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Was versteht man unter „proteolytischer Aktivierung“ eines Virus?

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Noob-Biologe hier. Ich vermute, dass dies im ersten Schritt bedeutet, das Virus durch Lyse eines Oberflächen-/Spike-Proteins zu aktivieren? Scheint irgendwie offensichtlich, aber ich setze es hier für den Fall ein, dass 'proteolytische Aktivierung' nicht nur eine Untermenge von 'Virusaktivierung' ist und etwas etwas anderes bedeutet.

Zweitens, wenn die obige Interpretation richtig ist, was genau meinen wir mit Virusaktivierung? Ist es die Freisetzung viraler RNA in das Zytosol der Wirtszelle? Dies wäre meine Vermutung, da es notwendig (ausreichend?) ist, damit die Replikation der viralen RNA beginnt und die virale Replikation stattfindet. Eine andere Idee ist, dass "Viren, die in die Wirtszelle eindringen" ausreichen, um eine virale Aktivierung zu bewirken, obwohl ich vermute, dass einige Viren in Zellen eindringen und dort inaktiv bleiben können. Kommt mir kaum nach Aktivierung vor.

Ich würde mich sehr über eine Klärung dieser Terminologie freuen, damit ich beim Lesen von Literatur keine Missverständnisse habe.


Viren haben alle einen Mechanismus, um in die Lipidmembranen der Zellen einzudringen, und diese müssen an einer vorzeitigen Aktivierung gehindert werden. Dies bedeutet oft, dass sich das Virus in einem inerten Zustand befindet, während es zusammengesetzt und aus der Wirtszelle transportiert wird, und dann durch ein chemisches Signal wie den niedrigen pH-Wert der inneren Endosomen aktiviert wird. "Aktivierung" bezieht sich normalerweise auf eine chemische Veränderung, die die Barrieren für den Zelleintritt beseitigt.

Zum Beispiel; in Flaviviren wie Zika oder Dengue wird das E-Glykoprotein, das die meisten Wirtseintrittsfunktionen übernimmt, zusammengebaut, während es an das prM-Protein gebunden ist. Sobald Virionen mit E in einer inerten Anordnung zusammengesetzt sind, wird prM proteolytisch gespalten. Wenn die neue Wirtszelle das Virion in ein Endosom absorbiert und den pH-Wert senkt, um es zu verdauen, ordnen sich die E-Glykoproteine ​​zu Spitzen um, die die endosomale Membran durchdringen und eine Fusion mit der viralen Membran induzieren können. Wenn prM nicht gespalten wird, kann das Virus keine Zellen infizieren. Hier ist ein aktuelles Papier, das diesen Prozess mit hochauflösenden Strukturen diskutiert. Für diese Viren gibt es zwei Aktivierungsrunden, und nur die erste ist proteolytisch.


Virusaktivierung

Die zelluläre Latenz tritt nach der HIV-Provirus-Integration auf und ist durch eine minimale Transkriptions- oder Translationsaktivität viraler Gene gekennzeichnet. Die Virusaktivierung aus einem latenten Zustand ist oft das Ergebnis einer Stimulation durch Mitogene, Zytokine oder DNA-schädigende Mittel. Die Regulierung der viralen Latenz bleibt schwer fassbar. Einige der zellulären Faktoren, die für die aktive Transkription viraler Gene an die LTR rekrutiert werden, umfassen NF-κB, Sp-1 und TBP. Rev, Tat, Vpu und Nef wurden jedoch durch ihre Interaktionen mit der LTR und Replikationszyklus. Ein weiteres Verständnis der Faktoren, die die Induktion und Reaktivierung durch virale Latenz verhindern, wäre hilfreich für die Entwicklung von Ansätzen zur Hemmung des Fortschreitens der Krankheit. Die Aktivierung von HIV aus einem latenten Zustand ist ein neuer Ansatz zur Herbeiführung einer Heilung (siehe unten).


Rollen von Caspasen bei Entzündungen und Apoptose: Perspektiven als Angriffspunkte für Wirkstoffe

Robert V. Talanian, Hamish J. Allen, in Annual Reports in Medicinal Chemistry, 1998

Posttranslationale Regulation

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Caspase-Aktivierung scheint die proteolytische Aktivierung zu sein. Wie unten beschrieben, kann die proteolytische Caspase-Aktivierung durch induzierte Nähe von Caspase-Vorläufern oder Proteolyse durch aktive Caspasen oder andere Proteasen stimuliert werden. In aktivierten humanen monozytären THP.1-Zellen hat aktive Caspase-1 eine sehr kurze Halbwertszeit und liegt bei <1 % des Niveaus des Vorläuferenzyms (10) vor. In vitro, Caspase-1-Autodegradation bei Asp381 (11) und reversible Dissoziation von Untereinheiten (11,12) treten leicht auf. Dissoziation kann nicht nur ein potenzieller Beitrag zur Inaktivierung sein, sondern auch eine Neuordnung zwischen verschiedenen Caspasen ermöglichen. Maus-Caspase-11, wahrscheinlich äquivalent zu Human-Caspase-4 oder -5, interagiert physisch mit und ist für die Maus-Caspase-1-Aktivierung erforderlich (13). Die in vitro Beobachtungen der Verzahnung von Caspase-Vorläufern (14) und eines reversiblen homodimeren Gleichgewichts (11,12) legen nahe, dass die Bildung von heteroligomeren Spezies mit Anteilen von bis zu vier Caspasen möglich ist (11).


Ausrichtung auf den Sonic Hedgehog Pathway bei Hirntumoren: Fortschritte, Einschränkungen und zukünftige Richtungen

Neuartige Arzneimitteltherapeutika für SHH-assoziierte Gliome und MBs

Ein Ansatzpunkt zur Identifizierung neuer Wirkstoff-Targets ist das Verständnis der Signalwege, die die GLI1-Aktivität außerhalb des kanonischen SHH-Signalwegs regulieren ( Abb. 25.4 ). Darüber hinaus ist es wichtig, die Mechanismen zu verstehen, die die MB-Resistenz gegen SMO-Inhibitoren antreiben.

Mehrere Kinasen, die die Stabilität und Lokalisierung des GLI1-Proteins regulieren, sind wie folgt:

Proteinkinase A (PKA) fördert die Proteolyse und die Herunterregulierung der Aktivität von GLI1. Die PKA-Phosphorylierung auf GLI1 an seiner Threonin-374-Stelle führt zu einer GLI1-Retention im Zytoplasma, was seine transkriptionelle Aktivität im Zellkern ausschließt [92] . PKA phosphoryliert GLI1 auch an einer anderen Stelle (Serin 640), was zur Interaktion von GLI1 mit dem 14-3-3 Protein und zur Unterdrückung der GLI1-Transkription führt [93] .

Ribosomale Protein S6-Kinase 1 (S6K1) phosphoryliert GLI1 auf Serin 84, was zur GLI1-Aktivierung führt [94] .

Die Aktivierung von AMPK reduziert den GLI1-Proteinspiegel und die Stabilität, wodurch die SHH-induzierte Transkriptionsaktivität herunterreguliert wird [95,96] . AMPK phosphoryliert GLI1 an den Serinen 102 und 408 und Threonin 1074 [95,96]. Wichtig ist, dass Zelllinien, die GLI1 enthalten, die gegenüber der Phosphorylierung durch AMPK resistent sind, ein erhöhtes onkogenes Potenzial aufweisen [95].

Aus der Literatur zu den posttranslationalen Modifikationen von GLI1 ergeben sich mehrere wichtige Themen. Erstens stellt die Phosphorylierung an verschiedenen Stellen von GLI1 eine Art komplexer Code dar, ein Netzwerk konkurrierender Regulationen. Eine grundlegende Frage, die noch geklärt werden muss, ist, wie diese konkurrierenden Phosphorylierungsmarkierungen, wie die gleichzeitige Phosphorylierung an mehreren Stellen, die GLI1-Aktivität regulieren. Zweitens repräsentieren die Beispiele der Phosphorylierung auf GLI1 die Regulierung durch nicht-kanonische (Nicht-SHH)-Wege. Dies ist von therapeutischer Bedeutung. Sekundäre Methoden zur Aktivierung von GLI1 wie die Phosphorylierung durch S6K1 stellen potenzielle Quellen für Resistenzen gegen Wirkstoffziele des SHH-Wegs dar. Drittens umfassen mögliche Wirkstoffziele die Aktivierung der Repressoren (direkt oder indirekt) der GLI1-Aktivität und/oder die Hemmung der Aktivatoren (direkt oder indirekt) der GLI1-Aktivität. Wichtig ist, dass die gleichzeitige Anwendung dieser Wirkstoffe mit bestehenden SMO-Inhibitoren ein vielversprechender Forschungsweg sein wird, da eine Kombinationsbehandlung sowohl die Wirksamkeit verbessern als auch Resistenzen verhindern kann.

Die Literatur offenbart auch Signalwege, die mit der SHH-Signalgebung kreuzen, obwohl der genaue Mechanismus der Wechselwirkung noch nicht vollständig verstanden ist. Diese interagierenden Wege könnten daher neue Regulationspunkte der SHH- und GLI1-Aktivität aufdecken und werden wie folgt beschrieben:

p53. Die Genomsequenzierung ergab, dass pädiatrische MBs mit mutiertem p53 assoziiert sind, dessen Status ein wichtiger diagnostischer Marker für Patienten mit SHH-MB ist. Der p53-Status spielt eine entscheidende Rolle für den Überlebensstatus von Patienten. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt 81 % für SHH-MB-Patienten ohne p53-Mutation, verglichen mit 41 % bei Patienten mit p53-Mutation [97] . Bei Mäusen mit einer einzigen Deletion von PTCH1, Inzidenz von MB betrug 14 %, aber diese Inzidenz stieg auf > 95 % mit Ablation von p53 [98]. MDM2, ein negativer Regulator von p53, spielt eine Rolle bei der SHH-Signalgebung, da eine Reduktion von MDM2 zu einer verminderten Expression von GLI1 und GLI2 und kleinen Kleinhirn führt [99]. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen verhinderte die Reduktion von MDM2 die MB-Tumorentstehung in PTCH1 heterozygote Mäuse [99] . Somit kann eine weitere Untersuchung, wie MDM2 die GLI1- und GLI2-Expression genau reguliert, neue Regulationspunkte aufdecken.

