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7.19D: Regulation der Sigma-Faktor-Aktivität - Biologie

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Lernziele

  • Analysieren Sie die Regulation der Sigmafaktoraktivierung

Sigma-Faktoren sind Proteine, die bei der Transkriptionsinitiation wirken. Insbesondere in Bakterien sind Sigmafaktoren für die Erkennung der RNA-Polymerase an der Genpromotorstelle notwendig. Der Sigma-Faktor ermöglicht es der RNA-Polymerase, richtig an die Promotorstelle zu binden und die Transkription zu initiieren, die zur Produktion eines mRNA-Moleküls führt. Die Art des Sigmafaktors, der in diesem Prozess verwendet wird, variiert und hängt vom Gen und von der zellulären Umgebung ab. Die bisher identifizierten Sigmafaktoren sind anhand des Molekulargewichts charakterisiert und zeigen auch eine Diversität zwischen Bakterienarten. Sobald die Rolle des Sigma-Faktors abgeschlossen ist, verlässt das Protein den Komplex und die RNA-Polymerase wird mit der Transkription fortfahren.

Die Regulierung der Sigmafaktor-Aktivität ist kritisch und notwendig, um eine ordnungsgemäße Initiation der Transkription sicherzustellen. Die Aktivität von Sigmafaktoren innerhalb einer Zelle wird auf vielfältige Weise kontrolliert. Die Sigma-Faktor-Synthese wird sowohl auf den Ebenen der Transkription als auch der Translation kontrolliert. Oftmals hängt die Sigmafaktor-Expression oder -Aktivität von spezifischen Wachstumsphasenübergängen des Organismus ab. Wenn die Transkription von Genen, die am Wachstum beteiligt sind, notwendig ist, werden die Sigma-Faktoren translatiert, um die Transkriptionsinitiation zu ermöglichen. Wenn jedoch keine Transkription von Genen erforderlich ist, sind Sigma-Faktoren nicht aktiv.

In bestimmten Fällen, in denen die Transkriptionsaktivität gehemmt werden muss, gibt es Anti-Sigma-Faktoren, die diese Funktion erfüllen. Die Anti-Sigma-Faktoren binden an die RNA-Polymerase und verhindern ihre Bindung an Sigma-Faktoren, die an der Promotorstelle vorhanden sind. Die Anti-Sigma-Faktoren sind für die Regulierung der Hemmung der Transkriptionsaktivität in Organismen verantwortlich, die den Sigma-Faktor für eine ordnungsgemäße Transkriptionsinitiation benötigen.

Wichtige Punkte

  • Sigma-Faktor-Proteine ​​fördern die Bindung von RNA-Polymerase an Promotorstellen innerhalb von DNA-Sequenzen, um die Initiation der Transkription zu ermöglichen.
  • Sigma-Faktoren sind spezifisch für das Gen und werden von der zellulären Umgebung beeinflusst.
  • Sigma-Faktoren können sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene regulieren.
  • Anti-Sigma-Faktoren sind für die Hemmung der Sigma-Faktor-Funktion verantwortlich und hemmen somit die Transkription.

Schlüsselbegriffe

  • Wachstumsphasenübergänge: Die verschiedenen Phasen, die für das Bakterienwachstum erforderlich sind, umfassen: Verzögerungs-, exponentielle und stationäre Phasen.

SIG1, ein Sigma-Faktor für die Chloroplast-RNA-Polymerase, assoziiert in vivo unterschiedlich mit mehreren DNA-Regionen in den Chloroplasten-Chromosomen

500–600 bp im Durchschnitt). Dann wird eine Immunpräzipitation mit einem spezifischen Antikörper durchgeführt, um das interessierende Protein zusammen mit der vernetzten Ziel-DNA zu reinigen. Schließlich werden Vernetzungen durch Hitzebehandlung entfernt und DNA wird gereinigt. Folglich können die zum Zeitpunkt der Formaldehyd-Vernetzung an das interessierende Protein gebundenen genomischen Regionen gezielt angereichert werden. Schließlich können die Mengen gereinigter genomischer Regionen durch quantitative PCR (qPCR) gemessen und ihre Signale als prozentuale Wiederfindung gegenüber der Menge der zugeführten DNA analysiert werden.


