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Zirkulierende Tumorzelle vs. zirkulierende Tumor-DNA

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Ich bin ein wenig verwirrt über den Wortlaut dieser beiden Sätze und in welchem ​​Kontext der epithelial-mesenchymale Übergang stattfindet.

Zum Beispiel:

Ist es die zirkulierende Tumorzelle, die die ctDNA freisetzt, damit sie einer EMT unterzogen wird?

Oder

ctDNA vom CTC irgendwie neue Anweisungen für das Auftreten des EMT-Phänomens?

Ich denke, es gibt etwas, worüber ich grundlegend verwirrt bin und oder ich mische mehrere oder verschiedene Konzepte und Phänomene zusammen und möchte diesbezüglich eine Klärung erhalten. Vielen Dank.

EDIT: Das ist also meine neue Hypothese / Denkweise…

Wenn also eine EMT auftritt, entwickeln sich CTCs mit größerer Wahrscheinlichkeit im Zusammenhang mit Krebs, und wenn CTCs durch den Blutkreislauf zirkulieren, können CTCs als Nebenprodukt von Nekrosen apoptosiert werden und so ctDNA im Blutkreislauf und oder möglicherweise im Körper hinterlassen .

Ist das eine richtige Erklärung für meine Verwirrung?


Ich bin mir nicht sicher, welche Beziehung Sie zwischen EMT und Krebszellen aufbauen möchten.

Ja, einige "gesunde" Zellen, die sich einer EMT unterziehen, könnten (aufgrund spezifischer zugrunde liegender Mutationen) zu Krebszellen führen, aber ein solches Phänomen ist keine "harte und schnelle" Regel.

Die Mehrheit der ctDNA würde wahrscheinlich (wie Sie vermuten) aus lysierten Zellen stammen, sollten jedoch Mutationen auftreten, die einen abweichenden Export von DNA ermöglichen, könnte letzteres auftreten (ich würde annehmen, dass dies selten ist, aber basierend auf der derzeit verfügbaren Literatur dies Möglichkeit kann nicht abgezinst werden).

Daher scheint Ihre "neue Hypothese" die wahrscheinlichste zu sein.


Zirkulierende Tumor-DNA und Flüssigbiopsie in der Onkologie

Techniken zur Analyse zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) zur Erkennung, Charakterisierung und Überwachung von Krebs sind schnell ausgereift. Immer mehr klinische Beweise belegen die Fähigkeiten dieser Technologie als diagnostischer Test. Das volle Potenzial der ctDNA-Flüssigbiopsie bei der Diagnose, Charakterisierung und Behandlung solider und hämatologischer Malignome wird durch interventionelle klinische Studien zur Bewertung des klinischen Nutzens aufgedeckt. In diesem Aufsatz diskutieren wir die aktuelle Landschaft der ctDNA-Flüssigbiopsie-Anwendungen im gesamten Krebskontinuum und zeigen Möglichkeiten für klinische Untersuchungen auf.


Einführung

Brustkrebs ist weltweit die häufigste bösartige Erkrankung bei Frauen und stellt die zweithäufigste Krebstodesursache bei amerikanischen Frauen dar, nur übertroffen von Lungenkrebs. Etwa 6% bis 10% der neuen Brustkrebsfälle sind anfänglich im Stadium IV (de novo metastasierende Erkrankung) und die Zahl der metastasierten Rezidive wird auf 20 bis 30 % aller bestehenden Brusttumorfälle geschätzt (1, 2).

Die primären Ziele des metastasierten Brustkrebses (MBC) bleiben die Linderung der Symptome und die Verbesserung der Lebensqualität mit der Hoffnung, dass wirksame Behandlungen auch zu einer objektiven Remission und Verlängerung der Krankheitskontrolle führen, was sich letztendlich auf das Überleben auswirkt.

Die Auswahl der systemischen Therapiestrategie berücksichtigt eine Kombination molekularer und klinischer Faktoren mit dem Ziel, den effektivsten und am wenigsten beeinträchtigenden maßgeschneiderten Ansatz zu verwenden (3).

Insbesondere bei Patienten mit hormonsensitiven Tumoren kann die endokrine Therapie ähnliche Überlebenschancen wie eine Chemotherapie bieten (allerdings mit weniger objektivem Ansprechen) und muss als erste Wahl angesehen werden, wenn kein klinischer Nachweis einer aggressiven Erkrankung vorliegt (4–8 ). Dennoch kann eine längere Exposition gegenüber einer endokrinen Therapie zu einer erworbenen Resistenz und anschließendem Fortschreiten der Krankheit führen. Jüngste Beweise zeigten, dass aktivierende Mutationen in der Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors-α (ESR1) treten bei etwa 30 % der Patienten auf, die endokrinen Therapien ausgesetzt waren, und diese genomischen Anomalien können die Ursache der endokrinen Resistenz sein (9).

Einer der Hauptgründe für das Versagen systemischer Krebstherapien ist unsere Unfähigkeit, die Heterogenität von Brustkrebs genau zu erfassen. In diesem Wettbewerb besteht die Hoffnung, dass die Precision Medicine – gemeint ist ein Set von diagnostischen Tests und daraus resultierenden Behandlungen, die auf die Bedürfnisse einzelner Patienten ausgerichtet sind – eine Möglichkeit sein könnte, dieser Herausforderung zu begegnen (10, 11).

Liquid Biopsy ist ein Werkzeug der Präzisionsmedizin und bietet eine Echtzeit-Beurteilung von MBC zu Studienbeginn und Rezidiv durch die Analyse von Genmutationen auf ctDNA und CTCs.

Mehrere Studien (12–17) haben gezeigt, dass in ctDNA identifizierte somatische Mutationen weitgehend repräsentativ für das Tumorgenom sind und eine alternative nichtinvasive Methode darstellen können, die viele Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Gewebebiopsie (z Tumor, serielle Probenentnahme in der Regel nicht durchführbar Lit. 17). ctDNA ermöglicht es, das Ansprechen auf die Behandlung zu überwachen, um unwirksame Therapien zu vermeiden und den Nutzen neuer Medikamente zu bewerten. Zum Beispiel der Nachweis von Mutationen in der Ligandenbindungsdomäne von ctDNA ESR1 dass die konstitutive Aktivität von ER ein neuer Prädiktor für die endokrine Therapieresistenz bei MBC ist (18). Es wurde auch gezeigt, dass dynamische Veränderungen des ctDNA-Spiegels Veränderungen der Tumorbelastung genau widerspiegeln und ein Anstieg des ctDNA-Spiegels die fortschreitende Krankheit oft mehrere Monate vor der Standardbildgebung vorhersagt. Die Bestimmung der ctDNA-Spiegel kann ebenfalls ein wichtiger Indikator für die Prognose sein, jedoch sind prospektive Studien an größeren Patientenkohorten erforderlich, um die Rolle der ctDNA als prognostischer Biomarker zu validieren (10, 19).

CTCs sind Krebszellen, die aus dem Primärtumor oder metastatischen Läsionen abgestoßen wurden oder aktiv in das Gefäßsystem einwandern und im Blutkreislauf zirkulieren. Sie können zu Metastasen von primären oder anderen Läsionen (Aussaat-Hypothese) in entfernten Organen führen und sind für die überwiegende Mehrheit der krebsbedingten Todesfälle verantwortlich (20, 21). (i) Wir haben zuvor den prognostischen Wert einer CTC-Zählung ≥5 zu Studienbeginn und Nachuntersuchung bei Patienten mit MBC gezeigt (22, 23). (ii) Das Vorhandensein eines oder mehrerer CTCs sagt ein frühes Rezidiv voraus und verringert das Gesamtüberleben (OS) auch bei chemonaiven Patienten mit Nicht-MBC (24). (iii) Über die Aufzählung hinaus besteht Interesse an der genotypischen und phänotypischen Charakterisierung von CTCs. Studien zu CTCs auf Einzelzellebene können helfen, den zugrunde liegenden Mechanismus der Tumorentstehung und Metastasen aufzuklären (25, 26).

Im Gegensatz zu CTCs wurde bisher kein Cutoff von ctDNA identifiziert, der mit einer schlechteren Prognose korreliert. Das Ziel unserer Studie war es, den prognostischen Wert sowohl von CTCs als auch von ctDNA – maximaler Prozentsatz (%ctDNA), Anzahl allelischer Varianten (Mutationen) – im Hinblick auf das progressionsfreie Überleben (PFS) und das OS in der Gesamtpopulation zu untersuchen und in der Untergruppe der Patienten mit ER + Krankheit.


Zirkulierende Tumor-DNA als Krebs-Biomarker: Fakt oder Fiktion?

Felix Leung, Vathany Kulasingam, Eleftherios P. Diamandis, Dave S. B. Hoon, Kenneth Kinzler, Klaus Pantel, Catherine Alix-Panabières, Zirkulierende Tumor-DNA als Krebs-Biomarker: Fakt oder Fiktion?, Klinische Chemie, Band 62, Ausgabe 8, 1. August 2016, Seiten 1054–1060, https://doi.org/10.1373/clinchem.2016.260331

Die Idee, zellfreie DNA (cfDNA) 8 im Blutkreislauf als Surrogat-Biomarker zu verwenden, ist kein neues Konzept. Mandel und Metais haben vor fast 60 Jahren das Vorhandensein von cfDNA im Blut gesunder Personen festgestellt. Jahrzehnte später gelang es mehreren Gruppen, die Arbeit von Mandel und Metais auf die Identifizierung von tumorabgeleiteter cfDNA – auch bekannt als zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) – im Blut von Krebspatienten auszuweiten. Diese Ergebnisse legten nahe, dass eine „flüssige Biopsie“ ein praktikables klinisches Werkzeug sein könnte, da Tumore DNA-Fragmente in das Kreislaufsystem freisetzen, die sowohl nachweisbar als auch tumorspezifisch sind.

In den letzten zehn Jahren haben wir einen Anstieg sowohl neuer Technologien als auch Verbesserungen bestehender Technologien zur DNA-Sequenzierung erlebt, die diesen einst mühsamen Prozess billiger und schneller gemacht haben. Im Jahr 2009 betrugen die Kosten für die Sequenzierung pro Genom 100 000 US-Dollar, während diese Kosten 2014 auf 5000 US-Dollar sanken (unter Berücksichtigung von Arbeit, Verwaltung, Management, Versorgungsunternehmen, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien). Dadurch wird die Verwendung von ctDNA als Flüssigbiopsie immer praktikabler.

Klinisch gesehen wäre eine ctDNA-basierte Flüssigbiopsie aufgrund verschiedener Vorteile die optimale Methode der Krebsbehandlung, darunter: (ein) Die Gewinnung von ctDNA wäre minimal invasiv, insbesondere im Vergleich zu einer Gewebebiopsie (B) ctDNA könnte eine vollständige Darstellung des Tumors (sowie aller klonalen Metastasen) liefern und (C) ctDNA würde eine personalisierte Momentaufnahme der Krankheit des Patienten liefern. Obwohl die klinische Verwendung von ctDNA als Surrogat-Biomarker immer noch durch biologische und technologische Hürden behindert wird, könnten die Auswirkungen einer Flüssigbiopsie enorm sein, da es zahlreiche potenzielle Anwendungen gäbe, darunter (aber nicht beschränkt auf): Früherkennung, Überwachung minimaler Restmengen Krankheit (MRD), Beurteilung des Therapieansprechens und Triaging basierend auf dem Rezidivrisiko.

In diesem Q&A-Artikel geben 4 Experten ihren Einblick in den aktuellen Stand von ctDNA als klinisches Werkzeug für das Krebsmanagement. Sie werden insbesondere die biologischen und analytischen Herausforderungen erörtern, vor denen diese Technologie noch steht, sowie die potenziellen Vorteile dieses schnell wachsenden Bereichs der translationalen Forschung.

Was ist Ihrer Meinung nach der Hauptmechanismus für die Freisetzung von ctDNA in den Kreislauf?

Dave S. B. Hoon: Der Hauptmechanismus kann erklärt werden, indem man die multiplen Ereignisse berücksichtigt, die mit Tumorzellen verbunden sind. ctDNA im Plasma kann aus primären, metastatischen oder zirkulierenden Tumorzellen stammen. Es kann aus Tumoren durch Apoptose, Nekrose (programmiert oder nicht), Tumorzellzerstörung und/oder Zellsekretion freigesetzt werden. Wahrscheinlich beeinflussen mehrere Faktoren die gesamte ctDNA-Zusammensetzung im Blut, die vom Tumorstatus, der Belastung und der Histopathologie abhängt.

