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Was bedeutet der Begriff „modifizierte Restposition“ bei der Phosphorylierung?

Was bedeutet der Begriff „modifizierte Restposition“ bei der Phosphorylierung?


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Bedeutet es die Position der Aminosäure in der Proteinsequenz oder etwas anderes?

Zum Beispiel stieß ich auf den Ausdruck "S 368 Phosphoryation", wobei S der modifizierte Rest und 368 die modifizierte Restposition ist. Was soll das alles heißen?


Du hast recht, die368steht für die Position der Aminosäure in der Sequenz des Proteins - dieses spezielle Serin ist der 368. Rest im Protein, gezählt vom aminoterminalen Ende.


Posttranslationale Modifikation

Posttranslationale Modifikation (PTM) bezeichnet die kovalente und im Allgemeinen enzymatische Modifikation von Proteinen nach der Proteinbiosynthese. Proteine ​​werden durch Ribosomen synthetisiert, die mRNA in Polypeptidketten übersetzen, die dann PTM durchlaufen können, um das reife Proteinprodukt zu bilden. PTMs sind wichtige Komponenten in der Zellsignalisierung, beispielsweise bei der Umwandlung von Prohormonen in Hormone.

Posttranslationale Modifikationen können an den Aminosäureseitenketten oder an den C- oder N-Termini des Proteins auftreten. [1] Sie können das chemische Repertoire der 20 Standardaminosäuren erweitern, indem sie eine bestehende funktionelle Gruppe modifizieren oder eine neue wie Phosphat einführen. Phosphorylierung ist ein sehr verbreiteter Mechanismus zur Regulierung der Aktivität von Enzymen und ist die häufigste posttranslationale Modifikation. [2] Viele eukaryontische und prokaryontische Proteine ​​haben auch Kohlenhydratmoleküle, die in einem als Glykosylierung bezeichneten Prozess an sie gebunden sind, was die Proteinfaltung fördern und die Stabilität verbessern kann sowie regulatorische Funktionen erfüllen kann. Die Anlagerung von Lipidmolekülen, bekannt als Lipidierung, zielt oft auf ein Protein oder einen Teil eines Proteins ab, das an der Zellmembran befestigt ist.

Andere Formen der posttranslationalen Modifikation bestehen in der Spaltung von Peptidbindungen, wie bei der Verarbeitung eines Propeptids zu einer reifen Form oder dem Entfernen des Initiator-Methioninrests. Die Bildung von Disulfidbrücken aus Cysteinresten kann auch als posttranslationale Modifikation bezeichnet werden. [3] Zum Beispiel wird das Peptidhormon Insulin zweimal geschnitten, nachdem Disulfidbrücken gebildet wurden, und ein Propeptid wird aus der Mitte der Kette entfernt. Das resultierende Protein besteht aus zwei Polypeptidketten, die durch Disulfidbrücken verbunden sind.

Einige Arten posttranslationaler Modifikation sind Folgen von oxidativem Stress. Carbonylierung ist ein Beispiel, das auf das modifizierte Protein zum Abbau abzielt und zur Bildung von Proteinaggregaten führen kann. [4] [5] Spezifische Aminosäuremodifikationen können als Biomarker verwendet werden, die auf oxidative Schäden hinweisen. [6]

Stellen, die häufig posttranslational modifiziert werden, sind solche mit einer funktionellen Gruppe, die bei der Reaktion als Nukleophil dienen kann: die Hydroxylgruppen von Serin, Threonin und Tyrosin die Aminformen von Lysin, Arginin und Histidin das Thiolatanion von Cystein die Carboxylate von Aspartat und Glutamat und die N- und C-Termini. Obwohl das Amid von Asparagin ein schwaches Nukleophil ist, kann es außerdem als Bindungspunkt für Glykane dienen. Seltenere Modifikationen können an oxidierten Methioninen und an einigen Methylenen in Seitenketten auftreten. [7]

Die posttranslationale Modifikation von Proteinen kann experimentell durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, einschließlich Massenspektrometrie, Eastern-Blotting und Western-Blotting. Weitere Methoden werden in den Abschnitten zu externen Links bereitgestellt.


Die Phosphorylierung von Calcineurin B-ähnlichen (CBL) Calciumsensorproteinen durch ihre CBL-wechselwirkenden Proteinkinasen (CIPKs) ist für die volle Aktivität der CBL-CIPK-Komplexe gegenüber ihren Zielproteinen erforderlich*

Calcineurin B-ähnliche Proteine ​​(CBLs) stellen eine Familie von Calciumsensorproteinen dar, die mit einer Gruppe von Serin/Threonin-Kinasen interagieren, die als CBL-interagierende Proteinkinasen (CIPKs) bezeichnet werden. CBL-CIPK-Komplexe sind entscheidend an der Weiterleitung von Pflanzenreaktionen auf viele Umweltsignale und an der Regulierung von Ionenflüssen beteiligt. Die biochemische Charakterisierung von CBL-CIPK-Komplexen wurde jedoch bisher durch geringe Aktivitäten rekombinanter CIPKs behindert. Hier berichten wir über einen effizienten Weizenkeimextrakt auf Basis in vitro Transkriptions-/Translationsprotokoll, das aktive Volllängen-Wildtyp-CIPK-Proteine ​​liefert. Wir identifizierten einen konservierten Serinrest innerhalb des C-Terminus von CBLs als durch ihre interagierenden CIPKs phosphoryliert. Bemerkenswerterweise haben unsere Studien gezeigt, dass die CIPK-abhängige CBL-Phosphorylierung strikt von der CBL-CIPK-Interaktion über die CIPK-NAF-Domäne abhängt. Der Phosphorylierungsstatus von CBLs scheint die Stabilität, Lokalisierung oder CIPK-Interaktion dieser Calciumsensorproteine ​​im Allgemeinen nicht zu beeinflussen. Die richtige Phosphorylierung von CBL1 ist jedoch unbedingt erforderlich für die in vivo Aktivierung des AKT1 K + -Kanals durch CBL1-CIPK23- und CBL9-CIPK23-Komplexe in Oozyten. Darüber hinaus zeigen wir, dass wir durch die Kombination von CBL1, CIPK23 und AKT1 die CBL-abhängige Verstärkung der Phosphorylierung von Zielproteinen durch CIPKs genau rekonstituieren können in vitro. Darüber hinaus berichten wir, dass die Phosphorylierung von CBL1 durch CIPK23 auch für die CBL1-abhängige Steigerung der CIPK23-Aktivität gegenüber seinem Substrat erforderlich ist. Zusammen identifizieren diese Daten einen neuen allgemeinen Regulationsmechanismus von CBL-CIPK-Komplexen, indem die CBL-Phosphorylierung an ihrem flexiblen C-Terminus wahrscheinlich Konformationsänderungen hervorruft, die die Spezifität und Aktivität von CBL-CIPK-Komplexen gegenüber ihren Zielproteinen erhöhen.