Mehrere Wege zur Regulierung der Stabilität von SigmaS (RpoS) in Escherichia coli durch die Wirkung mehrerer Anti-Adaptoren

SigmaS, der Sigmafaktor der stationären Phase von Escherichia coli und Salmonella, wird auf mehreren Ebenen reguliert. Das sigmaS-Protein ist während des exponentiellen Wachstums instabil und wird während der stationären Phase und nach verschiedenen Stressbehandlungen stabilisiert. Der Abbau erfordert sowohl die ClpXP-Protease als auch den Adapter RssB. Das kleine Antiadaptor-Protein IraP wird als Reaktion auf Phosphatmangel gebildet und interagiert mit RssB, was unter dieser Stressbedingung eine SigmaS-Stabilisierung bewirkt. IraP ist für die SigmaS-Stabilisierung unter einigen, aber nicht allen Hungerbedingungen essentiell, was auf die Existenz anderer Anti-Adaptor-Proteine ​​schließen lässt. Wir berichten hier über die Identifizierung neuer Regulatoren der SigmaS-Stabilität, die unter anderen Stressbedingungen wichtig sind. IraM (Inhibitor der RssB-Aktivität während Magnesiummangel) und IraD (Inhibitor der RssB-Aktivität nach DNA-Schädigung) hemmen die SigmaS-Proteolyse sowohl in vivo als auch in vitro. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mehrere Anti-Adaptor-Proteine ​​die Regulierung der SigmaS-Stabilität durch die Regulierung der RssB-Aktivität unter einer Vielzahl von Stressbedingungen ermöglichen.


Globale Regulation einer Sigma 54-abhängigen Flagellaren-Genfamilie in Caulobacter crescentus durch den Transkriptionsaktivator FlbD.

Die Biosynthese des Caulobacter crescentus polar flagellum erfordert die Expression einer großen Anzahl von Flagellen (fla)-Genen, die in einer regulatorischen Hierarchie von vier Klassen (I bis IV) organisiert sind. Der Zeitpunkt der fla-Genexpression im Zellzyklus wird durch spezialisierte Formen der RNA-Polymerase und das Auftreten und/oder die Aktivierung regulatorischer Proteine ​​bestimmt. Hier berichten wir über eine Untersuchung der Rolle des C. crescentus transkriptionalen regulatorischen Proteins FlbD bei der Aktivierung von Sigma 54-abhängigen Klasse-III- und Klasse-IV-fla-Genen der Hierarchie durch Rekonstitution der Transkription von diesen Promotoren in vitro. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Transkription von Promotoren der Klasse-III-Gene flbG, flgF und flgI und des Klasse-IV-Gens fliK durch Escherichia coli E sigma 54 durch FlbD oder das mutierte Protein FlbDS140F (wobei S140F eine S-zu-F-Mutation bezeichnet) aktiviert wird an Position 140), die wir hier zeigen, hat ein höheres Potenzial für die transkriptionelle Aktivierung. In-vitro-Studien des flbG-Promotors haben zuvor gezeigt, dass die transkriptionelle Aktivierung durch das FlbD-Protein ftr-Sequenzelemente (ftr für die Flagellare-Transkriptionsregulation) erfordert. Wir haben nun mehrere ftr-Sequenzen identifiziert, die sowohl in der Sequenz als auch in der räumlichen Architektur in allen bekannten Klasse-III- und Klasse-IV-Promotoren konserviert sind. Diese neu identifizierten ftr-Elemente sind ca. 100 bp von den Transkriptionsstartstellen jedes Sigma-54-abhängigen fla-Genpromotors entfernt, und unsere Studien zeigen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Transkriptionsniveaus von verschiedenen Klasse-III- und Klasse-IV-Promotoren spielen. Wir haben auch Mutationsanalysen verwendet, um zu zeigen, dass die ftr-Sequenzen für die vollständige Aktivierung durch das FlbD-Protein sowohl in vitro als auch in vivo erforderlich sind. Somit legen unsere Ergebnisse nahe, dass FlbD, das durch das flbD-Gen der Klasse II kodiert wird, ein globaler Regulator ist, der die zellzyklusregulierte Transkription von allen identifizierten Sigma 54-abhängigen Promotoren in der C. crescentus fla-Genhierarchie aktiviert.


Regulierung der Sigma-Faktor-Aktivität

Der Sigma-Faktor ist für die korrekte Transkriptionsinitiation verantwortlich.

Lernziele

Analysieren Sie die Regulation der Sigmafaktoraktivierung

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • Sigma-Faktor-Proteine ​​fördern die Bindung von RNA-Polymerase an Promotorstellen innerhalb von DNA-Sequenzen, um die Initiation der Transkription zu ermöglichen.
  • Sigma-Faktoren sind spezifisch für das Gen und werden von der zellulären Umgebung beeinflusst.
  • Sigma-Faktoren können sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene regulieren.
  • Anti-Sigma-Faktoren sind für die Hemmung der Sigma-Faktor-Funktion verantwortlich und hemmen somit die Transkription.