Kenneth Kinzler: Eine Möglichkeit besteht darin, dass die DNA durch das Absterben zirkulierender Tumorzellen freigesetzt wird. Die zweite Möglichkeit besteht darin, dass die DNA durch das Absterben von Tumorzellen im Tumorbett freigesetzt wird. Es gibt mehrere Beweise, die die letztere Erklärung als primäre Quelle für ctDNA stützen. Erstens haben die meisten Fälle mit nachweisbarer ctDNA keine nachweisbaren zirkulierenden Tumorzellen. Zweitens ist in den Fällen, in denen beides nachgewiesen werden kann, der ctDNA-Spiegel 1–2 Größenordnungen höher als der in zirkulierenden Tumorzellen. Drittens sind fortgeschrittene Krebsfälle oft mit erhöhten Konzentrationen von cfDNA aus normalen Zellen verbunden, vermutlich aufgrund des Absterbens und der Zerstörung normaler Zellen in den Tumorbetten.

Klaus Pantel: Grundsätzlich kann ctDNA aus Primärtumoren, zirkulierenden Tumorzellen, Mikrometastasen oder offenen Metastasen bei Krebspatienten freigesetzt werden. Der Großteil der ctDNA stammt höchstwahrscheinlich von apoptotischen und nekrotischen Tumorzellen, die ihre fragmentierte DNA in den Kreislauf abgeben. DNA wird auch von nicht bösartigen Wirtszellen freigesetzt und diese normale DNA verdünnt die ctDNA bei Krebspatienten, insbesondere in Situationen, in denen gewebeschädigende Therapien wie Chemotherapie oder Strahlentherapie verabreicht werden. Die Fragmentlänge könnte einige Informationen über den Ursprung der cfDNA liefern. Dieses Thema wird jedoch immer noch diskutiert, da verschiedene Gruppen unterschiedliche Cutoff-Werte bei Krebspatienten berichtet haben. Ein Teil dieser Diskrepanzen könnte auf die unterschiedlichen technischen Ansätze zur Bestimmung von ctDNA und Tumorarten zurückzuführen sein. Trotzdem müssen wir noch mehr über die Biologie hinter der Freisetzung von ctDNA in den Kreislauf wissen.

Catherine Alix-Panabières: Wenn Krebszellen durch Nekrose oder Apoptose sterben, gelangt ein Teil der freigesetzten DNA passiv in den Blutkreislauf, so dass die Freisetzung von cfDNA in das Blut durch sterbende Zellen nicht auf Krebspatienten beschränkt ist, sondern cfDNA im Blut von Gesunden nachgewiesen werden kann Personen, mit noch höheren Mengen bei Patienten mit gutartigen Erkrankungen oder entzündlichen Erkrankungen oder bei Patienten im Alter. "Nekrose" wird durch Faktoren außerhalb der Tumorzellen oder des Krebsgewebes verursacht, die zu einer unregulierten Verdauung und Freisetzung von Zellbestandteilen führen. „Apoptose“ ist definiert als ein kontrollierter Zelltod, der durch eine Vielzahl von physiologischen und pharmakologischen Mitteln induziert werden kann, gefolgt von DNA-Fragmentierung und Zelllyse. In beiden Fällen geben absterbende Tumorzellen kleine Stücke ihrer fragmentierten DNA in den Kreislauf ab. Da die Fragmentierung von ctDNA nach Apoptose höher zu sein scheint als nach Nekrose, sollte es möglich sein, zu bestimmen, wie ctDNA bei Krebspatienten freigesetzt wurde. Insbesondere ctDNA mit einer Länge von 160–180 bp entspricht nukleosomgeschützter DNA, die in apoptotischen Zellen beobachtet wurde. Neben der Freisetzung von DNA durch sterbende Tumorzellen deuten neuere Studien darauf hin, dass eine sehr kleine Menge DNA in Exosomen aktiv von lebenden Zellen freigesetzt werden könnte, aber dies ist immer noch umstritten. Wie ctDNA in den Kreislauf freigesetzt wird, ist eine Schlüsselfrage, denn um die ctDNA als klinischen Biomarker bei Krebspatienten zu etablieren, ist es entscheidend, in naher Zukunft aufzuklären, wie die ctDNA-Freisetzung mit der Tumorbiologie zusammenhängt, indem man Folgendes versteht: (1) von aus welchen Zellen es gewonnen wird, (2) welche spezifischen Klone zum Gesamt-ctDNA-Spiegel beitragen, der ihre klonale Belastung widerspiegelt, und (3) wie sich der ctDNA-Spiegel im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von den angewandten Krebstherapien verändert. Die Quelle der ctDNA ist von größter Bedeutung, da sie die genetische Information der klinisch relevanten Tumorzellen widerspiegeln muss. Da hauptsächlich sterbende Tumorzellen DNA freisetzen, spiegeln die Informationen, die wir aus ihrem Nachweis erhalten können, je nachdem, wann ctDNA im Blut von Krebspatienten nachgewiesen wird, möglicherweise nicht Mutationen der resistenten Klone von Tumorzellen wider, sondern die von empfindlichen Subpopulationen von Tumorzellen , meist nach Behandlungsbeginn – zB Chemotherapie, gezielte Therapie.

Wie wird ctDNA aus dem Kreislauf entfernt und wie wirkt sich das auf ihre Stabilität aus?

Dave S. B. Hoon: Die Clearance von ctDNA folgt ähnlichen physiologischen Mechanismen wie die von normaler DNA, die in den Kreislauf freigesetzt und routinemäßig von verschiedenen Organen, wie Tumoren, die in Lymphknoten, Niere und Leber abfließen, beseitigt wird. In der Tumormikroumgebung wird die Lymphdrainage wahrscheinlich die Mehrheit der freigesetzten DNA-Fragmente entfernen. Die ctDNA ist im Allgemeinen instabil, mit Ausnahme einiger Formen, die aus einem Grund, den wir nicht vollständig verstehen, eine längere Halbwertszeit zu haben scheinen. Die Form (d. h. Exosom), Größe, gebundene Molekülsubstanz (d. h. Lipid, Protein) und der Freisetzungsmechanismus spielen zusammen eine Rolle bei der ctDNA-Clearance.

Kenneth Kinzler: Die Clearance von cfDNA aus Blut wurde mit exogener DNA, fötaler DNA und Tumor-DNA in Human- und Tiermodellen untersucht. Diese Studien zeigen alle, dass DNA schnell aus dem Blut entfernt wird. Durch die Auswertung eines einzelnen Patienten, dessen Plasma nach einer vollständigen Tumorresektion mehrmals entnommen wurde, schätzten wir die Halbwertszeit der ctDNA nach der Operation auf 114 Minuten. Dennis Lo und Kollegen verfolgten die Clearance der zirkulierenden fetalen DNA bei 8 Frauen nach der Entbindung und fanden die mittlere Halbwertszeit für zirkulierende fetale DNA bei 16,3 Minuten (Bereich 4–30 Minuten). Der Clearance-Mechanismus für ctDNA wurde nicht gut untersucht, ähnelt aber wahrscheinlich dem für cfDNA aus anderen Quellen und kann mit dem physiologischen Zustand des Patienten variieren. Eine Kombination aus Nukleaseabbau, renaler Clearance und Aufnahme durch Leber und Milz dürfte eine Rolle spielen.

Klaus Pantel: Die Clearance von ctDNA ist nicht vollständig geklärt. Frühere Berichte weisen darauf hin, dass ctDNA eine Halbwertszeit von 16 Minuten hat. Eine aktuelle Studie derselben Gruppe verwendete jedoch Next Generation Sequencing (NGS), um die Kinetik von ctDNA zu untersuchen, die eine biphasische Clearance mit Halbwertszeiten von etwa 1 h für die schnelle Phase und 13 h für die zweite Phase zeigte. Es wird davon ausgegangen, dass der Großteil der ctDNA über die Nieren ausgeschieden wird, was in letzter Zeit das Interesse am Nachweis von ctDNA im Urin geweckt hat, nicht nur bei Krebserkrankungen des Urogenitaltrakts. Es ist vorstellbar, dass die Clearance-Rate von ctDNA bei Patienten mit Nierenfunktionsstörung beeinflusst wird. Dieser Aspekt muss weiter untersucht werden, da er ein wichtiger Störfaktor sein könnte, der die Menge an ctDNA im Blutkreislauf moduliert. Zusätzlich zur renalen Clearance kann DNA durch andere Mechanismen aus dem Kreislauf entfernt werden. DNA ist zum Beispiel klebrig und kann auch an Wirtszellen wie Endothelzellen anhaften, die die Blutgefäße auskleiden, es ist nicht ausgeschlossen, dass diese DNA wieder ins Blut abgegeben wird. Mehrere Berichte weisen darauf hin, dass ctDNA sogar von Wirtszellen aufgenommen werden kann und diese Aufnahme die Biologie dieser Zellen beeinflusst. Daher müssen die Mechanismen der ctDNA-Clearance und ihre Auswirkungen auf die ctDNA-Stabilität noch weiter untersucht werden.

Catherine Alix-Panabières: Die Clearance von ctDNA, „wie lange die Klärung dauert und wie sie durchgeführt wird“, ist derzeit nicht gut verstanden und wird noch untersucht. Bekannt ist, dass ctDNA im Blut von Krebspatienten tatsächlich eine begrenzte Stabilität besitzt, da auch im Blut vorhandene DNasen sie schnell verdauen. Daher hat ctDNA eine kurze Halbwertszeit von wenigen Stunden im Blutkreislauf, was auf Möglichkeiten für frühe Auslesungen hindeutet. Dieses genetische und fragmentierte Material kann bei Krebspatienten rasche Veränderungen erfahren, und die Zeitpunkte der Blutentnahme sind entscheidend und bei der Planung einer klinischen Studie im Voraus nicht leicht zu bestimmen. Darüber hinaus ist die Freisetzung von ctDNA durch sterbende Tumorzellen höchstwahrscheinlich zwischen Krebspatienten je nach Tumortyp, Tumorstadium, Ansprechen von Krebspatienten auf die Therapie, Tumorlast und Zellreplikation sehr unterschiedlich.

ctDNA kann in verschiedenen Aspekten wie Punktmutationen, Aneuploidie, Umlagerungen und Methylierung untersucht werden. Was können aktuelle Sequenzierungstechnologien untersuchen?

Dave S. B. Hoon: Es stehen mehrere Techniken zur Verfügung, um einzelne Formen genomischer und epigenomischer ctDNA-Aberrationen zu untersuchen. Jedes hat seine Vorzüge und einige wurden in klinischen Studien effizienter verifiziert als andere. Am wichtigsten ist die Spezifität und Sensitivität des einzelnen Assays, die stark mit dem klinischen Nutzen der ctDNA zusammenhängt. Die digitale Sequenzierung kleiner Moleküle ermöglicht derzeit einen sehr empfindlichen und spezifischen Ansatz für den Nachweis von Punktmutationen und Amplifikationen von ctDNA.

Kenneth Kinzler: Somatische Punktmutationen, Umlagerungen, Aneuploidie und Methylierung wurden alle verwendet, um ctDNA mit NGS zu identifizieren. Diese Ansätze zur Unterscheidung von normaler von Tumor-DNA variieren hinsichtlich ihrer Sensitivität, Spezifität und Praktikabilität, wenn sie auf ctDNA angewendet werden. Während die spezifische klinische Anwendung bestimmen kann, welcher Ansatz optimal ist, haben wir festgestellt, dass die Verwendung von Punktmutationen die beste Kombination von Attributen für die meisten der von uns untersuchten klinischen Anwendungen bietet.

