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9E: Stoffwechselkontrollanalyse und Systembiologie - Biologie

9E: Stoffwechselkontrollanalyse und Systembiologie - Biologie


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Lernziele

  • beschreiben den stationären Zustand im Kontext einer isolierten einzelnen enzymkatalysierten Reaktion und für das Enzym als Teil eines komplexen Stoffwechselweges in vivo;
  • angeben und beschreiben, was erforderlich ist, um eine Stoffwechselkontrollanalyse auf einem biologischen Weg durchzuführen;
  • schreiben Sie gewöhnliche Differentialgleichungen, um die Konzentrationsänderung von Analyten in einem gegebenen Satz gekoppelter Reaktionen zu beschreiben;
  • schreibe Massenbilanzausdrücke für Eo und verwende sie, um den Anteil jeder Enzymform unter Annahme eines schnellen Gleichgewichts zu berechnen;
  • "Draht"-Diagramme zeichnen, die Aktivierung und Hemmung für gekoppelte Reaktionen zeigen;
  • Definieren Sie den Flusssteuerungskoeffizienten verbal und in Form einer mathematischen Gleichung und erklären Sie, wie Sie ihn grafisch erhalten;
  • Flusskontrollkoeffizienten verwenden, um zu erklären, wie die Kontrolle des Flusses in einem Stoffwechselweg durch alle enzymkatalysierten Reaktionen in diesem Stoffwechselweg verteilt wird;
  • das Ergebnis einer Flusskontrollanalyse eines Stoffwechselwegs wie der Glykolyse analysieren;
  • beschreiben, warum kleine Veränderungen der Enzyme mit den größten ΔG-Werten bei der Glykolyse geringe Auswirkungen auf den Stoffwechselfluss bei der Glykolyse haben;
  • Definieren Sie den Konzentrationskontrollkoeffizienten verbal und in Form einer mathematischen Gleichung
  • das Ergebnis einer Konzentrationskontrollanalyse eines Stoffwechselwegs wie der Glykolyse analysieren;
  • Definieren Sie den Elastizitätskoeffizienten verbal und in Form einer mathematischen Gleichung und erklären Sie, wie Sie ihn grafisch erhalten
  • geben Sie an, ob die verschiedenen metabolischen Kontrollkoeffizienten globale Eigenschaften des Systems oder lokale Eigenschaften eines bestimmten Enzyms sind

BIOCHEMIE - DR. JAKUBOWSKI

Lernziele/-ziele für Kapitel 9E:
Nach dem Unterricht und dieser Lesung können die Schüler

  • beschreiben den stationären Zustand im Kontext einer isolierten einzelnen enzymkatalysierten Reaktion und für das Enzym als Teil eines komplexen Stoffwechselweges in vivo
  • angeben und beschreiben, was erforderlich ist, um eine Stoffwechselkontrollanalyse eines biologischen Stoffwechselwegs durchzuführen
  • schreiben Sie gewöhnliche Differentialgleichungen, um die Konzentrationsänderung von Analyten in einem gegebenen Satz gekoppelter Reaktionen zu beschreiben
  • Schreiben Sie Massenbilanzausdrücke für Eo und verwenden Sie sie, um den Anteil jeder Enzymform unter Annahme eines schnellen Gleichgewichts zu berechnen
  • Zeichne "Draht"-Diagramme, die die Aktivierung und Hemmung gekoppelter Reaktionen zeigen
  • Definieren Sie den Flusssteuerungskoeffizienten verbal und in Form einer mathematischen Gleichung und erklären Sie, wie Sie ihn grafisch erhalten
  • Verwenden Sie Flusskontrollkoeffizienten, um zu erklären, wie die Kontrolle des Flusses in einem Stoffwechselweg über alle enzymkatalysierten Reaktionen in diesem Stoffwechselweg verteilt ist
  • Analyse des Ergebnisses einer Flusskontrollanalyse eines Stoffwechselwegs wie der Glykolyse
  • beschreiben, warum kleine Veränderungen in den Enzymen mit den größten ΔG-Werten bei der Glykolyse geringe Auswirkungen auf den Stoffwechselfluss bei der Glykolyse haben
  • Definieren Sie den Konzentrationskontrollkoeffizienten verbal und in Form einer mathematischen Gleichung
  • Analyse des Ergebnisses einer Konzentrationskontrollanalyse eines Stoffwechselwegs wie der Glykolyse
  • Definieren Sie den Elastizitätskoeffizienten verbal und in Form einer mathematischen Gleichung und erklären Sie, wie Sie ihn grafisch erhalten
  • Geben Sie an, ob die verschiedenen Stoffwechselkontrollkoeffizienten globale Eigenschaften des Systems oder lokale Eigenschaften eines bestimmten Enzyms sind.

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E2. Grundprinzipien der Metabolic Control Analysis (MCA)

Für solche rechnerischen Analysen sind verschiedene Eingaben erforderlich:

A. Definierte Wege. Diese sind in vielen Datenbanken verfügbar. Ein Beispiel von KEGG-Wegen für die Hefe-Glykolyse ist unten gezeigt

B. Ein computergestütztes Modellierungsprogramm zur Eingabe aller Parameter, Gleichungen, Modelle und Berechnung von Konzentrationen für alle Spezies als Funktion der Zeit. Kostenlose herunterladbare Programme, die dies tun, umfassen COPASI, Virtual Cell und Cell Designer. Ein Beispiel für ein kartiertes Modell von Cell Designer für die Hefe-Glykolyse mit mehreren zusätzlichen Reaktionen, die vom klassischen glykolytischen Weg abzweigen, ist unten gezeigt.

Die rechnerischen Ergebnisse der Analysen zur Hefe-Glykolyse konnten nur dann an experimentelle Daten angepasst werden, wenn sie durch Zugabe mehrerer Verzweigungsreaktionen korrigiert wurden (in den Abbildungen oben und unten gezeigt):

C. Eine Liste aller am Stoffwechselweg beteiligten Spezies (in der Abbildung unten für Glykolyse und Verzweigungsreaktionen gezeigt).

D. Eine Liste aller Reaktionen (siehe unten für Glykolyse und Verzweigungsreaktionen, entnommen aus COPASI)

e. Parameter aller Arten. Ein Beispiel ist unten für Hexokinase (aus COPASI) gezeigt.

F. Gleichungen, die verwendet werden können, um die Konzentrationsänderung aller Spezies mit der Zeit zu berechnen. Dies sind in der Regel gewöhnliche Differentialgleichungen (ODE), wie in Kapitel 6B – Kinetik einfacher und enzymkatalysierter Reaktionen, Abschnitt B1: Einschrittreaktionen beschrieben.) ODEs sind einfach zu schreiben, erfordern jedoch einen Computer zum Lösen, wenn die Zahl der interagierenden Spezies zunimmt .

Eine beispielhafte chemische Reaktion und eine Reihe von ODEs für jede Spezies sind unten gezeigt.

Wenn eine Reaktion die Spezies X entfernt, hat die rechte Seite der ODE für das Verschwinden dieser Spezies ein – Zeichen für diesen Begriff. Ebenso, wenn eine Reaktion die Spezies X erhöht, hat die rechte Seite ein +-Zeichen. Die obigen Beispiele zeigen unimolekulare (C nach D, C nach A + B) und bimolekulare (A+B nach C) Reaktionen.

Ein Beispiel einer aus COPASI entnommenen ODE ist unten für die Konzentrationsänderung von Glucose-6-Phosphat gezeigt.

Für viele Pfade wurden Datenbanken entwickelt, die kuratierte Modelle mit allen oben genannten Informationen enthalten. Das oben beschriebene Hefe-Glykolyse-Modell ist in der Biomodels Database zu finden. Das Modell BIOMD0000000064 kann als Systembiologie-Markup-Sprachen-Datei (SBML) heruntergeladen und in jedes der oben beschriebenen Programme importiert werden.
Die folgenden Grafiken zeigen die Konzentrationen für ausgewählte und alle Spezies als Funktion der Zeit für die Hefe-Glykolyse unter Verwendung von COPASI.

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Die Enzymkinetik mag angesichts der komplizierten mathematischen Ableitungen, der Zahl der beteiligten chemischen Spezies (ein Enzym und all seiner Substrate und Produkte), der Zahl der Schritte im Mechanismus und der großen Zahl von Geschwindigkeits-, Kinetik- und Dissoziationskonstanten schwierig erscheinen. Ein Beispiel für eine solche „komplizierte“ Reaktion, die zuvor untersucht wurde, ist unten gezeigt:

Aber einzelne Enzyme wirken selten isoliert. Sie sind Bestandteile komplexer Stoffwechselwege, die eine Vielzahl von Schritten aufweisen, von denen viele reguliert werden. Um eine Reaktion vollständig zu verstehen, ist es wichtig, die Konzentrationen aller Spezies im gesamten Reaktionsweg als Funktion der Zeit zu untersuchen. Stellen Sie sich vor, Sie leiten die Gleichungen ab und bestimmen alle relevanten Konzentrationen und Konstanten eines Stoffwechselwegs wie der Glykolyse!

Um die Enzymkinetik im Labor zu untersuchen, müssen Sie viel Zeit in die Entwicklung von Assays investieren, um zu messen, wie sich die Konzentration von Spezies als Funktion der Zeit ändert, um die Anfangsgeschwindigkeiten einer enzymkatalysierten Reaktion messen zu können. In Netzwerken verbundener Stoffwechselreaktionen kann sich die Konzentration einiger Spezies im System jedoch nicht ändern. Wie kann das passieren? Zwei einfache Beispiele könnten helfen, zu erklären, wie.

Beispiel 1: Es gibt null Input oder Output von einer gegebenen Reaktion. Dies würde in einem geschlossenen System für eine reversible Reaktion im Gleichgewicht erfolgen.