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Forschergruppe 964 (an D. B., M. H. und J. K.) gefördert.

Derzeitige Adresse: Abteilung für biologische Wissenschaften, Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie und Zentrum für molekulare Genetik, University of California San Diego, 9500 Gilman Dr., 0116, La Jolla, CA 92093-0116.

M. Rehers, Hashimoto und J. Kudla, unveröffentlichte Ergebnisse.


Zusammenfassung des Autors

Die Parkinson-Krankheit ist durch den Verlust dopaminerger Neuronen im Mittelhirn und das Vorhandensein von αSyn-Proteineinschlüssen gekennzeichnet. Humanes αSyn ahmt die Krankheitspathologie in Hefe nach, was zu Zytotoxizität und Aggregatbildung führt. αSyn ist an Serin S129 reichlich phosphoryliert und besitzt vier Tyrosine (Y39, Y125, Y133 und Y136), die posttranslational durch Nitrierung oder Phosphorylierung modifiziert werden können. Die Konsequenz jeder dieser möglichen Modifikationen ist noch unklar. Nitrierung als Folge von oxidativem Stress ist ein Kennzeichen für neurodegenerative Erkrankungen. Hier befassten wir uns mit dem molekularen Mechanismus, wie posttranslationale Modifikationen von Tyrosin die αSyn-Zytotoxizität beeinflussen. Tyrosinnitrierung kann zur αSyn-Toxizität beitragen oder Teil eines zellulären Rettungsweges sein, wenn Di-Tyrosin-vernetzte Dimere gebildet werden. Der Y133-Rest, der entweder phosphoryliert oder nitriert sein kann, bestimmt, ob S129 schützend phosphoryliert ist und αSyn-Einschlüsse beseitigt werden. Dieses Wechselspiel mit der S129-Phosphorylierung zeigt eine doppelte Rolle für C-terminale Tyrosinreste. Hefe-Flavohämoglobin Yhb1 und sein menschliches Gegenstück Neuroglobin NGB schützen Zellen vor Zytotoxizität und Aggregatbildung. Diese neuen Erkenntnisse über die molekularen Wege, die für die αSyn-Zytotoxizität verantwortlich sind, weisen auf NGB als potenzielles Ziel für eine therapeutische Intervention bei Parkinson hin.

Zitat: Kleinknecht A, Popova B, Lázaro DF, Pinho R, Valerius O, Outeiro TF, et al. (2016)C-terminale Tyrosinrest-Modifikationen modulieren die schützende Phosphorylierung von Serin 129 von α-Synuclein in einem Hefemodell der Parkinson-Krankheit. PLoS Genet 12(6): e1006098. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006098

Editor: Bingwei Lu, Stanford University School of Medicine, VEREINIGTE STAATEN

Empfangen: 22. Dezember 2015 Akzeptiert: 10. Mai 2016 Veröffentlicht: 24. Juni 2016

Urheberrechte ©: © 2016 Kleinknecht et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind im Papier enthalten.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde vom DFG-Exzellenzcluster und dem DFG-Forschungszentrum Nanoskalige Mikroskopie und Molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB) gefördert. RP wird durch ein PhD-Stipendium des FCT Portugal (SFRH/BD/80884/2011) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


Diskussion

Die Bindung zwischen intrinsisch ungeordneten und geordneten Proteinen ist ein wichtiges Gebiet, und Molekulardynamiksimulationen sind eine der am besten geeigneten Methoden, um sie zu untersuchen, insbesondere um mechanistische Fragen zu beantworten. Wir haben Konformationsänderungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins, AANAT, vor und nach seiner Phosphorylierung und während der Bindung an 14-3-3 . beschriebenζ, ein geordnetes Gerüstprotein. Aus Gründen der statistischen Robustheit führen wir drei unabhängige Experimente durch, die äquivalente Ergebnisse und Schlussfolgerungen liefern (jedes umfasst drei 110-ns-Simulationen mit und ohne Thr31-Phosphorylierung, was eine Gesamtsimulationszeit von mehr als 300 ns × 2 ergibt). Vollständige Details und Diagramme aller in jedem Simulationslauf gemessenen Größen sind im Abschnitt Ergänzende Informationen enthalten. In einer früheren Arbeit haben wir theoretisch das Vorhandensein eines metastabilen pseudo-nativen Komplexes zwischen diesen beiden Proteinen vorgeschlagen und die Rolle von Ankerresten in diesem Prozess beschrieben. Glu87 trägt zum Bindungsprozess zwischen AANAT und 14-3-3 . beiζ über spezifische intermolekulare Kontakte, und ein Affinitätsverlust wird beobachtet, wenn dieser spezifische Rest zu Ala mutiert wird (Abb. 1). Unser Stopped-Flow-Experiment zeigte jedoch keine Hinweise auf weniger Affinitätskomplexe während der Bindung von Glu87Ala-Mutante AANAT und 14-3-3ζ, daher blieb die Dynamik dieses Prozesses zum endgültigen stabilen Komplex ungeklärt.