Klaus Pantel: Es wurden hochempfindliche und spezifische Methoden zum Nachweis von ctDNA entwickelt, wie BEAMing, Safe-SeqS, TamSeq und digitale PCR zum Nachweis einzelner Nukleotidmutationen in ctDNA oder Sequenzierung des gesamten Genoms zur Feststellung von Kopienzahländerungen. Grundsätzlich können die Technologien in gezielte Ansätze unterteilt werden, die darauf abzielen, Mutationen in einer Reihe vordefinierter Gene zu erkennen [z. B. KRAS-Proto-Onkogen, GTPase (KRAS) im Zusammenhang mit der EGFR-Blockade (Epidermal Growth Factor Receptor) durch Antikörper] oder nicht zielgerichteten Ansätzen (z. B. Array-CGH (comparative genomic hybridization), Whole-genom-Sequenzierung oder Exom-Sequenzierung), die darauf abzielen, das Genom zu screenen und neue genomische Aberrationen zu entdecken B. solche, die Resistenz gegen eine spezifische zielgerichtete Therapie verleihen (Murtarza et al., Nature 2013497:108–112). Die Stärken und Grenzen dieser Technologien wurden kürzlich in exzellenten Übersichtsartikeln diskutiert. Im Allgemeinen haben gezielte Ansätze eine höhere analytische Sensitivität als ungezielte Ansätze, trotz starker Bemühungen, die Nachweisgrenzen zu verbessern. Ein europäisches IMI (Innovative Medicines Initiative) Konsortium von mehr als 30 Institutionen aus Wissenschaft und Industrie [genannt CANCER-ID www.cancer-id.eu wissenschaftlicher Koordinator, Klaus Pantel EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations) Koordinator, Thomas Schlange] konzentriert sich nun auf Flüssigbiopsien. Das Hauptziel besteht darin, die verschiedenen cfDNA-Technologien nebeneinander zu validieren, zunächst in Ringexperimenten zwischen verschiedenen Institutionen und anschließend in multizentrischen klinischen Studien.

Catherine Alix-Panabières: Der Nachweis von ctDNA in der gesamten cfDNA im Plasma erfordert den Einsatz molekularer Methoden und basiert auf den genetischen oder epigenetischen Unterschieden zwischen normaler und tumorabgeleiteter DNA. Die Targets für den ctDNA-Nachweis sind (1) Mutationen mit bekannter oder vorhergesagter funktioneller Relevanz (Onkogen-aktivierende Mutationen und Tumorsuppressor-inaktivierende Mutationen), (2) Mutationen ohne oder unbekannter funktioneller Relevanz (somatische Chromosomenumlagerungen, nichtkodierende DNA-Mutationen und DNA-Varianten ) und (3) epigenetische Modifikationen (Methylierungsstatus von Schlüsselsequenzen und Histonmodifikationen). Einige der aktuellen Technologien, mit denen ctDNA untersucht werden kann, umfassen: (ich) Technologie, die Pyrophosphorolyse-aktivierte Polymerisation und allelspezifische Amplifikation während der PCR kombiniert (ii) eine Reihe digitaler genomischer Methoden, die die Identifizierung genetischer Veränderungen in der ctDNA verbessern (iii) eine PCR-basierte Methode, die die Durchführung von Einzelmolekül-PCR-Reaktionen auf magnetischen Beads in Wasser-in-Öl-Emulsionen ermöglicht, der BEAMing-Ansatz (NS) Andere digitale PCR-Technologien, die digitale Tröpfchen-PCR und mikrofluidische Systeme umfassen (v) PCR-Amplifikation gefolgt von NGS. Von NGS analysierte Plasma-cfDNA kann bestimmen (ein) das Vorhandensein einer bestimmten Mutation und die Schätzung ihrer Allelfrequenz innerhalb einer Probe und (B) die Gesamtgenom-Charakterisierung des gesamten Mutationsrepertoires bei einem Krebs. Um schließlich eine Vorstellung von der hohen Sensitivität verbesserter Technologien für den ctDNA-Nachweis zu bekommen, wurde berichtet, dass digitale PCR und BEAMing somatische Punktmutationen mit Sensitivitäten von 1 % bis 0,001 % nachweisen können. Neben der Untersuchung von Punktmutationen und Kopienzahländerungen kann die Bewertung des Methylierungsstatus von Tumorsuppressor- und Metastasensuppressorgenen in ctDNA durch methylierungsspezifische Echtzeit-PCR-Assays bewertet werden. Alle diese Technologien wurden mit verschiedenen In-vitro-Sensitivitäten unter Verwendung von Krebszelllinien berichtet, klinische Ergebnisse und deren entsprechende Bewertung sind jedoch noch in klinischen Studien im Gange.

In letzter Zeit haben wir das Aufkommen neuer Sequenzierungstechnologien wie Tagged-Amplicon Deep Sequencing (TAM-Seq) und CAncer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAPP-Seq) beobachtet. Was sind die Vorteile dieser neueren Technologien gegenüber den „älteren“?

Dave S. B. Hoon: Die neueren Techniken bieten ein direkteres Targeting, sind aber nicht unbedingt besser als neuere Ansätze von NGS. NGS in der digitalen Analyse kleiner Moleküle ist ein hochempfindlicherer und spezifischerer Ansatz als herkömmliche NGS. Herkömmliches paralleles NGS ist kostspielig und begrenzt. Die Erkennungstechniken entwickeln und verbessern sich schnell. Neuere Ansätze können nur dann als effizient angesehen werden, wenn der klinische Nutzen robust nachgewiesen ist.

Kenneth Kinzler: Viele Methoden können ctDNA in fortgeschrittenen Fällen nachweisen, in denen der Anteil der ctDNA mehr als 5% der gesamten DNA ausmachen kann. Jedoch erfordert die Maximierung des Anteils der Fälle mit nachweisbarer ctDNA, insbesondere im Fall einer frühen Erkrankung, Verfahren, die einige mutierte Moleküle nachweisen können, wenn sie <0,1% der Gesamt-DNA darstellen. Glücklicherweise ermöglichen digitale Ansätze (z. B. digitale PCR, BEAMing und SafeSeqS) den Nachweis und die genaue Quantifizierung selbst bei diesen niedrigen Konzentrationen.

Klaus Pantel: Der Hauptvorteil dieser neueren Technologien ist ihre höhere Empfindlichkeit. „Ältere“ Technologien wurden in Proof-of-Principle-Studien verwendet, bei denen das Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs analysiert wurde, bei denen die ctDNA-Menge sehr hoch ist und 50% der Gesamtmenge an cfDNA überschreiten kann. Diese Technologien sind jedoch nicht in der Lage, kleinere Mengen an ctDNA im „Meer“ der normal zirkulierenden cfDNA nachzuweisen, was insbesondere dann eine klare Einschränkung darstellt, wenn wir unsere Analysen auf Patienten mit MRD oder Krebsfrüherkennung ausweiten. Für diese Situationen wurde eine zunehmende Zahl viel empfindlicherer Technologien entwickelt, die ctDNA in bemerkenswert niedrigen Konzentrationen wie 0,00025% für die CAPP-Seq-Technologie nachweisen können. Allerdings könnten nun die Gesamtmenge an cfDNA und die verfügbare Anzahl an Genomäquivalenten eine wichtige Einschränkung darstellen. Um die bemerkenswerten Sensitivitäten dieser neuen Assays zu erreichen, muss daher die Größe der Plasmaprobe beträchtlich erhöht werden, um eine ausreichende Menge an ctDNA für die Analyse zu erhalten. In dieser Hinsicht stehen ctDNA-Analysen bei Krebspatienten im Frühstadium vor den gleichen Problemen wie zirkulierende Tumorzellanalysen. Daher ist das Versprechen, dass eine ctDNA-Analyse Krebs aus einem Blutstropfen erkennt, irreführend.

Catherine Alix-Panabières: Standard-PCR-basierte Assays haben eine relativ begrenzte Sensitivität und können keine Mutationen erkennen, die <5% bis 10% des Gesamtpools der Allele ausmachen. Tatsächlich produzieren sie viele Artefakte, insbesondere wenn die ctDNA-Mengen eher gering sind, während neue Technologien in der Lage sind, sehr geringe ctDNA-Mengen nachzuweisen. Die Identifizierung somatischer genetischer und epigenetischer Aberrationen wurde jetzt durch das Aufkommen hochspezifischer und sensitiver Techniken erleichtert (z. B. Bereich von 1% bis 0,001% für digitale PCR und BEAMing). Dies beinhaltet den Erhalt unterschiedlicher klinischer Informationen: Bei neueren, empfindlicheren Technologien können wir uns den Nutzen bei der Diagnose von Krebs, der Erkennung von Krebs im Frühstadium und der Erkennung von MRD vorstellen, während bei älteren Technologien nur fortgeschrittene und metastasierte Stadien Krankheiten erkannt und ausgewertet werden.

Was ist die größte technische Herausforderung, vor der wir bei der Genotypisierung von ctDNA noch stehen?

Dave S. B. Hoon: Das größte technische Problem oder die Achillesferse ist die Isolierung von ctDNA aus kleinen Mengen Serum/Plasma. Diese Isolationsbarriere wird die nachgelagerte Analyse beeinflussen. Erhalten wir die gesamte ctDNA genau? Die Testempfindlichkeit bleibt ein Hauptproblem. Die wichtigste technische Herausforderung besteht darin, zu bestimmen, welcher Anteil an ctDNA von klinischem Nutzen ist. Dies wird wahrscheinlich je nach Krebsart variieren, abhängig vom klinischen Status des Patienten und davon, welche Frage der spezifische Assay-Biomarker ctDNA anspricht.

Kenneth Kinzler: Die fortschreitende Technologie hat den Nachweis von ctDNA möglich gemacht und zukünftige Fortschritte werden solche Assays wahrscheinlich noch robuster und kosteneffektiver machen. Allerdings sind diese Assays, wie auch die aktuellen, wahrscheinlich eher durch praktische und biologische als durch technische Probleme eingeschränkt. Auf der praktischen Seite sind wir durch die Anzahl der zellfreien Moleküle begrenzt, die in einer Plasmaprobe vorhanden sind. Zum Beispiel enthält 1 ml Plasma typischerweise etwa 3000 Kopien eines bestimmten Gens, was unsere Fähigkeit zum Nachweis von ctDNA auf 1 von 15 000 Kopien bei einer 5-ml-Plasmaprobe beschränkt. Auf der biologischen Seite setzt nur ein kleiner Teil gutartiger Tumoren und einiger Tumorarten (z. B. Glioblastome) nachweisbare Konzentrationen an ctDNA frei, selbst wenn sie mit sehr empfindlichen Assays unter nahezu optimalen Bedingungen getestet werden. Einige der Einschränkungen bei der Verwendung von ctDNA als Biomarker können durch größere Probenvolumina und alternative Protokolle oder Orte für die Blutentnahme umgangen werden. Schließlich hat sich Tumor-DNA in anderen leicht verfügbaren klinischen Proben wie Stuhl-, Urin-, Sputum-, Speichel- und Pap-Abstrichproben als vielversprechender Krebs-Biomarker erwiesen.

Klaus Pantel: Die größte technische Herausforderung ist die Identifizierung sehr geringer Mengen an ctDNA in Blutproben mit unterschiedlichen Mengen an cfDNA und die Auswahl des richtigen Panels krebsspezifischer genomischer Aberrationen. Wenn die genomischen Aberrationen durch die Wahl der verfügbaren zielgerichteten Therapie definiert werden, scheint diese Aufgabe mit den vorhandenen Technologien machbar zu sein. Wenn die ctDNA-Analyse jedoch zum Screening von MRD bei Krebspatienten oder sogar zur Früherkennung von Primärerkrankungen bei „gesunden Personen“ verwendet wird, sind die genomischen Aberrationen bei einem einzelnen Patienten unbekannt. Bei Patienten mit MRD könnte der Primärtumor (oder zumindest eine Biopsie) für die Sequenzierung verfügbar sein. Dennoch ist die Qualität dieser formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben sehr variabel. Für die Früherkennung steht kein Tumormaterial zur Verfügung und das Spektrum möglicher genomischer Aberrationen ist bei den meisten soliden Tumoren beträchtlich. Darüber hinaus ist bekannt, dass krebsassoziierte Mutationen mit zunehmendem Alter auch bei Personen auftreten, die im Laufe ihres Lebens nie an Krebs erkranken. Eine aktuelle Studie hat beispielsweise gezeigt, dass bis zu 15% der gesunden Personen über 65 Jahre an somatischen Leukämiemutationen leiden, aber nur bei einer Minderheit dieser Patienten wurde Leukämie diagnostiziert. Somit weist der Nachweis von krebsassoziierten Mutationen auf der cfDNA möglicherweise nicht darauf hin, dass die getestete Person bereits an Krebs erkrankt ist oder im Laufe ihres Lebens an Krebs erkranken wird, aber es kann zu umfangreichen diagnostischen Verfahren wie CT- und MRT-Scans zur Suche nach einem mutmaßlich unbekannten Tumor führen Läsion.

