDS

The R-groups of amino acids in a particular protein may bear either positive or negative charge, making the protein an amphoteric Molekül. Therefore, in the native state, different proteins with the same molecular weight migrate at different speeds on the gel. This makes the separation of proteins in the polyacrylamide gel difficult. The addition of SDS to the protein denatures the proteins and covers them in a uniformly-distributed, net negative charge. This allows the migration of proteins towards the positive electrode during electrophoresis. In other words, SDS linearizes the protein molecules and masks the various types of charges on R-groups. In conclusion, the charge to mass ratio in SDS-coated proteins is same hence, there will be no differential migration based on the charge of the native protein. A SDS-PAGE of red blood cell membrane proteins is shown in figure 3.

Figure 3: SDS-PAGE

In addition to SDS-PAGE, SDS is used as a detergent in nucleic acid extractions for the disruption of the cell membrane and dissociation of nucleic acid: protein complexes.

Abschluss

SDS is an anionic detergent used as a detergent in various types of biotechnological techniques. It denatures the tertiary structure of a protein to produce a linear protein molecule. Furthermore, it binds to the denatured protein in a uniform manner, providing a uniform charge to mass ratio to all types of proteins. A net negative charge is given to the protein molecule by SDS by masking the charges on R-groups of amino acids of the protein. Hence, SDS allows the separation of proteins based on their molecular weight on a PAGE as the charge is proportional to the molecular weight of the denatured proteins by SDS.

Referenz:

1. “How SDS-PAGE Works.” Bitesize Bio, 16 Feb. 2018, Available here.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. “SDS with structure description” By CindyLi2016 – Own work (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. “Protein-SDS interaction” By Fdardel – Own work (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. “RBC Membrane Proteins SDS-PAGE gel” By Ernst Hempelmann – Ernst Hempelmann (Public Domain) via Commons Wikimedia

Über den Autor: Lakna

Lakna, Absolventin der Molekularbiologie und Biochemie, ist Molekularbiologin und hat ein breites und starkes Interesse an der Entdeckung naturbezogener Dinge


Schau das Video: Proteine - Eiweiße (Kann 2022).