Lager. Mehrere Studien verbinden den Second Messenger cAMP mit dem SHH-Signalweg und der Tumorpathogenese. Erstens wurde festgestellt, dass höhere cAMP-Spiegel mit einem niedrigeren Grad bei Hirntumoren korreliert sind [100] . Umgekehrt ergab die Studie, dass niedrigere Adenylatcyclase- und cAMP-Spiegel mit einer höheren Malignität einhergehen [100] . In einem Neurofibromatose-1-Modell erzeugten die Forscher mit Phosphodiesterase-4A1 im kortikalen Gewebe von Mäusen Herde mit verringertem cAMP und stellten fest, dass die Mehrheit der Mäuse kortikales Wachstum entwickelten, dessen Zellen eine Tumormorphologie aufwiesen [101]. Eine andere Studie ergab, dass der Verlust des für G-Protein Gαs kodierenden Gens zu einer SHH-MB-Initiation führte [102] . Somit können erhöhte cAMP-Spiegel mit einer verringerten Tumorprogression korrelieren, eine Möglichkeit, die sowohl für MB als auch für Gliome weiter getestet werden sollte.

Knochenmorphogene Proteine ​​(BMPs). Es wurde gezeigt, dass BMPs die SHH-vermittelte Zellproliferation regulieren. Es wurde gezeigt, dass BMP2 und BMP4 die SHH-induzierte Proliferation in Primärkulturen von Körnerzellvorläufern hemmen, was eine zelluläre Differenzierung ermöglicht. Die Zugabe von BMP2 zu SHH-stimulierten Kulturen führte zu einer Herunterregulierung von SmÖ und Gli1 mRNA-Spiegel [103] . Schließlich reduzierte die Überexpression von SMAD5 den Prozentsatz der SHH-induzierten proliferierenden Zellen [103]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aktivierung der BMP2-SMAD5-Achse ein wichtiger Zielpunkt bei SHH-MB sein könnte.

bFGF. Der basische FGF (bFGF)-Weg scheint die SHH-induzierte Proliferation zu hemmen. Die Co-Inkubation von SHH mit bFGF eliminierte die SHH-induzierte Teilung [104]. Eine andere Studie ergab, dass die Behandlung von MB-Zellen mit bFGF die Tumorbildung nach einer Transplantation verhindert [105].

Überleben. Survivin wurde in . überexprimiert PTCH1-mutierte MB-Zellen und MB-Tumorzellen, die aus Mäusen mit einer Deletion von Survivin isoliert wurden, zeigten einen signifikant reduzierten Thymidin-Einbau, was auf eine verminderte Zellteilung und einen Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase hindeutet [106]. Diese Studien zeigen, dass Survivin eine Rolle bei der SHH-MB-Pathogenese spielt und einen weiteren Untersuchungsort darstellt.


Bioinformatik erklärt: Proteolytische Spaltung

Die proteolytische Spaltung ist im Grunde der Prozess des Aufbrechens der Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in Proteinen. Dieser Prozess wird von Enzymen durchgeführt, die Peptidasen, Proteasen oder proteolytische Spaltungsenzyme genannt werden.

Proteine ​​durchlaufen oft eine proteolytische Verarbeitung durch spezifische proteolytische Enzyme (Proteasen/Peptidasen), bevor das Protein endgültig reift. Proteine ​​können auch als Folge der intrazellulären Prozessierung von beispielsweise fehlgefalteten Proteinen gespalten werden. Ein weiteres Beispiel für die proteolytische Prozessierung von Proteinen sind sekretorische Proteine ​​oder Proteine, die auf Organellen gerichtet sind, deren Signalpeptid durch spezifische Signalpeptidasen entfernt wird, bevor sie in die extrazelluläre Umgebung oder spezifische Organelle freigesetzt werden.

  • N-terminale Methioninreste werden oft nach der Translation entfernt.
  • Signalpeptide oder Targeting-Sequenzen werden während der Translokation durch eine Membran entfernt.
  • Virusproteine, die von einer monocistronischen mRNA translatiert wurden, werden gespalten.
  • Proteine ​​oder Peptide können gespalten und als Nährstoffe verwendet werden.
  • Vorläuferproteine ​​werden oft verarbeitet, um das reife Protein zu ergeben.

Die proteolytische Spaltung von Proteinen hat ihre Bedeutung in Laborexperimenten gezeigt, wo es oft sinnvoll ist, mit spezifischen Peptidfragmenten statt mit ganzen Proteinen zu arbeiten.

Proteasen haben auch kommerzielle Anwendungen. Als Beispiel können Proteasen als Detergenzien zur Spaltung von proteinhaltigen Flecken in Kleidung verwendet werden.

Die allgemeine Nomenklatur der Spaltstellenpositionen des Substrats wurde von Schechter und Berger, 1967-68 [Schechter und Berger, 1967], [Schechter und Berger, 1968] formuliert. Sie bezeichnen die Spaltungsstelle zwischen P1-P1' und erhöhen die Nummerierung in N-terminaler Richtung der gespaltenen Peptidbindung (P2, P3, P4 usw.). Auf der Carboxylseite der Schnittstelle wird die Nummerierung in gleicher Weise inkrementiert (P1', P2', P3' usw.). Dies ist in Abbildung 16.27 visualisiert.


Abbildung 16. 27: Nomenklatur des Peptidsubstrats. Das Substrat wird zwischen Position P1-P1' gespalten.

Proteasen haben oft eine spezifische Erkennungsstelle, an der die Peptidbindung gespalten wird. Als Beispiel spaltet Trypsin nur an Lysin- oder Argininresten, aber es spielt (mit wenigen Ausnahmen) keine Rolle, welche Aminosäure sich an Position P1' (Carboxyterminal der Spaltstelle) befindet. Ein anderes Beispiel ist Trombin, das spaltet, wenn sich an Position P1 ein Arginin befindet, aber nicht, wenn gleichzeitig ein D oder E an Position P1' gefunden wird. (Siehe Abbildung 16.28).


Abbildung 16. 28 : Hydrolyse der Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren. Trypsin spaltet unspezifisch an Lysin- oder Argininresten, während Trombin an Argininen spaltet, wenn Asparat oder Glutamat fehlen.

Bioinformatische Ansätze werden verwendet, um potentielle Peptidase-Spaltungsstellen zu identifizieren. Fragmente können durch Scannen der Aminosäuresequenz nach Mustern gefunden werden, die mit der entsprechenden Spaltstelle für die Protease übereinstimmen. Bei der Identifizierung von gespaltenen Fragmenten ist es relativ wichtig, das berechnete Molekulargewicht und den isoelektrischen Punkt zu kennen.


Hämagglutininspaltbarkeit, Säurestabilität und Temperaturabhängigkeit optimieren das Influenza-B-Virus für die Replikation in den menschlichen Atemwegen

Influenza-A-Virus (IAV) und Influenza-B-Virus (IBV) verursachen jährliche Epidemien mit signifikanter Morbidität und Mortalität. Wenn zoonotische IAVs in die menschliche Bevölkerung gelangen, muss das virale Hämagglutinin (HA) angepasst werden, um eine anhaltende Virusübertragung zu erreichen. Im Gegensatz dazu zirkuliert IBV seit langem im Menschen, seinem einzigen Wirt. Ob dies eine Anpassung von IBV HA an die menschlichen Atemwege mit sich brachte, ist nicht bekannt. Um diese Frage zu beantworten, verglichen wir zwei saisonale IAVs (A/H1N1 und A/H3N2) und zwei IBVs (B/Victoria- und B/Yamagata-Linien) im Hinblick auf die wirtsabhängige Aktivität von HA als Mediator der Membranfusion während des Viruseintritts . Wir untersuchten zunächst die proteolytische Aktivierung von HA, indem wir alle Typ-II-Transmembran-Serinprotease (TTSP) und Kallikrein-Enzyme abdeckten, von denen viele im menschlichen Atemwegsepithel nachgewiesen wurden. Der IBV HA0-Vorläufer wird durch ein breiteres Panel von TTSPs gespalten und mit viel höherer Effizienz als IAV HA0 aktiviert. Dementsprechend hob der Knockdown einer einzelnen Protease, TMPRSS2, die Ausbreitung von IAV, aber nicht von IBV in menschlichen respiratorischen Epithelzellen auf. Zweitens erwiesen sich die pH-Werte der HA-Fusion für IBV und human-adaptierte IAVs als ähnlich (mit einer Ausnahme von der HA von 1918 IAV). Drittens zeigte IBV HA eine höhere Expression bei 33 °C, einer Temperatur, die für die Membranfusion von B/Victoria HA erforderlich ist. Dies deutet auf eine ausgeprägte Anpassung von IBV HA an den leicht sauren pH-Wert und die kühlere Temperatur der oberen Atemwege des Menschen hin. Diese unterschiedlichen und intrinsischen Merkmale von IBV HA sind mit einer umfassenden Anpassung des Wirts während einer verlängerten Zirkulation dieses Atemwegsvirus in der menschlichen Bevölkerung vereinbar.BEDEUTUNG Influenza-Epidemien werden durch Influenza-A- und Influenza-B-Viren (IAV bzw. IBV) verursacht. IBV verursacht erhebliche Erkrankungen, ist jedoch weit weniger untersucht als IAV. Während IAV aus tierischen Reservoirs stammt, zirkuliert IBV nur im Menschen. Die Virusausbreitung erfordert, dass das virale Hämagglutinin (HA) in den menschlichen Atemwegen aktiv und ausreichend stabil ist. Wir klären hier, wie sich diese Mechanismen zwischen IBV und IAV unterscheiden. Während menschliche IAVs für die HA-Aktivierung auf eine bestimmte Protease angewiesen sind, ist dies bei IBV nicht der Fall. Eine überlegene Aktivierung von IBV durch mehrere Proteasen sollte die Absonderung infektiöser Partikel verbessern. IBV HA zeigt Säurestabilität und eine Präferenz für 33 °C, was auf eine ausgeprägte Anpassung an die oberen Atemwege des Menschen hinweist, wo der pH-Wert leicht sauer ist und eine kühlere Temperatur herrscht. Diese adaptiven Merkmale werden durch die lange Existenz von IBV beim Menschen erklärt und könnten eine breitere Bedeutung für das Verständnis der Biologie und Evolution von Atemwegsviren haben.

