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Regulierung der Chromatinstruktur

Regulierung der Chromatinstruktur


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Vor kurzem habe ich die verschiedenen Ebenen der Chromatinstruktur überprüft. Die primäre Ebene sind Nukleosomen, bei denen DNA an Histone gebunden ist und strukturelle Ähnlichkeit mit "Perlen an einer Schnur" aufweist. Die sekundäre Ebene ist eine 30-nm-Faser, und die tertiäre Ebene wird durch radiales Schleifen der Fasern gebildet.

Ich habe auch etwas über den Histoncode gelernt und wie verschiedene Modifikationen der Kernhistone mit der Transkriptionsregulation zusammenhängen. Sind diese Modifikationen der primäre Regulationsmechanismus für die Chromatinstruktur? Mit anderen Worten, nimmt Chromatin die kompakteste Struktur an, die möglich ist, bis Histonmodifikationen vorgenommen werden, um die Transkription zu ermöglichen? Oder wurden andere regulatorische Mechanismen entdeckt und charakterisiert, die nichts mit der Transkription zu tun haben?


"Sind diese Modifikationen der primäre Regulationsmechanismus für die Chromatinstruktur?"

Es hängt davon ab, wie Sie primär definieren, wir könnten Histonmodifikationen derzeit als primär betrachten, da andere Regulationsmechanismen noch nicht gut untersucht wurden. Etwas anderes, das Sie sich vorstellen können, sind die verschiedenen regulatorischen Proteine, die mit Histonmarkierungen interagieren, um Chromatin zu modifizieren.

Ich denke, Sie sollten sich Chromatin nicht so vorstellen, dass es "die kompakteste Struktur annimmt, die möglich ist, bis Histonmodifikationen vorgenommen werden, um die Transkription zu ermöglichen", sondern dass Histonmodifikationen ein dynamischer Prozess sind, bei dem verschiedene Transkriptionsfaktoren (eine Klasse von Proteinen) eintreten und hinzufügen / entfernen Histonmarkierungen sowie 'Remodeling Chromatin' (Hinzufügen/Entfernen von Nukleosomen)

Als Randbemerkung glaube ich, dass nicht viel über das von Ihnen eingangs erwähnte Tertiärstadium bekannt ist, also könnte es vielleicht eine große Rolle bei den Regulationsmechanismen der Chromatinstruktur spielen, es wurde nur noch nicht gut erforscht.


Regulation der Chromatinstruktur und Genexpression

Das langfristige Ziel meines Labors ist es, ein molekulares Verständnis epigenetischer Prozesse zu erlangen, die die Chromatinstruktur und Genexpression regulieren. Zu diesem Zweck haben wir eine neue Tandem-Kinase in Drosophila, JIL-1, identifiziert, die spezifisch in den Gen-aktiven Interband-Regionen der larvalen Polytänchromosomen lokalisiert, Histon H3S10 phosphoryliert und auf den transkriptionell hyperaktiven männlichen Larven fast zweifach angereichert ist Polytän-X-Chromosom. Bei JIL-1-Hypomorphen sind geordnete Interband-Regionen von Polytänchromosomen unterbrochen und die Chromosomenarme stark kondensiert. Die Positionseffekt-Variegation (PEV) bei Drosophila hat als wichtiges Paradigma für die Identifizierung und genetische Analyse von evolutionär konservierten Determinanten der epigenetischen Regulation der Chromatinstruktur und Gen-Silencing gedient, und wir liefern den Beweis, dass Funktionsverlust-Allele des JIL-1-Histons Die H3S10-Kinase kann abhängig von der Chromatinumgebung des Reporter-Locus entweder als Suppressor oder Enhancer von PEV wirken. Diese Effekte auf PEV korrelierten mit der Ausbreitung der wichtigsten Heterochromatin-Marker dmH3K9 und HP1 an ektopische Stellen auf den Chromosomenarmen mit der stärksten Hochregulation, die auf den männlichen und weiblichen X-Chromosomen gefunden wurde. Basierend auf diesen Ergebnissen schlagen wir ein Modell vor, bei dem die JIL-1-Kinase-Aktivität und die Phosphorylierung von Histon H3S10 an der Interphase wirken, um die Heterochromatisierung zu antagonisieren, indem ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Faktoren reguliert wird, die die Repression und die Aktivierung der Genexpression fördern.

Gen-Silencing ist ein kritischer Entwicklungsprozess, der für viele menschliche Gesundheitsprobleme, einschließlich Krebs, relevant ist. Darüber hinaus ist JIL-1 das Drosophila-Homolog der Säuger-MSK1-Kinase, die auch als Regulator der Chromatinstruktur durch Phosphorylierung des Histon-H3S10-Rests fungiert. Gegenwärtig sind die Studien an Säugetieren auf die Analyse der Histon-Phosphorylierung im Zusammenhang mit der unmittelbaren frühen Gentranskription gerichtet. Unsere Ergebnisse legen jedoch nahe, dass das Konzept der Histon-Phosphorylierung erweitert werden sollte, um auch im Kontext der Regulation des Gen-Silencing betrachtet zu werden. Unsere Studien werden daher dazu dienen, allgemeine Einblicke in die molekularen Mechanismen zu geben, wie Kinaseaktivität die Chromatinstruktur und Genregulation moduliert, die für den Menschen direkt relevant sind.