Schlüsselbegriffe

  • Wachstumsphasenübergänge: Die verschiedenen Phasen, die für das Bakterienwachstum erforderlich sind, umfassen: Verzögerungs-, exponentielle und stationäre Phasen.

Sigma-Faktoren sind Proteine, die bei der Transkriptionsinitiation wirken. Insbesondere in Bakterien sind Sigmafaktoren für die Erkennung der RNA-Polymerase an der Genpromotorstelle notwendig. Der Sigma-Faktor ermöglicht es der RNA-Polymerase, richtig an die Promotorstelle zu binden und die Transkription zu initiieren, die zur Produktion eines mRNA-Moleküls führt. Die Art des Sigmafaktors, der in diesem Prozess verwendet wird, variiert und hängt vom Gen und von der zellulären Umgebung ab. Die bisher identifizierten Sigmafaktoren sind anhand des Molekulargewichts charakterisiert und zeigen auch eine Diversität zwischen Bakterienarten. Sobald die Rolle des Sigma-Faktors abgeschlossen ist, verlässt das Protein den Komplex und die RNA-Polymerase wird mit der Transkription fortfahren.

Sigma-Faktor SigR: Struktur des Sigma-Faktors.

Die Regulierung der Sigmafaktor-Aktivität ist kritisch und notwendig, um eine ordnungsgemäße Initiation der Transkription sicherzustellen. Die Aktivität von Sigmafaktoren innerhalb einer Zelle wird auf vielfältige Weise kontrolliert. Die Sigma-Faktor-Synthese wird sowohl auf den Ebenen der Transkription als auch der Translation kontrolliert. Oftmals hängt die Sigmafaktor-Expression oder -Aktivität von spezifischen Wachstumsphasenübergängen des Organismus ab. Wenn die Transkription von Genen, die am Wachstum beteiligt sind, notwendig ist, werden die Sigma-Faktoren translatiert, um die Transkriptionsinitiation zu ermöglichen. Wenn jedoch keine Transkription von Genen erforderlich ist, sind Sigma-Faktoren nicht aktiv.

In bestimmten Fällen, in denen die Transkriptionsaktivität gehemmt werden muss, gibt es Anti-Sigma-Faktoren, die diese Funktion erfüllen. Die Anti-Sigma-Faktoren binden an die RNA-Polymerase und verhindern ihre Bindung an Sigma-Faktoren, die an der Promotorstelle vorhanden sind. Die Anti-Sigma-Faktoren sind für die Regulierung der Hemmung der Transkriptionsaktivität in Organismen verantwortlich, die den Sigma-Faktor für eine korrekte Transkriptionsinitiation benötigen.


Funktion von Plastiden-Sigma-Faktoren in höheren Pflanzen: Regulation der Genexpression oder nur Erhaltung der konstitutiven Transkription?

Die Genexpression von Plastiden ist ziemlich komplex. Die Transkription wird von drei verschiedenen RNA-Polymerasen durchgeführt, von denen zwei kernkodiert, monomer, vom Phagentyp sind (bezeichnet als RPOTp und RPOTmp) und eine von ihnen plastidkodiert, multimer, vom eubakteriellen Typ (bezeichnet als PEP) ist. . Die Aktivität der RNA-Polymerase vom eubakteriellen Typ wird durch bis zu sechs kernkodierte Transkriptionsinitiationsfaktoren vom Sigma-Typ reguliert. Diese Komplexität des plastidären Transkriptionsapparates ist noch nicht gut verstanden und wirft die Frage auf, ob er einer Regulierung unterliegt oder nur eine konstitutive Transkription des Plastidengenoms gewährleistet. Andererseits wurden in den letzten Jahren beträchtliche Fortschritte erzielt, um die Rolle von Sigma-Faktoren für die spezifische Promotorerkennung und die ausgewählte Transkription einiger Plastidengene aufzuklären. Mit Sigma interagierende Proteine ​​wurden identifiziert und phosphorylierungsabhängige funktionelle Veränderungen von Sigmafaktoren wurden aufgedeckt. Die vorliegende Übersichtsarbeit zielt darauf ab, diese jüngsten Fortschritte zusammenzufassen und den Leser davon zu überzeugen, dass die Plastiden-Genexpression auf Transkriptionsebene durch die Wirkung des Sigma-Faktors reguliert wird.