Es wurden einige Artikel veröffentlicht, die die Bindungsmechanismen unter Verwendung des Modellsystems KID-Domäne des Transkriptionsfaktors CREB durch freie Molekulardynamik beschreiben. Derzeit sind jedoch für die Mehrheit der Forscher molekulardynamische Gleichgewichtssimulationen der gekoppelten Faltung und Bindung mit allen Atomen unerreichbar. Es ist daher klar, dass die beste Möglichkeit zum Erhalten von Informationen mit atomarer Auflösung über gekoppelte Faltung und Bindung auf der Verwendung verbesserter Abtastmethoden 15 beruht, wie zum Beispiel harmonisch beschränkte Potentiale. Die KID-Phosphorylierung induziert eine geringfügige Verschiebung der Gleichgewichtsverteilung gefalteter Regionen. Die Bindung von kinetisch gesperrten und eingeschränkten Regionen kann anderen vorübergehenden Wechselwirkungen Zeit geben, sich zu bilden, was möglicherweise die Anzahl produktiver Bindungsereignisse erhöht und somit die Affinität für den Bindungspartner erhöht. In ähnlicher Weise könnten kinetisch gesperrte Regionen, die an der molekularen Erkennung beteiligt sind, den Entbindungsprozess vereiteln. Dies würde zu einer Verschiebung des Bindungsgleichgewichts in Richtung des gebundenen Zustands führen 16,17 . Ein weiteres Beispiel ist die Phosphorylierung der KH1-Domäne von KSR, die sich entfaltet und eine Stelle für 14-3-3 . bildetζ verbindlich 18. KH1-Domäne interagiert mit 14-3-3ζ erst wenn es phosphoryliert und entfaltet ist. Die AKT-Phosphorylierung von KH1 ist für seine Entfaltung verantwortlich, die die Bindungsstelle für 14-3-3 . bildetζ. Strukturelle Umlagerung nach Phosphorylierung ist ein üblicher Regulationsmechanismus 19 , aber nach unserem besten Wissen gibt es keine berichteten Beispiele für eine vollständige Protein-Protein-Bindungsanalyse.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorylierung an 14-3-3ζ Zielproteine ​​haben weitreichende Auswirkungen auf den Bindungsprozess und nicht nur auf die Stabilisierung der endgültigen Komplexe. AANAT hat zwei kanonische Stellen, eine am N-Terminus und die andere am C-Terminus des Proteins. Die komplexe Kristallstruktur kann jedoch nur gelöst werden, wenn die zweite C-terminale Bindungsstelle (als niedrigere Affinität betrachtet) entfernt wurde 46 . Hier haben wir die Elementareinheit (ein Monomer von 14-3-3ζ und C-terminal verkürztes AANAT), um mechanistisch zu analysieren, wie Phosphorylierung die Bindung zwischen AANAT und 14-3-3 . beeinflusstζ. Um die Rechenkosten zu reduzieren, haben wir ein in drei Regionen unterteiltes Protokoll mit einer Simulationszeit von insgesamt 110 ns angewendet. Aus Gründen der statistischen Robustheit führen wir drei unabhängige Simulationen durch, die identische Ergebnisse und Schlussfolgerungen liefern. In den ersten und letzten 10 ns haben wir ein harmonisches Potential angelegt, um die Bildung der pseudonativen bzw. nativen Komplexe zu induzieren. In Region II laufen wir 90 ns ungebremster Dynamik. Wir haben eindeutig beobachtet, dass die Phosphorylierung von Thr31 diesem Rest (und den umgebenden Aminosäuren) die Fähigkeit verleiht, mehr Konformationen nach einem Mechanismus namens „Fliegenwerfen“ zu erforschen 5 . Während dieses Vorgangs wird der Fangradius vergrößert und der Bindungsprozess verbessert. Wir berechneten den Einfangradius als den Gyrationsradius der interessierenden Reste (siehe Gleichung 2) und beobachteten einen Anstieg von 40% für Thr31 (siehe Fig. 7b). Überraschenderweise hat diese Phosphorylierung auch Auswirkungen auf 14-3-3ζ, hauptsächlich durch weitreichende Wechselwirkungen. Wir beobachteten, dass die wichtigste regulatorische Region auf 14-3-3 (α-Helix 9) wird auch von der Thr31-Phosphorylierung in AANAT beeinflusst, da die Bewegung dieser Region (α-Helix 9) ist ebenfalls erhöht (Fig. 7a). Diese verbesserten Bewegungen ermöglichen es dem Protein-Protein-System, am Ende unserer Simulationen einen kompakteren Endkomplex zu erreichen. Um dies zu messen, werden hier 3D-SASA-Karten als halbquantitative Schätzungen der freien Desolvatationsenergie bei der Proteinkomplexierung verwendet 20 . Für unsere beiden Bedingungen (AANAT und AANAT*) ist der letzte Komplex

3.5 Å in Bezug auf die komplexe Kristallstruktur, jedoch hat die endgültige Struktur in der AANAT-Situation viel mehr Lösungsmittel-exponierte Oberfläche als in der AANAT*-Struktur, was auf eine weniger stabile Konformation schließen lässt (siehe Abb. 7c,d).

Die anfängliche Assoziation zwischen Proteinen, die IDR enthalten, hängt oft stark von der Ionenstärke ab, was zeigt, dass spezifische oder unspezifische Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen die Assoziationsrate bestimmen 21 . Das elektrostatische Feld führt das Protein zu seinem Ziel und beschleunigt so die Bindungsrate. Die Proteinflexibilität erleichtert auch die Bindung über den Fliegenwurfmechanismus 22 . Unsere Ergebnisse stimmen stark mit dieser Interpretation überein. 14-3-3ζ ist ein Protein mit einer negativen Nettoladung 23 und einem positiven Hotspot, an dem die Phosphorylgruppe seiner Partner andockt, was zeigt, dass die Phosphorylierung von Thr31 an AANAT der Schlüssel für den Bindungsprozess ist.

Die aktuelle Vision der Proteinphosphorylierung hat eine Frage ohne offensichtliche Antwort: Wird die Phosphorylierung einzelner Reste durch ein Gerüstprotein vermittelt? und insbesondere, sind 14-3-3-Proteine ​​nur Leser der Modifikation? Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, hat die Phosphorylierung im weiten Sinne Auswirkungen sowohl auf das Partner- als auch auf das Reader-Protein. Wir schlagen vor, dass die Phosphorylierung vor der Protein-Protein-Bindung erfolgen muss und dass 14-3-3-Proteine ​​die Modifikation nur lesen und nicht daran teilnehmen.


Einführung

Mindestens zwei verschiedene Populationen sekretorischer Vesikel vermitteln die regulierte exozytotische Freisetzung von Neurotransmittern. Synaptische Vesikel (SVs) treten fast ausschließlich in Nervenenden auf, wo sie sich im synaptischen Spalt anhäufen (Calakos und Scheller 1996). Im Gegensatz dazu erscheinen große Vesikel mit dichtem Kern (LDCVs) überall in der Zelle und setzen Transmitter langsamer und als Reaktion auf andere Stimuli frei als SVs (De Camilli und Jahn 1990 Martin 1994). Obwohl allgemein davon ausgegangen wird, dass SVs klassische Transmitter enthalten, während LDCVs neuronale Peptide speichern, enthalten beide Arten regulierter sekretorischer Vesikel Monoamine, was auf das Potenzial für die Freisetzung eines einzelnen Transmitters durch zwei verschiedene Mechanismen hinweist (Thureson-Klein 1983 Bruns und Jahn 1995). Da klassische Transmitter, einschließlich Monoamine, im Zytoplasma synthetisiert werden, bestimmt die subzelluläre Lage der Transporter, die für ihre Verpackung in sekretorische Vesikel erforderlich sind, den Ort der vesikulären Speicherung und damit die Art der exozytotischen Freisetzung.