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Prinzipien der metabolischen Verbindung zur Epigenetik

Trotz der Herausforderungen beim vollständigen Verständnis der kontextabhängigen Rolle der Epigenetik-Achse des Stoffwechsels und der Komplexität der Stoffwechselwege und Chromatin-Modifikationen, die durch sie reguliert werden, liegen diesem Cross-Talk mehrere universelle Prinzipien zugrunde, die die evolutionäre Entstehung spezifischer molekularer Mechanismen demonstrieren die die epigenomische Dynamik unter metabolischen Veränderungen erleichtern.

Die Fähigkeit epigenetischer Modifikationen, auf Schwankungen der Stoffwechselaktivität zu reagieren, ist eine Folge der intrinsischen thermodynamischen und kinetischen Parameter chromatinmodifizierender Enzyme (Kasten 1). Die Addition und Entfernung der meisten dieser Modifikationen wird durch Enzyme (d. h. ‘writers’ und 𠆎rasers’) katalysiert, die Metabolite als Substrate oder Cofaktoren verwenden (d. h. Chromatin-modifizierende Metabolite ( Abbildung 1 )). Chromatin-modifizierende Enzyme, die Metabolit-Substrate verwenden, deren physiologische Konzentrationen nahe oder niedriger als die intrinsischen K . der Enzyme sindm und KD Werte [G] sind anfälliger für Veränderungen des Stoffwechselweges als solche, deren Substrate in Überschussmengen vorhanden sind 13 . Diese Eigenschaft ermöglicht es somit, dass metabolische Fluktuationen die Aktivitäten bestimmter Chromatin-modifizierender Enzyme beeinflussen und das Ausmaß spezifischer epigenetischer Modifikationen modulieren, und der Unterschied in den Substratverfügbarkeiten und Km-Werten kann die relative Empfindlichkeit epigenetischer Modifikationen gegenüber metabolischen Veränderungen bestimmen 24,25 (Kasten 1 ). Andererseits können auch nicht-enzymatisch Chromatin-Modifikationen hinzugefügt werden, deren detaillierte kinetische und thermodynamische Eigenschaften weniger gut charakterisiert sind, aber teilweise vom Massenwirkungsgesetz beeinflusst werden.

Die Häufigkeit von Chromatin-modifizierenden Metaboliten wird intrazellulär durch mehrere Mechanismen reguliert. Von Zellen aufgenommene Stoffwechselprodukte können passiv oder aktiv durch das Plasma und die Kernmembran diffundieren, um Chromatin zu modifizieren. Alternativ können Metaboliten intern durch die Aktivität von Stoffwechselenzymen verarbeitet werden, die sie in Substrate oder Co-Faktoren für Chromatin-remodellierende Enzyme umwandeln. Diese Enzyme können auch in den Zellkern translozieren, wo sie lokal Substrate für die Chromatinmodifikation produzieren können. Die resultierende Konsequenz der Metabolitenhäufigkeit auf die Rate der Chromatinmodifikation hängt von den kinetischen und thermodynamischen Parametern des Enzyms ab. Enzyme mit anfänglichen [S]/Km-Verhältnissen auf dem hervorgehobenen linearen Teil der angezeigten Kurve sind anfälliger für Störungen der Substratkonzentrationen – dazu gehören unter anderem Methyltransferasen und Acetyltransferasen. Schließlich können Effektorproteine, sobald die Modifikationen hinterlegt sind, diese erkennen und unter Verwendung spezifischer Proteinbindungsmodule binden, woraufhin sie eine Vielzahl von intrazellulären Schicksalen bestimmen, einschließlich der Regulation von Homöostase, Entwicklung, Immunregulation und Tumorgenese.

Kasten 1:

Kinetische und thermodynamische Eigenschaften chromatinmodifizierender Enzyme

Die Geschwindigkeit der Enzymreaktionen hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich intrinsischer enzymatischer Parameter wie der Umsatzzahl und der Michaelis–Menten-Konstante (Km)-Werte, Enzymhäufigkeit, Substrate, Cofaktoren und allosterische Aktivatoren oder Inhibitoren und andere Umweltfaktoren wie pH, Temperatur und lokale Viskosität. Diese Variablen bestimmen zusammen die Gesamtreaktionsgeschwindigkeit durch eine quantitative Beziehung, die vom molekularen Mechanismus der enzymatischen Reaktion 236 abhängt. Studien, die die Biochemie und Strukturbiologie von Chromatin-modifizierenden Enzymen beschreiben, haben entscheidende Einblicke in ihre katalytischen Mechanismen und Regulatoren geliefert. Kinetische Mechanismen von Enzymen, die an der DNA-Methylierung, Histonacetylierung und Histonmethylierung beteiligt sind, wurden umfassend untersucht, insbesondere wenn es um Fragen der Wirkstoffentwicklung geht ). Beispielsweise zeigen die Histon-Acetyltransferasen PCAF und GCN5 einen geordneten ternären katalytischen Mechanismus, bei dem Acetyl-CoA vor dem Histon-Peptid an das Enzym bindet, gefolgt von der Freisetzung von acetyliertem Histon und schließlich dem CoA-Molekül 237� . Im Gegensatz dazu funktionieren p300 und HAT8 über einen Ping-Pong-Mechanismus, der mit der Bindung von Acetyl-CoA beginnt und mit der Freisetzung von acetyliertem Histon endet 240,241 . Schließlich wurde eine zufällige ternäre Kinetik in der Hefe-Histon-Acetyltransferase Rtt109 242 beobachtet.

Angesichts der Diversität der katalytischen Mechanismen chromatinmodifizierender Enzyme und der Variabilität der spezifischen enzymatischen kinetischen Parameter weisen epigenetische Modifikationen aufgrund dieser unterschiedlichen Mechanismen wahrscheinlich eine Spezifität auf. Die thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften epigenetischer Modifikationen hängen von der Art der Modifikation, dem entsprechenden chromatinmodifizierenden Enzym, dem spezifischen Genom-Locus und der Häufigkeit allosterischer Regulatoren und Cofaktoren ab. Diese Variabilität führt zu einer ausgeprägten Dynamik der Ablagerung und des Umsatzes als Reaktion auf Störungen des Stoffwechsels. Die direkte Ausrichtung auf diese epigenetischen Modifikationen hat gezeigt, dass die Dynamik der Histon-Acetylierung im Allgemeinen schneller ist als die der DNA- und Histon-Methylierung 243 und dass Acetylierung und Deacetylierung im Minutenbereich erfolgen in vivo 244.245 . Histon- und DNA-Methylierung sind dagegen stabiler im Vergleich zur Acetylierung, die als Reaktion auf stärkere, aber vorübergehende Störungen eine Art epigenetisches Gedächtnis darstellen könnte 243 . Eine zusätzliche Komplexitätsebene ergibt sich aus der heterogenen Affinität und Aktivität von Chromatin-Modifikatoren gegenüber verschiedenen Chromatin-Modifikationen 246 und verschiedenen genomischen Loci 247,248 . Variation in der Häufigkeit von Chromatin-modifizierenden Metaboliten und scheinbarem Km Werte in verschiedenen Zellen und Geweben könnten daher zu einer Heterogenität der Empfindlichkeit epigenetischer Markierungen gegenüber metabolischen Veränderungen in verschiedenen Kontexten führen.

Es gibt mehrere zusätzliche Mechanismen, die eine effiziente und präzise Regulation von enzymkatalysierten Chromatin-Modifikationen durch metabolische Aktivität ermöglichen. Stoffwechselenzyme, die an der Synthese von Chromatin-modifizierenden Metaboliten wie Acetyl-CoA und beteiligt sind S-Adenosylmethionin (SAM) kann sich im Zellkern lokalisieren und mit Nukleosomen und Chromatin-modifizierenden Enzymen interagieren, um effizient Metaboliten an spezifischen Genomorten zu produzieren 26� . Der Gehalt an Chromatin-modifizierenden Metaboliten, wie SAM, wird durch mehrere Mechanismen kontrolliert, darunter sowohl Umwelteinflüsse wie Nährstoffverfügbarkeit als auch intrazelluläre Methylgruppensenken [G] die SAM 33� verbrauchen. Methylgruppensenken werden durch Enzyme vermittelt, die SAM metabolisieren, wodurch sie Methylgruppen von Enzymen wie Histon-Methyltransferasen ablenken und so deren Aktivität beeinträchtigen. Diese Mechanismen bieten Möglichkeiten zur Kontrolle der Metabolitenspiegel und somit für Chromatin, um den intrazellulären Stoffwechselstatus zu erfassen.