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Empfohlene Artikel (6)

Entwicklung einer chimärensäurestabilen α-Amylase-Glucoamylase (Amy-Glu) für die einstufige Stärkeverzuckerung

Um Stärke in einem Schritt zu verzuckern, wurde ein chimärer Biokatalysator (Amy-Glu) aus konstruierter α-Amylase (Ba-Gt-amy) von Bacillus acidicola und Glucoamylase (Kleber) Gen von Aspergillus niger. Um zwei Enzyme zu verbinden, wurde ein Linker-Peptid aus 25 Aminosäuren verwendet. Chimär Amy-Glu wurde ausgedrückt in E coli. Glu hat 75 kDa, während Amy-Glu 145 kDa hat. Sowohl Amy-Glu als auch Glu zeigten ein ähnliches pH-Profil mit guter Aktivität im sauren pH-Bereich wie das von Ba-Gt-Amy mit einem Optimum bei pH 4,0. Alle drei Enzyme (Ba-Gt-Amy, Amy-Glu und Glucoamylase) zeigten Aktivität im Temperaturbereich zwischen 40 und 70 °C mit einem Optimum bei 60 °C. Amy-Glu und Glu haben T1/2 90 bzw. 70 min bei 60 bzw. 70 °C. Das Km, Vmax und KKatze Werte von Glu (lösliche Stärke) betragen 0,34 mg mL −1 , 606 μmol mg −1 min −1 und 727 s −1 , während für Amy-Glu 0,84 mg mL −1 , 13.886 μmol mg −1 min −1 und 4,2 . betragen × 10 4 s –1 . Die Endproduktanalyse deutete darauf hin, dass Amy-Glu die Aktivität beider Elternenzyme beibehält und zusammen mit Glucose als Hauptprodukten Maltodextrine bildet. Amy-Glu verzuckert Weizen- und Maisstärken effizienter als Ba-Gt-Amy und Glucoamylase.

Kartierung von Atrazin- und Phenolabbaugenen in Pseudomonas sp. EGD-AKN5

Bakterielle Isolate mit Multisubstrat-Abbaukapazitäten sind gute Kandidaten für die biologische Sanierung von Umweltnischen. Laborisolat Pseudomonas sp. Es wurde festgestellt, dass EGD-AKN5 Atrazin, Benzoat, Phenol, Toluol und Catechol mit einer Geschwindigkeit von 1,88 ± 0,01, 16,5 ± 1,37, 9,08 ± 2,20, 3,86 ± 0,11 bzw. 3,3 ± 0,29 mg L −1 h −1 abbaut. Die Analyse der Genomsequenz des Entwurfs zeigte das Vorhandensein des vollständigen Abbauweges für Atrazin und Phenol. Die Ergebnisse der Genannotation zeigten, dass Atrazin über den Chlorhydrolase-Weg mit . abgebaut wurde atzA/B/C/D/E/F-Gene, während Phenol über eine Mehrkomponenten-Phenol-Hydroxylase aus dem phc-Weg in Catechol umgewandelt wurde. Gene aus dem ortho-Weg waren für den weiteren biologischen Abbau von Catechol verantwortlich, ein Ergebnis, das durch Enzymassays bestätigt wurde. Ein Modell zur Beschreibung des Wachstums und des biologischen Abbaus von Atrazin, Phenol und verwandten Verbindungen wurde angewendet und an eine Reihe von aeroben Batch-Abbauexperimenten angepasst. Kinetische Studien zeigten, dass EGD-AKN5 das Potenzial zum gleichzeitigen Abbau von Phenol und Atrazin unter Verwendung von Phenol als Kohlenstoffquelle und Atrazin als Stickstoffquelle zeigte. Genexpressionsstudien zeigten eine längere Lag-Phase für die Expression von Genen aus dem Atrazin-Abbauweg im Vergleich zur Expression von Phenol- und Catechol-Abbau.

Niedermolekulare organische Säuren fördern die Freisetzung von gebundenen PAK-Resten in Böden