Catherine Alix-Panabières: Zunächst müssen präanalytische Schritte standardisiert werden, bevor ctDNA in optimierter Weise nachgewiesen werden kann, z Reproduzierbare und robusteste Methodik ist dann eine vollständige Bewertung der analytischen Leistung (zB Robustheit, Reproduzierbarkeit, Sensitivität, Spezifität, interne und externe Qualitätskontrollen) sowie der Analysezeit von der Blutentnahme bis zum Ergebnis zurück zum Krebspatienten erforderlich. All diese technischen Punkte müssen berücksichtigt werden, aber noch wichtiger ist es, die klinische Relevanz von ctDNA zu verschiedenen Zeitpunkten zu bewerten, um verschiedene Schlüsselfragen in Bezug auf Anwendungen zu beantworten, wie z Rückfall oder Definition einer Behandlungsresistenz. Darüber hinaus müssen wir bei der Früherkennung von Krebs bedenken, dass (1) spezifische Mutationen bekannt sein müssen, um ctDNA nachzuweisen [z. KRAS oder B-Raf-Proto-Onkogen, Serin/Threonin-Kinase (BRAF) Mutation bei Dickdarmkrebs] und (2) viele Menschen haben gutartige Tumore (z. B. Hauttumore), die Mutationen tragen, die mit krebsassoziierten Mutationen überlappen und zu falsch positiven Befunden führen können, wenn ctDNA für die Krebsvorsorge verwendet wird.

Wie lange wird es Ihrer Meinung nach dauern, bis wir die Einführung von ctDNA in die klinische Praxis sehen?

Dave S. B. Hoon: Wir treten derzeit in eine Zeit ein, in der ctDNA-Assays in CLIA-akkreditierten Labors durchgeführt werden. Die ctDNA-Tests werden von den Kostenträgern des Gesundheitswesens und auch von einzelnen Patienten erstattet. Hoffentlich sehen wir in einigen Jahren die Zulassung bestimmter ctDNA-Assays für bestimmte Krebsarten durch die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA).

Kenneth Kinzler: Während es spekulativ ist, vorherzusagen, wann eine neue Technologie in die klinische Praxis eingeführt wird, gibt es eine wachsende Zahl von Studien, die darauf hindeuten, dass ctDNA in bestimmten klinischen Situationen die derzeit verwendeten klinischen Krebs-Biomarker übertreffen kann. Dementsprechend hoffe und erwarte ich, dass ctDNA-Messungen in den nächsten 5–10 Jahren in immer mehr Situationen als Entscheidungshilfe für klinische Entscheidungen dienen.

Klaus Pantel: Die blutbasierte Stratifizierung zielgerichteter Therapien ist wahrscheinlich die Eintrittskarte für die Einführung der ctDNA-Analyse in die klinische Praxis. Vor kurzem wurde der erste ctDNA-Test für den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Mutationen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) wurde von der FDA für den Fall zugelassen, dass kein Tumorgewebe biopsiert werden kann. Weitere Tests auf Mutationen in Genen, die für therapeutische Targets und/oder die entsprechenden Resistenzgene kodieren, werden in naher Zukunft folgen. NSCLC ist eine interessante Tumorentität für diese Anwendung, da vor kurzem verschiedene Mutationen identifiziert wurden, die spezifische zielgerichtete Therapien in kleinen Kohorten von ansprechenden Patienten steuern, und Biopsien bei einer beträchtlichen Anzahl von Patienten nicht leicht zu erhalten sind. Es muss jedoch betont werden, dass weder DNA-Analysen von ctDNA noch Tumorgewebe ein dauerhaftes und lebensverlängerndes Ansprechen des Patienten auf die jeweiligen Therapeutika garantieren. Der klinische Nutzen der ctDNA-Analyse (wie jeder andere diagnostische Test) muss in randomisierten klinischen Interventionsstudien nachgewiesen werden, in denen Therapieentscheidungen auf der ctDNA-Analyse basieren, dh kann die ctDNA-Analyse die Behandlung eines einzelnen Krebspatienten steuern und ändert sich dies? zu einem verbesserten Überleben führen? Es kann viele Jahre dauern, bis diese Studien abgeschlossen und von der medizinischen Gemeinschaft akzeptiert werden. Die jüngsten Ergebnisse der multizentrischen, offenen, Proof-of-Concept, randomisierten, kontrollierten Phase-2-Studie SHIVA waren eher enttäuschend, dass der Einsatz von molekular zielgerichteten Wirkstoffen außerhalb ihrer Indikationen das progressionsfreie Überleben im Vergleich zur Behandlung nach Wahl des Arztes nicht verbesserte stark vorbehandelte Patienten mit Krebs. Die Überwachung von ctDNA auf Mutationen, die Resistenzen gegen zielgerichtete Therapien verleihen, könnte auch dadurch erschwert werden, dass wir noch wenig über die dynamische Biologie der Freisetzung von ctDNA wissen. ctDNA stellt hauptsächlich das Genom absterbender Tumorzellen dar, aber lebensfähige Tumorzellen treiben die Krebsprogression voran und verursachen Therapieresistenz. Daher wird die Auswahl der geeigneten Zeitpunkte für das ctDNA-Screening entscheidend sein, um diejenigen ctDNA-Spezies nachzuweisen, die von den resistenten Tumorzellklonen abgeleitet sind. In diesem Zusammenhang könnte die parallele Bestimmung lebensfähiger zirkulierender Tumorzellen als Frühindikatoren für ein Therapieversagen den in der Klinik eingesetzten Standard-Tumormarkern überlegen sein.

Catherine Alix-Panabières: Die Entwicklung molekularer Tests zur Entscheidungsfindung bei der Behandlung, gekoppelt mit technologischen Entwicklungen, ist in den letzten Jahren in Mode gekommen und wir hoffen immer noch, dass die Echtzeit-Flüssigbiopsie zu nicht-invasiven und sensitiven Methoden zur Erkennung und Überwachung von Krebs bei Patienten führen wird. Die Einführung von ctDNA in die klinische Praxis kann jedoch mehrere Jahre dauern, da wir definieren müssen, welche Technologie für die ctDNA-Vorbereitung (präanalytische Schritte) und den Nachweis die beste ist, was die Endpunkte sein werden und ob die ctDNA-Analyse informativer und unabhängig von aktuellen Standards wie Gewebebiopsien. Wie bereits erwähnt, müssen wir die klinische Relevanz von ctDNA und vor allem ihren klinischen Nutzen bewerten, die Schlüsselfrage für die personalisierte Medizin. Darüber hinaus müssen für das primäre Screening sehr große Kohorten von Krebspatienten und übereinstimmenden Kontrollpersonen prospektiv analysiert werden, einschließlich Patienten mit gutartigen Erkrankungen als Kontrollgruppe. Betrachtet man andere Screening-Ansätze [z. B. PSA (Prostata-spezifisches Antigen) bei Prostatakrebs oder Mammographie bei Brustkrebs] erfordert diese Anstrengung Tausende von Patienten und Kontrollen und Beobachtungszeiträume von 10 Jahren oder mehr.

Anmerkung von Moderatoren hinzugefügt: Nachdem diese Fragen und Antworten abgeschlossen waren, gab der Sequenzierungsgigant Illumina die Gründung eines neuen Unternehmens, Grail, mit dem Ziel bekannt, Bluttests zu entwickeln, die weniger als 1000 US-Dollar kosten und in der Lage sind, viele Krebsarten in asymptomatischen Stadien zu erkennen. Die Tests basieren auf „Liquid Biopsies“ (Bluttests) und der Sequenzierung isolierter ctDNA. Das Unternehmen hat bereits 100 Millionen US-Dollar aufgebracht und umfasst hochkarätige Investoren wie Bill Gates (Microsoft) und Jeff Bezos (Amazon). Der CEO von Illumina geht davon aus, dass diese Tests bis 2019 die Verbraucher erreichen und in Arztpraxen verfügbar sein werden.


Zirkulierende Tumorzellen

CTCs können im Blutkreislauf von Krebspatienten als einzelne Zellen oder seltener als Zellcluster gefunden werden, und CTC-Spiegel haben einen klinischen Zusammenhang mit dem Überleben und dem Ansprechen auf die Therapie (7). CTCs werden mutmaßlich von Primärtumoren oder entfernten Metastasenherden in das Gefäßsystem abgegeben und enthalten vermutlich Subpopulationen von „schuldigen Zellen“, die für die Aussaat und Neuaussaat von Metastasen verantwortlich sind, was schließlich zum Tod des Patienten führt (8). Es ist daher attraktiv, CTCs nicht nur zur Messung der Krankheitslast und zum Nachweis minimaler Resterkrankungen aufzuzählen, sondern auch CTCs als Mittel zur gezielten Therapie dieser mutmaßlichen Täterzellen zu charakterisieren.

CTC-Anreicherungs- und -Detektionstechnologien

Mehrere Übersichtsartikel haben die verschiedenen Technologien zur Anreicherung und Detektion von CTC diskutiert (7, 9–12). Tabelle 1 enthält eine aktualisierte Liste von CTC-Assays, die in den letzten 5 Jahren zum Testen von Patientenproben verwendet wurden, zusammen mit ihrem Vermarktungsstatus. CTC-Nachweis- oder -Fängermethoden können grob als markierungsabhängig kategorisiert werden, wobei positive Anreicherung mit Zelloberflächenmarkern wie dem Epithelzelladhäsionsmolekül (EPCAM) verwendet wird, das auch in in vivo Fangtechniken oder markierungsunabhängige Anreicherung von CTCs basierend auf negativer Selektion, Größe oder anderen biophysikalischen Eigenschaften. Andere Strategien umfassen die direkte Bildgebung von CTCs und funktionelle Assays. Ein wesentliches Problem beim Nachweis und Einfangen von CTCs durch markierungsabhängige Methoden ist das Fehlen zuverlässiger immunzytochemisch identifizierbarer Marker, die sie von normalen Epithelzellen unterscheiden. Da Epithelzellen in Blutproben von gesunden Personen selten vorhanden sind und zirkulierende Epithelzellen (CEC) bei Krebspatienten oft die gleichen genetischen Aberrationen aufweisen, die beim Primärtumor beobachtet werden (13), war die gemeinsame Definition von CTCs gleichwertig zu der von CECs: kernhaltige Zellen im Blutkreislauf, die epitheliale Zytokeratine exprimieren und das Oberflächenantigen der weißen Blutkörperchen CD45 nicht exprimieren.In jüngerer Zeit wurden Cytokeratin-negative CTCs identifiziert, die möglicherweise Tumorzellen darstellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen, oder alternativ Krebsstammzellen, die noch keine epitheliale Differenzierung gezeigt haben (14–17).

CTC-Nachweis-/Fangmethoden mit kürzlich veröffentlichten klinischen Studien, 2010–2015

CTCs in klinischen Studien

Einige der in Tabelle 1 aufgeführten Technologien können unterschiedliche CTC-Subpopulationen erkennen und könnten daher in Zukunft in verschiedenen klinischen Szenarien eingesetzt werden. Für jede in der Klinik einzusetzende Technologie ist jedoch der Nachweis der analytischen Validität (die Genauigkeit des Tests zur Messung des interessierenden Ziels), der klinischen Validität (der Wert des Tests zur Vorhersage des klinischen Ergebnisses) und letztendlich des klinischen Nutzens ( Fähigkeit des Tests, zu einem verbesserten klinischen Ergebnis zu führen, wenn die Behandlungswahl durch die Testergebnisse bestimmt wird) ist erforderlich (9, 18). Das einzige derzeit von der FDA zugelassene System zur Überwachung von Patienten mit metastasiertem Brust-, Darm- oder Prostatakrebs ist CELLSEARCH (Janssen Diagnostics Refs. 19–21). Jüngste Daten legen nahe, dass diese Technologie auch für klinische Studien in mehreren Labors im nicht metastasierten Umfeld verwendet werden kann, vorausgesetzt, dass kontinuierliches Training und eine zentrale Bildprüfung durchgeführt werden (22).

Im April 2015 ergab eine Suche auf der Website „ClinicalTrials.gov“ nach dem Stichwort „zirkulierende Tumorzelle“ 296 Studien mit CTCs. Tabelle 2 bezieht sich auf Studien an mehreren Tumortypen, die eine CTC-Auszählung oder -Charakterisierung als Einschlusskriterium verwenden. Tabelle 3 bezieht sich auf Studien zur Entwicklung und/oder Validierung von CTC-Assays für eine bestimmte Indikation.