Epigenetische Modifikationen beeinflussen Transkriptionsprogramme durch verschiedene Mechanismen (Kasten 2). Alle diese Ergebnisse können potenziell durch die metabolische Regulation des Epigenoms beeinflusst werden. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass Chromatinkompartimente mit unterschiedlicher Transkriptionsaktivität durch Flüssigphasentrennung in membranlose Organellen segregieren können [G] als Reaktion auf Chromatinmodifikationen, Etablierung unterschiedlicher Chromatindomänen mit unterschiedlichen Regulationsmustern. Transkriptionell inaktives Heterochromatin kann phasengetrennte Flüssigkeitströpfchen bilden, indem es mit dem Heterochromatin-Protein 1 (HP1) interagiert, das die Histon-Modifikation H3K9me erkennt und daran bindet, wodurch Chromatin stabil in diesen Tröpfchen kondensieren kann 36� . Andererseits können aktive Chromatinregionen, wie solche, die Histonacetylierung enthalten, Enhancer [G] und Superverstärker [G] , sind auch in der Lage, sich durch Interaktion mit Bindungsproteinen wie der Bromodomäne . phasenzutrennen [G] -haltige Proteine ​​39� . Es wurde auch gefunden, dass ähnliche Effekte, die die Phasentrennung fördern, durch die Wechselwirkung zwischen n 6-Methyladenosin (m 6 A) in mRNA und die m 6 A-bindenden YTHDF-Proteine ​​42 . Obwohl es eine offene Frage ist, ob die Chromatin-Phasentrennung durch den Metabolismus reguliert wird, legen diese Ergebnisse nahe, dass die Fähigkeit von Chromatin zur Phasentrennung innerhalb von Zellen durch epigenetische Modifikationen, die von Metaboliten abgeleitet sind, reguliert werden und empfindlich auf den Zellmetabolismus reagieren könnten. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Phasentrennung anderer Biomoleküle Moleküle in einer bestimmten Phase konzentriert, um biochemische Signalprozesse zu aktivieren 43 . Ob die Chromatin-Phasentrennung auch zur Lokalisierung von Metaboliten und zur Aktivierung oder Hemmung von Chromatin-modifizierenden Reaktionen in einer bestimmten Phase führt, bleibt unbekannt, dient jedoch möglicherweise als zusätzlicher Mechanismus zur präzisen Kontrolle lokaler Metaboliten-Spiegel und Chromatin-Modifikationen.

Kasten 2:

Einflüsse epigenetischer Modifikationen auf Chromatinstruktur und Genexpression

Die frühesten Hinweise auf die funktionellen Konsequenzen bestimmter epigenetischer Modifikationen sind ihre lokusspezifische Anreicherung und Assoziation mit Genexpressionsniveaus und Genregulation. Obwohl dies keine schlüssige Kausalität impliziert, wurden diese Ergebnisse verwendet, um die Existenz eines ‘Histon-Codes’ zu theoretisieren, der postuliert, dass das Vorhandensein und die Kombination spezifischer DNA- und Histon-Modifikationen mit der Regulation von Transkriptionsprogrammen und Genexpressionsereignissen in Verbindung stehen 249 . Studien der letzten Jahrzehnte haben zwei Hauptwege für epigenetische Modifikationen zur Regulierung der Genexpression aufgezeigt: durch Veränderung der lokalen Chromatinstruktur oder durch Beeinflussung der Rekrutierung von Nicht-Histon-Proteineffektoren an Chromatin 250 . Chromatin kann aufgrund ihrer strukturellen und biochemischen Eigenschaften grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: kondensiertes, transkriptionell stummgeschaltetes Heterochromatin und dekondensiertes, aktiv transkribiertes Euchromatin. Die Bildung von Heterochromatin und Euchromatin hängt von der Existenz epigenetischer Modifikationen ab. Die Histonacetylierung, typischerweise angereichert mit Euchromatin, ist in der Lage, die positive Ladung des modifizierten Lysinrests zu neutralisieren, wodurch die Interaktion zwischen Histon und DNA unterbrochen wird und eine offene Chromatinstruktur entsteht, die die aktive Transkription erleichtert. Heterochromatin ist typischerweise angereichert mit der Trimethylierung von Histon 3 Lysin 9 (H3K9me3), das von Heterochromatinprotein 1 (HP1) gebunden wird, das die Verdichtung und Ausbreitung von Heterochromatin 251 fördert und die Flüssigphasentrennung durch Bildung von Oligomeren auslöst 38 .

Die Chromatin-Bindungsaffinitäten einer Vielzahl von Proteinen, darunter Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Remodeler und Komponenten der Transkriptionsmaschinerie, können durch diese Modifikationen moduliert werden. Dies wird am besten durch das Vorhandensein von Chromatin-bindenden ‘reader’-Modulen in diesen Proteinen demonstriert, wie die Chromodomänen und PHD-Finger, die methylierte Histone erkennen und binden, sowie die Bromodomänen und YEATS-Domänen, die an acetylierte Histone binden 252,253 . Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Assoziation zwischen H3K4me3 und aktiver Transkription weitgehend durch die Bindung von H3K4me3 durch den PHD-Finger der TAF3-Untereinheit von TFIID, einer Komponente des RNA-Polymerase-Prä-Initiationskomplexes 254, vermittelt wird. Es wurde kürzlich gezeigt, dass DNA-Methylierung die Bindungsaffinität der meisten Transkriptionsfaktoren verringert, während sie die Bindung von PHD-enthaltenden Proteinen durch hydrophobe Wechselwirkungen mit dem methylierten Cytosin fördert 255 . Leser einiger der aufkommenden, nicht-kanonischen Histon-Modifikationen, wie Succinylierung 116 und Crotonylierung 256,257 , wurden ebenfalls kürzlich identifiziert 258 .


Chromatin

Keimzellen in der Prophase der Meiose I von einem Him-8-Hermaphroditen. Die unsynapsierten X-Chromosomen sind für H3K9me2 angereichert (Pfeilspitzen) H3K9ac ist an Autosomen angereichert.