Sekretorische Vesikel weisen vier verschiedene Neurotransmitter-Transportaktivitäten auf, darunter eine für Monoamine, eine zweite für Acetylcholin (ACh), eine dritte für γ-Aminobuttersäure (GABA) und eine vierte für Glutamat (Liu und Edwards 1997b). Alle diese Aktivitäten hängen vom elektrochemischen H + -Gradienten über die Vesikelmembran ab und tauschen lumenale Protonen gegen zytoplasmatischen Transmitter aus (Schuldiner et al. 1995). Die pharmakologische Manipulation des vesikulären Transports weist auf die Bedeutung dieser Aktivitäten für das Verhalten hin. Das blutdrucksenkende Medikament Reserpin hemmt den vesikulären Monoamintransport und induziert ein depressionsähnliches Syndrom (Frise 1954). Außerdem induzieren Amphetamine Efflux aus vesikulären Monoaminspeichern (Sulzer et al. 1995) und können Psychosen verursachen. Somit haben Veränderungen der vesikulären Transportaktivität das Potenzial, das Verhalten zu beeinflussen, aber das Ausmaß, in dem sie reguliert werden, ist unbekannt geblieben.

Die molekulare Klonierung hat begonnen, die Proteine ​​zu identifizieren, die für den Transport von Neurotransmittern in sekretorische Vesikel verantwortlich sind. Eine Proteinfamilie umfasst zwei vesikuläre Monoamintransporter (VMATs) und den vesikulären Acetylcholintransporter (VAChT). VMAT1 wird hauptsächlich in peripheren, nicht-neuralen Geweben exprimiert und VMAT2 wird von zentralen Monoaminneuronen exprimiert (Varoqui und Erickson 1997, Liu und Edwards 1997b). In Übereinstimmung mit der beobachteten Freisetzung von Monoaminen sowohl aus SVs als auch aus LDCVs treten die VMATs bei mehreren Populationen sekretorischer Vesikel auf. Im Gehirn lokalisiert VMAT2 bevorzugt LDCVs, befindet sich aber auch auf SVs sowie auf tubulovesikulären Strukturen im Zellkörper und Dendriten zentraler Dopaminneuronen (Nirenberg et al. 1995, Nirenberg et al. 1996). In ähnlicher Weise residiert VMAT2 überwiegend auf LDCVs und nicht auf den synaptisch-ähnlichen Mikrovesikeln (SLMVs), die in PC12-Zellen vorhanden sind (Liu et al. 1994, Erickson et al. 1996). Im Gegensatz dazu lokalisiert VAChT hauptsächlich auf SVs im Gehirn (Gilmor et al. 1996 Weihe et al. 1996) und auf leichteren Membranen, einschließlich der SLMVs in PC12-Zellen (Liu und Edwards 1997a Varoqui und Erickson 1998). VAChT kommt jedoch auch in niedrigeren Konzentrationen auf LDCVs in PC12-Zellen (Liu und Edwards 1997a) und in Neuronen (Lundberg et al. 1981, Agoston und Whittaker 1989) vor. Somit lokalisieren zwei eng verwandte vesikuläre Neurotransmitter-Transporter verschiedene Populationen sekretorischer Vesikel, die sich in ihrer Freisetzungsart unterscheiden.

Um zu verstehen, wie sich VMAT2 und VAChT auf verschiedene sekretorische Vesikel lokalisieren, haben wir versucht, ihre Sortiersignale zu identifizieren. Als integrale Membranproteine ​​sind die Transporter vermutlich auf Signale in ihren zytoplasmatischen Domänen angewiesen, die mit einer zytosolischen Sortiermaschinerie interagieren. Wir haben zuvor festgestellt, dass Dileucin-Motive, die COOH-terminal zur Transmembrandomäne (TMD) 12 von VMAT2 und VAChT lokalisiert sind (siehe Fig. 1 A), die Internalisierung der Transporter von der Plasmamembran vermitteln (Tan et al. 1998). Dileucin-Motive, die an der Endozytose bestimmter anderer Proteine ​​beteiligt sind, erfordern die Anwesenheit von sauren Resten an den Positionen –4 und –5 relativ zu den beiden Leucinen (Pond et al. 1995 Dietrich et al. 1997) und die VMATs enthalten hochkonservierte Glutamate an beiden diese Positionen. Der Ersatz dieser Glutamate durch Alanin beeinträchtigt jedoch nicht die Internalisierung von VMAT2 (Tan et al. 1998). Da Dileucin-Motive den Transport an mehreren Stellen im sekretorischen Weg vermitteln, können diese Reste andere Ereignisse beeinflussen, die sich von der Endozytose unterscheiden. Obwohl VAChT wie die VMATs ein Glutamat bei −4 relativ zum Dileucin enthält, enthält es ein Serin bei −5, was die Möglichkeit eröffnet, dass die Ladung dieses Rests für die Lokalisierung der Transporter zu verschiedenen Populationen sekretorischer Vesikel verantwortlich ist. Darüber hinaus legt die Anwesenheit eines Serins bei –5 relativ zum Dileucin in VAChT nahe, dass die Phosphorylierung dieses Rests die Sortierung des Transporters beeinflussen kann. Tatsächlich beeinflusst die Phosphorylierung von Serinresten bei −5 relativ zu den Dileucinmotiven in CD4 (Shin et al. 1991) und CD3γ (Dietrich et al. 1994) den Transport dieser Proteine ​​dramatisch.