Das Verständnis der Freisetzung und Verfügbarkeit von gebundenen Rückständen polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) in der Rhizosphäre ist für die Bewertung ihres Verbleibs und Risikos in der Bodenumgebung unerlässlich. Es liegen jedoch nur begrenzte Informationen zum Einfluss von wurzelsekretierten niedermolekularen organischen Säuren (LMWOAs) auf die Freisetzung von gebundenen PAK-Rückständen in Böden vor. Ziel dieser Studie war es, die LMWOA-beeinflusste Freisetzung von bodengebundenen PAK-Rückständen zu untersuchen. Ein n-Butanol-Extraktionsverfahren wurde verwendet, um die Freisetzung von im Boden gebundenen PAK-Rückständen zu bewerten. LMWOAs können die Freisetzung von gebundenen PAK-Resten dramatisch fördern und die Extrahierbarkeit und Verfügbarkeit von PAKs im Boden verbessern. Die Zugabe von LMWOAs erhöhte die extrahierbaren Konzentrationen von ΣPAK und jedem einzelnen PAK in Böden mit gebundenen PAK-Resten in Abhängigkeit von der LMWOA-Konzentration signifikant. Im Vergleich zu Kontrollbehandlungen ohne Zugabe von LMWOA waren die Konzentrationen an Butanol-extrahierbarem ΣPAK und jedem PAK in Böden nach Zugabe von 10–100 mmol/kg LMWOA 54–745% bzw. 58–605% höher nach 40 bzw. 80 Tagen . Zitronensäure erzeugte immer die größte PAK-Freisetzung aus bodengebundenen PAK-Resten, während Äpfelsäure die niedrigste Freisetzung unter den drei getesteten LMWOAs erzeugte. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Informationen zum Verbleib von gebundenen PAK-Rückständen in der Bodenumgebung und werden für die Risikobewertung PAK-belasteter Böden und die Entwicklung von Sanierungsstrategien für Altlasten nützlich sein.

Proteinarchitektur und Kernreste in ungewickelten α-Helices geben Einblicke in die Transportfunktion von pflanzlichem AtCHX17

Verwenden von Arabidopsis thaliana AtCHX17 als Beispiel kombinieren Strukturmodellierung und Mutagenese, um Einblicke in seine Proteinarchitektur und Transportfunktion zu gewinnen, die schlecht charakterisiert sind. Dieser Ansatz basiert auf der Beobachtung, dass Proteinstrukturen in der Evolution deutlich konservierter sind als lineare Sequenzen und mechanistische Ähnlichkeiten zwischen diversen Transportern entstehen. Es wurden zwei Homologiemodelle von AtCHX17 erhalten, die eine Proteinfaltung ähnlich den bekannten Strukturen der bakteriellen Na + /H + -Antiporter, EcNhaA und TtNapA, zeigen. Die unterschiedlichen Sekundär- und Tertiärstrukturmodelle hoben Reste an Positionen hervor, die für die CHX17-Aktivität potenziell wichtig sind. Mutagenese zeigte, dass Asparagin-N200 und Aspartat-D201 in Transmembrane5 (TM5) und Lysin-K355 in TM10 für die AtCHX17-Aktivität entscheidend sind. Wir enthüllen bisher unerkannte Threonin-T170 und Lysin-K383 als Schlüsselreste in ungewundenen Regionen in der Mitte der TM4- bzw. TM11-α-Helices. Eine Mutation von Glutamat-E111 in der Nähe der Membranoberfläche hemmte die AtCHX17-Aktivität, was auf eine Rolle bei der pH-Erfassung hindeutet. Der lange Carboxylschwanz unbekannten Zwecks weist eine alternierende β-Faltblatt- und α-Helix-Sekundärstruktur auf, die in prokaryotischen universellen Stressproteinen konserviert ist. Diese Ergebnisse unterstützen die Gesamtarchitektur von AtCHX17 und identifizieren D201, N200 und die neuen Reste T170 und K383 am funktionellen Kern, die wahrscheinlich an der Ionenerkennung, Koordination und/oder Translokation beteiligt sind, ähnlich wie bei charakterisierten Kationen/H + -Austauschern. Der Kern von AtCHX17-Modellen gemäß EcNhaA- und TtNapA-Templaten zeigt nach innen bzw.