Für eine reversible Reaktion des Reaktanten R zum Produkt P mit Vorwärts- und Rückwärtsgeschwindigkeitskonstanten erster Ordnung kann die folgende Gleichung im Gleichgewicht geschrieben werden:

Im Gleichgewicht ändern sich R und P nicht.

Beispiel 2: Betrachten Sie die Reaktion als Teil eines Reaktionsweges (wie ein offenes System). Stellen Sie sich nun einen von Null verschiedenen Input zur Bildung des Reaktanten R und einen von Null verschiedenen Output vor, der das Produkt P verbraucht. Wenn die Input- und Outputraten gleich sind, würden sich die Konzentrationen von R und P mit der Zeit nicht ändern. Das heißt, die Bildungsgeschwindigkeit eines Reaktanten R für eine gegebene Reaktion ist gleich der Geschwindigkeit, mit der das Produkt P der gegebenen Reaktion verwendet wird. Dies würde zu einem stationären Zustand, aber nicht zu einer Gleichgewichtskonzentration der Spezies führen.

Das Verständnis eines reinen Enzyms in vitro und in vivo erfordert unterschiedliche Ansätze. Biochemiker isolieren und reinigen gerne ein Enzym, das in einigen Geweben gefunden wird, bis zur Homogenität und untersuchen seinen Wirkungsmechanismus. Bei thermodynamischen Messungen zur Messung von Gleichgewichtskonstanten (Keq) oder Dissoziationskonstanten (KD), aus dem ΔG 0 berechnet werden kann, wird eine Proteinkonzentration normalerweise konstant gehalten, wenn die Konzentration des Bindungsliganden variiert wird (unabhängige Variable). Ein abhängiges Variablensignal (oft spektroskopische) wird gemessen. Die Messungen werden durchgeführt, wenn das Gleichgewicht erreicht ist.

Bei enzymkinetischen Messungen in vitro wird die Enzymkonzentration normalerweise konstant gehalten, während Substrat und Modifikatoren variiert werden (unabhängige Variablen), um zu bestimmen, wie sich die Geschwindigkeit (abhängige Variable) ändert. Die Geschwindigkeit wird durch die Substratkonzentration bestimmt. Wenn die Hemmung untersucht wird, wird das Substrat variiert, während der Inhibitor bei mehreren unterschiedlichen festen Konzentrationen konstant gehalten wird.

In vivo wird die Substratkonzentration und sogar die Enzymkonzentration durch die Geschwindigkeit bestimmt. Vergleichen Sie dies erneut mit der In-vitro-Kinetik, wenn Konzentrationen die Geschwindigkeit bestimmen
Für Reaktionsgruppen in Reaktionswegen ist es besser, den Begriff Fluss J zu verwenden. Im stationären Zustand sind die Ein- und Ausflüsse für eine gegebene Reaktion identisch. Fluss J wird verwendet, um die Geschwindigkeit des Systems zu beschreiben, während Geschwindigkeit oder Geschwindigkeit v verwendet wird, um die Geschwindigkeit eines einzelnen Enzyms in einem System zu beschreiben.

Computerprogramme können stationäre Konzentrationen finden, indem sie die Wurzeln der gewöhnlichen Differentialgleichungen (ODE) finden, wenn sie auf Null gesetzt sind (vF = vR). Um einen Prozess bei sehr niedrigen Konzentrationen zu modellieren, können Programme auch probabilistische oder stochastische Simulationen verwenden, um Wahrscheinlichkeitsverteilungen für Arten und deren zeitliche Änderung für eine endliche Anzahl von Partikeln zu modellieren. In solchen Simulationen werden Konzentrationen (mM) mit Anzahl der Partikel platziert. ODEs eignen sich nicht gut, um diese Bedingungen zu beschreiben, da Konzentrationsänderungen nicht kontinuierlich sind.

Nun zurück zu unserer früheren rhetorischen Frage, die Gleichungen abzuleiten und alle relevanten Konzentrationen und Konstanten eines Stoffwechselwegs wie der Glykolyse zu bestimmen! Es wurde tatsächlich von Teusink et al. für die Glykolyse in Hefe durchgeführt. Tatsächlich wurden viele dieser komplizierten Stoffwechsel- und Signaltransduktionswege mathematisch modelliert, in der Hoffnung, zelluläre und organismische Reaktionen besser zu verstehen. Die quantitative Modellierung und Vorhersage von Input, Output und Konzentrationen aller Arten in komplexen Stoffwechselwegen ist die Grundlage der Systembiologie.

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Diskussion

Das langfristige Ziel der Systembiologie ist die Generierung prädikativer mathematischer Modelle, um zelluläre Prozesse und Phänotypen basierend auf molekularen Daten zu beschreiben und zu verstehen. Für dieses Ziel sind genaue, reproduzierbare und konsistente Messungen der absoluten Analytkonzentrationen unter vielen Bedingungen von entscheidender Bedeutung. Unter den verschiedenen Biomolekülen einer Zelle spielen Proteine ​​eine zentrale Rolle, da sie an fast allen zellulären Prozessen aktiv beteiligt sind und viele wichtige biochemische Ereignisse aus genomischen oder transkriptomischen Messungen nicht abgeleitet werden können (Liu et al, 2016). Jüngste Fortschritte auf dem Gebiet der Proteomik, wie die DIA/SWATH-Massenspektrometrie in Kombination mit neuartigen Datenanalysestrategien, sind so ausgereift, dass es möglich ist, genaue Messungen von Tausenden von Proteinen reproduzierbar über viele Proben hinweg zu erhalten. Es ist jedoch immer noch eine Herausforderung, genaue absolute Häufigkeiten für niedrig exprimierte Proteine ​​zu erhalten. Derzeit werden biologische Erkenntnisse aus quantitativen proteomischen Studien von E. coli stammen meist von grobkörnigen Ebenen, z. B. von der Gesamthäufigkeit der Enzyme, die an einem Stoffwechselweg beteiligt sind et al, 2015 Schmidt et al, 2016 ), aber nicht aus einzelnen Proteinen.

In dieser Arbeit haben wir einen vielseitigen Arbeitsablauf entwickelt, um absolute Häufigkeiten für Tausende von Proteinen auf individueller Proteinebene unter einer Vielzahl von Bedingungen zu erhalten. DIA/SWATH-Massenspektrometrie wurde verwendet, um qualitativ hochwertige Peptidvorläufer-Intensitätsprofile bei hohem Durchsatz und minimalen Kosten zu erzeugen. Für die peptidzentrierte DIA/SWATH-Datenanalyse ist ein umfassendes E. coli Spektralbibliothek mit 64 % aller annotierten E. coli Proteine ​​(2.770 Proteine) wurde erzeugt. Ein neuartiger Protein-Inferenz-Algorithmus namens xTop wurde verwendet, um Protein-Intensitäten aus Peptid-Vorläufer-Intensitäten genau abzuleiten. xTop berücksichtigt alle nachgewiesenen Peptidvorläufer für ein bestimmtes Protein in allen Proben, wodurch die Auswirkungen von Rauschen und fehlenden Werten im Datensatz reduziert werden und eine bessere relative Quantifizierung im Vergleich zu häufig verwendeten Inferenzmethoden wie iBAQ und TopPep1/3 erzielt wird (Abb. 2 ).

Um absolute Proteinmassenfraktionen zu erhalten, haben wir verschiedene Quantifizierungsmethoden mit einer Reihe von Kalibrierungsproben untersucht, die biologische und technische Replikate aus derselben Bedingung umfassten. Die aus Proteomics-Daten mit verschiedenen Inferenzalgorithmen und aus Ribosomen-Profiling-Daten erhaltenen absoluten Massenanteile wurden unter Verwendung (i) eines Satzes von Ankerproteinen bewertet, für die genaue Proteinhäufigkeiten mit stabilen isotopenmarkierten synthetischen Peptiden (AQUA) gemessen wurden, und (ii) mehrere Proteinkomplexe mit bekannter Stöchiometrie. Unter diesen Methoden ergab das Ribosomen-Profiling die genaueste Quantifizierung, zumindest für Proteome, die im Vergleich zur Verdünnung durch die Wachstumsrate nicht signifikant abgebaut werden (Koch & Levy, 1955, Mandelstam, 1958). Da es nicht möglich ist, Ribosomen-Profiling zur parallelen Untersuchung vieler Proben zu verwenden, haben wir das Ribosomen-Profiling als Standard für die Messung absoluter Proteinmassenfraktionen verwendet und es mit einer genauen relativen Quantifizierung über viele Proben von DIA/SWATH und der xTop-Proteininferenzmethode kombiniert.