Laufende Studien mit CTC-Nachweis oder -Charakterisierung als Einschlusskriterium

Studien zur Entwicklung und/oder Validierung von CTC-Assays für eine bestimmte Indikation

CTC-Aufzählung

Eine aktuelle gepoolte Analyse lieferte Level-1-Evidenz für die klinische Validität von erhöhten CTC-Spiegeln als Marker für eine schlechte Prognose bei metastasiertem Brustkrebs (23). Der Wert der CTC-Zählung für die Behandlungsentscheidung bei metastasiertem Brustkrebs wurde jedoch prospektiv in der klinischen Studie S0500 der Southwest Oncology Group (SWOG) getestet (24). Die SWOG-Studie untersuchte den Nutzen einer frühzeitigen Änderung der Chemotherapie für Patienten mit anhaltend erhöhten CTCs bei der ersten Nachuntersuchung nach Beginn der Erstlinien-Chemotherapie. Von 595 auswertbaren Patienten wurden 123 Patienten mit anhaltend erhöhten CTCs am 21. Therapietag randomisiert, um entweder die gleiche Behandlung fortzusetzen oder auf eine alternative Chemotherapie nach Wahl des Arztes umzustellen. In dieser Studie erhöhte ein früher Wechsel zu einer alternativen Chemotherapie das Gesamtüberleben (OS) nicht. Obwohl CTCs stark prognostisch waren, deutet das Fehlen eines Überlebensvorteils eines Behandlungswechsels aufgrund erhöhter CTC-Zahlen darauf hin, dass eine frühere Erkennung von Rückfällen nur dann wichtig sein kann, wenn eine wirksamere Behandlung verfügbar ist: Der Wechsel von einer unwirksamen Therapie zu einer anderen unwirksamen Therapie ändert sich nicht. Ergebnis. Stattdessen könnte eine Änderung der Behandlung basierend auf der molekularen Charakterisierung von CTC ein vielversprechenderer Testansatz sein.

Bei nicht metastasiertem Brustkrebs ist der Nachweis erhöhter CTC-Spiegel mit CELLSEARCH und anderen Plattformen (25–29) ebenfalls mit einer ungünstigen Prognose verbunden. Die laufende Treat CTC-Studie (NCT01548677 Tabelle 2) bewertet die CTC-Dynamik als frühes Signal für die Wirkstoffaktivität. In diese Studie werden Frauen mit primärem Hochrisiko eingeschlossen HER2-nicht amplifizierter Brustkrebs, der nach Abschluss der Operation und (neo)adjuvanter Chemotherapie nachweisbare CTCs aufweist. Dabei wird bewertet, ob sechs Zyklen Trastuzumab (ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der auf den HER2-Wachstumsfaktor-Rezeptor abzielt) im Vergleich zur alleinigen Beobachtung die persistierenden CTCs eliminieren. Diese Studie basierte auf mehreren Beweislinien: (i) In präklinischen Modellen scheint Trastuzumab auf die Krebsstammzellpopulation in einem Prozess abzuzielen, der nicht erforderlich ist HER2 Genamplifikation (30) (ii) Teilmengenanalysen prospektiver Studien zeigen einen ähnlichen Nutzen von Trastuzumab für Frauen mit HER2-positiven Tumoren durch lokale Testung, aber als HER2-negativ durch zentrale pathologische Überprüfung (31, 32) und (iii) eine monozentrische randomisierte Phase-II-Studie mit 75 Patientinnen mit HER2-negativem Brustkrebs im Frühstadium ergab, dass Trastuzumab mit kurzer Behandlungsdauer chemotherapieresistente CK19-mRNA-positive CTCs eliminieren und das Patientenergebnis im Vergleich zur Beobachtung verbessern kann (33). Zusätzliche Studien mit CTCs bei Brustkrebs sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

Es wurde auch gezeigt, dass die CTC-Zählung prognostische Informationen beim metastasierten kastrationsresistenten Prostatakarzinom liefert (34, 35). In der COU-AA-301-Registrierungsstudie, in der Abirateron plus Prednison mit Prednison allein verglichen wurde, erwies sich die Kombination aus CTC-Zählung und Laktatdehydrogenase (LDH)-Spiegel 12 Wochen nach der Behandlung als Surrogat für das OS auf individueller Patientenebene (36) . Die Bemühungen zur Validierung dieses Biomarker-Panels laufen.

Klinische Studien mit CTCs bei anderen Tumorarten als Brust- und Prostatakrebs sind in den Tabellen 2 und 3 beschrieben.

CTC-Charakterisierung

Proteinexpression in CTCs.

Über die CTC-Zählung hinaus wurde die Charakterisierung der Proteinexpression auf CTCs auch verwendet, um die Behandlungsauswahl in klinischen Studien zu leiten (Tabelle 2). Bei Brustkrebs wurde die HER2-Proteinexpression auf CTCs mit der CELLSEARCH-Technologie bewertet, wobei gezeigt wurde, dass einige Frauen mit HER2-negativem Brustkrebs nachweisbare HER2-positive CTCs aufweisen können (37, 38). Eine Phase-II-Studie mit Lapatinib als Monotherapie (einem Anti-HER2-Tyrosinkinase-Inhibitor) zeigte jedoch bei Patienten mit metastasiertem Brustkrebs mit HER2-negativen Primärtumoren und HER2-positiven CTCs zu Studienbeginn kein objektives Ansprechen (39). Von 139 gescreenten HER2-negativen Patienten hatten nur 96 (69 %) ≥ 2 CTCs und nur 7 (5%) 50 % HER2-positive CTCs und erhielten eine Behandlung. Ein Patient (1 von 139 gescreenten Patienten) zeigte eine dauerhafte Stabilisierung der Krankheit, nachdem er Lapatinib als dritte Therapielinie erhalten hatte, obwohl eine Wirksamkeitsanalyse aufgrund der geringen Anzahl behandelter Patienten nicht durchgeführt werden konnte. Bemerkenswert ist, dass von den 7 behandelten Patienten die 6 mit fortschreitender Krankheit Lapatinib als vierte-Linien-Therapie bei fortgeschrittener Erkrankung erhielten, was die Frage aufwirft, ob der HER2-Status von CTCs den HER2-Status der Mehrheit der Metastasen im sehr späten Stadium der Erkrankung repräsentiert. Eine laufende Phase-III-Studie (DETECT III, NCT01619111) untersucht die Rolle der zusätzlichen Chemotherapie mit Lapatinib bei derselben Patientenpopulation (Tabelle 2). Andere Forscher verwenden CELLSEARCH zur Überwachung der endokrinen Resistenz bei ER-positivem HER2-negativem metastasiertem Brustkrebs. Zu diesem Zweck wird derzeit im COMETI . ein Score auf Basis der CTC-Auszählung und -Charakterisierung für Östrogenrezeptor (ER), Bcl-2, HER2 und Ki67, der CTC-Endocrine Therapy Index (CTC-ETI Ref. 40), getestet Phase-II-Studie (NCT01701050 Tabelle 3).

Die CTC-Proteinexpression wurde auch bei anderen Tumorarten charakterisiert. Bei Patienten mit metastasierendem Kolorektalkarzinom wurde die Expression von Thymidylat-Synthase in CTCs als potenzieller Marker für eine Resistenz gegenüber 5-Fluorouracil untersucht (41). Immunfluoreszenzmarker wurden verwendet, um die Androgenrezeptor(AR)-Signalgebung in CTCs von Patienten mit metastasiertem Prostatakrebs zu untersuchen, um hormonelle Behandlungsansätze anzupassen (42).

RNA-Expression in CTCs.

Ein aufstrebendes Forschungsgebiet ist die transkriptionelle Profilerstellung von CTCs, um die Medikamentenauswahl in Echtzeit zu unterstützen. Ein postulierter Grund dafür, dass Patienten mit kastrationsresistentem Prostatakrebs (CRPC) möglicherweise nicht auf Medikamente ansprechen, die die AR-Signalübertragung hemmen oder beeinträchtigen, könnte das Vorhandensein von AR-Spleißvarianten in ihren Tumorzellen sein. Dies wurde durch die Untersuchung von mRNA aus CTCs demonstriert, die prospektiv von Patienten mit metastasiertem CRPC gesammelt wurden, die in eine klinische Studie zur Behandlung mit Abirateron oder Enzalutamid aufgenommen wurden. Beim Testen der CTC-mRNA auf die Spleißvariante AR-V7, eine konstitutiv aktive Isoform des AR, der die Ligandenbindungsdomäne fehlt, gab es einen signifikanten Zusammenhang mit einer therapeutischen Resistenz gegen Abirateron und Enzalutamid, Arzneimittel, die indirekt (Abirateron) oder direkt ( Enzulatamid) zielen auf den AR ab, wo diese Liganden-bindende Domäne vorhanden ist (43).

Eine wichtige Herausforderung bei der RNA-Expressionsanalyse von CTC-angereicherten Zellfraktionen ist jedoch das potenziell störende Signal von kontaminierenden Leukozyten. Um dieser Herausforderung zu begegnen, werden Multiplex-PCR mit CTC-spezifischen mRNAs (44–46) und Einzelzellansätze untersucht. Hochdimensionale Einzelzell-Transkriptionsprofile von CTCs, die mit dem MagSweeper, einer immunmagnetischen Anreicherungstechnologie, gereinigt wurden (47), ergab eine signifikante CTC-Heterogenität, selbst innerhalb derselben Blutabnahme, was auf die Notwendigkeit einer Multidrug-Therapie hindeutet, um sich der molekularen Diversität des Tumors zu nähern (8). Wichtig ist, dass CTCs auch deutlich unterschiedliche Genexpressionsprofile im Vergleich zu denen in einzelnen Zellen aus Brustkrebszelllinien aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die CTC-Analyse die Zelllinienanalyse bei der Arzneimittelentwicklung ergänzen könnte. In ähnlicher Weise scheint auch Prostatakrebs durch CTC-Heterogenität gekennzeichnet zu sein, mit deutlichen Unterschieden in der Einzelzellexpression von EMT-verwandten Genen zwischen CTCs von kastrationssensitiven und kastrationsresistenten Krebsarten (48).

DNA-Aberrationen in CTCs.

Mehrere Proof-of-Concept-Studien haben die Machbarkeit des Nachweises spezifischer somatischer Mutationen oder anderer genetischer Veränderungen in gepoolten oder einzelnen CTCs von Patienten mit verschiedenen Tumorarten gezeigt (49–54). Darüber hinaus werden jetzt nicht zielgerichtete Ansätze verwendet, um die Kopienzahlaberrationen des gesamten Genoms in einzelnen CTCs durch Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) und NGS-Techniken (55–57) zu analysieren, einschließlich der Sequenzierung einzelner CTCs im gesamten Exom (58).

Eine Herausforderung bei der Analyse einzelner CTCs mit Sanger- oder NGS-Methoden besteht darin, falsch positive und falsch negative Ergebnisse aufgrund von Verzerrungen auszuschließen, die durch die Amplifikation des gesamten Genoms eingeführt werden. Darüber hinaus bleibt unklar, wie viele CTCs analysiert werden müssen, um die Tumorheterogenität ausreichend zu erfassen, um die Wirksamkeit der Behandlung vorherzusagen.

CTC in vitro und in vivo Modelle für das Ansprechen auf Medikamente

CTCs von Patienten wurden vermehrt in vitro durch mehrere Gruppen. Dazu gehören Kurzzeitkulturen (28 Tage oder weniger) von CTCs von Patienten mit Brust-, Dickdarm-, Pleuramesotheliom, Prostata-, Urothel-, Blasen-, Speiseröhren-, Bauchspeicheldrüsen-, Magen- und Lungenkrebs (59–70) und Langzeitkulturen ( 6–24 Monate) von CTCs von Patientinnen mit Brust-, Prostata- und Dickdarmkrebs (71–74). Der Zweck solcher Modellsysteme wäre es, das Ansprechen auf Arzneimittel zu untersuchen oder in einer Studie mehrschichtige Cluster zu identifizieren, die, wenn sie bis zum Tag 14 in Kultur erscheinen, ein früher Prädiktor für eine Therapieresistenz sein können (70).

Mehrere neuere Studien haben die Entwicklung von Maus-Xenotransplantaten berichtet, die direkt aus CTCs oder aus CTC-Kulturen von Patienten mit fortgeschrittenem Brust-, Kolorektal-, Prostata-, Leberzell-, kleinzelligem Lungen- und Magenkrebs generiert wurden (68, 72, 74–79). Einige dieser Assays untersuchen metastatische Subpopulationen von CTCs und andere generieren patientenspezifische Modelle zur Anleitung der Behandlung.