Rolle des Zusammenspiels zwischen Quorum Sensing Regulator VqsR und dem Pseudomonas Chinolonsignal bei der Vermittlung der Carbapenemtoleranz bei Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa koordiniert seine Reaktion auf Umweltbedingungen durch die Aktivierung eines Quorum Sensing (QS)-Systems. In dieser Studie untersuchten wir die regulatorische Interaktion zwischen dem QS-Transkriptionsregulator VqsR und dem Pseudomonas Chinolonsignal (PQS) durch die Integration des Sigmafaktors RpoS, und wir untersuchten, ob einer der Wege, die die Carbapenemtoleranz kontrollieren, VqsR zugeschrieben werden kann. Das zeigen wir vqsR Expression auf Transkriptionsebene wird reguliert durch pqsA, pqsR, und pqsE. Beurteilung der transkriptionellen Expression von vqsR, lasI, rhI, und qscR inpqsA undpqsAΔrpoS Mutanten gaben Einblick in pqsA- und rpoS-abhängige Regulierung von vqsR und vqsR-kontrollierte Gene. Exogen ergänztes PQS kehrte die Expression von . um vqsR und vqsR-kontrollierte Gene impqsA auf Wildtyp-Mengen mutiert, konnte jedoch die Expressionsniveaus von . nicht erhöhen lasI und qscR impqsAΔrpoS mutiert zu Spiegeln, die in Wildtyp-PAO1 beobachtet wurden. DievqsR Mutante zeigte im Vergleich zu Wildtyp-PAO1 ein reduziertes Überleben, wenn sie mit Carbapenemen herausgefordert wurde. Einführung von a pqsA Mutation in die ΔvqsR Mutante ihren Carbapenem-sensitiven Phänotyp vollständig abgeschafft.

Wir kommen zu dem Schluss, dass ein regulatorischer Zusammenhang zwischen PQS und vqsR existiert, und dass RpoS in ihrem Zusammenspiel wichtig ist. Wir zeigen auch, dass VqsR die Carbapenem-Toleranz beeinflusst.


Einführung

Rickettsien sind gramnegative Bakterien, die durch Vektoren von Arthropoden auf den Menschen übertragen werden. Je nach Art der von ihnen verursachten Krankheit sowie ihren antigenen und genetischen Merkmalen können die Rickettsien Die Gattung wurde in 2 Hauptgruppen unterteilt, die Fleckfiebergruppe und die Typhusgruppe (Raoult und Roux, 1997). Da Rickettsien durch eine streng intrazelluläre Lokalisation gekennzeichnet sind, die ihre detaillierte Untersuchung lange Zeit verhindert hat, sind die molekularen Mechanismen, die an ihrer Pathogenität beteiligt sind, noch wenig verstanden. Trotz zahlreicher Bemühungen (Wood und Azad, 2000, Rachek et al., 2000, Renesto et al., 2002, Qin et al., 2004) fehlen noch zuverlässige Werkzeuge für deren genetische Manipulation. Kürzlich wurde die Sequenzierung mehrerer Rickettsiengenome (Blanc et al., 2007) erreicht, was Studien zur besseren Kenntnis dieser Mikroorganismen sinnvoll unterstützt.

Die Verfügbarkeit von Rickettsien-Genomsequenzen ermöglicht groß angelegte Untersuchungen einschließlich DNA-Microarray-basierter Experimente. Eine solche funktionelle postgenomische Anwendung ist sehr nützlich, um zu verstehen, wie sich Krankheitserreger an ihre Umgebung anpassen, und hat einige Einblicke in die pathogenen Strategien verschiedener Mikroorganismen während des Infektionsprozesses geliefert (Boyce et al., 2004, Jansen und Yu, 2006). Allerdings wurden DNA-Mikroarray-basierte Genexpressionsprofile zur Untersuchung bakterieller Infektionen durch mehrere Herausforderungen behindert (Hinton et al., 2004). Im Gegensatz zu eukaryotischen mRNAs sind bakterielle mRNAs frei von Poly-A-Schwänzen und haben eine reduzierte Halbwertszeit von schätzungsweise 15 min für Rickettsia prowazekii (Winkler, 1995), die ihre Isolierung erschweren. Ausgehend von eukaryontisch infizierten Zellen, wie es bei der Untersuchung obligat intrazellulärer Bakterien der Fall ist, ist es noch schwieriger, qualitativ hochwertige prokaryontische mRNAs zu erhalten (Hinton et al., 2004). Die mRNA-Stabilität kann durch die Koextraktion von eukaryontischen und prokaryontischen Nukleinsäuren, wie sie üblicherweise für RT-PCR-Assays durchgeführt wird, sichergestellt werden. Da eukaryotische RNA mit bakterieller RNA während der cDNA-Synthese und der Fluorochrom-Markierung konkurrieren kann, muss sie daher aus solchen Proben eliminiert werden, um eine erfolgreiche Microarray-Hybridisierung zu erreichen (Belland et al., 2003, Di Cello et al., 2005). Abgesehen von der Qualität ist eine weitere große Einschränkung bei Markierungs- und Hybridisierungsreaktionen die geringe Menge an verfügbarer RNA (Hinton et al., 2004). Unserer Kenntnis nach war die einzige genaue globale transkriptomische Analyse von obligaten intrazellulären Bakterien, die sowohl die eukaryotische RNA-Kontamination als auch die geringe Menge an Template umgeht, die von Belland et al. (2003). Ihre Strategie, angewendet auf Chlamydia trachomatis, kombinierten die Entfernung von eukaryontischer RNA aus der Gesamt-RNA gefolgt von einem cDNA-Amplifikationsschritt mit einem vollständigen Satz von Oligonukleotiden, die speziell für diesen Mikroorganismus entwickelt wurden. Eine andere nicht verzerrte Amplifikationsmethode basierend auf der Verwendung von Zufallsprimern wurde kürzlich beschrieben und hat sich als kompatibel sogar für AT-reiche Mikroorganismen erwiesen (Francois et al., 2007).