Wir berichten nun, dass das Serin bei -5 relativ zum Dileucin-Motiv in VAChT (Ser-480) durch eine Calcium-abhängige Isoform der Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert wird. Der Ersatz von Ser-480 durch Alanin, das die Phosphorylierung verhindert, reduziert die Expression von VAChT auf LDCVs im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Im Gegensatz dazu erhöht die Substitution von Ser-480 durch Glutamat, um die Sequenz von VMAT2 an dieser Position und das Phosphorylierungsereignis nachzuahmen, die Expression von VAChT auf LDCVs. In Übereinstimmung mit der Bedeutung von sauren Resten stromaufwärts eines Dileucin-Motivs bei der Sortierung nach LDCVs reduziert der Ersatz von Glu-478 und -479 stromaufwärts des dileucin-ähnlichen Motivs in VMAT2 die Lokalisierung auf LDCVs. Die Ergebnisse liefern einige der ersten Informationen über Signale, die bei der Sortierung in verschiedene Klassen von sekretorischen Vesikeln beteiligt sind. Darüber hinaus legen sie nahe, dass die Phosphorylierung das Targeting von VAChT auf LDCVs reguliert, was einen möglichen Mechanismus zur Regulierung der Transmitterfreisetzung bietet.


Was bedeutet der Begriff „modifizierte Restposition“ bei der Phosphorylierung? - Biologie

Die p21-aktivierten Kinasen (Paks) dienen als Effektoren der Rho-Familie GTPasen Rac und Cdc42. Die sechs menschlichen Paks werden aufgrund der Sequenzähnlichkeit in zwei Gruppen eingeteilt. Paks der Gruppe I (Pak1 bis -3) phosphorylieren eine Reihe von Substraten, die diese Gruppe mit der Regulation des Zytoskeletts und sowohl der proliferativen als auch der anti-apoptotischen Signalübertragung verbinden. Es wird angenommen, dass Gruppe-II-Paks (Pak4 bis -6) unterschiedliche funktionelle Rollen spielen, aber ihre wenigen bekannten Substrate werden auch von Gruppe-I-Paks angegriffen. Um zu bestimmen, ob die beiden Gruppen unterschiedliche Zielsequenzen erkennen, verwendeten wir ein degeneriertes Peptidbibliotheksverfahren, um die Konsensus-Phosphorylierungsmotive der Gruppe I und II Paks umfassend zu charakterisieren. Wir stellen fest, dass Pak1 und Pak2 eine praktisch identische Substratspezifität aufweisen, die sich von der von Pak4 unterscheidet. Basierend auf Strukturvergleichen und Mutagenese identifizierten wir zwei Schlüsselaminosäurereste, die die unterschiedlichen Spezifitäten von Gruppe I und II Paks vermitteln und schlagen eine strukturelle Grundlage für diese Unterschiede vor. Diese Ergebnisse implizieren zum ersten Mal Reste aus dem kleinen Lappen einer Kinase in der Substratselektivität. Schließlich nutzten wir das Pak1-Konsensusmotiv, um eine neue Pak1-Phosphorylierungsstelle in Pix vorherzusagen (Pak-ichinteraktiv exÄnderungsfaktor) und zeigen, dass Pak1 diese Stelle sowohl phosphoryliert in vitro und in kultivierten Zellen. Zusammengenommen verdeutlichen diese Ergebnisse die Spezifität von Pak-Kinasen und veranschaulichen ein allgemeines Verfahren zur Identifizierung neuer Stellen, die von Paks phosphoryliert werden.

Diese Forschung wurde zum Teil durch einen American Association for Cancer Research-Fox Chase Cancer Center Career Development Award in Translational Cancer Research, durch das Forschungsprogramm des US-Verteidigungsministeriums W81XWH-05-1-0200 und durch ein Stipendium des Pennsylvania Department unterstützt of Health (alle nach JRP). Zusätzliche Unterstützung wurde durch den National Institutes of Health Grant CA006927 und durch eine Zuweisung des Commonwealth of Pennsylvania an das Fox Chase Cancer Center bereitgestellt. Das Structural Genomics Consortium ist eine eingetragene Wohltätigkeitsorganisation (Nummer 1097737), die vom Wellcome Trust, GlaxoSmithKline, Genome Canada, den Canadian Institutes of Health Research, dem Ontario Innovation Trust, dem Ontario Research and Development Challenge Fund, der Canadian Foundation for Innovation, VINNOVA . finanziert wird , die Knut and Alice Wallenberg Foundation, die Swedish Foundation for Strategic Research und das Karolinska Institutet. Die Kosten für die Veröffentlichung dieses Artikels wurden teilweise durch die Zahlung von Seitengebühren bestritten. Dieser Artikel muss daher hiermit gekennzeichnet werden „Werbung“ gemäß 18 U.S.C. § 1734 nur, um auf diese Tatsache hinzuweisen.

Die Online-Version dieses Artikels (verfügbar unter http://www.jbc.org) enthält ergänzende Tabellen 1 und 2 sowie Abb. 1.

Unterstützt durch Mittel von NCI, National Institutes of Health (NIH), Grant T32 CA009035.

Derzeitige Adresse: Abteilung für Biologie, Kansas State University, Manhattan, KS 66502.


Zusätzliche Informationen

Dies liefert eine detaillierte Beschreibung der Sekundärstruktur- und RMSF-Analyse für KLHL3 (Abbildung S1), elektrostatisches Potential von KLHL3 für die äquilibrierten Simulationen (Abbildung S2), zeitabhängige Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Schlüsselresten von KLHL3 und das saure Motiv von WNK4 (Abbildung S3), Vergleich der Wechselwirkungsenergie für Reste von KLHL3, die an hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Kelch-Domäne und dem sauren Motiv von WNK4 beteiligt sind (Abbildung S4), und der Abstand zwischen dem sauren Motiv und dem Kelch-Domäne (Abbildung S5) sowie ein Vergleich der Abstände in Gegenwart von pS433 und protoniertem pS433 (Abbildung S6).


Autorenbeiträge

DB, FDR und AB haben die Experimente dieser Studie entworfen. DB, ES, AA, AT, CB und AN führten die Experimente durch. DB, FDR und AB führten eine Datenanalyse und eine kritische Diskussion der Ergebnisse durch. DB, DR, SP, FDR und AB trugen zum Schreiben und Bearbeiten des Manuskripts bei. Alle Autoren haben dem endgültigen Entwurf des Manuskripts zugestimmt.