Der resultierende vielseitige Arbeitsablauf wurde verwendet, um die absolute Häufigkeit von 2.335 Proteinen für verschiedene E. coli Stämme, die unter 66 Bedingungen gewachsen sind, einschließlich Stressbedingungen und nicht-planktonischer Zustände, die noch nie zuvor beschrieben wurden. Absolute Häufigkeiten werden als Proteinmassenfraktionen angegeben, die direkt den zellulären Proteinkonzentrationen entsprechen, ungeachtet möglicher Veränderungen der Zellgröße unter Wachstumsbedingungen (Anmerkung S1) im Anhang. Unser quantitativer Datensatz umfasst Proteine ​​mit geringer Häufigkeit mit zellulären Proteinmassenfraktionen von nur 10 −5 des Proteoms, was Konzentrationen nahe 30/μm 3 für ein durchschnittlich großes Protein entspricht (

60 Kopien pro Zelle für Zellen, die in Glukose-Minimalmedium wachsen), sowie Proteine ​​in hoher Menge mit zellulären Proteinmassenanteilen nahe 10 % (300.000/μm 3 ,

Wir haben die Ergebnisse dieser Studie mit früheren Studien zum Proteom von verglichen E. coli. Peebo et al ( 2015 ) studiert E. coli BW25113 in Chemostat gezüchtet (Peebo et al, 2015). Wir verglichen ihre in Glucose-Minimalmedium erhaltenen Ergebnisse mit unseren für MG1655 (EQ353), das in Glucose-Batch-Kultur gezüchtet wurde. Ihre Studie zeigte eine geringere Proteinabdeckung (etwa 60% von uns). Für die nachgewiesenen (höher exprimierten) Proteine ​​stimmten ihre absoluten Häufigkeiten gut mit unseren überein (Anhang Abb. S14A und blaue Symbole in Anhang Abb. S14D). Schmidt et al ( 2016 ) untersuchten hauptsächlich BW25113 in einer Vielzahl von Batch- und kontinuierlichen Kulturen, lieferten aber auch Daten für MG1655 in Glukosemedium zum Vergleich mit anderen Studien (Schmidt et al, 2016). Letzteres verglichen wir mit unseren Ergebnissen für MG1655 (EQ353) in Glucose-Match-Kultur. Während die Anzahl der nachgewiesenen Proteine ​​vergleichbar war (1.901 vs. 1.843), beobachteten wir eine systematische Unterschätzung von Proteinen mit geringer Häufigkeit (Anhang Abb. S14B) und eine größere Varianz in der Stöchiometrie bekannter Proteinkomplexe im Vergleich zu unseren Daten (hellblau in Anhang Abb S14D). Diese Ergebnisse stimmen mit dem Bias der iBAQ-Methode überein, die in dieser Arbeit zur Ableitung der Proteinhäufigkeit verwendet wurde, wie zuvor diskutiert (Anhang Abb. S4D und S5). Schließlich Caglar et al ( 2017 ) berichtete Proteinabundanzen für E. coli B Stamm (REL606) unter einer Reihe von Bedingungen (Caglar et al, 2017). Wir verglichen ihre Daten für Glukose-Minimalmedium bei exponentiellem Wachstum mit dem gleichen Datensatz für MG1655 (EQ353), das mit ähnlichen Geschwindigkeiten (0,69/h im Vergleich zu 0,75/h für REL606) in Glukose-Minimalmedium wuchs. Während die Anzahl der berichteten Proteine ​​ähnlich war, zeigten die beobachteten Proteinhäufigkeiten eine deutlich größere Streuung im Vergleich zu den anderen Studien (S14C, graue Symbole in S14D).

Bemerkenswert ist, dass die in diesen Studien diskutierten biologischen Ergebnisse weitgehend unempfindlich gegenüber der Problematik von Proteinen mit geringer Häufigkeit waren, da sie meist auf dem Verhalten von Proteingruppen oder einzelnen Proteinen in hoher Häufigkeit beruhten. Dies zeigt sich am deutlichsten in der Studie von Hui et al ( 2015 ), in dem nicht einmal über die Abundanz einzelner Proteine ​​berichtet wurde (Hui et al, 2015). Die anderen Studien berichteten über Abundanzen meist auf der Ebene von Signalwegen oder funktionellen Gruppen, die von den reichlich vorhandenen Proteinen dominiert werden. Selten werden Abundanzen einzelner Proteine ​​diskutiert. Im Gegensatz dazu führte uns die robuste Quantifizierung von Proteinmassenfraktionen unter allen Bedingungen, die unser Arbeitsablauf bietet, zu vielen interessanten biologischen Szenarien, wie unten zusammengefasst.

Die in dieser Arbeit analysierten biologischen Ergebnisse gliedern sich in zwei Teile, auf grobkörniger Ebene und auf individueller Proteinebene. Aufbauend auf früheren Arbeiten (Hui et al, 2015 ) haben wir zunächst das Proteom von E. coli auf einem grobkörnigen Niveau, als Reaktion auf drei Haupttypen von wachstumslimitierenden Bedingungen (metabolische Einschränkung und antibiotische Hemmung, insgesamt 29 Proben). Dies führte zur Klassifizierung von 1.821 Proteinen in acht „Proteomsektoren“, die jeweils aus Proteinen mit ähnlichen Reaktionsprofilen unter diesen Bedingungen bestehen. Unsere Ergebnisse stimmen sehr stark mit denen von Hui . überein et al ( 2015 ) für die in beiden Studien nachgewiesenen Proteine. Mit unserem Workflow wurde jedoch eine deutlich höhere Auflösung bei Proteinen mit geringer Häufigkeit erreicht, d. h. wir haben fast doppelt so viele Proteine ​​quantifiziert und klassifiziert, obwohl die absoluten Massenanteile dieser Proteine ​​nur betrugen

10 % mehr als in Hui . gemeldet et al (2015). Ein Großteil der neu entdeckten Proteine ​​war in allen drei Limitationen (S’-Sektor) hochreguliert, ein bisher nicht beobachtetes Muster.Da viele dieser Proteine ​​mit zellulären Prozessen wie Lipid- und Zellwandbiosynthese, Zellteilung, Zellzyklus und DNA-Replikation assoziiert sind, führten wir die Zunahme des Massenanteils dieser Proteine ​​bei langsamem Wachstum auf Veränderungen im Verhältnis von Zelloberfläche und Zellzahl zu Zellvolumen, da das Zellvolumen bei langsamem Wachstum abnimmt (Si et al, 2017). Dies konnte explizit für die Porine der äußeren Membran gezeigt werden (Abb. 5E), wo die Häufigkeit pro Masse bei langsamem Wachstum zunahm, was mit S/S’-Sektorprofilen übereinstimmte, während die Oberflächendichte unter allen Bedingungen eine ungefähre Konstanz zeigte.

In dieser Studie haben wir eine noch nie dagewesene Vielfalt an Wachstumsbedingungen untersucht, die es uns ermöglichte, ein umfassendes E. coli Spektralbibliothek und bot uns eine einzigartige Perspektive zum Studium E. coli Physiologie. Hier fassen wir einige Highlights zusammen. Zum Beispiel könnten die Proteome von Zellen in Glucose-begrenztem Wachstum über titrierbare Glucoseaufnahme mit denen von Zellen verglichen werden, die auf einer Vielzahl von Kohlenstoffquellen wachsen. Dies ergab eine einzigartige Perspektive auf die Proteinallokation bei kohlenstoffbegrenztem Wachstum (Abb. 6). Überraschenderweise war nur ein kleiner Bruchteil der im kohlenstoffbegrenzten Wachstum hochregulierten Proteine ​​spezifisch für die Nutzung der zugeführten Kohlenstoffquellen. Die Hälfte dieser hochregulierten Proteine ​​waren TCA-Enzyme und Flagellen-verwandte Proteine, während der Rest zwischen anderen generischen Transportern und dem Außenmembranporin NmpC verteilt war. Dieses Ergebnis stellt die Ansicht, dass die Proteomzusammensetzung optimal für die Maximierung des Wachstums bestimmt ist, in Frage (O'Brien et al, 2013 de Groot et al, 2020 Dourado & Lercher, 2020 ), da viele dieser hochregulierten Proteine ​​nicht direkt für das Wachstum in der zugeführten Kohlenstoffquelle nützlich sind.

Das Proteom von Zellen unter verschiedenen Nährstoffbeschränkungen und Antibiotikahemmung zeigte starke Unterschiede, wie in der Sektoranalyse (Abb. 4) und auch in direkten Streudiagrammen (Anhang Abb. S10) quantifiziert. Überraschenderweise veränderte sich das Proteom unter Stressbedingungen, insbesondere bei hoher Temperatur (42 °C) oder unter hyperosmotischem Stress (0,6 M NaCl), auf globaler Ebene nicht signifikant, trotz eines 4-fachen Unterschieds in den Wachstumsraten im Vergleich zu unbelasteten Bedingungen oder zwischen unterschiedlichen Belastungszuständen (Abb. 8, Anhang Abb. S11). Dies deutet darauf hin, dass im Gegensatz zu Stoffwechseleinschränkungen und Antibiotikahemmung, bei denen die Wachstumsrate eng mit der Einschränkung im Proteom (You et al, 2013 ) sind die mit diesen Stressreaktionen verbundenen Wachstumsdefekte wahrscheinlich nicht auf Einschränkungen im Proteom zurückzuführen, sondern können stattdessen von Problemen herrühren, die durch eine Neuzuordnung des Proteoms nicht gelöst werden können.

Ein weiteres überraschendes Ergebnis unseres Datensatzes sind die deutlichen Unterschiede bei den Proteinmassenfraktionen, die aus scheinbar geringen Effekten resultieren. M9 und MOPS sind beispielsweise zwei häufig verwendete Nährmedien für Laborstudien von E. coli. Der Vergleich ihrer Proteome zeigt jedoch eine Vielzahl von deutlichen Unterschieden, die durch Unterschiede in der Thiamin- und Eisenverfügbarkeit verursacht werden ( 7A ). Ebenso können verschiedene Laborstämme von E. coli, sogar solche, die als gewöhnlicher MG1655-Stamm markiert sind, weisen wichtige biologische Unterschiede auf (Abb. 9), insbesondere in Bezug auf die Expression von Genen, die an der Synthese und dem Abbau von cyclischem-di-GMP beteiligt sind, einem wichtigen Botenmolekül, das die Biofilmbildung steuert (Jenal et al, 2017). Dies wird auf die stammabhängige Expression von FlhDC (Barker et al, 2004 Fahrner & Berg, 2015), dem Hauptregulator der Flagellensynthese, der auch die Expression von PdeH antreibt (Ko & Park, 2000), der wichtigsten Phosphodiesterase, die für den zyklischen di-GMP-Abbau verantwortlich ist. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung der Stammselektion bei der Untersuchung von Motilität und Biofilmbildung.