Schlüsselwörter: Säurestabilität Atemwegsproteasen Hämagglutinin Wirtsadaptation Influenza-A-Virus Influenza-B-Virus Membranfusionstemperatur.

Copyright © 2019 Amerikanische Gesellschaft für Mikrobiologie.

Figuren

Menschliches Lungengewebe und Atemwege…

Menschliches Lungengewebe und epitheliale Zelllinien der Atemwege sind reich an TTSP und…

IBV HA0 wird effizient gespalten…

IBV HA0 wird von einer Vielzahl von TTSPs effizient gespalten. (A) Experimentieren…

TTSP-Spaltung erzeugt fusionskompetentes IBV…

Die TTSP-Spaltung erzeugt fusionskompetentes IBV HA. (A) Versuchsaufbau. HeLa-Zellen, die IBV exprimieren…

Pseudopartikel, die IBV HA tragen, sind…

Pseudopartikel, die IBV HA tragen, werden durch verschiedene TTSPs effizient aktiviert. (A) Versuchsaufbau.…

TMPRSS2 ist eine entscheidende Protease…

TMPRSS2 ist eine entscheidende Protease für die Replikation von IAV, aber nicht IBV. (EIN)…

MDCK-Zellen enthalten hohe Konzentrationen…

MDCK-Zellen enthalten hohe Mengen an HA-aktivierendem TMPRSS4. (A und B) IAV oder…

IBV HA weist eine ähnliche…

IBV HA zeigt einen ähnlichen Fusions-pH wie human-adaptierte IAV HAs. (A) Experimentieren…

IBV HA bevorzugt eine Temperatur…

IBV HA bevorzugt eine Temperatur von 33°C für die Proteinexpression, was die temperaturbeschränkte Fusion erklärt…

Pseudopartikel, die B/Victoria HA tragen, erfordern…

Pseudopartikel, die B/Victoria HA tragen, erfordern 33 °C für die Infektiosität. (A) Versuchsaufbau. Pseudopartikel, die…


Ergebnisse

Spaltung von SARS-CoV-2 S1/S2-Stellen-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Substraten durch Furin

Es wurde gezeigt, dass die S1/S2-Spaltungsstelle des neu entstandenen SARS-CoV-2 ein minimales Furin-Konsensusmotiv der Sequenz RRA-R↓ mit einem Alanin anstelle eines basischen Rests in der P2-Position besitzt ( Abb. 1B (22 , 23)). Nur wenige Furinsubstrate besitzen einen nichtbasischen Rest in P2-Position, wie z Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A oder Shiga-Toxin (10, 19). Um zu testen, ob die S1/S2-Sequenz des SARS-CoV-2 S-Proteins effizient durch Furin gespalten wird, wurde eine kleine Reihe von FRET-Substraten synthetisiert ( 2A ). Alle Verbindungen besitzen ein 3-Nitrotyrosinamid als P4′-Rest und ein 2-Amino-Benzoyl-Fluorophor in P7-Position. Als Referenzsubstrate wurden die analogen Sequenzen der S-Proteine ​​aus MERS-CoV, SARS-CoV und dem aviären infektiösen Bronchitis-Virus (IBV)-Stamm Beaudette hergestellt. Darüber hinaus wurden zwei FRET-Substrate der SARS-CoV-2 S1/S2-Spaltungsstelle mit P2 A → K- und A → R-Mutationen synthetisiert, um zu evaluieren, ob sie für Furin noch effizientere Schnittstellen darstellen könnten als die wilden Typ. Die FRET-Substrate wurden in einem enzymkinetischen Assay mit menschlichem Furin getestet und ihre Spaltungseffizienz ist in 2B gezeigt. Das FRET-Substrat der SARS-CoV-2 S1/S2-Schnittstelle wurde effizient durch rekombinantes Furin gespalten. Im Gegensatz dazu wurde das monobasische SARS-CoV-FRET-Substrat nicht von Furin verarbeitet. Das MERS-CoV S1/S2 FRET-Substrat mit einem zweibasigen R-X-X-R-Motiv wurde von Furin �-fach weniger effizient gespalten als die besten Substrate dieser FRET-Serie. Das FRET-Substrat SARS-CoV-2_M1, das aufgrund einer A → K-Mutation in der P2-Position eine optimierte Furin-Erkennungsstelle enthält, wurde mit ähnlicher Effizienz wie die Wildtyp-Sequenz gespalten. Allerdings verstärkte die Substitution von A → R in der P2-Position die Spaltung durch Furin stark. Erwartungsgemäß wurde auch die analoge Referenzsequenz von IBV von Furin sehr effizient verarbeitet. Die Daten zeigen, dass das R-R-A-R-Motiv an der S1/S2-Schnittstelle von SARS-CoV-2 S in vitro effizient von Furin gespalten wird.

(EIN) Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Substrate der S-Protein S1/S2-Stellen der angegebenen CoVs. M1 und M2 sind Mutanten der SARS-CoV-2 S1/S2-Stelle mit Substitution von A → K oder A → R in P2-Position. IBV, aviärer infektiöser Bronchitis-Virusstamm Beaudette. Die Furinspaltung ist rot markiert. (B) Spaltung der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Substrate (20 μM) durch Furin (0.5 nM). Die Spaltungseffizienz von SARS-CoV-2_M2 wurde auf 100 % gesetzt. (C) Spaltung von SARS-CoV-2 S durch Furin und TMPRSS2 in HEK293-Zellen. Zellen wurden mit pCAGGS-S-Myc-6xHis und entweder leerem Vektor oder pCAGGS-TMPRSS2 cotransfiziert. Die Zellen wurden dann in Abwesenheit oder Gegenwart von Aprotinin oder Furin-Inhibitor MI-1851 (jeweils 50 μM) für 48 h inkubiert. Zelllysate wurden einer SDS–PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern gegen das C-terminale Myc-Tag unterzogen. Für jeden Western-Blot werden Bahnen aus einem Immunoblot aus einem Experiment zusammengespleißt. β-Actin wurde als Ladekontrolle verwendet.

Für diese Abbildung sind Quelldaten verfügbar.

Das SARS-Cov-2-Spike-Protein wird sowohl von Furin als auch von TMPRSS2 . gespalten

Als nächstes untersuchten wir, ob das SARS-CoV-2 S-Protein durch endogenes Furin in HEK293-Zellen gespalten wird. Die Zellen wurden vorübergehend mit dem pCAGGS-Plasmid transfiziert, das für das SARS-CoV-2 S-Protein mit einem C-terminalen Myc-6xHis-Tag kodiert, und in Abwesenheit und Gegenwart des potenten synthetischen Furin-Inhibitors MI-1851 inkubiert (vgl Synthese eingereicht). 48 h nach der Transfektion wurden Zelllysate einer SDS–PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern gegen das Myc-Epitop unterzogen. Wie in 2C (linkes Feld) gezeigt, wurden der ungespaltene Vorläufer S und die S2-Untereinheit in Abwesenheit von MI-1851 nachgewiesen, was darauf hinweist, dass S durch endogene Proteasen an der S1/S2-Stelle in HEK293-Zellen gespalten wird. Im Gegensatz dazu wurde die S-Spaltung durch MI-1851 effizient verhindert. Die S1-Untereinheit kann durch den Myc-spezifischen Antikörper nicht nachgewiesen werden (vgl. Fig. 1A). Die S-Spaltung wurde jedoch durch den Trypsin-ähnlichen Serinprotease-Inhibitor Aprotinin nicht verhindert ( 2C , rechtes Feld, Spur 2). Somit weisen die Daten darauf hin, dass das SARS-CoV-2 S-Protein von Furin an der S1/S2-Stelle in HEK293-Zellen gespalten wird.

Aprotinin enthält drei Disulfidbrücken (durch Linien gekennzeichnet).