Dateiname Beschreibung
mol212881-sup-0001-FigS1.jpgJPEG-Bild, 1,3 MB Abb. S1. Bewertung der Transfektionseffizienz. 48 h mit Empy-Vektor (CTRL), wt-p27 und G9R-p27 transfizierte HEK-293-Zellen wurden mit anti-p27-mAb und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern gefärbt und mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACScalibur analysiert. Berechnungen wurden über 30 000 Ereignisse durchgeführt. M2 umfasst wt- und mutierte p27-exprimierende Zellen, die mindestens 50% der gesamten Zellpopulationen entsprechen. M1 umfasst Zellen mit einer sehr geringen Fluoreszenz, die einer endogenen p27-Färbung entspricht.
mol212881-sup-0002-FigS2.jpgJPEG-Bild, 1,8 MB Abb. S2. Sphäroidbildungsfähigkeit von Zellen, die wt-p27 und G9R-p27 exprimieren. LN-229-Glioblastomzellen, die am Tag zuvor mit leerem Vektor (CTRL) oder Plasmiden, die WT- und G9R-p27 kodieren, transfiziert wurden, wurden in Matrigel für einen 3D-Sphäroid-basierten Tumorinvasionsassay ausgesät. Details werden unter „Materialien und Methoden“ berichtet. Die Kulturen wurden unter dem Lichtmikroskop beobachtet und Bilder wurden 4, 5 und 6 Tage nach der Aussaat aufgenommen. Das Experiment wurde dreimal wiederholt, während die Abbildung die Ergebnisse von zwei Wiederholungen für jeden Zeitpunkt wiedergibt. Rechts, Bilder nach 6-tägigem Einschluss bei höherer Vergrößerung: G9R-exprimierende Kulturen zeigen das Vorhandensein von Zellen, die sich von den Kugeln abzulösen scheinen (hervorstehende Zellen).
mol212881-sup-0003-FigS3.jpgJPEG-Bild, 1,5 MB Abb. S3. Sphäroidbildungsfähigkeit von PC-3-Zellen, die wt-p27 und G9R-p27 exprimieren. PC-3-Zellen, die am Tag zuvor mit leerem Vektor (CTRL) oder Plasmiden, die WT- und G9R-p27 kodieren, transfiziert wurden, wurden in Matrigel für einen 3D-Tumorinvasionsassay auf Sphäroidbasis ausgesät. Details werden unter „Materialien und Methoden“ berichtet. Die Kulturen wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet und Bilder wurden 6 Tage nach der Aussaat aufgenommen. Das Experiment wurde dreimal wiederholt, während die Abbildung die Ergebnisse von zwei Wiederholungen wiedergibt. Rechts und links wurden Bilder mit unterschiedlicher Vergrößerung aufgenommen. In der Mitte wurde der Durchmesser der erhaltenen Kolonien unter Verwendung des Maßstabsbalkens (50 µm) als Referenz gemessen. Die gezeigten Ergebnisse sind der Mittelwert von 3 Bestimmungen, die bei drei unabhängigen Experimenten erhalten wurden, und die Standardabweichung ist gezeigt. Die Daten wurden von Student's . analysiert T Prüfung. *P < 0,05.
mol212881-sup-0004-FigS4.jpgJPEG-Bild, 961.2 KB Abb. S4. Apoptoseanalyse von Zellen, die G9R-p27 exprimieren, im Vergleich zu wt-p27. PC-3-Zellen wurden 48 h lang mit pcDNA3.0-Leervektor und pcDNA3.0, die für p27 oder G9R-p27 kodieren, transfiziert. Dann wurden die Zellen 18 h lang mit 1 µm Staurosporin behandelt. Die Zellen wurden gesammelt und mit dem Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit gemäß den Herstellerangaben verarbeitet. Die Kontrolle dieses Experiments erfolgt durch Zellen, die mit leerem Vektor transfiziert und mit Staurosporin (STAUROSPORINE) behandelt wurden, wie unter „Materialien und Methoden“ beschrieben. Die Zellapoptose wurde durch Durchflusszytometrie mit einem FACScalibur nachgewiesen und berechnet, indem 50 000 Ereignisse analysiert wurden. Der obere rechte (UR) Quadrant enthält apoptotische Zellen.
mol212881-sup-0005-FigS5.jpgJPEG-Bild, 839,8 KB Abb. S5. Zweidimensionale Analyse transfizierter Mutanten von G9R-p27. (A) 2D/WB-Analyse von Zellextrakten von PC-3-Zellen, die mit pcDNA3.0-Plasmiden transfiziert wurden, die für S10A/G9R-p27, S10A/T187A/G9R-p27 [*T187A], S10A/T198V/G9R-p27 [*T198V . kodieren ], S10A/T157A/G9R-p27 [*T157A] und S10A/Y(74,88,89)F/G9R-p27 [*Y(74,88,89)F] auf der linken Seite und Plasmide, die S10A . kodieren /G9R-p27, S7A/S10A/G9R-p27 [*S7A], S183A/S10A/G9R-p27 [*S183A], S83A/S10A/G9R-p27 [*S83A] rechts. Nach dem Blotting wurden die Filter durch mAb anti-p27 analysiert. Signale 0 und 1 entsprechen unmodifiziertem bzw. 1Pi-Protein. (B) HeLa-Zellen wurden mit pcDNA3.0-Plasmiden transfiziert, die für G9R-p27, S10A/G9R-p27 [*S10A] und S12A/G9R-p27 [*S12A] kodieren. Zellextrakte wurden hergestellt und durch 2D/WB analysiert. Nach dem Blotting wurden die Filter durch mAb anti-p27 analysiert. Die Signale 0, 1 und 2 entsprechen unmodifiziertem 1Pi- bzw. 2Pi-Protein. (C) Auf der linken Seite. 2D/WB-Analyse von Zellextrakten von K562-Zellen, die mit pcDNA3.0-Plasmiden transfiziert wurden, die für G9R-p27 und S12A/G9R-p27 [*S12A] kodieren. Nach dem Blotting wurden die Filter durch mAb anti-p27 analysiert. Die Signale 0, 1 und 2 entsprechen unmodifiziertem 1Pi- bzw. 2Pi-Protein. Zur Rechten. 2D/WB-Analyse von Zellextrakten von SH-SY5Y-Zellen, die mit pcDNA3.0-Plasmiden transfiziert wurden, die für G9R-p27 kodieren. Nach dem Blotting wurden die Filter durch mAb anti-p27 analysiert. Die Signale 0, 1 und 2 entsprechen unmodifiziertem 1Pi- bzw. 2Pi-Protein. (D) Links. 2D/WB-Analyse von Zellextrakten von K562-Zellen, die mit pcDNA3.0-Plasmiden transfiziert wurden, die das p27-Protein und seine Derivate S12A/p27 [*S12A] und S12D/p27 [*S12D] kodieren. Zur Rechten. Die Histogramme geben den Intensitätsprozentsatz jedes Signals (unmodifiziert, 1Pi-Isoformen) relativ zum Gesamtwert für p27 und seine abgeleiteten mutierten Proteine ​​an. Die Intensität der spezifischen Signale wurde mit der TotalLab CLIQS Gelbildanalysesoftware ausgewertet. Die gezeigten Daten sind die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten. Balken repräsentieren die Standardabweichung. Die Daten wurden von Student's . analysiert T Prüfung. **P < 0,01.
mol212881-sup-0006-FigS6.jpgJPEG-Bild, 1,3 MB Abb. S6. Wirkung von CDK2 auf die nukleäre und zytosolische Lokalisation von G9R-p27. (A) Verschiedene Populationen von MEF-Zellen wurden untersucht, um die Abwesenheit von CDK2- und CDK4-Protein zu bestätigen. Immortalisierte Wildtyp-MEFs und MEFs ohne CDK4 oder CDK2 oder sowohl CDK4 als auch CDK2 wurden wie in Materialien und Verfahren kultiviert. Dann wurden die Kern- und Zytosolkompartimente präpariert und durch WB und spezifische Antikörper auf CDK2 und CDK4 analysiert. Die Filter wurden auch durch spezifische Antikörper auf HDAC- und PKM2-Gehalt analysiert, um eine gleichmäßige Beladung und Kompartimenttrennung zu bestätigen. (B) Obere Abbildung. Das für G9R-p27 kodierende pcDNA3.0-Plasmid wurde in verschiedene MEF-Populationen transfiziert, nämlich MEF-immortalisierte Zellen, CDK4 –/– MEFs, CDK2 –/– und CDK4 –/– CDK2 –/– -Zellen. Nach 24 h wurden nukleäre und zelluläre Kompartimente präpariert und durch WB unter Verwendung von mAb anti-p27 analysiert. HDAC1 wurde zur Bewertung der Beladungsmenge und der Kernreinheit untersucht. Untere Figur. Es wurden drei ähnliche Experimente wie oben beschrieben durchgeführt. Der Prozentsatz an nuklearem und zytosolischem Protein wurde durch die Imagej-Software bewertet. Auf der Grundlage der ermittelten Daten wurden die gezeigten Histogramme erstellt. Error bars represent the standard error of the mean of the experiments. (C) pcDNA3.0 plasmids encoding p27 and G9R-p27 were transfected in parental and CDK2 −/ CDK4 − MEFs. After 24 h, nuclear and cytosol extracts were prepared and analyzed by 2D/WB with mAb anti-p27. For the nuclear extracts, images at different film exposition times are reported. (D) S10/S12/T187A/G9R-p27 protein was prepared from PC-3 transfected cells. The partially purified protein was incubated with recombinant CDK2 for 40 min. The assay mixtures at time 0 and after 40 min were analyzed by 2D/WB.