In einem Xenograft-Assay mit luminalen Brustkrebs-CTCs wurde gezeigt, dass im Gegensatz zu Bulk-EPCAM + CTCs eine EPCAM + CD44 + CD47 + MET + CTC-Subpopulation bei Injektion in das Knochenmark von immunsupprimierten . stark an metastasenauslösenden Zellen angereichert ist Mäuse (75). In einer anderen Studie wurde eine Untergruppe von EpCAM-negativen CTCs aus dem peripheren Blut von Patientinnen mit Brustkrebs (EpCAM − /ALDH1 + /CD45 − ) gezüchtet in vitro. Während alle in Kultur gezüchteten EpCAM-negativen CTCs Lungenmetastasen nach Schwanzvene oder intrakardialer Injektion verursachten, zeigten nur Zellen, die für eine „Brain Metastasis Selected Marker (BMSM)-Signatur“ angereichert waren, HER2 + /EGFR + /HPSE + /Notch1 + , ein erhöhtes Potenzial sowohl für Lungen- als auch für Hirnmetastasen (71).

Aus dem Blut von Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs angereicherte CTCs wurden als CTC-derived explants (CDX) subkutan in immunsupprimierte Mäuse implantiert. Die CTCs waren tumorerzeugend, wenn mehr als 400 CTCs in 7,5 ml Blut enthalten waren. CDX zeigte nicht nur ähnliche genomische Profile wie die CTCs der Patienten, sondern spiegelte auch genau das Ansprechen des Spenderpatienten auf die Cisplatin/Etoposid-Chemotherapie wider (78). Xenotransplantate aus CTC-Zelllinien können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit verschiedener Medikamentenkombinationen zu testen (68, 72). Solche Studien eröffnen spannende Möglichkeiten für den Einsatz von CTC-Genotypisierung und Funktionstests, um rationale Wirkstoffkombinationen für die klinische Bewertung zu identifizieren.

Potenzielle Einschränkungen jedoch von in vitro und in vivo Modelle bestehen darin, dass sie normalerweise aus hochaggressiven Tumorsubklonen erzeugt werden, die das Spektrum der Tumorzellheterogenität möglicherweise nicht genau widerspiegeln, und, vielleicht noch wichtiger in der gegenwärtigen Ära der aufkeimenden Krebsimmuntherapie, in vivo Xenograft-Modelle rekapitulieren keine Tumor-Wirt-Wechselwirkungen, die bei der Arzneimittelresistenz eine Rolle spielen könnten. Es sind zusätzliche Arbeiten erforderlich, um die experimentellen Bedingungen für die effiziente Generierung dieser Modelle bei der Mehrheit der Patienten mit metastasierendem Krebs zu optimieren und zu zeigen, dass die Ergebnisse dieser Modelle die Ergebnisse im klinischen Umfeld genau widerspiegeln.

CTCs und Neigung zur metastatischen Kolonisation

In CTCs wurden verschiedene mesenchymale Marker identifiziert, was auf einen EMT-Phänotyp schließen lässt (8, 80–82), der zur Metastasierung beitragen kann. Plastin3 (kodiert von PLS3 Gen), ein Aktin-bindendes/bündelndes Protein, wurde in Tumoren und CTCs von Patienten mit primärem und metastasiertem Kolorektalkarzinom identifiziert, mit höherer Expression in fortgeschrittenen und metastasierten Tumoren CTCs, die Plastin 3 exprimieren, zeigen einen EMT-Phänotyp und sind mit einer schlechten Prognose verbunden (83).

Obwohl die meisten CTCs einzeln sind, wurden CTC-Cluster auch in Blutproben von Patienten mit metastasierendem Krebs identifiziert. Auch bekannt als zirkulierende Tumor-Mikroembolien, wurden bei mehr als 30 % der Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs mittels der CELLSEARCH-Plattform immunmagnetisch erfasste Cluster identifiziert und scheinen keine apoptotischen oder proliferierenden Zellen zu haben, was möglicherweise einen Überlebensvorteil bietet (84). Die Verwendung eines neuen Geräts, des Cluster-Chips, bietet eine markierungsfreie Isolierung von CTC-Clustern unter Verwendung von dreieckigen Säulen, die als mikrofluidische „Clusterfallen“ wirken (85). Diese Methode zeigte, dass bei 30% bis 40% der Patienten mit metastasierendem Melanom, Brustkrebs und Prostatakrebs Cluster identifiziert wurden, wobei die Mehrheit der Cluster 2 bis 10 Zellen enthielt, manchmal jedoch bis zu 19 Zellen. Im Gegensatz zu CTC-Clustern, die durch CELLSEARCH bei metastasierendem kleinzelligem Lungenkrebs isoliert wurden, proliferierte jedoch etwa die Hälfte der CTCs innerhalb von Clustern, die durch den Cluster-Chip bei metastasierendem Brustkrebs isoliert wurden.

Ähnlich wie einzelne migratorische mesenchymal-ähnliche CTCs scheinen CTC-Cluster um mesenchymale Marker angereichert zu sein (82, 86). Es wird postuliert, dass CTC-Cluster aus oligoklonalen Tumorzellgruppen mit hohem Metastasierungspotential entstehen können und dass EMT in den CTC-Clustern durch TGFβ-Signalgebung durch an diesen Clustern angelagerte Blutplättchen vermittelt werden kann (Lit. 82, 87, 88 Fig. 1).

Einzelne CTCs im Vergleich zu verschiedenen Arten von CTC-Clustern. Ihr Kolonisierungspotenzial bleibt eine offene Forschungsfrage.

Über CTCs hinaus wurde ein zunehmendes Interesse an der Rolle zirkulierender Stromazellen und Makrophagen bei der metastatischen Progression geäußert. In Mausmodellen haben Tumorzellen, die zusammen mit primären Tumor-abgeleiteten Stromazellen in den Blutkreislauf gelangen, einen Überlebensvorteil gegenüber einzelnen CTCs und sind effizienter bei der Bildung von Lungenmetastasen (89). In ähnlicher Weise können sich zirkulierende krebsassoziierte Makrophagen-ähnliche Zellen von Patienten mit metastasierendem Brust-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs in den Kreislauf ausbreiten und mit CTCs interagieren (90), wobei einige beobachtet wurden, dass sie an CTCs gebunden wandern, was möglicherweise eine entfernte Kolonisation und Neovaskularisation erleichtert. CTC-Cluster können Marker exprimieren, die mit Blutplättchen-Transkripten und/oder aus Gewebe stammenden Makrophagen assoziiert sind, jedoch nicht T/B/natürliche Killer-(NK)-Zellen (85). Verbesserungen unserer Fähigkeit, CTCs und assoziierte Zellen abzufragen, könnten eine schnellere klinische Entwicklung zielgerichteter Wirkstoffe ermöglichen, die die Metastasenkaskade beeinflussen können.


Zirkulierende Tumorzelle vs. zirkulierende Tumor-DNA - Biologie

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Abschluss

Wir haben gezeigt, dass frühe Veränderungen der ctDNA mit späteren radiologischen Tumorreaktionen verbunden sind und dass serielle ctDNA-Messungen ein erhebliches Potenzial haben, eine RECIST-basierte Standard-Krankheitsbewertung zu antizipieren, was zu einer sofortigen klinischen Auswirkung führt. Darüber hinaus sind der Nachweis und die Dynamik von ctDNA am Tag 30 prognostische Faktoren für PFS. Die in dieser explorativen Studie gezogenen Schlussfolgerungen müssen in größeren Kohorten bestätigt werden. Eine große randomisierte Studie, PADA-1 (NCT03079011), testet derzeit den Nutzen des Nachweises resistenter Subklone in Echtzeit in ctDNA aus ER+ HER2− MBC, die mit Palbociclib und Aromatasehemmer behandelt wurden. Serienproben für die ctDNA-Analyse sollten daher in zukünftige klinische Studien integriert werden, um eine robustere Bewertung dieses vielversprechenden Biomarkers zu ermöglichen.


Prognoseinformationen

CTCs können als Samen für die Fernverbreitung verschiedener Krebsarten angesehen werden. Es wird berichtet, dass nur etwa 2,5% der CTCs zu Mikrometastasen führen würden und nur 0,01% schließlich zu Makrometastasen, die zu einem Wiederauftreten und einer Mortalität der Krankheit führen [81, 82]. Daher wäre ein progressionsfreies Überleben ein direkter Indikator für die Funktion dieser CTCs [83].Einige Studien fanden einen Zusammenhang zwischen der CTC-Zählung und prognostischen Informationen von Bauchspeicheldrüsenkrebs [31, 32, 63, 84], während andere dies nicht taten [57, 60, 62]. Eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse mit 623 Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs ergab, dass die Patienten mit positivem CTC ein schlechteres progressionsfreies Überleben (HR=1,23, 95 % CI=0,88-2,08, Pɘ.001) und Gesamtüberleben (HR=1,89, 95 %) aufwiesen. CI=1,25-4,00, Pɘ.001) [85]. Aufgrund der Diskrepanzen in den Prognoseinformationen stellt sich die Frage, ob diese isolierten Zellen bösartige biologische Merkmale aufweisen oder nur eine Spitze des Eisbergs sind [10]. Zum Beispiel bestätigte eine kleine Pilotstudie, dass EpCAM + CTCs bei Krebspatienten ein schlechtes Outcome anzeigten, während EpCAM - CTCs nicht mit einem schlechten Gesamtüberleben assoziiert waren. Daher sollte eine Reihe von Analysen durchgeführt werden, um die Tumorgenität dieser isolierten Zellen bei verschiedenen Ebenen, um prognostische Informationen vertiefend zu erklären [86, 87].


1. EINLEITUNG

Kopf-Hals-Krebs tragen weiterhin eine erhebliche globale Krankheitslast. 1, 2 Besorgniserregend ist die zunehmende Inzidenz und Sterblichkeit von Kopf-Hals-Krebs, mit einem stärkeren Anstieg in Entwicklungsländern und einem gegensätzlichen Anstieg von Oropharynxkarzinomen in Industrieländern. 1, 2 Obwohl mehrere Krebsarten über Biomarker verfügen, die Krankheiten diagnostizieren und die Tumorbelastung vor und nach der Behandlung überwachen können, beispielsweise das Prostata-spezifische Antigen bei Prostatakrebs oder das Karzinom-Antigen (CA19-9) bei Bauchspeicheldrüsenkrebs, gibt es für Kopf-Hals-Krebs keinen solchen Test . Daher stützt sich die Überwachung von Kopf-Hals-Tumoren auf klinische und radiologische Befunde. 3 Patienten stellen sich häufig mit fortgeschrittenen Krankheitsstadien vor und die Merkmale einer frühen Invasion und Metastasierung führen zu einer erheblichen Morbidität und beeinträchtigen die Lebensqualität. 4 Aus diesen Gründen liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei Kopf-Hals-Tumoren trotz Fortschritten in der Behandlung bei 60 %, was sich in den letzten Jahrzehnten nur geringfügig verbessert hat. 5

Mit einem Bluttest versprechen zirkulierende biochemische molekulare Marker bei Kopf-Hals-Krebs, Diagnose, Planung, Therapieüberwachung und Überwachung verbessern zu können. 6 Ein Bluttest ist wenig morbide, kann zu verschiedenen Zeitpunkten der Behandlung wiederholt werden und ist kostengünstig. Ein solcher vorgeschlagener Biomarker ist das Niveau der zirkulierenden Tumor-DNA (ctDNA). 7 Die Entdeckung, dass ein Teil der zirkulierenden DNA bei Krebspatienten von Tumoren stammen kann, hat das Potenzial für eine sogenannte „Liquid Biopsy“ als Alternative zur Gewebebiopsie zur Charakterisierung von Tumorgenetiken geschaffen. 8, 9

Dieser Aufsatz bietet eine Einführung in die biologische Struktur und Funktion der zirkulierenden DNA. Wir diskutieren seine Verwendung als Biomarker für die Tumorlast und die potenzielle Verwendung von ctDNA als Flüssigbiopsie bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC), um die genetische Heterogenität des Tumors zu identifizieren. Wir setzen bewusst auf HNSCC und eine ctDNA-basierte Flüssigbiopsie. Obwohl dies den Rahmen dieses Artikels sprengen würde, sollten sich die Autoren anderer zirkulierender Komponenten bewusst sein, die zur Verwendung als potenzielle Flüssigbiopsie bei Kopf- und Halskrebs untersucht werden. Zum Beispiel zirkulierende Tumorzellen (CTCs) 8 oder zirkulierende virale DNA, wie Plasma-Human-Papillomavirus-DNA bei Oropharynxkarzinom 10 und Plasma-Epstein-Barr-Virus-DNA bei Nasopharynxkarzinom. 11