Anschließend untersuchten wir die SARS-CoV-2 S-Spaltung durch TMPRSS2. Da HEK293-Zellen kein endogenes TMPRSS2 exprimieren (unveröffentlichte Daten siehe auch www.proteinatlas.org), haben wir die Zellen mit pCAGGS-S-Myc-6xHis und pCAGGS-TMPRSS2 co-transfiziert. Dann wurden die Zellen in Abwesenheit oder Gegenwart von MI-1851 inkubiert, um die S-Spaltung durch endogenes Furin zu unterdrücken. Interessanterweise wurden bei der Co-Expression von TMPRSS2 in Abwesenheit von MI-1851 zwei S-Spaltungsprodukte von � bzw beide werden durch den Myc-spezifischen Antikörper nachgewiesen (vgl. Fig. 1A). In Gegenwart von MI-1851 wurde nur eine geringfügige S2-Proteinbande nachgewiesen. Allerdings war die Menge an S2′-Protein, die in transienten TMPRSS2-exprimierenden Zellen vorhanden war, in MI-1851–-behandelten und unbehandelten Zellen ähnlich, was darauf hindeutet, dass die S-Spaltung an der S2′-Stelle nur durch die TMPRSS2-Aktivität verursacht wird. Die geringe Menge an S2-Protein, die in TMPRSS2-exprimierenden Zellen in Gegenwart von MI-1851 nachgewiesen wurde, war wahrscheinlich eher auf die restliche Furinaktivität als auf die Spaltung von S an der S1/S2-Stelle durch TMPRSS2 zurückzuführen. Die Spaltung von S durch TMPRSS2 an der S2′-Stelle wurde weiter durch die Reduktion des S2′-Proteins in mit Aprotinin behandelten Zellen unterstützt ( 2C , rechtes Feld). Zusammen zeigen die Daten, dass SARS-CoV-2 S durch Furin und durch TMPRSS2 gespalten werden kann. Die Daten legen ferner nahe, dass die Proteasen S an verschiedenen Stellen spalten, wobei Furin die S1/S2-Stelle prozessiert und TMPRSS2 an der S2′-Stelle spaltet.

Knockdown von TMPRSS2 verhindert die proteolytische Aktivierung und Vermehrung von SARS-CoV-2 in Calu-3-Epithelzellen der menschlichen Atemwege

Als nächstes untersuchten wir, ob TMPRSS2 an der proteolytischen Aktivierung und Multizyklus-Replikation von SARS-CoV-2 in Calu-3-Epithelzellen der menschlichen Atemwege beteiligt ist. Um die TMPRSS2-Aktivität spezifisch zu reduzieren, haben wir zuvor ein Antisense-Peptid-konjugiertes Phosphorodiamidat-Morpholino-Oligomer (PPMO) entwickelt (25). PPMOs sind einzelsträngige Nukleinsäure-ähnliche Verbindungen, die aus einem kovalent an ein zellpenetrierendes Peptid konjugierten Morpholino-Oligomer bestehen und die Genexpression durch sterische Blockierung komplementärer RNAs stören können. PPMOs sind wasserlöslich und gelangen ohne Assisted Delivery in Zellen und Gewebe (siehe Referenzen 26 und 27). Das zuvor entwickelte PPMO T-ex5 stört das Spleißen von TMPRSS2-Prä-mRNA, was zur Produktion von reifen mRNA ohne Exon 5 und folglich zur Expression einer verkürzten TMPRSS2-Form führt, die enzymatisch inaktiv ist. Durch den T-ex5 PPMO-vermittelten Knockdown der TMPRSS2-Aktivität konnten wir TMPRSS2 als die wichtigste aktivierende Protease des Influenza-A-Virus in Calu-3-Zellen und primären humanen Atemwegsepithelzellen sowie des Influenza-B-Virus in primären humanen Typ-II-Pneumozyten (25 , 28).

Hier wurden Calu-3-Zellen vor der Infektion mit SARS-CoV-2 einmalig 24 h mit T-ex5 PPMO behandelt, um die Produktion von normaler TMPRSS2-mRNA zu hemmen und das in den Zellen vorhandene enzymatisch aktive TMPRSS2 zu vernichten. Die Zellen wurden dann mit SARS-CoV-2 bei einem niedrigen MOI von 0,001 beimpft, ohne zusätzliche PPMO-Behandlung 72 h weiter inkubiert und dann mit einem ursprünglich gegen SARS-CoV 2002 hergestellten Kaninchenserum fixiert und immungefärbt. Wie in 3A gezeigt, war ein starker zytopathischer Effekt (CPE) und eine effiziente Ausbreitung der SARS-CoV-2-Infektion in Calu-3-Zellen sichtbar, die mit einem Negativkontroll-PPMO der Nonsense-Sequenz mit der Bezeichnung “scramble” behandelt wurden, sowie unbehandelte Zellen, die als Kontrollen verwendet wurden. Im Gegensatz dazu wurden in T-ex5 PPMO-behandelten Zellen 72 h p.i. kein CPE und nur kleine Infektionsherde beobachtet. (Abb. 3A). Um die SARS-CoV-2-Aktivierung und Multizyklus-Replikation in PPMO-behandelten Zellen genauer zu untersuchen, wurden Calu-3-Zellen vor der Infektion 24 h mit PPMO behandelt, dann mit Virus bei einer MOI von 0,001 für 1 h 30 min inokuliert und 72 h in Abwesenheit von weiterem PPMO inkubiert, wie oben beschrieben. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Virustiter in den Überständen durch eine Gewebekulturinfektionsdosis von 50 % (TCID .) bestimmt50) Endpunktverdünnung. Die Behandlung mit T-ex5 PPMO reduzierte die Virustiter in Calu-3-Zellen dramatisch um das 500- bzw. 2000-fache bei 16 bzw. 24 h p.i. und das 90-fache bei 48 h p.i. (Abb. 3B).

(EIN) Multizyklische Replikation von SARS-CoV-2 in T-ex5�handelten Calu-3-Zellen. Die Zellen wurden 24 h mit 25 μM T-ex5 oder Kontroll-PPMO (Scramble) behandelt oder blieben ohne Behandlung (w/o). Die Zellen wurden dann mit SARS-CoV-2 bei einer MOI von 0,001 für 1 h 30 min inokuliert, das Inokulum wurde entfernt und die Zellen in Abwesenheit von PPMO für 72 h weiter inkubiert. Die Zellen wurden fixiert und mit einem Serum gegen SARS-CoV immungefärbt. Virus-positive Zellen sind blau gefärbt. Maßstabsbalken zeigen 500 μm an. (B) Calu-3-Zellen wurden 24 h mit PPMO behandelt und dann wie oben beschrieben 72 h mit SARS-CoV-2 infiziert. Die Virustiter in den Überständen wurden durch eine Gewebekulturinfektionsdosis von 50 % (TCID .) bestimmt50) Endpunktverdünnung zu den angegebenen Zeitpunkten. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SD aus drei unabhängigen Experimenten. (C) Analyse von TMPRSS2-mRNA in PPMO-behandelten Calu-3-Zellen. Die Zellen wurden mit 25 μM T-ex5, Scramble-PPMO behandelt oder blieben 24 h unbehandelt (w/o) (Bahnen 1𠄴). T-ex5�handelte Zellen wurden mit SARS-CoV-2 wie oben beschrieben inokuliert und in Abwesenheit von PPMO 72 h lang inkubiert (Spur 4). Die Gesamt-RNA wurde isoliert und durch RT-PCR unter Verwendung von Primern analysiert, die entwickelt wurden, um 1.228 nt TMPRSS2-mRNA voller Länge zu amplifizieren. PCR-Produkte voller Länge und verkürzte, denen Exon 5 fehlt, werden durch gefüllte bzw. offene Pfeilspitzen angezeigt. (D) Wirkung der PPMO-Behandlung auf die Lebensfähigkeit von Calu-3-Zellen. Calu-3-Zellen wurden 24 h mit Scramble oder T-ex5 PPMO (25 μM) behandelt. Die Zelllebensfähigkeit von unbehandelten (w/o) Zellen wurde als 100 % festgelegt. Ergebnisse sind Mittelwerte ± SD (n = 3).

Für diese Abbildung sind Quelldaten verfügbar.

Um den Knockdown der enzymatisch aktiven TMPRSS2-Expression zu bestätigen, wurden Calu-3-Zellen mit PPMO behandelt oder blieben 24 h unbehandelt, wonach TMPRSS2-spezifische mRNA isoliert und wie zuvor beschrieben durch RT-PCR analysiert wurde (25). Die Gesamt-RNA wurde mit Primern analysiert, die entwickelt wurden, um die Nukleotide 108𠄱.336 von TMPRSS2-mRNA zu amplifizieren. Ein PCR-Produkt voller Länge von 1.228 bp wurde aus unbehandelten und mit Scramble-PPMO behandelten Calu-3-Zellen amplifiziert, wohingegen ein kürzeres PCR-Fragment von etwa 1.100 bp aus T-ex5-PPMO-behandelten Zellen amplifiziert wurde ( 3C ). Die Sequenzierung ergab, dass der verkürzten TMPRSS2-mRNA das gesamte Exon 5 fehlte (Daten nicht gezeigt). Um weiter zu bestätigen, dass die T-ex5-PPMO-Einzeldosisbehandlung vor der Infektion immer noch das Spleißen von TMPRSS2-mRNA bei 72 h p.i. stört, wurde Gesamt-RNA aus infizierten Zellen 72 h p.i. isoliert. und wie oben beschrieben verstärkt. Wie in 3C gezeigt, amplifizierten die meisten TMPRSS2-mRNA aus T-ex5-behandelten Zellen 72 h p.i. fehlte Exon 5. Die Daten zeigen, dass T-ex5 sehr effektiv bei der Erzeugung von Exon-Skipping in TMPRSS2-prä-mRNA und somit bei der Hemmung der Expression von enzymatisch aktiver Protease während der Viruswachstumsperiode in Calu-3-Zellen war. Allerdings war nach 72 h pi eine kleine Bande des Volllängen-PCR-Produkts sichtbar, was auf niedrige Expressionsniveaus von enzymatisch aktivem TMPRSS2 zu späteren Zeitpunkten der Viruswachstumsperiode hindeutet, was den Anstieg der Virustiter nach 48 h . erklären könnte Pi (vgl. Abb. 3B). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die T-ex5-PPMO-Behandlung von Calu-3-Zellen nicht beeinflusst, wie in 3D gezeigt und zuvor beschrieben (25, 28).