Meiotisches Silencing von ungepaartem Chromatin ist ein weit verbreitetes Phänomen, das bei vielen Wirbeltieren und wirbellosen Organismen beschrieben wurde. In C. elegans, wie bei anderen Spezies, akkumulieren ungepaarte Chromosomen ein hohes Maß an repressiven Chromatinmodifikationen, die auf synapsierten Chromosomen nicht beobachtet werden. Zum Beispiel akkumuliert das männliche X-Chromosom ein hohes Maß an Histon-H3-Lysin-9-Dimethylierung (H3K9me2), ebenso wie Hermaphrodit-Xs, die aufgrund von Mutationen nicht synapsen können (siehe Abbildung). Diese weithin konservierte Histonmodifikation ist mit dem Aufbau einer geschlossenen Chromatinstruktur und transkriptionaler Repression verbunden. Unser Ziel ist es, die Mechanismen zu verstehen, durch die ungepaartes Chromatin während der Meiose erkannt und zum Schweigen gebracht wird, und die chromosomalen Ziele der meiotischen Stummschaltung zu identifizieren.

Wir haben gezeigt, dass ein Zweig der C. elegansein kleines RNA-Netzwerk reguliert die meiotische H3K9me2-Akkumulation und -Verteilung. Zu den Komponenten dieses Weges gehören die RNA-gerichtete RNA-Polymerase EGO-1 und das Argonaute/Slicer-Protein CSR-1. MET-2 ist die Histon-Methyltransferase, die für die Anreicherung von H3K9me2 in der Keimbahn verantwortlich ist. Wir arbeiten daran, zu verstehen, wie die Aktivität des EGO-1/CSR-1-Small-RNA-Wegs die MET-2-Aktivität beeinflusst, um sie auf nicht-synapsierte Chromosomen zu lenken.

Keimzellen in der Prophase der Meiose I von Wildtyp- und Ego-1-Mutantenmännchen. H3K9me2 ist im Wildtyp (Pfeile) auf dem X-Chromosom angereichert, jedoch nicht beim männlichen Ego-1.

C. elegans bietet ein beispielloses System zur Untersuchung des Mechanismus der meiotischen Stilllegung im Kontext der Keimbahnentwicklung. Die C. elegans Keimbahn hat sich als ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung genetischer Regulations- und Entwicklungsfragen erwiesen. Umfangreiche genetische Werkzeuge verfügbar in C. elegans erlauben uns, die meiotische Stummschaltungsmaschinerie zu untersuchen und umfassendere Fragen zur Rolle der meiotischen Stummschaltung bei der Keimbahnentwicklung und -funktion zu beantworten. Ein Schwerpunkt unserer aktuellen Arbeit besteht darin, zusätzliche Faktoren zu identifizieren, die zusammen mit MET-2 und/oder dem EGO-1/CSR-1-Signalweg wirken, um die H3K9me2-Akkumulation zu regulieren. Ein weiterer Schwerpunkt ist die Identifizierung der Stellen, an denen H3K9me2-Modifikationen auf ungepaarten Chromosomen abgelagert werden. Durch das Verständnis des Mechanismus und der Ziele der H3K9me2-Akkumulation werden wir in der Lage sein, die Auswirkungen dieses Prozesses auf die Entwicklung zu untersuchen. Wir erwarten, dass unsere Ergebnisse die Untersuchung des meiotischen Schweigens bei komplexeren Tieren, einschließlich Säugetieren, erleichtern.


PERSPEKTIVEN UND FAZIT

Unsere 3D-Kryo-EM-Strukturen mit einer Auflösung von 11 haben die grundlegenden Strukturmerkmale der schwer fassbaren 30-nm-Chromatinfaser und eine solide Grundlage für das Verständnis des Grundprinzips der Chromatinverdichtung bereitgestellt, während höher aufgelöste Strukturen der Chromatinfaser benötigt werden, um vieles aufzudecken weitere strukturelle Details für die Nukleosom-Nukleosom-, Nukleosom-H1- und H1-H1-Wechselwirkungen in Chromatinfasern. Darüber hinaus implizieren unsere Kryo-EM-Strukturen eindeutig das Vorhandensein von drei wichtigen Interaktionsgrenzflächen in der 30-nm-Faser, wobei noch unklar bleibt, wie diese Grenzflächen durch verschiedene Chromatinfaktoren reguliert werden. Hinsichtlich der Variation von NRLs in vivo werden auch rekonstituierte Chromatinfasern mit einer Kombination verschiedener NRLs in Zukunft gute Kandidaten für Einzelmolekül- und Kryo-EM-Studien sein. Diese weiteren Studien werden nicht nur unser Verständnis der Vielfalt von Chromatinstrukturen in vivo verbessern, sondern auch eine strukturelle Grundlage dafür liefern, wie verschiedene Kombinationen von DNA-Sequenzen, NRLs, Histonvarianten, Chromatinmodifikationen und Chromatinarchitekturproteinen koordiniert werden können, um die biologische Funktion der genomischen DNA im Zellkern.