Bisher deckten unsere Analysen nur einen kleinen Teil der in dieser Studie genau quantifizierten Proteine ​​ab. Perspektivisch können unsere Daten als reichhaltige Ressource für die Systembiologie-Community dienen, um Hypothesentests, die Integration mit anderen quantitativen Omics-Ressourcen oder klassische biochemische Studien sowie genomweite Modellierungen von E. coli Genexpression und Stoffwechsel. Wenn sie beispielsweise mit RNA-seq-Daten zu denselben Stämmen und Bedingungen kombiniert werden, können diese Daten verwendet werden, um die Translationseffizienz für Tausende von Genen unter vielen Bedingungen abzuleiten. Wir erwarten, dass Daten dieser hohen Qualität und Robustheit auf der Ebene einzelner Proteine ​​eine neue Ära in der quantitativen Systembiologie einläuten.


9E: Stoffwechselkontrollanalyse und Systembiologie - Biologie

Metabolomik: Themen der Chemischen Biologie

Julian L. Griffin, Helen J. Atherton und Michael R. Pears, Department of Biochemistry, Tennis Court Road, Cambridge, Vereinigtes Königreich

Mit der Entwicklung der Systembiologie wurden mehrere Ansätze entwickelt, um eine Organisationsebene in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus weltweit zu profilieren. Metabolomics, auch als Metabonomics bezeichnet, ist ein Ansatz, der versucht, alle niedermolekularen Metaboliten in einer biologischen Matrix zu profilieren. Eine große Herausforderung dieses Ansatzes besteht wie bei anderen "-omic"-Technologien darin, dass das Metabolom kontextabhängig ist und je nach Entwicklungsstadium/Alter, genetischer Veränderung, Krankheit und Umgebung variiert. Somit muss das Metabolom eines Organismus per Definition alle Auswirkungen dieser Manipulationen berücksichtigen. Trotz dieser Herausforderungen wurde der Ansatz bereits in einer Reihe von Tiermodellen zum Verständnis des Stoffwechsels angewendet und in jüngerer Zeit auch in klinischen Studien eingesetzt. In diesem Artikel werden wir einige gängige Ansätze diskutieren, die derzeit in der Metabolomik verwendet werden, und die Ergebnisse, die sie hervorgebracht haben. Insbesondere werden wir uns auf die beiden gebräuchlichsten analytischen Ansätze, die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und die Massenspektrometrie, und einige biologische Probleme konzentrieren, mit denen sie behandelt wurden.

Die postgenomische Ära versucht, die biologische Funktion von Genen zu definieren und wie diese den Phänotyp eines Organismus definieren. Im Gegensatz zu Genomsequenzierungsprojekten erfordert das effektive Studium der funktionellen Genomik eine Vielzahl multidisziplinärer Techniken (1). Die Entwicklung von Analysewerkzeugen, die die Hochdurchsatzmessung von Genprodukten ermöglichen, hat eine umfassende Signatur des physiologischen Zustands der Zelle auf mehreren Ebenen geliefert (Abb. 1). Metabolomics beschreibt die groß angelegte Analyse von endogenen Metaboliten, die die gesamte Sammlung kleiner Moleküle in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organismus oder einer Bioflüssigkeit umfassen und Zucker, organische Säuren, Aminosäuren und Nukleotide umfassen (2, 3).

Abbildung 1. Der physiologische Zustand der Zelle wird in einem funktionellen genomischen Ansatz auf mehreren Ebenen gemessen, die alle miteinander interagieren, um ein hochgradig vernetztes Netzwerk zu bilden. Insbesondere werden Unterschiede im Transkriptom, Proteom und Metabolom überwacht, um die Genfunktion und zelluläre Reaktionen auf externe Stimuli zu untersuchen.

Vorteile eines metabolomischen Ansatzes

Ein metabolomischer Ansatz hat mehrere Vorteile für die Verwendung in der funktionellen Genomik. Erstens ist die Technik wie bei Transkriptions- und Proteomanalysen kontextabhängig, sodass das Metaboliten-Komplement je nach physiologischem, Entwicklungs- oder pathologischem Zustand der Zelle, des Gewebes, des Organs oder des Organismus variiert, was es zu einem hochwirksamen Werkzeug macht um Veränderungen des Phänotyps zu messen.

Zweitens macht die Bedeutung von Metaboliten für die biologische Kontrolle und Kommunikation als Bausteine ​​für komplexe Makromoleküle und Energietransporter sie zu wirksamen Markern der Zellfunktion. Tatsächlich bilden Metaboliten molekulare Endpunkte weiter unten vom Gen bis zur Funktion. Drittens legt die metabolische Kontrollanalyse nahe, dass, obwohl erwartet wird, dass Veränderungen der Mengen einzelner Enzyme einen geringen Einfluss auf den metabolischen Fluss haben, sie einen signifikanten Einfluss auf die Metabolitenkonzentrationen haben können und dies auch tun, selbst wenn Veränderungen des Flusses vernachlässigbar sind. Viertens überspannen Metaboliten die Speziesbarriere, weil sie unabhängig vom Organismus die gleiche chemische Struktur aufweisen. Metabolomics ist daher eine universelle „Omic“-Technologie im Gegensatz zur Transkriptomik und Proteomik, bei der a priori Kenntnisse der DNA- und Proteinsequenzen jedes Organismus erforderlich sind. Es wird wenig Zeit benötigt, um Protokolle für eine neue Spezies zu reoptimieren. Schließlich bietet die Metabolomik mehrere praktische Vorteile, darunter günstige Kosten pro Probe, hoher Durchsatz und vollständige Automatisierung. Zum Beispiel können nach dem ersten Kauf eines Kernspinresonanz-(NMR)-Spektrometers oder Massenspektrometers (MS) Proben zu einem Preis in der Größenordnung von £ . analysiert werden

1,00 pro Probe, bezogen auf Verbrauchsmaterialien, wobei die analytischen Erfassungszeiten typischerweise 10 min (NMR) bis 70 min (GC-MS) betragen. Diese Kosten sind im Vergleich zu Transkriptions- und Proteomanalysen sehr günstig.

Die Begriffe Metabolomics (2) und der verwandte Begriff Metabonomics (3) wurden in den späten 1990er Jahren geprägt, um die Verwendung globaler Profiling-Tools in Kombination mit Mustererkennung zu beschreiben, um einen metabolischen Phänotyp einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus zu definieren. Die Verwirrung darüber, wie das Feld genannt werden soll, ist immer noch ein anhaltendes Problem, und neue Forscher auf diesem Gebiet sollten sich beider Begriffe bewusst sein. Viele Menschen verwenden die Begriffe Metabolomik und Metabonomik synonym (4, 5). Nicholson und Mitarbeiter stellen jedoch fest, dass Metabonomik die „quantitative Messung der zeitbezogenen multiparametrischen metabolischen Reaktion lebender Systeme auf pathophysiologische Stimuli oder genetische Veränderungen“ ist, während Metabolomik die „Messung von Metabolitkonzentrationen und -flüssen und -sekretionen in Zellen und Geweben in denen ein direkter Zusammenhang zwischen der genetischen Aktivität, der Proteinaktivität und der Stoffwechselaktivität selbst besteht“ (6). Um noch mehr Verwirrung zu stiften, wurden in Abhängigkeit von den angewandten Analysetechniken zusätzliche Begriffe vorgeschlagen. „Metabolic Profiling“ wurde vorgeschlagen, um sich auf die detaillierte Analyse von Metaboliten durch Bindestrich-Techniken wie Gaschromatographie-(GC)-MS und Flüssigchromatographie-(LC)-MS zu beziehen. Im Gegensatz dazu wird angenommen, dass der „metabolische Fingerabdruck“ eine Untergruppe von Metaboliten misst und Techniken wie NMR und direkte Infusionselektrospray-MS verwendet, um einen Stoffwechsel-Strichcode zu erstellen (7). Der Begriff „Metabolomik“ wird in diesem Artikel durchgehend verwendet.

Analytische Techniken

Die Metabolomik wird durch die bemerkenswerte Heterogenität und Komplexität der Metaboliten herausgefordert. Metaboliten umfassen Konzentrationsbereiche in der Größenordnung von 10 9 , Polaritätsbereiche von

10 20 und Massenbereiche in der Größenordnung von 1500 amu. Darüber hinaus liefern die meisten Extraktionsverfahren keine vollständigen Darstellungen, was dazu führt, dass nur ein Teil des Metaboloms analysiert wird. Eine wirklich umfassende Abdeckung des Metaboloms erfordert daher mehrere Techniken und unterschiedliche Probenvorbereitungsstrategien, um diese Vielfalt zu erfassen. Die wichtigsten analytischen Plattformen für die Metabolomik umfassen 1 H-NMR-Spektroskopie und GC- und LC-MS (Abb. 2), obwohl andere auch andere Techniken wie Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Raman-Spektroskopie verwendet haben . Die wichtigsten Techniken, beurteilt nach der aktuellen Anzahl von Veröffentlichungen, werden unten diskutiert.

Abbildung 2. Die beiden am häufigsten verwendeten Ansätze für die Metabolomik sind die NMR-Spektroskopie und die Massenspektrometrie. Um die Abdeckung des Metaboloms zu maximieren, können diese Techniken kombiniert werden. Diese Abbildung zeigt die Analyse der wässrigen Fraktion eines Abschnitts von Herzgewebe, die NMR-Spektroskopie, Gaschromatographie-Massenspektrometrie und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie verwendet. Obwohl Massenspektrometrie-Ansätze von Natur aus empfindlicher sind als NMR-Spektroskopie, wird die Identifizierung von Metaboliten schwieriger.