Zusammen identifizieren unsere Daten TMPRSS2 als einen Wirtszellfaktor, der für die Aktivierung und Vermehrung von SARS-CoV-2 in Calu-3-Zellen essentiell ist, und zeigen, dass die Herunterregulierung der TMPRSS2-Aktivität die SARS-CoV-2-Replikation dramatisch blockiert.

Die Hemmung der TMPRSS2- oder der Furin-Aktivität unterdrückt die mehrzyklische Replikation von SARS-CoV-2 in menschlichen Atemwegsepithelzellen

Als nächstes untersuchten wir die Wirksamkeit verschiedener Inhibitoren von Trypsin-ähnlichen Serinproteasen, die auch TMPRSS2 hemmen, auf die Verhinderung der SARS-CoV-2-Aktivierung durch TMPRSS2 in Calu-3-Zellen. Wir verwendeten den natürlichen Breitband-Serinprotease-Inhibitor Aprotinin aus Rinderlunge und zwei prospektive peptidmimetische Inhibitoren von TMPRSS2, MI-432 (29) und MI-1900 ( Fig. S1). Es ist seit langem bekannt, dass Aprotinin die proteolytische Aktivierung und Vermehrung des Influenza-A-Virus in Zellkulturen und Mäusen verhindert. Darüber hinaus verkürzte die Inhalation von aerosolisiertem Aprotinin bei Influenza-Patienten die Dauer der Symptome deutlich, ohne Nebenwirkungen hervorzurufen (30). Es wurde gezeigt, dass MI-432 die proteolytische Aktivierung und Vermehrung des Influenza-A-Virus in Calu-3-Zellen wirksam hemmt (31). Der Inhibitor MI-1900 ist ein monobasisches und strukturell verwandtes Analogon des dibasischen Inhibitors MI-432.

Um die antivirale Wirksamkeit der Protease-Inhibitoren gegen SARS-CoV-2 zu untersuchen, wurden Calu-3-Zellen mit dem Virus bei einer niedrigen MOI von 0,001 für 1 h 30 min infiziert, wonach das Inokulum entfernt und die Zellen in Gegenwart inkubiert wurden der Inhibitoren in den angegebenen Konzentrationen für 72 h. Die Zellen wurden fixiert und mit einem Antiserum gegen SARS-CoV 2002 immungefärbt. Wie in 4 gezeigt, wurde in Calu-3-Zellen in Abwesenheit von Protease-Inhibitoren ein starkes CPE mit sichtbaren Löchern in der gesamten Monoschicht und eine effiziente Ausbreitung der SARS-CoV-2-Infektion beobachtet. Die Ausbreitung der SARS-CoV-2-Infektion und der virusinduzierten CPE wurde durch eine Aprotinin-Behandlung dosisabhängig effizient gehemmt und in Calu-3-Kulturen, die mit 20 und 50 &mgr;m Aprotinin behandelt wurden, waren nur wenige viruspositive Zellen sichtbar. Even at a lower concentration of 10 μM, the spread of SARS-CoV-2 was greatly reduced and CPE markedly prevented. Treatment with peptide mimetic TMPRSS2 inhibitors MI-432 and MI-1900 also strongly prevented SARS-CoV-2 multiplication and CPE in Calu-3 cells in a dose-dependent manner, although less potently than aprotinin. At 20 or 50 μM of MI-432 or MI-1900, only small foci of infection were visible. At a concentration of 10 μM, virus spread and CPE in MI-432– or MI-1900–treated cells were still reduced compared with control cells. The data demonstrate that SARS-CoV-2 multiplication in Calu-3 human airway cells can be strongly suppressed by aprotinin and the synthetic TMPRSS2 inhibitors MI-432 and MI-1900.

Calu-3 cells were inoculated with SARS-CoV-2 at a low MOI of 0.001 and then incubated in the presence of inhibitors of TMPRSS2 (aprotinin, MI-432, and MI-1900), furin (MI-1851), and endosomal cathepsins (E64d), respectively, at the indicated concentrations. Cells were fixed and immunostained using a rabbit serum against SARS-CoV at 72 h p.i. Virus-positive cells are stained in blue or dark gray depending on the staining intensity. Cells infected in the absence of inhibitors (w/o), in the presence of DMSO (0.5%) and noninfected cells (mock) were used as controls. Scale bars indicate 500 μm. Images are representatives of three independent experiments.

The observed efficient cleavage of transient expressed SARS-CoV-2 S protein by furin in HEK293 cells prompted us to investigate if furin is involved in SARS-CoV-2 activation in Calu-3 cells. Hence, virus spread in Calu-3 cells was analyzed in the presence of the furin inhibitor MI-1851. Interestingly, MI-1851 strongly inhibited SARS-CoV-2 spread at even the lowest concentration of 10 μM, indicating that furin is critical for SARS-CoV-2 activation and multiplication in these cells ( Fig 4 ). Finally, to examine whether endosomal cathepsins are involved in SARS-CoV-2 activation in Calu-3 cells, multicycle virus replication was determined in the presence of the cathepsin inhibitor E64d. Cathepsin L was shown to cleave the S protein of 2002 SARS-CoV S close to the S1/S2 site (R667) at T678 in vitro (2). Here, strong CPE and foci of infection were observed in E64d-treated cells even at the highest dose of 50 μM, similar to that observed in DMSO-treated as well as untreated control cells, indicating that SARS-CoV-2 activation in Calu-3 cells is independent of endosomal cathepsins.

In sum, our data demonstrate that inhibition of either TMPRSS2 or furin strongly inhibits SARS-CoV-2 in Calu-3 human airway cells, indicating that both proteases are critical for S activation. In contrast, endosomal cathepsins are dispensable or not involved at all in SARS-CoV-2 activation in these cells.

Growth kinetics of SARS-CoV-2 in protease inhibitor–treated Calu-3 cells

To analyze inhibition of SARS-CoV-2 activation and multiplication by the different protease inhibitors in more detail, we performed virus growth kinetics in inhibitor-treated cells. Calu-3 cells were inoculated with SARS-CoV-2 at an MOI of 0.001 and then incubated in the presence of 10 or 50 μM of the different protease inhibitors. At 16, 24, 48, and 72 h p.i., the viral titer in supernatants was determined by TCID50 titration. Untreated cells and cells treated with DMSO alone were used as controls. SARS-CoV-2 replicated to high titers within 24� h in untreated and DMSO-treated cells Calu-3 cells ( Fig 5A ). Aprotinin suppressed virus replication 25- to 100-fold compared with control cells even at a concentration of 10 μM at 16-48 h p.i. The TMPRSS2 inhibitor MI-432 only slightly affected virus replication at a concentration of 10 μM but reduced virus titers 75-fold at 24 h p.i. at 50 μM. Treatment of cells with TMPRSS2 inhibitor MI-1900 reduced virus titers in a dose-dependent manner and caused strong inhibition of SARS-CoV-2 replication at 50 μM with 35- to 280-fold reduced viral titers compared with control cells. The furin inhibitor MI-1851 efficiently suppressed SARS-CoV-2 multiplication in Calu-3 cells, producing a 30- to 190-fold reduction in virus titers at a dose of 10 μM. In contrast, virus multiplication was not affected by treatment with the cathepsin inhibitor E64d, consistent with the data shown in Fig 4 . To provide evidence that inhibition of SARS-CoV-2 replication in inhibitor-treated cells was not caused by cytotoxic effects, we analyzed cell viability in Calu-3 cells treated with 50 μM of the different inhibitors for 72 h. As shown in Fig 5B , evaluation of cell viability revealed no significant cytotoxicity by any of the inhibitors under conditions used in the virus growth experiments.

(EIN) Calu-3 cells were inoculated with SARS-CoV-2 at a low MOI of 0.001 and then incubated in the absence (w/o) or presence of inhibitors of TMPRSS2 (aprotinin, MI-432, and MI-1900), furin (MI-1851), and endosomal cathepsins (E64d), respectively, or DMSO (0.5%), at the indicated concentrations. At 16, 24, 48, and 72 h postinfection (p.i.), supernatants were collected, and virus replication was determined by tissue culture infection dose 50% (TCID50) titration at indicated time points. Data are mean values ± SD of three to five independent experiments. (B) Effect of inhibitor treatment on cell viability. Calu-3 cells were treated with the indicated protease inhibitor (50 μM) for 72 h. Untreated cells (w/o) and DMSO treated cells were used as controls. Cell viability of untreated cells was set as 100%. Results are mean values ± SD (n = 3). (C) Antiviral activity of combinations of TMPRSS2 and furin inhibitors against SARS-CoV-2 in human airway epithelial cells. Calu-3 cells were inoculated with SARS-CoV-2 at an MOI of 0.001 as described above and then incubated in the presence of single protease inhibitors or inhibitor combinations at the indicated concentrations. Virus titers in supernatants were determined by TCID50 at 16, 24, 48, and 72 h p.i. Data are mean values ± SD of three independent experiments. (D) Calu-3 cells were treated with PPMO for 24 h, then infected with SARS-CoV-2 as described above and incubated in the absence of PPMO (w/o, scramble and T-ex5) and with or without 50 μM of furin inhibitor treatment (MI-1851) for 72 h. At 16, 24, 48, and 72 h p.i., supernatants were collected, and viral titers were determined by TCID50 at indicated time points. Data are mean values ± SD (n = 2).

The data demonstrate that SARS-CoV-2 replication can be efficiently reduced by inhibiting either TMPRSS2 or furin activity, demonstrating that both proteases are crucial for SARS-CoV-2 activation.