1.1 Zirkulierende Tumor-DNA

Zirkulierende DNA ist extrazelluläre DNA, die im zirkulierenden Blut vorkommt und bereits 1948 erstmals identifiziert wurde. 12 Diese DNA wird sowohl durch pathogene als auch durch physiologische Mechanismen, einschließlich Apoptose, zelluläre Nekrose, Phagozytose oder Exozytose, in den Kreislauf freigesetzt. 13 Normalerweise wird zirkulierende DNA durch Blutnukleasen schnell abgebaut und von Leber, Milz und Nieren eliminiert und hat eine kurze Halbwertszeit von etwa 10 bis 15 Minuten. 13 Daher können systemische Erkrankungen wie Leber- oder Nierenerkrankungen die ctDNA-Spiegel beeinflussen und die Interpretation von Blutergebnissen möglicherweise verfälschen. 14 CtDNA kommt in vielen Formen vor, entweder als freie DNA, an Proteinkomplexe gebunden, an die Zelloberfläche gebunden oder in Vesikeln (apoptotischen Körpern, Mikrovesikeln und Exosomen). 13

1977 entdeckten Leon et al. 1989 konnten Stroun et al. 16 zeigen, dass ein Teil dieser DNA-Fragmente aufgrund der Genominstabilität tatsächlich von einem Tumor stammt, und 1994 dann, Sorenson et al Mutationen in der KRAS Gen in ctDNA. Das Vorhandensein krebsspezifischer genomischer Veränderungen (zum Beispiel Punktmutationen) ermöglicht die Unterscheidung zwischen ctDNA und DNA aus normalen gesunden Zellen. 9, 13 Ein zusätzlicher Unterscheidungsfaktor ist der Unterschied in der Basenpaarlänge des DNA-Fragments. Zelluläre Apoptose erzeugt DNA-Fragmente von etwa 100 bis 200 Basenpaaren, während Nekrose aufgrund einer unregelmäßigeren Verdauung größere Fragmente erzeugt, die manchmal viele Kilobasenpaare groß sind. 13, 18

Die Konzentration der zirkulierenden DNA bei gesunden Kontrollpatienten ist im Allgemeinen sehr niedrig, im Bereich von <5 ng/ml, wohingegen Patienten mit Krebs erhöhte Spiegel von mehreren hundert ng/ml aufweisen können. 13, 18 Der Anstieg der ctDNA bei Krebspatienten und die genaue Herkunft der ctDNA bleiben umstritten. Wenn die Tumorgröße zunimmt und die metabolische Versorgung übersteigt, führt die Gewebehypoxie zu zellulärer Nekrose, Ablösung von Tumorzellen und damit zur Freisetzung von ctDNA. 13, 18 Die CTCs werden in diesem Aufsatz nicht diskutiert, aber theoretisch kann die Lyse dieser Zellen im Kreislauf auch zur ctDNA beitragen, obwohl die Beweise gemischt sind. 10

Es ist nicht klar, ob ctDNA eine aktive Rolle bei der Karzinogenese spielt oder ob sie nur ein Nebenprodukt der Tumorausscheidung ist. García-Olmo et al. 19 waren eine der ersten Gruppen, die das Konzept beschrieben, dass ctDNA durch Transfektion gesunder Zellen Krebsmetastasen verursachen könnte. Mit Plasma von tumortragenden Ratten konnten sie bei gesunden Ratten Tumore induzieren. Dieselbe Gruppe zeigte später, dass das Serum von Patienten mit Dickdarmkrebs die Tumorbildung in in vitro kultivierten Zellen induzierte. 20

Die Labormethoden zum Nachweis und zur Analyse von ctDNA haben sich in den letzten Jahrzehnten mit der Entwicklung der digitalen Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) stark verändert. Die vorherrschende Methode zur Analyse von ctDNA ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation von ctDNA-Genzielen, gefolgt von einer nachgeschalteten Analyse. Für den sensitiven Nachweis von Punktmutationen werden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter Real-Time-PCR, digitale Tröpfchen-PCR und Sanger-Typ-Sequenz. Für ein umfassenderes molekulares Profiling des zirkulierenden Tumorgenoms können ganze Genom-Amplifikationsmethoden (wie Multiple Displacement-Amplifikation oder zufällige Hexamer-Amplifikation) verwendet werden, um einen begrenzten ctDNA-Input zu amplifizieren, gefolgt von einer Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung. 21 Wie man sieht, ist das Protokoll für die Entnahme und Analyse eines Flüssigbiopsie-Assays sowohl komplex als auch in seinem Ansatz noch nicht standardisiert, wobei eine große Hürde die Sensitivität und Fehlerrate von NGS für ctDNA ist. 14, 21

1.2 Klinische Anwendungen zirkulierender Tumor-DNA

Angesichts zahlreicher Datenendpunkte, die in ctDNA-Studien beschrieben wurden, ist es nützlich zu klären, wie sich jeder dieser Punkte auf die klinische Praxis auswirken würde. In der bisherigen Literatur wurden die Begriffe „Biomarker“ und „Liquid Biopsy“ teilweise synonym verwendet. In diesem Review trennen wir bewusst die Begriffe Biomarker und Liquid Biopsy, um Verwechslungen zu vermeiden. Im Gegensatz zu einer statischen Biopsie, die Tumormerkmale bestimmt, sollte ein Biomarker ein objektiver und quantitativer Test des Krankheitsverlaufs und -ausgangs sein. 22 Wir diskutieren die klinische Anwendung der ctDNA-Analyse in zwei großen Kategorien: (1) ein Biomarker zur Beurteilung der Tumorlast und (2) eine Flüssigbiopsie zur Bestimmung der genetischen Heterogenität des Tumors (Tabelle 1).

Biomarker Flüssigbiopsie
Vorbehandlung
Diagnose-Screening-Tool Tumorgenotypisierung zur Bestimmung von Treibermutationen und zur Ermöglichung einer gezielten molekularen Krebstherapie
Diagnose in unsicheren Fällen
Begründung des Behandlungsprotokolls (d. h. Neck dissection in knotennegativem Hals)
Baseline-Bewertung der Tumorlast für den Nachbehandlungsvergleich
Nachbehandlung
Beurteilen Sie die Resterkrankung in der unmittelbaren Nachbehandlungsphase Überwachung der klonalen Evolution und Bewertung auf Resistenztreiber-Mutationen bei rezidivierendem Krebs
Bereitstellung einer Risikoanalyse für die Entscheidung zur adjuvanten Radiochemotherapie
Überwachung für lokoregionäre Rezidive

1.3 Biomarker der Tumorlast

Bisher konzentrierte sich die Verwendung von ctDNA zur Beurteilung der HNSCC-Tumorbelastung auf zwei Bereiche: die Gesamtkonzentration der ctDNA und den Nachweis von ctDNA als Werkzeug für die Diagnose und als Marker für die Prognose. Der Einsatz einer ctDNA-Flüssigbiopsie als nichtinvasives Screening-Tool ist ein interessanter Vorschlag und wird derzeit untersucht. Wie bei allen Screening-Tools sind die technischen und klinischen Anforderungen bei der Erstellung eines sensitiven und spezifischen ctDNA-basierten Tests immens. Die Entwicklung kostengünstiger NGS-Technologie und die komplexe bioinformatische Datenanalyse machen dieses Konzept jedoch zu einer möglichen zukünftigen Realität. 23 Die sofortige Anwendung von ctDNA als Biomarker in der Vorbehandlungsphase wird wahrscheinlich bei Patienten sein, bei denen ein hohes Risiko oder eine diagnostische Unsicherheit besteht. Zum Beispiel die Überwachung von prämalignen Läsionen, bei denen der beste Behandlungsverlauf noch diskutiert wird, oder wenn eine Biopsie potenzielle Malignome bei einer stark dysplastischen Läsion übersehen kann. 24 In der Nachbehandlungsphase bietet die hohe Sensitivität der ctDNA eine echte Chance für den ersten Biomarker bei HNSCC, eine Resterkrankung oder ein lokoregionäres Rezidiv zu beurteilen.

1.4 Zirkulierende Tumor-DNA-Spiegel und Nachweis bei Krebspatienten

Wie besprochen, war der Befund, dass die gesamte zirkulierende DNA-Konzentration bei Krebspatienten erhöht war, die Grundlage für die Hypothese, dass ein Teil dieser DNA von Tumoren stammen könnte. Die Gesamt-ctDNA-Konzentration kann jedoch unabhängig von der anschließenden ctDNA-Genomanalyse auch als diagnostisches und prognostisches Werkzeug verwendet werden. Mazurek et al. 25 untersuchten die Gesamtkonzentration der zirkulierenden DNA bei 200 Patienten mit HNSCC im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von 15 Patienten. Die durchschnittlichen Gesamt-DNA-Werte waren in der HNSCC-Gruppe höher, aber nicht bis zu signifikanten Werten. Interessanterweise wiesen oropharyngeale SCCs signifikant höhere ctDNA-Spiegel auf (P = 0,011) als andere HNSCCs (Nasopharynx, Hypopharynx und Larynx). Sie zeigten auch eine signifikante Beziehung zwischen dem Knotenstatus (N0-1 vs. N2-3), dem Stadium (I-III vs. IV) und dem Alter (<63 und >63) mit steigenden ctDNA-Konzentrationen.

Um als Biomarker verwendet zu werden, muss der ctDNA-Nachweis ein sensitiver Test für HNSCC sein und mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren. In der bisher größten Studie untersuchten Bettegowda et al. 26 den Nachweis von ctDNA bei 359 Patienten mit 15 verschiedenen Krebsarten. Sie teilten die Patienten in Patienten mit lokalisierter Erkrankung (n = 136) und solche mit metastasierter Erkrankung (n = 223) ein, leider war die Zahl der Kopf-Hals-Krebsfälle relativ gering (n = 12). In der Gruppe der metastasierten Erkrankung wurde ctDNA bei 82 % der Patienten nachgewiesen, im Gegensatz zu 55 % in der Gruppe der lokalisierten Erkrankung. Bei der Bewertung von ctDNA als prognostisches Instrument durch den Vergleich der metastasierten und lokalisierten Gruppen bei Krebserkrankungen mit ausreichender Anzahl (kolorektal, gastroösophageal, Bauchspeicheldrüse und Brust) gab es einen signifikanten Zusammenhang (P < 0,001) und auch ein klarer Trend hinsichtlich fortschreitender Krankheitsstadien und erhöhter ctDNA-Menge.

1.5 Überwachung nach der Behandlung

Die Fähigkeit, ctDNA als Biomarker für das Wiederauftreten von Krankheiten in der Nachbehandlungsphase zu verwenden, ist wohl wertvoller als ihre diagnostischen Vorzüge. 27 Angesichts der Abhängigkeit von schlecht empfindlichen klinischen und röntgenologischen Tests wäre ein Biomarker für die Tumorbelastung nach der Behandlung ein wertvolles Instrument. 3 Die Studie von van Ginkel et al. 27 diskutierte die Rolle von ctDNA bei der Überwachung von Kopf-Hals-Tumoren und schlug einen Arbeitsablauf vor, wie dies in der klinischen Praxis angewendet werden könnte. Studien an Brust-, Darm-, Lungen- und mehreren anderen Krebsarten haben alle die klinische Anwendung von ctDNA gezeigt. 8, 9, 13 In einer Studie an 18 Patienten mit Dickdarmkrebs konnten Diehl et al.P = 0,006). Bis auf einen Patienten, der postoperativ nachweisbare ctDNA aufwies, trat ein Rezidiv auf und keiner der Patienten mit nicht nachweisbarer ctDNA erlitt ein Rezidiv. Sie waren in der Lage, grafische Darstellungen der ctDNA-Spiegel im Zeitverlauf elegant darzustellen, um eine genaue Darstellung der „persönlichen dynamischen Belastung des Tumors“ zu liefern. In einer ähnlichen Studie verglichen Dawson et al. 29 ctDNA mit CTCs und Karzinomantigen (CA15-3) bei 30 Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebs, die sich in Behandlung befanden. Die ctDNA war statistisch sensitiver als CTCs oder Karzinomantigen (CA15-3), um das Ansprechen auf die Behandlung zu messen (P < 0,002) und war ein signifikanter Überlebensmarker (P < .001).