Ob die strukturellen Ergebnisse aus den in vitro-Studien die tatsächliche Struktur von Chromatinfasern in situ wiedergeben können, ist noch rätselhaft. Daher muss die 3D-Organisation von Chromatinfasern in den intakten Kernen mit neu entwickelten Techniken weiter untersucht werden. In vitro rekonstituierte gut charakterisierte Chromatinfasern, einschließlich verdichteter 30-nm-Fasern und offener nukleosomaler Arrays, wären perfekte strukturelle Referenzen für die Analyse der 3D-Organisation von Chromatinfasern in situ in diesen Studien. Die Kombination von Kryo-EM mit superauflösenden Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren wurde kürzlich entwickelt, um die Ultrastruktur kryokonservierter Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren (Chang et al. 2014 Liu et al. 2015). Die Kombination von genomischen Ansätzen (wie micro-C und RICC-seq) und CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat)-basierten Bildgebungstechniken kann es uns ermöglichen, die Ultrastruktur und 3D-Organisation von Chromatinfasern in definierten genomischen Regionen im intakten zu untersuchen Kerne. Zweifellos können durch die Anwendung dieser fortschrittlichen Bildgebungstechniken in Zukunft mehr strukturelle Details für die 3D-Organisation von Chromatinfasern in situ erhalten werden.


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Aktuelle Themen der Entwicklungsbiologie. vol. 56 2003. p. 55-83 (Aktuelle Themen in der Entwicklungsbiologie Bd. 56).

Forschungsergebnis : Kapitel in Buch/Bericht/Konferenzbericht › Kapitel

T1 - Regulation der Chromatinstruktur und Genaktivität durch Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen

N2 – Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1) ist ein reichlich vorhandenes nukleäres Protein, das eine wichtige Rolle bei der DNA-Reparatur und der Reaktion auf Infektionen spielt. Hier fassen wir aktuelle Beweise zusammen, dass PARP1 und verwandte Proteine ​​während der normalen Entwicklung auch entscheidende Funktionen erfüllen, die Gene regulieren. Genetische Studien an Säugetieren und Drosophila haben gezeigt, dass PARPs schnelle Reaktionen auf Umweltreize, einschließlich Infektionen, Stress, Hormone und Wachstumssignale, vermitteln. Darüber hinaus können diese Polymerasen grundlegende Prozesse kontrollieren, die Chromatin in den vielen Zelltypen eines sich entwickelnden Embryos unterschiedlich formen und umbauen. Wir diskutieren einen einheitlichen Mechanismus der PARP-Wirkung während der DNA-Reparatur, Gentranskription und Chromatinmodulation.

AB – Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1 (PARP1) ist ein reichlich vorhandenes nukleäres Protein, das eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA und der Reaktion auf Infektionen spielt. Hier fassen wir aktuelle Beweise zusammen, dass PARP1 und verwandte Proteine ​​während der normalen Entwicklung auch entscheidende Funktionen erfüllen, die Gene regulieren. Genetische Studien an Säugetieren und Drosophila haben gezeigt, dass PARPs schnelle Reaktionen auf Umweltreize, einschließlich Infektionen, Stress, Hormone und Wachstumssignale, vermitteln. Darüber hinaus können diese Polymerasen grundlegende Prozesse kontrollieren, die Chromatin in den vielen Zelltypen eines sich entwickelnden Embryos unterschiedlich formen und umbauen. Wir diskutieren einen einheitlichen Mechanismus der PARP-Wirkung während der DNA-Reparatur, Gentranskription und Chromatinmodulation.


RNA-gerichtete DNA-Methylierung

Steven E. Jacobsen ist Prüfarzt am Howard Hughes Medical Institute und Professor für Molekulare Zell- und Entwicklungsbiologie an der University of California, Los Angeles, USA. Seine Forschung konzentriert sich auf Mechanismen der epigenetischen Vererbung in Pflanzen, einschließlich der Genetik und Genomik der DNA-Methylierung, der Histon-Methylierung sowie kleiner RNA-gesteuerter Silencing-Signalwege. Mit über 130 epigenetisch relevanten Publikationen leistete er grundlegende Beiträge zu diesem aufstrebenden Forschungsgebiet.

Jacobsen hielt einen Vortrag über den RNA-abhängigen DNA-Methylierungsweg (RdDM), der Arabidopsis thaliana verwendet, um die Cytosin-DNA-Methylierung aufrechtzuerhalten und wahrscheinlich zu etablieren, um Gene und Transposons zum Schweigen zu bringen. Während die gut untersuchten DNA-Methyltransferasen MET1, CMT3 und DRM2 dafür verantwortlich sind, vorher festgelegte Methylierungsmuster über klassische Mechanismen aufrechtzuerhalten, ist anscheinend DRM2 – ein Homolog von Säugetier-Dnmt3 – das einzige, das RdDM vermittelt. Die DRM2-Rekrutierung an die jeweilige DNA-Stelle wird dabei durch ein komplexes Zusammenspiel von Polymerase IV (PolIV), Polymerase V (PolV), der von ihnen produzierten RNA-Spezies und zahlreichen weiteren Faktoren vermittelt.