Treatment of SARS-CoV-2–infected Calu-3 cells with a combination of TMPRSS2 and furin inhibitors

Finally, we wished to examine whether the combination of inhibitors against TMPRSS2 and furin shows a synergistic antiviral effect. Therefore, Calu-3 cells were infected with virus as described above and incubated in the presence of aprotinin, MI-432, or MI-1900 in combination with MI-1851 at 10 and 50 μM each, respectively, for 72 h. Virus titers in supernatants were determined at indicated time points. Single-dose treatment of each inhibitor and untreated cells were used as controls. As shown in Fig 5C , the combination of 10 μM of MI-1851 with either aprotinin or MI-432 showed enhanced antiviral activity against SARS-CoV-2 and 10- to 30-fold reduced virus titers compared with 10 μM of each inhibitor alone and also reduced viral titer four to eightfold more than that observed with either of the single inhibitors at 50 μM. A combination of 50 μM each of MI-432 and MI-1851 reduced virus titers 10- to 32-fold compared with 50 μM of each inhibitor alone and thereby dramatically suppressed SARS-CoV-2 multiplication 100- to 250-fold compared with untreated or DMSO-treated cells. In contrast, treatment of Calu-3 cells with 50 μM each of MI-1851 and aprotinin did not cause further suppression of virus titers compared with the combination of 10 μM of each inhibitor. The combination of 10 μM each of MI-1851 and MI-1900 did not show enhanced antiviral activity compared with single inhibitor treatments at 10 μM. However, treatment of cells with 50 μM each of MI-1900 and MI-1851 caused fivefold reduction in viral titers when compared with cells treated with 50 μM of each inhibitor alone and thereby SARS-CoV-2 multiplication in Calu-3 cells was markedly reduced compared to control cells. We furthermore examined the antiviral activity of a combination of T-ex5 PPMO and furin inhibitor MI-1851 against SARS-CoV-2 in Calu-3 cells. As shown in Fig 5D , combined treatment of Calu-3 cells with 25 μM T-ex5 PPMO and 50 μM MI-1851 almost completely blocked SARS-CoV-2 replication with a nearly 15,000-fold reduction in virus titers at 24 h p.i., and reduced virus titers 500-fold at 48 h p.i. compared with control cells. Combination of T-ex5 and MI-1851 was synergistic and caused 30- to 10-fold lower virus titers at 16 and 24 h p.i. compared with single inhibitor-treated cells. The data demonstrate that efficient inhibition of S cleavage by a combination of TMPRSS2 and furin inhibitors can dramatically block SARS-CoV-2 replication in human airway epithelial cells. Furthermore, our data show that combination of TMPRSS2 and furin inhibitors can act synergistically to produce inhibition of SARS-CoV-2 activation and multiplication at lower doses than single protease inhibitor treatment.

In conclusion, our data demonstrate that both TMPRSS2 and furin cleave the SARS-CoV-2 S protein and are essential for efficient virus multicycle replication in Calu-3 human airway cells. The results indicate that TMPRSS2 and furin cleave S at different sites𠅏urin at the S1/S2 site and TMPRSS2 at the S2′ site𠅊nd suggest that TMPRSS2 and furin cannot compensate for each other in SARS-CoV-2 S activation. Our data further demonstrate that inhibition of either one of these critical proteases can render the S protein of SARS-CoV-2 unable to efficiently mediate virus entry and membrane fusion and, therefore, provides a promising therapeutic approach for treatment of COVID-19.


Ergebnisse

Role of Mpl and the PLCs in Mouse Virulence and Plaque Formation

A series of deletions was generated into the PLC-, Mpl-, and ActA-encoding genes to evaluate the requirements for proPC-PLC proteolytic activation. The mutations were introduced into the chromosome of L. monocytogenes strains SLCC-5764 and 10403S. Proteolytic activation of proPC-PLC was first evaluated in vitro, using SLCC-5764 and isogenic mutant strains. SLCC-5764 is a hypersecreting strain of L. monocytogenes that facilitates in vitro analysis of virulence factors, such as ActA and PC-PLC, not normally expressed in vitro (Camilli et al., 1993). ProPCPLC (MR 33 kD) and the processed form of the enzyme (MR 28 kD) were identified by Coomassie blue staining and Western immunoblotting. ProPC-PLC was secreted in comparable amounts from each plcB positive strain (Fig. 1, ein und B), indicating that the internal deletions in mpl und actA genes, which are located within the same operon and upstream of the plcB gene (Portnoy et al., 1992), did not affect plcB Genexpression. Similarly, the internal deletion in plcA, which is located within the same operon and upstream of prfA, the transcriptional regulator encoding gene (Portnoy et al., 1992), did not affect plcB gene expression (Fig. 1, ein und B, lane 3). The processed form of PC-PLC was secreted in comparable amounts from SLCC5764 and isogenic plcA und actA mutant strains (Fig. 1, ein und B, lanes 2, 3, und 5). Enzymatic activity, as determined by the egg yolk gel overlay assay, comigrated with the processed form of PC-PLC (compare Fig. 1,B to 1 C, lanes 2, 3, und 5), confirming that PI-PLC and ActA are not required for the proteolytic activation of proPC-PLC in vitro and that the processed form is the active form of the enzyme. A processed form of PC-PLC was detected in minute amounts from the mpl mutant strain (Fig. 1, ein und B, lane 6). However, there was no detectable PC-PLC activity associated with this mutant (Fig. 1 C, lane 6), even after increasing the amount of protein loaded on the gel fourfold (data not shown). This result is consistent with Mpl being required for activation of proPC-PLC in broth culture as previously reported (Poyart et al., 1993).

The virulence of wild-type strain 10403S and isogenic mutants was evaluated in vivo using the mouse infection model. The ability of these mutants to spread cell to cell was evaluated in a mouse fibroblast cell line by a plaquing assay. The results are reported in Fig. 2 and Table II. Der Single plcA und plcB mutants show respective reductions of 12% and 33% in plaque sizes, and the double plcA, plcB mutant shows a reduction of 66% in plaque size. In the mouse infection model, the plcA mutant shows a minor increase in LD50, das plcB mutant is 1 log less virulent, whereas the double plcA, plcB mutant is 2.5 logs less virulent than the wild-type strain. These results are consistent with previously reported data, suggesting that the PLCs have overlapping functions (Smith et al., 1995). The double mpl, plcB mutant was phenotypically identical to the single plcB mutant, consistent with Mpl function being related to the activation of proPC-PLC. Similarly, the triple plcA, plcB, mpl mutant was phenotypically identical to the double plcA, plcB Mutant. A single mutation in the mpl gene resulted in a 29% decrease in plaque size, also consistent with Mpl being required for proPC-PLC activation. Allerdings ist die mpl mutant was as virulent as the wild-type strain in the mouse infection model, which is inconsistent with Mpl function being required for the activation of proPC-PLC. In addition, a double plcA, mpl mutant had a 47% decrease in plaque size, which differs significantly (P < 0.0001) from the 66% decrease observed with the double plcA, plcB Mutant. The double mpl, plcA mutant was ∼2 logs less virulent than wild type but not as attenuated as the double plcA, plcB mutant in the mouse infection model. Taken together, these data clearly show a role for Mpl in bacterial cell-to-cell spread and reveal a role for Mpl in virulence as seen in the double mpl, plcA Mutant. However, unlike the plcB mutant, the virulence of the single mpl mutant was not attenuated in mice, and that of the double mpl, plcA mutant was not as attenuated as the double plcA, plcB Mutant. These results raised the possibility that intracellular activation of proPC-PLC may proceed in the absence of Mpl.

Intracellular Activation of ProPC-PLC

To directly evaluate the role of Mpl in the intracellular activation of proPC-PLC, we examined the production and processing of proPC-PLC in a tissue-culture model of infection. At 4 h after infection, J774 cells were pulse labeled for 30 min with [ 35 S]methionine and lysed, and both forms of PC-PLC were immunoprecipitated using affinity-purified antibodies. The precursor and processed forms of PCPLC were identified based on their relative migration on SDS-PAGE, and by comparison with cells infected with the plcB mutant strain. Both forms of the enzyme were present in cells infected with either the wild-type strain or the mpl mutant (Fig. 3, lanes 1 und 3), indicating that Mpl was not essential for intracellular processing of proPCPLC. Furthermore, results from an egg yolk gel overlay assay from infected cells indicated that the processed form of PC-PLC generated in cells infected with either the wildtype strain or the mpl mutant had enzymatic activity (Fig. 4, lanes 2 und 5). Phospholipase activity was not detected in uninfected cells or cells infected with the plcB mutant (Fig. 4, lanes 1 und 3).

Subcellular Localization of PC-PLC

Double immunofluorescence staining and confocal microscopy was performed at 5 h after infection to determine the site of PC-PLC and L. monocytogenes localization. Distinctively, only a small proportion of intracellular bacteria stained positively for PC-PLC, and PC-PLC staining colocalized with L. monocytogenes (Fig. 5,EIN). The pattern of PC-PLC staining suggested a vacuolar localization. Double immunofluorescence staining of PC-PLC and Lamp1 was performed to define more precisely the site of PC-PLC localization. Lamp1 is an endosomal/lysosomal marker (Chen et al., 1985 Lewis et al., 1985) that increases in concentration with endosomal maturation (Berón et al., 1995 Pitt et al., 1992). Colocalization of PC-PLC and Lamp1 was observed (Fig. 5, D und E), but the amount of Lamp1 colocalizing with PC-PLC varied considerably. This staining pattern suggested that PC-PLC was concentrated in vacuoles that had fused with endosomes and lysosomes. PC-PLC staining was not observed in filopodia-like structures, but we cannot eliminate the possibility that this could be due to a lack of sensitivity of the technique used.

