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Kolokalisierung durch IFA?

Kolokalisierung durch IFA?


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Ich habe zuvor IFA (Immunfluoreszenzassay) durchgeführt, aber ich habe nur auf ein Protein abgezielt oder mein endogenes Protein mit GFP/RFP markiert, dann habe ich IFA durchgeführt. Ich möchte den IFA in einer elterlichen Zelllinie (HEK-Zellen) durchführen. Mein Ziel ist es zu zeigen, dass die beiden Proteine ​​co-lokalisiert sind oder nicht?

  1. Protein-1 (Sekundärantikörper Maus)
  2. Protein-2 (Sekundärantikörper Kaninchen)

Wie kann ich zwei verschiedene Proteine ​​in derselben Probe kolokalisieren? Welchen Primärantikörper muss ich zuerst hinzufügen? kann mir bitte jemand etwas vorschlagen?


Wenn Sie im Web oder bei Google Scholar suchen, sollten Sie viele Beispiele für Kolokalisierungsprotokolle finden.

Im Allgemeinen benötigen Sie jedoch für jedes Target eine ungefärbte Kontrollprobe (Sie können eine für alle Targets verwenden), eine nur sekundäre Probe, um nach unspezifischer Hintergrundfärbung zu suchen, und eine einfarbige Probe (primär plus sekundär). Dann haben Sie eine Probe mit beiden Primär- und beiden Sekundärteilen. Sie fügen die Primärfarben immer gleichzeitig und die Sekundärfarben gleichzeitig hinzu.

Wenn Sie mit einer höheren Anzahl von Farben beginnen, benötigen Sie auch eine FMO-Steuerung (Fluoreszenz minus eins) für jede Farbe, damit Sie den Signalüberschlag von einem Kanal zum anderen testen können. Dieses Beispiel kombiniert alle Farben außer einer.