Die hochauflösende 1 H-Kernresonanzspektroskopie (NMR) ist eine relativ schnelle Technik und ist hinsichtlich der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sehr robust. Die Allgegenwart von Protonen in zellulären Metaboliten und die Tatsache, dass andere Kerne durch NMR beobachtbar sind (z. B. 31 P und 13 C), führen dazu, dass eine relativ große Anzahl verschiedener Metaboliten nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus erfordert die Technik eine minimale Probenvorbereitung und ihre zerstörungsfreie Natur ermöglicht die Durchführung von mehr Analysen. 1 H-NMR ist jedoch ein von Natur aus unempfindliches Analysewerkzeug, das nur hochkonzentrierte Metaboliten misst. Typischerweise kann 1 H-NMR unter Verwendung einer einfachen eindimensionalen Pulssequenz 30-100 Metaboliten im Urin, 20-30 Metaboliten im Blutplasma und 10-30 Metaboliten in Gewebeextrakten messen (8). Trotzdem hat sich 1 H-NMR als hochgradig diskriminierend für Lebertoxine bei Ratten (9, 10), Mausmodellen von Herz- und neurologischen Erkrankungen (11, 12) und stillen Phänotypen bei Hefen (13) erwiesen. Es wurde vermutet, dass dieser Befund auf die hochkonzentrierten Metaboliten zurückzuführen ist, die zentrale Hubs des Stoffwechsels darstellen, wodurch eine Störung an einem Punkt in einem metabolischen Netzwerk über diese hochgradig verbundenen Hubs auf andere Pfade übertragen würde (14, 15). Die Beschränkung der Abdeckung des Metaboloms auf etwa 30 Metaboliten kann jedoch die Isolierung von Metaboliten als einzigartige Biomarker für Krankheitsprozesse erschweren und die Schlussfolgerung, welche Wege während einer bestimmten Modifikation gestört werden, verwirren. Es werden Strategien entwickelt, um die NMR zu einem sensibleren Ansatz zu machen, einschließlich der Verwendung von Kryosonden und Techniken mit Bindestrich. Kryosonden verwenden flüssiges Helium, um die NMR-Spulenbaugruppe und den Vorverstärker auf abzukühlen

4 K, was durch Reduzierung des thermischen Rauschens zu einer drei- bis vierfachen Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses führt. Techniken mit Bindestrich beinhalten zuerst die Trennung von Metaboliten hoher und niedriger Konzentration unter Verwendung von Flüssigchromatographie. Diese Trennung verbessert die Empfindlichkeit, indem sie die Wahrscheinlichkeit von koresonanten Peaks verringert und den dynamischen Bereich des NMR-Experiments verbessert (16).

Andere NMR-basierte Techniken ermöglichen die Quantifizierung von Metabolitenkonzentrationen in intaktem Gewebe, entweder in vivo oder ex vivo. Beispielsweise ermöglicht die Magnetresonanzspektroskopie (MRS) die nichtinvasive Abfrage von Metabolitenkonzentrationen direkt in vivo innerhalb einer bestimmten lokalisierten Region. Die Technik hat sich bei der Untersuchung von Alzheimer (17, 18), Schädel-Hirn-Trauma (19), Multipler Sklerose (20) und vielen Hirntumoren (21) bewährt. Ein Nachteil der MRS besteht jedoch darin, dass sie durch eine geringe spektrale Auflösung beeinträchtigt wird, teilweise aufgrund der in vivo verwendeten niedrigeren Felder, aber auch durch dipolare Kopplungen, Anisotropie der chemischen Verschiebung und Inhomogenitätseffekte des magnetischen Volumens, die zu einer Verbreiterung des spektralen führen Resonanzen. Diese Effekte können drastisch reduziert werden, indem die Probe im „magischen Winkel“ (54,7 °) gedreht wird. Tatsächlich ist es mit hochauflösender 1 H-NMR-Spektroskopie um magische Winkeldrehung (HRMAS) möglich, hochauflösende Spektren zu erzeugen, die denen von Gewebeextrakten, insbesondere von intaktem Gewebe ex vivo, vergleichbar sind (22-24). Dieses Verfahren umgeht die Notwendigkeit von Gewebeextraktionsverfahren und eliminiert effektiv einen Schritt, der mehr Variation in die Metabolitenquantifizierung einführt. Ein weiterer Vorteil von HRMAS 1 H NMR ist die Aussicht, die metabolische Kompartimentierung zu untersuchen. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte Subkompartimente von Acetoacetat und Glutamin in Mitochondrien des Rattenherzens, die nicht NMR-sichtbar waren (22).

Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die Analyse von Metaboliten mit geringerer Konzentration im Vergleich zur 1 H-NMR-Spektroskopie. Eine umfassende metabolische Analyse durch MS erfordert jedoch häufig eine Probenvorfraktionierung, die am häufigsten durch Gaschromatographie (GC) und Flüssigkeitschromatographie (LC) erfolgt. Obwohl diese Vorfraktionierung die Auflösung der Technik verbessert und die Ionenunterdrückung verringert, kann das Hinzufügen eines chromatographischen Schritts zu einer Variabilität in einem Datensatz führen.

Bei der GC-MS werden zunächst flüchtige und thermisch stabile Verbindungen durch GC getrennt und die eluierten Verbindungen durch MS nachgewiesen. Um das Spektrum an flüchtigen und thermisch stabilen Verbindungen zu maximieren, werden die Proben normalerweise vor der Analyse für metabolomische Experimente derivatisiert. Methoximation in Kombination mit Trimethylsilylierung ist das vorherrschende Protokoll zur Untersuchung von wasserlöslichen Metaboliten (25). Die Methoximierung reduziert die Zahl der bei Zuckern vorhandenen Isomeren, wobei die Zahl der isomeren Formen von 5 auf 2 reduziert wird, wodurch Chromatogramme drastisch vereinfacht werden. Bei der Trimethylsilylierung werden austauschbare Protonen durch Silylgruppen ersetzt, um Verbindungen weniger polar und damit flüchtiger zu machen und die Chromatographie zu verbessern. Die derivatisierten Proben werden in einer Einlassöffnung verdampft und auf die Säule injiziert, wo sie von einem Inertgas getragen werden. Verbindungen werden entsprechend ihrer Verteilung zwischen der mobilen Gasphase und der säulengebundenen stationären Phase getrennt und die eluierten Verbindungen anschließend innerhalb der Ionenquelle ionisiert. Die am häufigsten verwendete Ionisationsmethode ist der Elektronenstoß, bei dem ein Elektronenstrahl die Probenmoleküle ionisiert, die gleichzeitig fragmentieren. Da die Energie dieser Elektronen vordefiniert ist, ist das Fragmentierungsmuster reproduzierbar und liefert effektiv einen nahezu einzigartigen Metaboliten-Fingerabdruck. Metaboliten können daher leicht identifiziert werden, indem Spektren mit denen in kommerziell erhältlichen Massenspektraldatenbanken (z. B. http://www.nist.gov) verglichen werden. Obwohl dieser Ansatz im Allgemeinen gut funktioniert, wird die Unterscheidung zwischen Zuckerdiastereomeren dadurch erschwert, dass beide Spezies identische Fragmentierungsmuster aufweisen. In solchen Fällen sind Aufbewahrungszeiten von Standards für eine genaue Zuordnung zwingend erforderlich. Darüber hinaus sind Spektraldatenbanken nicht erschöpfend, sodass nicht alle Peaks zugeordnet werden können. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, metabolomspezifische Massenspektralbibliotheken zu erstellen (26). Eine detailliertere Charakterisierung unbekannter Peaks kann durchgeführt werden, indem dieselben Proben unter Verwendung chemischer Ionisation im Gegensatz zur Elektronenstoß-Ionisation oder unter Verwendung von Ionenfallen-Massenspektrometern untersucht werden. Die chemische Ionisation ist eine weniger energiereiche Ionisationsmethode und erzeugt daher weniger Fragmentierung. Dieses Verfahren erhöht die Wahrscheinlichkeit, das Molekülion zu beobachten und kann so die Identifizierung von Verbindungen erleichtern.

Die Sensitivität des GC-MS-Ansatzes ist beeindruckend. Mit einer einfachen Einzelquadrupol-GC-MS berichteten Fiehn und Mitarbeiter, die an Arabidopsis thaliana arbeiteten, über den Nachweis von 326 Metaboliten, eine Zahl, die seitdem mit einem Flugzeit-GC-MS auf über 1000 angestiegen ist (25, 27). Darüber hinaus hat die Technik von den jüngsten technologischen Fortschritten in der zweidimensionalen GC profitiert (28).

LC-MS bietet eine Metabolitentrennung durch LC vor dem Nachweis durch MS.Eine Probenderivatisierung ist im Allgemeinen nicht erforderlich, da keine Voraussetzung für die Flüchtigkeit erforderlich ist. Darüber hinaus kann LC-MS im Vergleich zu GC-MS ein breiteres Spektrum an Metaboliten analysieren, da es nicht auf flüchtige Verbindungen oder Moleküle beschränkt ist, die flüchtig gemacht werden können. Insbesondere thermolabile oder große Moleküle wie Di- und Triphosphate, CoA-Addukte, Peptide und Lipide sind alle einer LC-MS-Analyse zugänglich (29). Nach der Trennung durch LC werden die Verbindungen ionisiert, typischerweise unter Verwendung von Elektrospray-Ionisierung (26). Die Probe wird durch ein dünnes metallisches Kapillarröhrchen geleitet, das je nach verwendetem Lösungsmittel positiv oder negativ geladene Ionen enthält. Die elektrostatische Aufladung der Probe erzeugt dann eine Wolke geladener Tröpfchen, und die Auflösung dieser Tröpfchen führt zu Ionen, die von der MS abgetastet werden. Da die Elektrospray-Ionisation eine minimale Fragmentierung des Molekülions verursacht, ist eine direkte Identifizierung von Metaboliten durch Vergleich von Massenspektren oft nicht möglich. Strukturelle Informationen können jedoch durch den Einsatz von Tandem-MS-Technologien gewonnen werden, wobei sequentielle und selektive Fragmentierungen durchgeführt werden können. Darüber hinaus können Verbindungen, die eine bestimmte funktionelle Einheit enthalten, analysiert werden, indem Neutralverlustexperimente durchgeführt werden.