Hier wurde daher eine neue Strategie, die die Entfernung eukaryotischer Kontaminanten mit anschließender zufälliger Amplifikation von cDNA kombiniert (Francois et al., 2007), als die beste Möglichkeit untersucht, eine Microarray-basierte Transkriptomanalyse von Rickettsien zu erreichen. Die Schwierigkeit, eine hohe Ausbeute und Qualität von RNA aus diesen obligaten intrazellulären Bakterien zu erhalten, wird durch das Fehlen veröffentlichter Daten bezüglich ihrer globalen Transkriptionsanalyse veranschaulicht. Während R. prowazekii Ganze DNA-Mikroarrays wurden konstruiert, nur DNA-Hybridisierungsexperimente wurden berichtet (Ge et al., 2004).

Die in diesem Beitrag vorgestellte Arbeit wurde mit Rickettsia conorii, der Erreger des Mittelmeer-Fleckfiebers, der auf den Menschen übertragen wird Rhipicephalus sanguineus, die braune Hundezecke (Raoult und Roux, 1997). Um sowohl die Machbarkeit als auch die Genauigkeit des vorgeschlagenen Ansatzes bei der Überwachung der Transkriptionsänderungen von Rickettsien durch Microarrays zu beurteilen, wurden Bakterien einem Nährstoffstress ausgesetzt. Aus RT-PCR-basierten Experimenten haben wir festgestellt, dass unter solchen Bedingungen R. conorii unterliegt einigen transkriptionellen Modifikationen (Rovery et al., 2005a, Rovery et al., 2005b). Ein kleines Mikroarray, das aus einer begrenzten Anzahl von Zielen besteht, einschließlich der R. conorii ORFs, die zuvor hoch- oder herunterreguliert gefunden wurden, wurden konstruiert. Andere Ziele, einschließlich Transkriptionsfaktoren, Chaperone oder virB Gene, sind anfällig dafür, das Überleben von Bakterien während längerer Hungerperioden zu verbessern. Aufgrund ihrer mutmaßlichen Regulation wurden sie auch amplifiziert und auf unserem Microarray entdeckt. Differenziell exprimierte Gene, die durch die Mikroarray-basierten Experimente identifiziert wurden, wurden dann validiert, um sicherzustellen, dass das vorgeschlagene Protokoll, das die Entfernung eukaryotischer Verunreinigungen und die Amplifikation gereinigter bakterieller RNA kombiniert, den Informationsgehalt der Originalproben bewahrt.


REVIEW Artikel

  • Institut für Biochemie und Biotechnologie, Martin-Luther-Universitätät Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Deutschland

Vierzig Jahre nach der ersten Entdeckung der lichtabhängigen Proteinphosphorylierung am Thylakoidmembransystem beginnen wir nun, die Rolle von Chloroplasten-Phosphorylierungsnetzwerken in ihrer Funktion zu verstehen, Informationen über den Stoffwechselstatus der Organelle zu entschlüsseln und an langfristige Anpassungen zu vermitteln bei der Plastiden- und Kerngenexpression. Mithilfe genetischer und funktioneller Genomik-Tools wurden Chloroplastkinasen und mehrere hundert Phosphoproteine ​​identifiziert, die nun einer detaillierten funktionellen Charakterisierung bedürfen. Die Regulation und das Zielproteinspektrum einiger Kinasen sind bekannt, jedoch sind diese Informationen bezüglich des Kinase- und Zielprotein-Crosstalks in einer sich ändernden Umgebung fragmentarisch. In diesem Aufsatz werden wir die neuesten Fortschritte auf diesem Gebiet hervorheben und Ansätze diskutieren, die zu einem umfassenden Verständnis der Plastidensignalintegration durch Proteinphosphorylierung führen könnten.


Verweise

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Definitionen

Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by a person skilled in the art to which this invention belongs. The following references provide one of skill with a general definition of many of the terms used in this invention: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994) The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988) The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991) and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). As used herein, the following terms have the meanings ascribed to them unless specified otherwise.