Da die PolIV- und PolV-DNA-Bindung keine signifikante Sequenzspezifität zeigt, zeigen epigenetische Markierungen höchstwahrscheinlich ihre Erkennungsstellen. Es wurde gezeigt, dass PolIV mit SHH1 interagiert, das an H3K9me bindet, eine Silencing-Marke, die häufig an RdDM-Stellen zu finden ist, während PolVs indirekte Interaktion mit SUVH2 auf methylierte DNA abzielt. Durch die Fusion von SUVH2 mit einer Zinkfingerdomäne, die auf ein unmethyliertes Epiallel des Homöodomänen-Transkriptionsfaktors FWA gerichtet ist, zeigte Jacobsens Labor, dass SUVH2 ausreicht, um PolV zu rekrutieren, DNA-Methylierung zu etablieren und schließlich Gen-Silencing zu verursachen.

Mechanistisch produzieren PolV und PolV, die mit RdDM-Stellen assoziiert sind, 24 Nukleotid-siRNAs bzw. lncRNAs. Diese RNAs interagieren mit einer Reihe weiterer Faktoren wie AGO4, um ein sehr komplexes Netzwerk aufzubauen, das letztendlich zur Rekrutierung von DRM2 führt, um bestehende Methylierungsmuster zu erhalten. Interessanterweise besteht eine enge Abhängigkeit zwischen solchen Methylierungsmarkierungen und anderen epigenetischen Modifikationen wie beispielsweise der Histon-Methylierung, die robuste Verstärkungsschleifen erzeugt. Dennoch bleibt unklar, wie die erstmalige Etablierung von RdDM abläuft.


Abstrakt

Bahnbrechende Transkriptionsfaktoren spielen eine Hauptrolle beim Aufbau der Kompetenz für die Genexpression und bei der Initiierung der zellulären Programmierung und Reprogrammierung, und ihre Fehlregulation hat schwerwiegende Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, wie zum Beispiel die Förderung der Tumorentstehung. Obwohl in jedem Zelltyp mehr als 200 Transkriptionsfaktoren exprimiert werden, sind nur wenige Transkriptionsfaktoren notwendig, um dramatische Veränderungen des Zellschicksals in der Embryonalentwicklung und der Zellschicksalskonversion hervorzurufen. Unter diesen wichtigen Transkriptionsfaktoren hat eine Untergruppe namens „Pioneer-Transkriptionsfaktoren“ eine bemerkenswerte Fähigkeit, frühzeitig in der Entwicklung auf nukleosomale DNA oder geschlossenes Chromatin abzuzielen, was oft zur lokalen Öffnung des Chromatins führt, wodurch die Kompetenz für die Genexpression aufgebaut wird. Obwohl weitere wichtige Transkriptionsfaktoren als Pionier-Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden, werden die molekularen Mechanismen hinter ihren besonderen Eigenschaften erst am Anfang aufgeklärt. Das Verständnis der bahnbrechenden Mechanismen wird unsere Fähigkeit verbessern, das Zellschicksal für Forschungs- und Therapiezwecke nach Belieben präzise zu steuern.

  • Biologische Mechanismen > Zellschicksale
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8.4: Gene und Chromatin in Eukaryoten

  • Beigetragen von Gerald Bergtrom
  • Emeritierter Professor (Biowissenschaften) an der University of Wisconsin-Milwaukee

Chromosomen und Chromatin sind eine einzigartige eukaryotische Assoziation von DNA mit mehr oder weniger Protein. Bakterielle DNA (und prokaryontische DNA im Allgemeinen) ist relativ „unbedeckt&rsquo– nicht sichtbar mit Protein assoziiert.

Die elektronenmikroskopische Aufnahme von an Zwischenphase Zelle (unten) zeigt, dass das Chromatin selbst in verschiedenen Kondensationszuständen existieren kann.

Chromatin wird während der Mitose maximal kondensiert und bildet Chromosomen. Während der Interphase existiert Chromatin in mehr oder weniger kondensierter Form, genannt Heterochromatinund Euchromatinbzw. Der Übergang zwischen diesen Chromatinformen beinhaltet Veränderungen in den Mengen und Arten von Proteinen, die an das Chromatin gebunden sind, und kann während der Genregulation auftreten, d. h. wenn Gene an- oder ausgeschaltet werden. Aktive Gene befinden sich in der Regel im stärker dispergierten Euchromatin, so dass Replikations- und Transkriptionsenzyme leichteren Zugang zur DNA haben. Gene, die in der Transkription inaktiv sind, sind heterochromatisch und werden durch zusätzliche Chromatinproteine ​​verdeckt, die in Heterochromatin vorhanden sind. Wir werden uns einige Experimente ansehen, die dies in einem späteren Kapitel demonstrieren.