Pietiläinen und Mitarbeiter (29) haben LC-MS-basierte Lipidomika verwendet, um zu untersuchen, ob erworbene Fettleibigkeit mit unterschiedlichen Serumlipidprofilen bei jungen erwachsenen eineiigen Zwillingen assoziiert war, die entweder konkordant oder diskordant (10-25 kg Gewichtsunterschied) für Fettleibigkeit waren. Bei den diskordanten Zwillingen wies das Blutserum erhöhte Konzentrationen an proinflammatorischen und proatherogenen Lysophosphatidylcholinen und eine Abnahme der antioxidativen Etherphospholipide auf, was darauf hindeutet, dass bei diesen adipösen Personen das Lipidprofil bereits so war, dass es Atherogenese, Entzündungen und Insulinresistenz förderte. LC-MS wurde auch verwendet, um Veränderungen in der wässrigen Fraktion von Gewebeextrakten (31), Blutplasma und Urin (30) von Nagetiermodellen mit Typ-II-Diabetes zu verfolgen, aber hier besteht die größte Herausforderung darin, die nachgewiesenen Metaboliten zu identifizieren, und oft Solche Daten wurden hauptsächlich zur Klassifizierung von Proben im Rahmen einer metabolischen Fingerabdruckstudie verwendet, anstatt Biomarker zu identifizieren.

Im Vergleich zur GC-MS befindet sich die Anwendung der LC-MS im Bereich der Metabolomik noch in einem Vorstadium. Die Reproduzierbarkeit ist ein wichtiges Anliegen, und eine echte Quantifizierung kann durch Ionensuppressionseffekte behindert werden, bei denen ein koeluierender Metabolit die Ionisierung eines anderen beeinflusst (26). Das Fehlen von Elektrospray-Ionisations-Massenspektralbibliotheken macht auch die Identifizierung durch LC-MS zu einem besonders herausfordernden Problem. Nichtsdestotrotz entwickelt sich die Technik schnell und hat von mehreren technologischen Fortschritten profitiert, wie der Erfassung genauer Massendaten durch die Verwendung der Ionenzyklotronresonanz-Fourier-Transformations-MS (26).

Es ist möglich, die Chromatographiestufe zu umgehen und die direkte Infusion von Lipidextrakten in das Massenspektrometer als Teil eines als Shotgun-Lipidomik bezeichneten Ansatzes zu verwenden. Han und Kollegen (32), die diesen Ansatz verwendeten, zeigten eine starke Abnahme von Cardiolipin im Myokard nach Streptozotocin-induziertem Diabetes mit fortschreitender Ansammlung von Triglyceriden im Herzen. Ähnliche Modulationen des Cardiolipin-Stoffwechsels wurden bei der ob/ob-Maus beobachtet.

Beachten Sie, dass ein wesentlicher Bestandteil des metabolomischen Ansatzes die Anwendung von Mustererkennungstechniken ist, um abzuleiten, welche Variation in einem Datensatz mit einer bestimmten Krankheit, genetischen Veränderung oder anderen Manipulation des Systems verbunden ist. Aus Platzgründen ist es nicht möglich, diesen Bereich im Rahmen dieses Artikels zu diskutieren, wir verweisen jedoch auf mehrere hervorragende Übersichtsartikel (33, 34).

Anwendungen der Metabolomik

Die Metabolomik hat sich mit einer Vielzahl von Anwendungen als äußerst vielseitig erwiesen, einschließlich der Untersuchung der Genfunktion, Toxikologie, des Pflanzenstoffwechsels, der Umweltanalyse, der klinischen Diagnostik, der Untersuchung von Krankheiten und der Unterscheidung von Genotypen von Organismen. Angesichts der Vielzahl und Bandbreite der inzwischen veröffentlichten Ansätze ist es nicht möglich, eine endgültige Liste zu erstellen, aber wir haben im Folgenden einige wichtige Veröffentlichungen aufgeführt, um die möglichen Anwendungen der Metabolomik aufzuzeigen.

Untersuchung der Genfunktion

Einer der ersten großen Erfolge der Metabolomik war die Definition von stillen Phänotypen in Hefe, bei der konventionelle Wachstumsratenanalysen nicht in der Lage waren, verschiedene Hefemutanten zu unterscheiden (12). Mithilfe von 1 H-NMR-Spektroskopie wurde offensichtlich, dass „stille“ Hefemutanten kompensierende Veränderungen in intrazellulären Metaboliten aufweisen, damit die Zellen mit normaler Geschwindigkeit wachsen können. Mutanten, bei denen Gene mit verwandter biologischer Aktivität deletiert wurden, führten zu ähnlichen metabolischen Störungen und somit zu metabolischen Profilen. Insbesondere in dieser Studie wurden zwei Hefestämme, die entweder für eines oder das andere der beiden redundanten Gene für 6-Phosphofructo-2-Kinase deletiert waren, gemäß ihren Stoffwechselprofilen zusammengeclustert, ebenso wie Stämme, die für Gene im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Stoffwechsel deletiert wurden (12) . Um diesen vergleichenden Metabolomik-Ansatz zu beschreiben, haben die Autoren den Begriff FANCY für die funktionelle Analyse von Coresponses in Hefe geprägt (12). Derzeit wird FANCY verwendet, um die Genfunktion vorherzusagen. Metabolische Profile von Stämmen, die für bekannte Gene deletiert wurden, werden mit denen für unbekannte Gene verglichen, in der Hoffnung, biologische Rollen zuzuordnen.

Einige der bedeutendsten Entwicklungen in der metabolischen Profilerstellung, insbesondere unter Einbeziehung der GC-MS, wurden in der Disziplin der Pflanzenwissenschaften gemacht (35) (Abb. 3). Pflanzen gelten im Vergleich zu Säugetieren und Hefe als außergewöhnlich reich an Metaboliten. Dieser Reichtum rührt nicht nur von der Größe ihrer Genome her, die von 20.000 bis 50.000 Genen reicht, sondern auch von mehreren Substratspezifitäten für viele Enzyme, subzellulären Kompartimenten und nichtenzymatischen Reaktionen. Derzeit wurden 50.000 verschiedene Verbindungen in Pflanzen aufgeklärt (36), und die endgültige Zahl soll auf etwa 200.000 steigen (28). Gleichzeitig wurden die in der Metabolomik verwendeten Werkzeuge und Analysetechniken von Forschern auf diesem Gebiet schnell weiterentwickelt. Ein Hauptziel der Pflanzenmetabolomik besteht darin, die Informationen über die Zusammensetzung und Kontrolle der Pflanzenbiochemie zu erweitern. Ein Metaboliten-Profiling wurde an einer Vielzahl von Pflanzenarten durchgeführt, darunter Arabidopsis thaliana (25), Tomate (37), Kartoffel (38) und Reis (39). Die Bemühungen konzentrieren sich auf die Charakterisierung stiller Pflanzenphänotypen und den Versuch, die biologische Rolle von Genen mit unbekannter Funktion aufzuklären. Zum Beispiel zeigte eine modifizierte Kartoffelpflanzenlinie, die in der Expression der Saccharose-Synthase-Isoform II unterdrückt wurde, keinen offensichtlichen Phänotyp in Bezug auf Morphologie, Ertrag oder Wachstumsrate im Vergleich zu Elternlinien. Durch die Verwendung von GC-Time-of-Flight-MS zur Analyse der Stoffwechselprofile wurden jedoch ungefähr 1000 Verbindungen quantifiziert und Pflanzensorten erfolgreich unterschieden (38). In ähnlicher Weise haben andere Forscher transkriptomische und metabolomische Analysen integriert, um die globalen Reaktionen auf Ernährungsstress bei Arabidopsis thaliana zu untersuchen, und haben gezeigt, dass die am Glucosinolat-Stoffwechsel beteiligten Gene und Metaboliten als Reaktion auf Schwefel- oder Stickstoffmangel koordiniert reguliert werden (40). Metabolomik wurde auch bei der Charakterisierung der regulatorischen Synthese neuer Pflanzenprodukte eingesetzt, beispielsweise wurden modifizierte gesundheitsbezogene Carotinoid- und Flavonoid-basierte Antioxidantien in transgenen Tomaten isoliert (41). Auch Pflanzen-Wirt-Interaktionen sind ein beliebtes Ziel für metabolomische Studien (42, 43).

Abbildung 3. Ein Beispiel für die Verwendung von GC-MS für das metabolische Profiling. Links: Ein Ausschnitt des Gesamtionenchromatogramms aus der Analyse von TMS-derivatisierten wässrigen Gewebeextrakten aus der Leber von PPAR-α-Null-Maus. Metaboliten werden aus genauen Retentionszeiten und dem Vergleich entsprechender Massenspektren mit denen in der NIST-Datenbank identifiziert. 97 Metaboliten wurden quantifiziert. Rechts: Zusammenfassung der Metabolitenunterschiede in den Geweben der PPAR-α-Null-Maus. Rot – erhöht im Vergleich zur Kontrolle, Blau – verringert im Vergleich zur Kontrolle. Die vergrößerte/verringerte Breite bestimmter Pfeile spiegelt jeweils die relativen erhöhten/erniedrigten Konzentrationen über diese Pfade wider.