When introducing elements of the present disclosure or the preferred embodiments(s) thereof, the articles “a”, “an”, “the” and “said” are intended to mean that there are one or more of the elements. The terms “comprising”, “including” and “having” are intended to be inclusive and mean that there may be additional elements other than the listed elements.

As used herein, the term “endogenous sequence” refers to a chromosomal sequence that is native to the cell.

The term “exogenous,” as used herein, refers to a sequence that is not native to the cell, or a chromosomal sequence whose native location in the genome of the cell is in a different chromosomal location.

A “gene,” as used herein, refers to a DNA region (including exons and introns) encoding a gene product, as well as all DNA regions which regulate the production of the gene product, whether or not such regulatory sequences are adjacent to coding and/or transcribed sequences. Accordingly, a gene includes, but is not necessarily limited to, promoter sequences, terminators, translational regulatory sequences such as ribosome binding sites and internal ribosome entry sites, enhancers, silencers, insulators, boundary elements, replication origins, matrix attachment sites, and locus control regions.

The term “heterologous” refers to an entity that is not endogenous or native to the cell of interest. For example, a heterologous protein refers to a protein that is derived from or was originally derived from an exogenous source, such as an exogenously introduced nucleic acid sequence. In some instances, the heterologous protein is not normally produced by the cell of interest.

The terms “nucleic acid” and “polynucleotide” refer to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer, in linear or circular conformation, and in either single- or double-stranded form. For the purposes of the present disclosure, these terms are not to be construed as limiting with respect to the length of a polymer. The terms can encompass known analogs of natural nucleotides, as well as nucleotides that are modified in the base, sugar and/or phosphate moieties (e.g., phosphorothioate backbones). In general, an analog of a particular nucleotide has the same base-pairing specificity i.e., an analog of A will base-pair with T.

The term “nucleotide” refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides. The nucleotides may be standard nucleotides (i.e., adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, and uridine) or nucleotide analogs. A nucleotide analog refers to a nucleotide having a modified purine or pyrimidine base or a modified ribose moiety. A nucleotide analog may be a naturally occurring nucleotide (e.g., inosine) or a non-naturally occurring nucleotide. Non-limiting examples of modifications on the sugar or base moieties of a nucleotide include the addition (or removal) of acetyl groups, amino groups, carboxyl groups, carboxymethyl groups, hydroxyl groups, methyl groups, phosphoryl groups, and thiol groups, as well as the substitution of the carbon and nitrogen atoms of the bases with other atoms (e.g., 7-deaza purines). Nucleotide analogs also include dideoxy nucleotides, 2′-O-methyl nucleotides, locked nucleic acids (LNA), peptide nucleic acids (PNA), and morpholinos.

The terms “polypeptide” and “protein” are used interchangeably to refer to a polymer of amino acid residues.

Techniques for determining nucleic acid and amino acid sequence identity are known in the art. Typically, such techniques include determining the nucleotide sequence of the mRNA for a gene and/or determining the amino acid sequence encoded thereby, and comparing these sequences to a second nucleotide or amino acid sequence. Genomic sequences can also be determined and compared in this fashion. In general, identity refers to an exact nucleotide-to-nucleotide or amino acid-to-amino acid correspondence of two polynucleotides or polypeptide sequences, respectively. Two or more sequences (polynucleotide or amino acid) can be compared by determining their percent identity. The percent identity of two sequences, whether nucleic acid or amino acid sequences, is the number of exact matches between two aligned sequences divided by the length of the shorter sequences and multiplied by 100. An approximate alignment for nucleic acid sequences is provided by the local homology algorithm of Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). This algorithm can be applied to amino acid sequences by using the scoring matrix developed by Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized by Gribskov, Nucl. Säuren Res. 14(6):6745-6763 (1986). An exemplary implementation of this algorithm to determine percent identity of a sequence is provided by the Genetics Computer Group (Madison, Wis.) in the “BestFit” utility application. Other suitable programs for calculating the percent identity or similarity between sequences are generally known in the art, for example, another alignment program is BLAST, used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used using the following default parameters: genetic code=standard filter=none strand=both cutoff=60 expect=10 Matrix=BLOSUM62 Descriptions=50 sequences sort by=HIGH SCORE Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Details of these programs can be found on the GenBank website.

As various changes could be made in the above-described cells and methods without departing from the scope of the invention, it is intended that all matter contained in the above description and in the examples given below, shall be interpreted as illustrative and not in a limiting sense.