In einer Studie mit 47 Patienten mit HNSCC konnten Wang et al. 30 postoperative Behandlungsproben von 9 Patienten sammeln. Bei 3 Patienten, die ein Rezidiv entwickelten, war das Vorhandensein von ctDNA im Plasma 15 Monate, 9 Monate und <1 Monat älter als der klinische/radiographische Nachweis eines Rezidivs. Von den 5 Patienten mit negativen ctDNA-Ergebnissen waren alle bei einer mittleren Nachbeobachtungszeit von 12 Monaten rezidivfrei. 30 Hamana et al. 31 verglichen den Nachweis von ctDNA bei 64 Patienten mit oralem Plattenepithelkarzinom in der prä- und postoperativen Phase. 44% der Patienten (28/64) wiesen präoperativ ctDNA mit tumorspezifischen Mikrosatellitenveränderungen auf und diese sank postoperativ auf 20% (13/64). Von den 28 präoperativen Patienten mit nachweisbarer ctDNA hatten 20 keine postoperativ nachweisbare ctDNA und alle diese Patienten waren ohne Rezidiv krankheitsfrei. Vier der Patienten mit nachweisbarer ctDNA nach 4 Wochen in der unmittelbaren postoperativen Phase entwickelten weiter Fernmetastasen. In dieser Studie wurde das Vorhandensein von cDNA statistisch mit der Erkrankung im Frühstadium (I/II) und im Spätstadium (III/IV) korreliert (P = .0378).

1.6 Flüssigbiopsie zur Beurteilung der genetischen Heterogenität des Tumors

Die Fähigkeit, Treibermutationen und epigenetische Veränderungen eines Tumors zu identifizieren, ist ein wichtiger Schritt bei der Implementierung einer zielgerichteten Therapie und Verbesserung der Ergebnisse bei Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren. Da HNSCC eine erhebliche tumorgenetische Heterogenität aufweist, bedeutet dies, dass verschiedene Teile des Tumors unterschiedliche Mutationen aufweisen können. 32 Die Kenntnis aller wichtigen „Treiber“-Mutationen eines Tumors ist notwendig, um diesen Tumor gezielt behandeln zu können. Der derzeitige Einsatz der Gewebebiopsie als diagnostisches Verfahren ist in dieser Hinsicht ein wesentlicher Mangel. Eine Gewebebiopsie erfasst 1 oder 2 Teile eines Tumors und ist daher aufgrund der intratumoralen Heterogenität zusammen mit der Invasivität und Morbidität des Verfahrens selbst einem hohen Risiko für Bias und fehlende wichtige Treibermutationen ausgesetzt. 27 Im Gegensatz zur „statischen Biopsie“, die aus Gewebeproben gewonnen wird, schafft die Möglichkeit, mehrere Flüssigbiopsien zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung zu entnehmen, die Realität einer „dynamischen Biopsie“, um die Entwicklung von Tumorklonen zu erkennen und ein Wiederauftreten oder eine Behandlungsresistenz zu identifizieren. Dies würde das Potenzial für die Echtzeitüberwachung des Fortschreitens der genetischen Mutation bei Krebs und die Anpassung einer personalisierten zielgerichteten molekularen Therapie ermöglichen. Neuere Studien bei Kopf-Hals-Tumoren konzentrierten sich auf die Identifizierung tumorspezifischer genomischer Veränderungen in der ctDNA. Wir diskutieren jede anwendbare genomische Veränderung der Reihe nach.

1.7 Mutationen

Lebofsky et al. 33 untersuchten tumorspezifische Mutationen in der ctDNA von 34 Patienten mit 18 verschiedenen Arten von metastasiertem Karzinom (Kopf-Hals-Karzinom = 5). Bei 27 Patienten stimmten die ctDNA-Mutationen mit denen aus soliden Tumorbiopsien überein. In der oben erwähnten Studie von 47 Patienten mit HNSCC von Wang et al. konnten 30 in 87 % der Fälle Plasma-ctDNA mit tumorspezifischen Punktmutationen nachweisen. Sie untersuchten das Vorhandensein von Mutationen in 6 Genen (TP53, PIK3CA, CDKN2A, FBXW7, HRAS, NRAS, und E7 [humanes Papillomavirus] DNA) häufig mit HNSCC assoziiert (>85% hatten TP53-Mutationen). Die Mehrheit der Patienten hatte eine fortgeschrittene (Stadium III oder IV) Erkrankung. Die Kombination von Plasmabefunden mit dem Nachweis von DNA-Fragmenten im Speichel erhöhte die diagnostische Sensitivität auf 96%. Bemerkenswert ist, dass die Plasmanachweisraten zwischen den Standorten kaum variierten (80 % Mundhöhle, 91 % Oropharynx, 86 % Larynx und 100 % Hypopharynx). Erwartungsgemäß war der Speichel-DNA-Nachweis bei Mundhöhlentumoren (100%) im Vergleich zu anderen Lokalisationen (47%-70%) signifikant höher. Obwohl die Mutationshäufigkeit im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung höher war (70 % vs. 92 %), hatte dies keine statistische Signifikanz. Sie kamen zu dem Schluss, dass die Kombination des DNA-Nachweises in 2 Kompartimenten (Plasma und Speichel) ein wertvolles Instrument zur Erhöhung der Sensitivität ist.

1.8 Mikrosatellitenveränderungen

Mikrosatellitenveränderungen umfassen Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und Verlust der Heterozygotie (LOH). Mikrosatelliten sind Abschnitte von DNA mit kurzen Basenpaarmotiven (normalerweise 1-6 Basenpaare lang), die 5 bis 100 Mal wiederholt werden. Kurz gesagt bedeuten sie ein defektes Mismatch-Reparatursystem, das wiederum ein Marker für Mutationen in DNA-Reparaturgenen ist. 34 Es gibt starke Belege für die Rolle von MSI bei Darmkrebs als Marker für Prognose und Überleben, aber die Rolle von MSI bei Kopf-Hals-Tumoren ist unklar. 34 Einige Studien berichten über keinen Zusammenhang, während andere von einem positiven MSI berichteten, der eine bessere Prognose verlieh. Der LOH ist das Ergebnis des Verlusts einer Kopie eines diploiden Gens und ist ein häufiger Mechanismus zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen. In einem aktuellen Review von De Schutter et al. 34 hoben sie LOH als nützlicheren prognostischen prädiktiven Marker hervor als MSI, teilweise aufgrund einer erhöhten Häufigkeit von LOH im Vergleich zu MSI bei HNSCC. Der LOH wird mit fortgeschrittener hochgradiger Erkrankung in Verbindung gebracht und ist ein negativer prognostischer Indikator für das Überleben, 35 mit dem Hinweis auf eine Korrelation mit Chemotherapieresistenz. 36

Einige der frühesten Arbeiten zur Identifizierung von HNSCC-tumorspezifischen genomischen Veränderungen in der ctDNA wurden von Nawroz et al. 37 In einer Kohorte von 21 Patienten identifizierten sie Mikrosatellitenveränderungen in der ctDNA von 6 Patienten mit HNSCC. Alle 6 Patienten hatten eine fortgeschrittene (Stadium III-IV) Erkrankung und 5 hatten Lymphknotenmetastasen. Dieselbe Gruppe verfolgte diese vorläufigen Ergebnisse mit einer größeren Studie mit 152 Patienten mit HNSCC. 38 45 % der Patienten (68/152) wiesen tumorspezifische Mikrosatelliten-Veränderungen in der ctDNA auf, wobei 84 % der Kohorte eine Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium oder ein Rezidiv aufwiesen (127/152). Diejenigen mit fortgeschrittener Erkrankung und Lymphknotenmetastasen hatten eine höhere positive Rate an Mikrosatellitenveränderungen als diejenigen mit Krebs im Frühstadium. Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zu den Stadien III und IV (52 % und 44 %) ein deutlicher Sprung bei der Erkennung vom Stadium I zum Stadium II (17 % gegenüber 47 %) zu verzeichnen war.Bei einer mittleren Nachbeobachtungszeit von 27 Monaten war das krankheitsfreie Überleben in der Gruppe mit positivem ctDNA-Nachweis verringert, jedoch nicht auf statistische Signifikanz.

1.9 Tumorsuppressorgen-Hypermethylierung

Das Stummschalten von Tumorsuppressorgenen durch Hypermethylierung ihrer Promotorregionen ist ein Mechanismus der Gensuppression, der an der Karzinogenese beteiligt ist. 39 Dieses epigenetische Phänomen der Hypermethylierung wurde bei HNSCC untersucht und validiert, wobei eine Vielzahl von Tumorsuppressorgenen als potenzielle Angriffspunkte involviert sind. 39 Der Nachweis einer Hypermethylierung von ctDNA ist daher eine weitere potenzielle prognostische Anwendung bei HNSCC.

Mydlarz et al. 40 untersuchten den Methylierungsstatus von 100 Patienten mit HNSCC im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von 50 Patienten. Sie untersuchten speziell die Hypermethylierung der EDNRB, DCC, und p16 (CDKN2A) Gene. Zehn Patienten (10 %) stellten aus EDNRB Hypermethylierung, 2 dieser Patienten hatten DCC Hypermethylierung, und 1 dieser 2 Patienten hatte auch eine p16-Hypermethylierung. Statistisch signifikant war, dass HNSCC-Proben EDNRB Amplifikation im Vergleich zur Kontrollgruppe (P = .02), aber nicht mit dem DCC oder p16-Gene. Es ist schwierig, den klinischen Nutzen dieser Daten zu ermitteln. Der Nachweis von hypermethylierten Regionen in ctDNA ist für die Diagnose von HNSCC hochspezifisch, aber die Sensitivität ist gering. Darüber hinaus müsste ein Assay mit diagnostischer Spezifität, der als diagnostisches Screening-Tool verwendet werden kann, bei Dutzenden von Tumorsuppressorgenen, die an HNSCC beteiligt sind, 39 jedes dieser Gene einzeln bewerten. Eine Lösung besteht darin, eine genomweite Analyse der DNA-Methylierung durchzuführen, eine Technik, die derzeit untersucht wird. 41

1.10 Zukünftige Fragen zur zirkulierenden Tumor-DNA

Damit ctDNA als Biomarker und Flüssigbiopsie verwendet werden kann, muss die Quantifizierung von ctDNA-Spiegeln über den Nachweis genomischer Veränderungen im HNSCC standardisiert und validiert werden. Eine Goldstandard-Untersuchung müsste Patienten-, Tumor-, Verfahrens- und Behandlungsfaktoren berücksichtigen, um eine risikoadjustierte Bestimmung von Prognose und Tumorheterogenität zu erstellen (Abbildung 1). Leider hat jeder dieser Faktoren unbeantwortete Forschungsfragen.

Eine große Herausforderung ist die Harmonisierung der Methodik zum Nachweis und zur Analyse von ctDNA. 8, 9 Hier liegt das Problem, einen validierten und allgemein akzeptierten Biomarker/Liquid Biopsy Assay mit festgelegten Parametern zu erstellen, die von verschiedenen Institutionen reproduziert werden können. Darüber hinaus scheint die mutierte ctDNA-Belastung zwischen Tumortyp und -lokalisation stark zu variieren, 18, 26, 33 und das Stadium der Erkrankung oder Therapie korreliert möglicherweise nicht immer mit den ctDNA-Spiegeln. 18 Mazurek et al. 25 stellten beispielsweise fest, dass das oropharyngeale SCC signifikant höhere ctDNA-Spiegel aufwies als andere HNSCC-Orte, die Ursache dafür ist unbekannt, aber vermutlich hat die individuelle Tumorbiologie einen Einfluss. Thierry et al. 13 stellten fest, dass die Tumorwachstumskinetik und die Varianz der Zellproliferations- und Zellverlustfaktoren einen Einfluss auf die ctDNA-Spiegel haben. Darüber hinaus ist der Einfluss systemischer Faktoren (Komorbidität, Alter und Rauchen) auf den Spiegel und die Clearance der zirkulierenden DNA nicht vollständig verstanden. Die Möglichkeit, die oben genannten Faktoren zu quantifizieren und diese Berechnungen auf einzelne Patientenproben anzuwenden, bleibt eine unbeantwortete Aufgabe.


Autorenbeiträge

Konzeption/Design: Melodie J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Lynn Schuchter, Gary D. Kao

Bereitstellung von Studienmaterial oder Patienten: Melodie J. Xu, Jay F. Dorsey, Lynn Schuchter

Erhebung und/oder Zusammenstellung von Daten: Melodie J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Wei Xu, Erica L. Carpenter, Lynn Schuchter, Gary D. Kao

Datenanalyse und Interpretation: Melodie J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Wei Xu, Erica L. Carpenter, Lynn Schuchter, Gary D. Kao

Manuskript schreiben: Melodie J. Xu, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Erica L. Carpenter, Gary D. Kao

Endgültige Genehmigung des Manuskripts: Melodie J. Xu, Jay F. Dorsey, Ravi Amaravadi, Giorgos Karakousis, Charles B. Simone II, Xiaowei Xu, Wei Xu, Erica L. Carpenter, Lynn Schuchter, Gary D. Kao