Umweltwissenschaft

Metabolomics hat bemerkenswerte Fortschritte in der Umweltforschungsgemeinschaft gemacht. Hier liegt ein Hauptaugenmerk darauf, die Auswirkungen von Umweltstress wie Umweltverschmutzung und Klimawandel auf die Tierwelt zu verstehen. Tatsächlich überwachen viele Regierungsorganisationen die Prävalenz von Schadstoffen in bestimmten Wildtierarten als Indikatoren für das Expositionsrisiko in der Umwelt. Es wurden Studien mit japanischem Medaka durchgeführt, um die Auswirkungen von Trichlorethylen, einem verbreiteten Umweltschadstoff, und dem Pestizid Dinoseb auf die Entwicklung von Fischembryonen zu untersuchen (44, 45). In ähnlicher Weise wurde die Cadmiumtoxizität bei der Uferwühlmaus und der Ratte untersucht und zeigte Veränderungen im Fettstoffwechsel, die der klassischen Nephrotoxizität vorausgingen (46, 47). Eine andere Studie untersuchte die Auswirkungen von Umweltgiften auf Regenwürmer (48). Insbesondere die Analyse von Regenwurm-Gewebeextrakten durch 1 H-NMR-Spektroskopie identifizierte Maltose als potentiellen Biomarker für Ökotoxizität innerhalb einer metallkontaminierten Stelle.

Metabolomics eignet sich gut für klinische Studien, und da effizientere und umfassendere Analysewerkzeuge zur Verfügung stehen, können aus kostspieligen klinischen Studien eine Fülle zusätzlicher Informationen gewonnen werden, ohne das Unbehagen für den Patienten zu erhöhen oder die Praktikabilität für den Arzt zu verringern. Die Tatsache, dass alle an der Metabolomik beteiligten Technologien einen relativ hohen Durchsatz aufweisen, ermöglicht die Durchführung groß angelegter klinischer Studien. Makinen und Mitarbeiter (49) untersuchten den Einsatz von 1 H-NMR-Spektroskopie von Blutserum zur Diagnose einer diabetischen Nephropathie bei 182 Patienten mit Typ-1-Diabetes. Dieser Ansatz beruhte teilweise auf der Modellierung der unterschiedlichen Verteilungen der Lipoproteinfraktionen und erzeugte einen Test, der ungefähr so ​​gut war wie der klinisch verwendete. Die Gruppe hat seitdem einen Bayes-Markov-Ketten-Monte-Carlo-Ansatz zur Modellierung der Bestandteile des gesättigten Lipidprofils im Blutserum entwickelt (50) und untersucht die Verwendung dieses Ansatzes zur Modellierung von Komplikationen im Zusammenhang mit Typ-1-Diabetes. In ähnlicher Weise beschrieben Brindle und Kollegen eine auf 1 H-NMR-Spektroskopie basierende Methode zur potentiellen Diagnose einer koronaren Herzkrankheit durch Blutserum als möglichen Ersatz für die Angiographie (51). Allerdings können Datensätze in Bezug auf die Stratifizierung einer bestimmten Population verzerrt sein, und daher sollte man selbst in relativ großen Studien die erzielten Ergebnisse mit Vorsicht betrachten. Kirschenlohr und Kollegen (52) zeigten, dass die Diagnose von CAD durch 1 H-NMR-Spektroskopie von Blutplasma durch verwandte Veränderungen in der Lipoprotein/gesättigten Lipid-Region der 1 H-NMR-Spektren im Zusammenhang mit der Geschlechts- und Statinbehandlung signifikant erschwert wurde und dass frühere Modelle eine künstlich hohe Klassifikation der Krankheitspräsenz erzeugt. Roussel und Mitarbeiter (53) zeigten in ähnlicher Weise, dass das kardiovaskuläre Risiko durch 1 H-NMR-Spektroskopie und multivariate Analyse in einer Population von Typ-2-Diabetikern schlecht vorhergesagt wurde. Daher wird es wie bei epidemiologischen Studien wichtig sein, Studien zur Entdeckung metabolomischer Biomarker beim Menschen mit weiteren Studien in anderen Populationen zu verfolgen, um potenzielle Störfaktoren zu erkennen.

Die diskutierten Studien haben sich hauptsächlich auf NMR-basierte Metabolomik konzentriert, aber viele neuere Studien haben auch Massenspektrometrie verwendet, um entweder niedrig konzentrierte Metaboliten gezielt zu quantifizieren (54) oder das Chromatogramm offen zu profilieren (55). Es würde den Rahmen dieses Artikels sprengen, sie alle im Detail zu beschreiben, aber wir verweisen den Leser auf die Übersichtsartikel am Ende dieses Artikels sowie auf einen Übersichtsartikel von German und Kollegen (56), der detailliert beschreibt, wie diese Technologien für die klinische Anwendung eingesetzt werden könnten Diagnose.

Metabolomics wird zunehmend in toxikologischen Studien in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt, insbesondere bei der Sicherheitsbewertung von Medikamentenkandidaten. Aufgrund der hohen Kosten, die mit klinischen Studien verbunden sind, ist ein wirksames frühes Screening auf Toxizität äußerst wünschenswert. Die Metabolomik zielt darauf ab, neuartige Biomarker für Toxizität zu identifizieren und Wirkmechanismen aufzuklären (5). Beispiele hierfür sind die Korrelation von erhöhten Kreatinwerten in Serum und Urin mit Hepatotoxizität und ernährungsphysiologischen Effekten (9) und die Charakterisierung der Dicarbonsäureazidurie im Urin als Folge eines gestörten Fettsäurestoffwechsels (10). Durch die Messung der metabolischen Reaktionen des gesamten Systems in Urin oder Plasma im Gegensatz zu herkömmlichen Assays, die sich auf ausgewählte Organe konzentrieren, kann ein metabolomischer Ansatz unser Verständnis systemischer toxischer Wirkungen verbessern (5). Darüber hinaus lässt sich die Technik problemlos in bestehende toxikologische Studien integrieren und die Ergebnisse mit routinemäßig gemessenen Endpunkten aus der klinischen Chemie und Histopathologie korrelieren.

Untersuchung von Tiermodellen der Krankheit und Unterscheidung von Genotypen von Organismen

Metabolomics ist ideal als Phänotypisierungswerkzeug bei der Erforschung natürlich vorkommender und transgener Krankheitsmodelle platziert. Die Verfeinerung von Knockout- und Knockin-Strategien in Kombination mit der Akkumulation von Sequenzdaten hat die Generierung genauer Krankheitsmodelle beschleunigt. Darüber hinaus wurden groß angelegte Maus-Mutagenese-Programme eingerichtet, die Tausende von Mutanten hervorgebracht haben, die einer Analyse bedürfen (57). Das Screening auf angeborene Fehlbildungen und biochemische, hämatologische und immunologische Defekte ist äußerst arbeits- und zeitintensiv. Darüber hinaus exprimieren viele Modelle nicht den gleichen Phänotyp wie Menschen und weisen oft eine mildere Pathologie auf, so dass es schwierig ist, die Auswirkungen genetischer Störungen zu beurteilen. Diese Situation spiegelt zum Teil die kürzere Lebensdauer von Modellorganismen wie Mäusen im Vergleich zu Menschen wider.

Die Metabolomik wird zu einem wichtigen Hilfsmittel bei der Phänotypisierung, um Gewebe und Organismen schnell in einem biologischen Kontext zu charakterisieren. Unter Verwendung eines metabolomics-gesteuerten Screens von mutierten Mäusen wurde beispielsweise ein Mausmodell mit einem neuartigen Enzymmangel isoliert, der der menschlichen Ahornsirup-Urinkrankheit ähnelt (58). Bei Mäusen wurden erhöhte Spiegel von verzweigtkettigen Aminosäuren im Blut und erhöhte Konzentrationen von verzweigtkettigen &agr;-Ketosäuren im Urin identifiziert. Weitere Untersuchungen korrelierten diese Ergebnisse mit einem Mangel an verzweigtkettiger Aminotransferase. Andere Forscher haben Metabolomics verwendet, um die Stoffwechseldefizite zu charakterisieren, die mit einem bestimmten Krankheitsprozess verbunden sind, zum Beispiel dem menschlichen metabolischen Syndrom. Zum Beispiel wurden die systemischen Wirkungen der PPARα-Mutation, einem Gen, das für die Regulierung der Nahrungsaufnahme/Nüchtern-Reaktion wichtig ist, kürzlich mit einer Kombination von 1 H-NMR und GC-MS definiert, metabolische Veränderungen wurden in Herz, Leber, Skelett beobachtet Muskel und Fettgewebe der PPARα-Null-Maus (31). Ähnliche metabolische Profiling-Ansätze wurden auch durchgeführt, um Herzerkrankungen bei der mdx-Maus (10) und Atherosklerose bei der ApoE3-Leiden-Maus (59) zu untersuchen.

Metabolomische Techniken wurden auch in großem Umfang zur phänotypischen neurologischen Störungen verwendet, mit einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Charakterisierung von regionalen Variationen, Hirntumoren und neurologischen Störungen (60-64) (Abb. 4). Da das Gehirn stark in Kompartimente unterteilt ist, wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie metabolisches Profiling verwendet, um verschiedene neuroanatomische Regionen bei Ratten ex vivo durch hochauflösendes 1 H-NMR mit magischem Winkel zu charakterisieren (62). Deutliche biochemische Unterschiede wurden zwischen Hirnstamm, frontalem Kortex, Kleinhirn und Hippocampus definiert. Diese Studie bietet eine unschätzbare Basisreferenz für weitere HRMAS 1 H-NMR-spektroskopische Studien zur Überwachung von Krankheiten und spezifischen pharmakologischen Störungen im Gehirn. Weiterhin konnte mittels HRMAS 1 H-NMR-Spektroskopie eine Akkumulation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in BT4C-Gliomen der Ratte während der gentherapieinduzierten Apoptose charakterisiert werden (61). Solche Lipide sind in vivo durch Magnetresonanzspektroskopie leicht nachweisbar und könnten verwendet werden, um die Wirksamkeit der Gentherapie bei Patienten mit Gliom zu überwachen. Als Ergänzung zu dieser Studie (65) wurde anschließend die niedermolekulare intermediäre Zusammensetzung der gleichen Rattengliome quantifiziert, und es wurde gezeigt, dass die Konzentrationen von Myo-Inositol, Glycin und Taurin mit der Tumorzelldichte korrelierten, während die Gesamtkonzentration von cholinhaltige Verbindungen wurden durch Zellverlust nicht beeinflusst (66). Eine andere Studie hat MRS mit automatisierten Mustererkennungstechniken kombiniert, um Radiologen zu helfen, Hirntumore nach histologischem Typ und Grad zu kategorisieren (66). Mittels Metabolic Profiling konnte zwischen Meningeomen, niedriggradigen Astrozytomen und aggressiven Tumoren wie Glioblastomen und Metastasen unterschieden werden. Spektralprofile, die aus intaktem Gewebe, Gewebeextrakten und Bioflüssigkeiten erstellt wurden, haben sich auch bei mehreren neurologischen Erkrankungen, einschließlich spinozerebellärer Ataxien und der Huntington-Krankheit, als sehr diskriminierend erwiesen (58, 67).