To directly address whether PC-PLC localized to secondary vacuoles formed upon bacterial cell-to-cell spread, J774 cells were infected with a 10-fold lower multiplicity of infection to facilitate identification of primary and secondary infected cells at 5 and 6 h after infection. Double immunofluorescence staining of PC-PLC and L. monocytogenes indicated that the majority of PC-PLC localized to cells at the periphery of infected foci, presumably in secondary vacuoles formed during bacterial cell-to-cell spread. An example of an infection focus at 6 h after infection is shown in Fig. 5 B.

The Mpl-dependent and -independent Pathways of ProPC-PLC Proteolytic Activation

The above results suggested that secondary vacuoles formed during bacterial cell-to-cell spread fused with vesicles of the endocytic pathway (Berón et al., 1995 Gruenberg and Maxfield, 1995 Pitt et al., 1992). To assess the role of vacuolar acidification and lysosomal enzymes in proPC-PLC processing, we used two enzyme inhibitors. The first, bafilomycin A1, is a specific inhibitor of the vacuolar proton pump ATPase (Yoshimori et al., 1991), which serves to acidify a vacuolar compartment. The second is a peptidyldiazomethane, Z-FA-CHN2, which specifically inactivates cysteine proteases by alkylation of the reactive site cysteine residue (Leary et al., 1977). Z-FA-CHN2 has strong affinity for cathepsins B and L (Crawford et al., 1988 Kirschke and Shaw, 1981 Wilcox and Mason, 1992), which are lysosomal acid cysteine proteases, but does not react with the calpains (Crawford et al., 1988), which are cytosolic calcium-activated neutral cysteine proteases. The results showed that both bafilomycin A1 and Z-FA-CHN2 blocked processing of proPC-PLC in cells infected with the mpl mutant (Fig. 6, lanes 5 und 6). In wild-type infected cells, processing of proPC-PLC was not affected by Z-FACHN2, but no processing was detected in cells treated with bafilomycin A1 (Fig. 6, lanes 2 und 3), although the protein was detected by immunofluorescence in secondary vacuoles (data not shown). Neither bafilomycin A1 nor Z-FACHN2 inhibited activation of proPC-PLC in broth culture (data not shown). These results indicate that there are two intracellular pathways of activation of proPC-PLC: an Mpl-mediated pathway and a cysteine protease-mediated pathway. Both pathways were blocked by a specific inhibitor of the vacuolar proton pump ATPase, suggesting that vacuolar acidification is a prerequisite to the intracellular processing of proPC-PLC.

Intracellular Activity of PC-PLC on Phosphatidylcholine and Sphingomyelin

Intracellular activation of proPC-PLC was mediated by either Mpl or a cysteine protease, raising the possibility that PC-PLC activity might vary depending on the activating protease. To address that point, we investigated the activities of PC-PLC generated in cells infected with either the wild-type strain or the mpl Mutant. PC-PLC was immunoprecipitated from infected cells, and the enzymatic assay was performed directly on PC-PLC bound to antibodies on protein A–Sepharose beads. Hydrolysis of 3 H-PC and 14 C-sphingomyelin by immunoprecipitated PC-PLC was measured as described in Materials and Methods. In either case, PC-PLC was capable of mediating PC and sphingomyelin hydrolysis (Table III). When corrected for the number of bacteria per dish, the ability of PC-PLC generated by the wild-type strain and the mpl mutant to hydrolyze PC and sphingomyelin was essentially the same, although a small shift in substrate preference was observed. Phospholipase activity was not detected on immunoprecipitates from uninfected cells or cells infected with the plcB mutant (data not shown).

Proteolytic Activation of ProPC-PLC in the Absence of Bacterial Cell-to-Cell Spread

The above results indicated that PC-PLC localized to Lamp1-positive vacuoles (Fig. 5) and that vacuolar acidification was a prerequisite to proPC-PLC activation (Fig. 6, lanes 2 und 5). These results suggested that active PC-PLC would not be generated in the cytosol of infected cells. To further investigate the intracellular requirements for proPCPLC activation, we monitored the presence of PC-PLC in cells infected with an actA mutant of L. monocytogenes that is defective in actin-based motility, and consequently fails to spread cell to cell. ProPC-PLC was immunoprecipitated in similar amounts in cells infected with either the wild-type strain or the actA mutant, indicating that proPCPLC was synthesized by cytosolic bacteria, but processing of proPC-PLC, although observable, was very inefficient in the cytosol of cells infected with the actA mutant (Fig. 7, compare lanes 1 und 5).

To eliminate the possibility that ActA was directly involved in proPC-PLC processing, we infected cells with the wild-type strain, and then blocked bacterial cell-to-cell spread by adding cytochalasin D (Dabiri et al., 1990 Tilney and Portnoy, 1989), an inhibitor of actin polymerization, 30 min before labeling. Again, the precursor form of PC-PLC was present in these infected cells but the processed form was not detectable, indicating that ActA was not directly responsible for proPC-PLC processing (Fig. 7, lane 4). Moreover, the amount of processed PC-PLC was largely reduced when actin polymerization was blocked as late as 10 min into the pulse, and it was barely detectable when actin polymerization was blocked 10 min before labeling (Fig. 7, lanes 2 und 3). Results from the cytochalasin D time course experiment indicated that continuous bacterial spreading was required for proPC-PLC processing. Not surprisingly, PC-PLC activity, as measured by the egg yolk gel overlay assay, was detected neither in cells infected with the actA mutant strain (Fig. 4, lane 4) nor in wild-type infected cells treated with cytochalasin D (data not shown). Therefore, proPC-PLC proteolytic activation, but not synthesis, occurred predominantly in secondary vacuoles.

Cytosolic Degradation of ProPC-PLC

Our observations indicated that proPC-PLC proteolytic activation was inefficient in the absence of bacterial cellto-cell spread (Fig. 7). However, in the absence of proteolytic activation, proPC-PLC did not appear to accumulate intracellularly, suggesting that proPC-PLC was rapidly degraded when secreted in the cytosol of the host cell. Proteolytic degradation of cytosolic proteins is mostly proteasome dependent (Rock et al., 1994). We investigated the role of the proteasome in the intracellular degradation of proPC-PLC using two aldehyde tripeptide inhibitors: LLnL and LLM. LLnL blocks the proteasome activity, while LLM does not (Rock et al., 1994 Vinitsky et al., 1992).

The intracellular stability of proPC-PLC was evaluated by a pulse-chase experiment. Cells infected with ActA − bacteria were treated with either LLnL or LLM at 3 h after infection and the inhibitors were present during the entire pulse-chase experiment. At 3 h and 50 min after infection, cells were pulse labeled with [ 35 S]methionine for 10 min, and then chased for specific periods of time. A role for the proteasome in proPC-PLC degradation was demonstrated by the observation that proPC-PLC was stabilized in infected cells treated with LLnL (Fig. 8, compare lanes 5–8 to lanes 1–4), but not in those treated with LLM (Fig. 8, lanes 9–12). Indeed, the half-life of proPC-PLC was <15 min in either untreated or LLM-treated cells, and >60 min in LLnL-treated cells. The intracellular stability of proPC-PLC was comparable in cells infected with either the wild-type strain, the mpl mutant, or the actA mutant (data not shown). Yet, in wild-type and Mpl − infected cells, proPC-PLC chased into active PC-PLC (data not shown). These results suggested an additional level of PC-PLC regulation by proteolytic degradation of the precursor. ProPC-PLC secreted into the cytosol was degraded by host proteases and consequently had a short half-life.


Nesfatin-1

Processing of the Precursor

The NUCB2 protein contains several cleavage recognition sites for prohormone convertases (PC). The proteolytic processing of NUCB2 by PC-1/3 is assumed to generate several products including nesfatin-1 (amino acids 1–82), nesfatin-2 (amino acids 85–163) and nesfatin-3 (amino acids 166–396, Fig. 1 B). 22 In their landmark study, Oh-I and colleagues reported the presence of the 82 amino acid peptide in rat cerebrospinal fluid, whereas the mature peptide was not detectable in hypothalamic tissue. 22 Subsequent reports did not detect mature nesfatin-1 (9.7 kDa) in the brain 9,10 or plasma, 29 whereas full length NUCB2 as well as small amounts of exogenous synthetic nesfatin-1 were detectable by Western blot. 29 So far, most studies describing the expression at the protein level did not distinguish between NUCB2 and nesfatin-1 as the antibodies used recognized both molecules. Because of these findings, it remains to be clarified whether nesfatin-1 or full length NUCB2 is the biologically active molecule since NUCB2 also shows biological activity upon third ventricular injection in rats. 22 Among the known cleavage products, only nesfatin-1 influences food intake, whereas nesfatin-2 and nesfatin-3 do not. 22


Interferons: Meaning, Production and Applications

Interferons are natural glycoproteins produced by virus-infected eukaryotic cells which protect host cells from virus infection. They were discovered by Isaacs and Lindenmann in 1957 in course of a study of the effect of UV-inactivated influenza virus on chick chorioallantoic membrane kept in an artificial medium.

They observed that the infected membrane produced a soluble substance in the medium which could inhibit the multiplication of active influenza virus inoculated in fresh chick chorioallantoic membranes. The substance was called interferon because it interfered with intra­cellular multiplication of viruses.

Later observations confirmed that such host-produced antiviral substances were common to many viruses. Viral interference is a phenomenon observed when multiplication of one virus is inhibited by another virus. For instance, when influenza-A virus is inoculated into the allantoic cavity of an embryonated egg followed after 24 hr by influenza-B virus, the multiplication of influenza-B virus is partly or completely inhibited. The reason why influenza-B virus cannot multiply is that the influenza-A virus infected cells produce interferon which partly or totally inhibits multiplication of B virus. The interferon also protects cells from influenza A virus.

Characteristics of Interferons:

An outstanding feature of interferons is that they are host-cell-specific and not virus-specific. This means that interferons produced by mouse or chicken will not protect human cells against the same virus which induced interferon in the experimental animals. On the other hand, an interferon produced by a virus X in an animal will protect the animal also from other viruses.