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Materialen und Methoden

Cell cultures

Vero monkey kidney, epithelial HEK293T or LLCPK1 cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium. Jurkat T lymphoid cells were maintained in RPMI 1640 medium (Bio Whittaker Europe, Verviers, Belgium). Media were supplemented with 10% fetal calf serum and cells were grown at 37°C in 5% CO2.

Antibodies and reagents

Polyclonal rabbit IgGs against L-plastin have been previously characterised (Lapillonne et al., 2000). Mouse monoclonal anti-vinculin antibody was a kind gift of M. Glukhova (Institut Curie, Paris, France) anti-cortactin antibody was purchased from Upstate (TE Huissen, The Netherlands) and anti-vimentin antibody from Santa Cruz Biotechnology (Tebu-Bio, Boechout, Belgium). Polyclonal anti-Ser5-P antibody against L-plastin phosphorylated at Ser5 was raised against a peptide encoding L-plastin residues 2-17 in which Ser5 was phosphorylated (ARGS(P)VSDEEMMELREA). Rabbit antiserum was purified by negative affinity on non-phosphorylated peptide followed by positive affinity on the phosphorylated peptide. The monoclonal VII-E-7 antibody against the 13 C-terminal residues of the Sendai virus L protein (sv-tag) was a kind gift of J. Neubert (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Germany). The rabbit polyclonal antibody against the same sequence was described previously (Arpin et al., 1994). The anti-rabbit IgG antibody coupled to horseradish peroxidase was purchased from Amersham Biosciences (Roosendaal, The Netherlands). Cy2-conjugated goat anti-rabbit IgG was purchased from Jackson Immuno-Research Laboratories (De Pinte, Belgium). Alexa Fluor 350- or 594-coupled phalloidin and secondary antibodies were purchased from Molecular Probes (Invitrogen, Merelbeke, Belgium). β-G-actin was purchased from Cytoskeleton (Boechout, Belgium). PKA catalytic subunit, PKA activator 8-Bromo-cAMP, PKA inhibitors H89 and KT5720 and PKC inhibitor GF109 and Gö6796 were purchased from Calbiochem (Leuven, Belgium). Forskolin was obtained from Sigma (Bornem, Belgium). Lipofectin reagent was purchased from Invitrogen.

Site-directed mutagenesis of cDNAs

To mutate Ser5 into Ala or a Glu by a PCR-based approach, Mut5A (5′-AAAAATGGCCAGAGGA GCA GTGTCC-3′), Mut5E (5′-AAAAATGGCCAGAGGA GAA GTGTCC-3′) sense primers corresponding to L-plastin nucleotides 4-21 were used. Underlined sequences indicate mutated amino acids. The common reverse primer (3′-CTTCCCCTCCTTCAGGTCCTCAGC-5′) was complementary to bases 802-780 of L-plastin cDNA and flanked at its 5′-end by an NcoI site. The PCR fragment containing the mutation was used to replace the corresponding fragment of the L-plastin cDNA inserted in the pCB6 expression vector, downstream of the cytomegalovirus promoter. The Ser5Glu and Ser5Ala cDNAs were also cloned into the BamHICH-EcoRI sites of the pGEX-2T expression vector. Mutated DNAs were verified by sequencing.