Wir können drei Ebenen der Chromatinorganisation im Allgemeinen definieren:

1. DNA, die um Histonproteine ​​gewickelt ist, bildet sich Nukleosomen in einer "Beads on a string"-Struktur.

2. Mehrere Nukleosomen wickeln sich (kondensieren) und bilden 30 nm Faser-(Solenoid-)Strukturen.

3. Eine Packung höherer Ordnung der 30-nm-Faser führt zur Bildung von Metaphase-Chromosomen, die bei Mitose und Meiose beobachtet werden.

Die Niveaus der Chromatinstruktur wurden teilweise durch selektive Isolierung und Extraktion von Interphasenzellchromatin, gefolgt von selektiver chemischer Extraktion von Chromatinkomponenten, bestimmt. Die Schritte sind:

· Kerne werden zuerst aus den Zellen isoliert.

· Die Kernhülle riss sanft auf, um die Chromatinstruktur nicht physikalisch zu zerstören.

· das Chromatin kann durch eine von mehreren verschiedenen chemischen Behandlungen (hoher Salzgehalt, Salzarm, Säure. ) schonend extrahiert werden.

Die Stufen der Chromatinstruktur sind unten dargestellt.

Die Salzextraktion trennt die meisten Proteine ​​vom Chromatin. Wenn ein salzarmer Extrakt zentrifugiert und das Pellet resuspendiert wird, sieht das restliche Chromatin aus wie Perlen an einer Schnur. DNA-verpackt Nukleosomen sind die Perlen, die ihrerseits durch gleichförmige Längen metaphorischer DNA &ldquostring&rsquo ( # 1 in der Abbildung oben). Ein Chromatin-Extrakt mit hohem Salzgehalt erscheint als eine Spirale von Nukleosomen, oder 30 nm Magnetfaser (# 2 Oben). Andere Extraktionsprotokolle zeigten andere Aspekte der Chromatinstruktur, die in #s . gezeigt werden 3 und 4 Oben. Chromosomen, die in der Metaphase der Mitose zu sehen sind, sind die "höchste" und am stärksten kondensierte Form von Chromatin.

Das 10 nm-Filament des Nukleosoms &lsquobeads-on-a-string&rsquo, das nach einer Extraktion mit niedrigem Salzgehalt zurückbleibt, kann in einem Elektronenmikroskop wie unten gezeigt gesehen werden.

Als diese Nukleosomenketten mit dem Enzym verdaut wurden Desoxyribonuklease (DNAse), wurde die DNA zwischen den &lsquobeads&rsquo abgebaut, so dass nach kurzer Verdauungszeit verkürzte 10-nm-Filamente zurückblieben oder nach längerem Verdau nur einzelne Beads der Beads (unten).

Roger Kornberg (Sohn des Nobelpreisträgers Arthur Kornberg, der das erste DNA-Polymerase-Replikationsenzym entdeckte) war noch als Postdoc an der Entdeckung und Charakterisierung von Nukleosomen beteiligt! Die Elektrophorese von DNA, die aus diesen Verdauungen extrahiert wurde, ergab Nukleosomen getrennt durch einen &ldquolinker&rdquo-DNA-Abschnitt von etwa 80 Basenpaaren. Die aus den Nukleosomen extrahierte DNA war etwa 147 Basenpaare lang. Dies ist die DNA, die um die Proteine ​​des Nukleosoms gewickelt wurde.

Nachdem alle Proteine ​​von der nukleosomalen DNA abgetrennt worden waren, wurden fünf Proteine ​​identifiziert (siehe unten).

Histone sind basische Proteine ​​mit vielen Lysin und Arginin Aminosäuren. Durch ihre positiv geladenen Seitenketten binden diese Aminosäuren die sauren, negativ geladenen Phosphodiester Rückgrat von Doppelhelix-DNA. Die DNA wickelt sich um ein Oktamer von Histonen (je 2 von 4 der Histonproteine), um die Nukleosom. Etwa ein Gramm Histone ist mit jedem Gramm DNA verbunden. Nach einer Chromatin-Extraktion mit hohem Salzgehalt ist die im Elektronenmikroskop sichtbare Struktur das 30-nm-Solenoid, die in der Abbildung unten modellierte Nukleosomenspule.

As shown above, simply increasing the salt concentration of an already extracted nucleosome preparation will cause the &lsquonecklace&rsquo to fold into the 30nm solenoid structure.

As you might guess, an acidic extraction of chromatin should selectively remove the basic histone proteins, leaving behind an association of DNA with non-histone proteins. This proved to be the case. An electron micrograph of the chromatin remnant after an acid extraction of metaphase chromosomes is shown on the next page.

DNA freed of the regularly spaced histone-based nucleosomes, loops out, away from the long axis of the chromatin. Dark material along this axis is a protein scaffolding that makes up what&rsquos left after histone extraction. Much of this protein is topoisomerase, an enzyme that prevents DNA from breaking apart under the strain of replication.


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