This is because interferons do not interact directly with the viruses. But they induce the virus infected cells to synthesize antiviral proteins which inhibit viral multiplication. These proteins have a wide inhibitory spectrum. As a result, not only the interferon-inducing virus, but others are also inhibited.

The reason why interferon produced by one species does not protect another species is that the same virus produces different interferons in different species. It has been observed that interferons produced by different host species following infection by the same virus differ in molecular weight as well as in other properties, like isoelectric point etc. Not only different species produce different interferons, different tissues of the same animal produce different interferons.

All types of interferons are proteins having a comparatively low molecular weight ranging between 15,000 to 40,000 Daltons. Hence, they are non-dialyzable and destroyed by proteolytic enzymes. Interferons are fairly stable at low pH (pH2) and can withstand moderate temperature being stable at 37°C for an hour or so. They are produced in minute amounts by the infected cells as a longer precursor having 23 amino acid residues more than the mature molecule.

Human interferons are of three main types. These are called alpha interferons (α-IFN), beta-interferons (β-IFN) and gamma-interferons (γ-IFN). Alpha-interferon contains many subtypes. The total subtypes exceed 20 in number.

It is produced by the B-lymphocytes, monocytes and macrophages. β-IFN is produced by the fibroblasts in the connective tissues. γ-IFN is synthesized by the T-lymphocytes after they are activated by antigens. α-IFN has been shown to be coded by as many as 20 distinct chromosomal genes, indicating thereby that the subtypes of this interferon represent a family of closely related proteins.

β-IFN appears to be a glycoprotein. It is coded by a single human gene. All the genes of α-IFN and β-IFN are located on the short arm of human chromosome 9. α-IFN proteins are all 166 amino acid long (except one). They are non-glycosylated and the proteins are monomeric. The single β-IFN protein is also 166 amino acid long and a glycoprotein. It is dimeric.

Production of Interferons:

Interferons are produced by living animal cells, both in vivo as well as cultured cells. Interferon production and its antiviral activity require expression of cellular genes, and these functions are blocked by inhibitors of transcription and translation. Thus, virus-infected host cells fail to produce interferon in presence of actinomycin D, an inhibitor of eukaryotic RNA polymerase. When the inhibitor is added after 2 hr of infection, interferon production is not inhibited, suggesting that transcription is completed by that time.

Interferon production starts after initiation of viral maturation and continues for 20 to 50 hr after that. Then the production stops, due to formation of a repressor which presumably is formed or activated only when the interferon concentration in the producing cell exceeds a certain threshold concentration. Most of the interferon is transported from the producing cell to other neighbouring cells.

The substance in a virus that is responsible for interferon synthesis by the host cell is known as interferon inducer. The nature of this substance was identified by Merigan (1970) as double-stranded RNA. The activity seems to reside in polyribonucleotide’s with a high helical content. The double- stranded RNA viruses — like reoviruses — can act as interferon inducer without replication. Single- stranded RNA viruses can act as inducers only after replication when they form double-stranded replicative intermediates. DNA-viruses can also induce interferons, presumably due to overlapping transcription of viral DNA as observed in case of vaccinia vinus (Fig. 6.39).

Fungal viruses which have mostly double-stranded RNA genomes are also efficient inducers of interferons. Some synthetic polymers containing riboinosinic acid, ribocytidylic acid (Poly I: C) as well as those containing riboadenylic acid and ribouridylic acid (Poly A: U) are also good inducers. All interferon inducers are characterized by high molecular weight, high density of anionic groups and resistance to enzymatic degradation. DNA and DNA-RNA hybrids have been found to be ineffective as interferon inducers.

The induction of interferon synthesis concerns α- and β-interferon’s which belong to a single class, called Type I. Gamma-interferon belongs to a separate class, called Type II. The human Υ-interferon is the single representative of its type. The gene coding the y-interferon protein is located on the long arm of chromosome 12. The gene has three introns, while the genes of α- and β- interferons are without any introns. Gamma-interferon (human) has 146 amino acids and is an N-glycosylated tetrameric protein. It is induced by antigenic stimulation of T-lymphocytes.

In presence of the inducer which is viral ds-RNA, the α- and β-interferon genes of the host chromosome(s) are activated to produce interferon m-RNAs. Those are then translated intoα- and β- interferon proteins. These proteins at first accumulate in the producing cell and eventually leave the cell to reach neighbouring host cells.

As the interferon concentration in the producing cell rises above a threshold level, it activates another gene of the producing cell which codes for a repressor protein which feeds back and stops further synthesis of interferon. As a result, virus-infected cells generally produce only small quantities of interferons.

The interferon molecules that leave the producing cell reach the neighbouring uninfected host cells and interact with the cell membrane or nuclear membrane receptors of these cells. Thereby these cells are induced to synthesise antiviral proteins. These antiviral proteins are the actual agents that provides protection to these host cells against viral infection.

Mechanism of Action of Interferons:

Type I interferons include α-IFN and β-IFN. These interferons do not interact with the viruses directly causing their inhibition, but they induce the formation of antiviral proteins which are activated to inhibit viral multiplications. These interferon-regulated proteins (IRPs) act presumably by blocking synthesis of the macromolecular components necessary for viral multiplication.

A general scheme for mechanism of action of type I interferons is shown in Fig. 6.40:

Several interferon regulated host proteins (IRPs) have been identified, though all of them have not been fully characterized. Among the better known of these proteins are a protein kinase and an enzyme catalyzing the formation of a short polymer of adenylic acid, the 2′, 5′-oligoadenylate synthetase (2′-5′ A synthetase).

The protein kinase is induced by Type I interferons. It has to be activated by ds-RNA. The activated kinase catalyses phosphorylation of initiation factor (el F-2) thereby causing inhibition of protein synthesis (Fig. 6.41).

The 2′-5′-oligoadenylate synthetase is an enzyme also induced by Type I interferons which requires activation by ds-RNA like the protein kinase. The activated synthetase acts as an activator of an endonuclease, RNase L. The activated RNAse degrades viral ss-RNA (Fig. 6.42).

Another group of proteins, called Mx-proteins induced by α- and β-IFN are known to possess intrinsic antiviral activity, although the exact molecular mechanism by which they inhibit viral multiplication is not known. Mx-proteins have been reported to play a major controlling role in infections caused by influenza viruses in experimental animals as well as in humans.

Type II interferon includes g-IFN which is also known as immune IFN. Although g-IFN also possesses anti-viral activity, its major role is in the immunity through activation of cytotoxic T-lymphocytes which can destroy virus infected cells. Besides T-lymphocytes, other naturally occurring killer cells like macrophages and monocytes are also activated by g-IFN. Thus, in contrast to that of Type I interferons, the antiviral effect of g-IFN is expressed through activating the killer cells of the body which destroy the virus-infected cells.

Type II interferon induces the major histocompatibility antigens of human cells. Expression of these antigens is essential for immuno-potent cells to present foreign antigens to the T-lymphocytes during generation of specific immune responses.

IFN induced expression of these major histocompatibility antigens represents an important contribution of the antiviral activity of g-IFN through enhancement of the activity of cytotoxic T-lymphocytes. The activation of cytotoxic T-lymphocytes by y-IFN also implies its possible role in elimination of cancer cells which are recognized by the immune system of the body as foreign objects.

Applications of Interferons:

Interferons could be ideal agents for combating viral diseases. They inhibit viral multiplication at such low concentration which is non-toxic to uninfected cells. One interferon can inhibit many viruses. But there are certain draw-backs which stand in their use.

Firstly, for application in humans, interferon must be of human origin, though interferons produced in monkey kidney cell cultures are also effective in humans. Interferons are produced in very small quantities and it is difficult to get them in sufficient quantity in pure form for clinical application. Another factor is that interferons are effective only for short periods and as such can be used against only acute infections, like influenza.

The difficulty of obtaining sufficient quantity of pure interferon for clinical use has been overcome by cloning the α-IFN and β-IFN human genes in bacteria and yeast. By growing these transgenic organisms in mass culture, it has been possible to obtain clinically usable interferons in sufficiently large quantities. Alpha-interferon has been marketed in 1984 under the trade name Intron A.

In the following years, this biotechnologically produced interferon has been approved for clinical use against diseases like genital herpes caused by herpes-virus, hepatitis B and C. Beta-interferon has also been biotechnologically produced and marketed under the trade name Betaseron. It has been used in a disease called multiple sclerosis. A recombinant g-interferon has been found effective against an inherited chronic disease, called granulomatous disease.

The neutrophils of the affected individual are unable to kill the infectious bacteria. Application of y-IFN to such persons restores the ability of the neutrophils to kill bacteria. As the disease is chronic and inherited, the affected persons must take g-IFN throughout their life to remain normal.

Interferons are not only antiviral, but they have also anticancer activity. Clinical trials have shown that interferons have effect against only some types of tumours. Alpha-interferon has been approved for treating hairy-cell leukemia, and Kaposi’s sarcoma, a cancer that occurs in AIDS patients.

Gamma-interferon has been mainly used as an immuno-stimulant in cancer patients. Resistance against tumours in the body is controlled by the immune response against tumour antigens. The cytotoxic T-lymphocytes recognize these antigens as foreign and destroy them. Gamma-interferon can stimulate the cytotoxic function of T-lymphocytes and other natural killer cells of the body, thereby helping to control the tumour cells.


Informationen zum Autor

Mitgliedschaften

Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Germany

E. M. Abdelwhab, Jutta Veits & Thomas C. Mettenleiter

Department of Experimental Animal Facilities and Biorisk Management, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Germany

Reiner Ulrich & Jens P. Teifke

Institute of Epidemiology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Greifswald-Insel Riems, Germany