Recombinant proteins

Wild-type human L-plastin, as well as the Ser5Glu and Ser5Ala variants of L-plastin were produced in E coli from the pGEX-2T expression vector and purified as described previously (Arpin et al., 1994). The concentration of thrombin-cleaved proteins was determined according to the Bradford method (BioRad, Nazareth, Belgium) and by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using a BSA protein standard curve.

Transient expression of cDNAs in cells

Five or 10 μg of cDNA encoding wild-type human L-plastin or L-plastin variants was transfected respectively into HEK239T cells using calcium phosphate procedure (Chen and Okayama, 1988) or into 5×10 6 Vero cells by electroporation at 240 volt and 950 μF (Toneguzzo et al., 1986). LLCPK1 cells were transfected by Lipofectin.

Treatment of cells with pharmacological agents

Cells were washed with PBS and resuspended in HBSS ++ (1× Hanks' buffered salt solution) containing 20 mM Hepes, 0.5 mM Mg 2+ and 1.0 mM Ca 2+ . Jurkat T lymphoid cells or HEK293T cells were treated with PKA or PKC activators or inhibitors as indicated in the figure legends and described (Wang and Brown, 1999). After treatment, cells were lysed and processed for immunoblotting analysis.

Analysis of L-plastin or L-plastin variants by immunoblotting

Cells were lysed for 30 minutes in ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% NP40 and 1% Na-deoxycholate) containing a cocktail of protease and phosphatase inhibitors. Lysates were cleared by centrifugation in a microfuge at 16,000 g for 10 minutes at 4°C, and the protein concentration was determined using a modified Lowry method or Bradford assay (BioRad).

Total cell lysates (20 μg of protein) were separated by PAGE under reducing conditions and transferred onto nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) using a semi-dry transblot apparatus. Primary antibodies indicated in figure legends were revealed by using secondary antibodies coupled to horseradish peroxidase and enhanced chemiluminescence (ECL). In some experiments, the membrane was stripped as previously described (Janji et al., 1999).

Indirekte Immunfluoreszenz

Transfected cells were fixed with 3% paraformaldehyde and processed for immunofluorecence labelling as described previously (Friederich et al., 1999). Labelled cells were analysed by epifluorescence microscopy (Leica DMRX microscope, HCX PL APO ×63 or ×100) or a Zeiss laser scanning confocal microscope (LSM-510 Meta). Images were acquired with a linear CCD camera (micromax, Princeton Instruments) and analysed with Metaview or Metamorph software (Universal Imaging Cooperation)

Detergent extraction of cells

Transfected Vero cells were plated onto glass coverslips. After 48 hours, coverslips were cut in halves. One half was directly processed for indirect immunofluorescence, while the other was detergent-extracted with 0.5% Triton X-100 for 16 seconds at 20°C, as previously described (Arpin et al., 1994 Friederich et al., 1992) and then processed for immunofluorescence labelling. For quantification, number of cells with detectable sv-tag labelling per 100 cells were determined for each half coverslip, yielding quantitative information on the transfection efficiency and on the resistance of transfected proteins to detergent extraction.

Phosphorylation of L-plastin in vitro

L-plastin protein was phosphorylated using PKA catalytic subunit (specific activity ⩾750 units/μg of protein) at 30°C in a reaction mixture containing 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 100 μM ATP. To monitor phosphorylation, aliquots were removed, the reaction was stopped by addition of boiling SDS-sample buffer and proteins were analysed by immunoblotting following the ECL detection method (Amersham Bioscience). To analyse F-actin binding capacity of L-plastin, aliquots from the reaction were added to G-actin and processed as described below.

Actin binding and bundling assays

G-actin was polymerised overnight at 4°C or for 4 hours at room temperature in the presence of L-plastin variants in polymerisation buffer (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0.5 mM EGTA, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) as indicated in figure legends. Sedimentation of actin filaments and L-plastin was achieved by high-speed centrifugation at 200,000 g for 30 minutes. To sediment actin bundles, samples were centrifuged for 15 minutes at 12,000 g (Glenney, Jr et al., 1981). Proteins in pellets and supernatants were separated by SDS-PAGE. Coomassie-stained protein bands were scanned and densities were quantified using BioCapt and Bio-PROFIL Bio 1D software (Windows applications) or LabImage software 2.7.2 (Kapelan Bio-Imaging Solution).

Transmissionselektronenmikroskopie

Samples prepared for the above-described bundling assay were analysed by transmission electron microscopy. Aliquots were removed from the mixture before centrifugation and immediately negatively stained with 1% uranyl acetate. Electron micrographs were obtained using a Philips CM 120 microscope at a magnification of 28,000× or 45,000×.

Collagen invasion assays

Gels were prepared in a six-well plate from a collagen-type-I solution (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Cells (1×10 5 ) were incubated on top of the gels for 24 hours at 37°C. HEK293T cells inside the gel were scored with a phase contrast microscope controlled by a computer program (Bracke et al., 2001 De Corte et al., 2002). Invasive and superficial cells were counted in 12 fields of 0.157 mm 2 . The invasion index is the percentage of cells invading the gel over the total number of cells counted. DHD-FIB rat colon myofibroblasts were used as a positive control. Experiments were performed in triplicate. Mean values and standard deviations were calculated.

Fast aggregation assay

Cell-cell adhesion was numerically evaluated in an aggregation assay as described earlier (Boterberg et al., 2001). Briefly, single-cell suspensions of HEK293T cells were prepared according to an N-cadherin-saving procedure and allowed to aggregate on a Gyrotory shaker at 80 rpm for 30 minutes in aggregation buffer (1.25 mM Ca 2+ , 0.1 mg DNase /ml, 10 mM Hepes and 0.1% BSA) and equilibrated at physiological pH and osmolarity. Cell aggregation was measured with an LS particle size analyzer (LS 200, Coulter Electronics) after 0 and 30 minutes of aggregation. The relative volume in function of the particle size was used as an index of aggregation. Semi-quantitative evaluation of Fast Aggregation (FA) was determined as follow. Less than 20 μm, no aggregates I between 20 and 100 μm, no aggregates II between 100 and 1000 μm, aggregates III more than 1000 μm, aggregates IV.

Wound healing assay

HEK293T cells (8×10 5 ) were seeded into six-well cell culture plates and 18 hours after seeding, cells were transfected with cDNA constructs. After 48 hours, a wound was made by scratching a line in a confluent monolayer. Cell debris was removed by washing the cells with serum-free medium. Migration of cells into the wound was then observed at different time points. Cells were followed for 24 hours.


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