Abbildung 4. Hochauflösende 1 H-NMR-Spektroskopie wurde verwendet, um metabolische Störungen in einem Mausmodell der Batten-Krankheit namens CLN3 54 zu überwachen. Links: Hochauflösende 1 H-NMR-Spektren von Kortexgewebe, aufgenommen bei 700 MHz. Gezeigt werden typische Spektren von cln3 (rot) und Kontrollgewebe (blau) zusammen mit den zugeordneten Metaboliten. Rechts: Score-Plot eines PLS-DA-Modells, das Gewebe von cln3-Mäusen mit Kontrollmäusen vergleicht. Das Modell wurde durch Untersuchung von Spektren von wässrigen Extrakten von Kortexgewebe gebildet. Pareto-Skalierung wurde verwendet, um die Daten zu skalieren. Die wichtigsten Metaboliten, die für die Trennung verantwortlich sind, die aus der Untersuchung des entsprechenden Belastungsdiagramms bis zum angezeigten Score-Diagramm identifiziert wurden, sind unterhalb des Diagramms aufgeführt.

Obwohl die Prägung des Begriffs Metabolomik relativ neu war, hat es eine Explosion von Veröffentlichungen auf diesem Gebiet gegeben und die Erkenntnis, dass viele Forscher bereits ähnliche Studien durchgeführt haben, wenn auch ohne ein „-omic“-Tag vor dem Wort. Es war nicht möglich, alle Anwendungen der Metabolomik vollständig zu überprüfen, und die Anwendungen werden zunehmen. Neben der Entwicklung neuer Anwendungen wird auch die Entwicklung der analytischen Ansätze im Mittelpunkt stehen, da die Forscher die Nachweisgrenzen der NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und anderer analytischer Ansätze verschieben. Neben diesen Wet-Lab-Entwicklungen müssen sowohl die Mustererkennungsansätze zur Verarbeitung von Metabolomics als auch die Metabolomic-Datenbanken zur Identifizierung von Metaboliten weiterentwickelt bzw. erweitert werden. In dieser Hinsicht sind die aktuellen Metabolom-Datenbanken im Internet, die Standardspektren frei verfügbar machen, ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für den mühsamen Weg zur Entdeckung von Biomarkern durch Metabolomik (68-70).

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Einführung

Die spät einsetzende Alzheimer-Krankheit (LOAD) ist eine komplexe Erkrankung mit einer ungefähr 20-jährigen Prodromalperiode 1,2,3 . Die prodromale/präklinische Phase der AD ist mit einem Glukosehypometabolismus im Gehirn verbunden, der in Risikogruppen vor der Diagnose der Krankheit nachgewiesen werden kann und das Fortschreiten der Krankheit vorhersagt 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13 .

Glukosehypometabolismus im Gehirn, mitochondriale Dysfunktion und reduzierter Sauerstofffluss im Gehirn gelten als primäre Risikofaktoren für LOAD 14,15,16,17,18 . Auf zellulärer Ebene ist das Altern mit einer reduzierten Glucosetransporter-Expression, einer beeinträchtigten Hexokinase-Aktivität, phosphorylierter (inaktivierter) PDH und veränderten Spiegeln und Aktivitäten von Schlüsselenzymen verbunden, die an der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind 19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 . Auf molekularer Ebene ist das Altern mit einer signifikanten Herunterregulierung der im Kern kodierten OXPHOS-Gene 19,37 und einem gestörten Gleichgewicht des NAD/NADH-, AMP/ATP-, Purin- und Pyrimidin-Pools 38,39 verbunden.

In der Lebensmitte erfahren Frauen sowohl chronologisches als auch endokrinologisches Altern. Der Übergang von der Perimenopause zur Menopause ist einzigartig bei Frauen und ist mit Defiziten im Glukosestoffwechsel im Gehirn und mitochondrialer Dysfunktion verbunden 3,19,40 , was zu dem zweifach höheren Lebenszeitrisiko von AD bei Frauen beitragen könnte 41,42,43 .

Unter normalen Bedingungen verwendet das Gehirn Glukose als primäre Energiequelle. Unter Stressbedingungen kann sich das Gehirn anpassen, um als Reaktion auf eine Energiekrise zusätzliche Energiequellen zu nutzen. Unter Bedingungen eingeschränkten Nährstoffzugangs werden Hilfsenergiesubstrate wie Lactat und Ketonkörper verwendet, um ATP zu erzeugen 44,45,46,47 . Unsere früheren Forschungen haben gezeigt, dass Ketonkörper, die aus Hirnlipiden und weißer Substanz gewonnen werden, im alternden weiblichen Gehirn als Reaktion auf Defizite im Glukosestoffwechsel als Hilfskraftstoff verwendet werden 22,33 .

Hier beschreiben wir das dynamische Stoffwechselprofil in jedem Stadium des chronologischen und endokrinologischen Alterns (Menopause) im weiblichen Gehirn in jeder Phase des chronologischen und endokrinologischen Alterns. Angesichts der zentralen Rolle der Mitochondrien und der Elektronentransportkette (ETC) in der Bioenergetik des Gehirns untersuchten wir das Transkriptom sowohl mitochondrialer als auch nukleär kodierter OXPHOS-Gene, gefolgt von der Expression wichtiger metabolischer Upstream-Regulatoren. Anschließend haben wir das dynamische Stoffwechselprofil im weiblichen Gehirn in jedem Alterungsstadium detailliert beschrieben, wobei wir globale Metabolomik- und Lipidomanalysen verwendet haben, und diese Ergebnisse durch transkriptomische Analysen unterstützt. Darüber hinaus haben wir die Beziehung zwischen Gehirn und peripheren Stoffwechsel- und Lipidprofilen charakterisiert.


9E: Stoffwechselkontrollanalyse und Systembiologie - Biologie

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(Im) Perfekte Robustheit und Anpassung von metabolischen Netzwerken unter metabolischer und Genexpressionsregulation: die Verbindung von Control Engineering mit Metabolic Control Analysis

Hintergrund: Metabolische Kontrollanalyse (MCA) und Angebots-Nachfrage-Theorie haben zu einem bemerkenswerten Verständnis der Systemeigenschaften von metabolischen Netzwerken geführt, die ausschließlich der metabolischen Regulation unterliegen. Die Angebots-Nachfrage-Theorie hat die Genexpressionsregulation noch nicht explizit berücksichtigt, während eine Variante der MCA, d. h. die Hierarchical Control Analysis (HCA), dies getan hat. Bestehende Analysen, die auf regelungstechnischen Ansätzen basieren, haben nicht sehr deutlich gemacht, ob eine metabolische oder eine Genexpressionsregulation involviert ist, aber sie haben unterschiedliche Wege entworfen, wie die Regulation organisiert werden könnte, mit dem Potenzial, eine perfekte Anpassung zu bewirken.

Ergebnisse:Diese Studie integriert Regelungstechnik und klassische MCA, ergänzt um Angebots-Nachfrage-Theorie und HCA. Da die Genexpressionsregulation eine zeitliche Integration beinhaltet, wird sie als eine natürliche Instanzierung des

„integrale Regelung“ (oder nahezu integrale Regelung) in der Regelungstechnik bekannt. Diese Studie konzentriert sich dann auf die Robustheit gegenüber und die Anpassung an Störungen von Prozessaktivitäten im Netzwerk, die aus Umweltstörungen, Mutationen oder langsamem Rauschen resultieren könnten. Es zeigt sich jedoch, dass diese Art der „integralen Kontrolle“ selten zu einer „perfekten Anpassung“ führen sollte: Die Regulation der Genexpression erhöht zwar die Robustheit wichtiger Metabolitenkonzentrationen, macht sie jedoch selten unendlich robust. Damit eine perfekte Anpassung stattfindet, sollten die Proteinabbaureaktionen in der Konzentration des Proteins nullter Ordnung sein, was bei stetig wachsenden Zellen biologisch selten sein kann.

Schlussfolgerungen:Ein vorgeschlagener neuer Rahmen, der die Methoden der Kontrolltechnik und der metabolischen und hierarchischen Kontrollanalyse integriert, verbessert das Verständnis biologischer Systeme, die sowohl metabolisch als auch durch Genexpression reguliert werden. Insbesondere ermöglicht der neue Ansatz, der Frage nachzugehen, ob die intrazellulären biochemischen Netzwerke, die von Genomik und Systembiologie identifiziert wurden und werden, den

„perfekte“ Regelstrukturen aus der Steuerungstechnik im Vergleich zu optimalen Funktionen wie Robustheit. Soweit dies nicht der Fall ist, legen die Analysen nahe, wie sie dazu werden könnten, was wiederum die synthetische Biologie und das Metabolic Engineering erleichtern sollte.

Schlüsselwörter:Stoffwechselkontrollanalyse, Regelungstechnik, Transkriptionsregulation, Synthetische Biologie, Robustheit

1Das Manchester Centre for Integrative Systems Biology, Manchester

Interdisziplinäres Biozentrum, University of Manchester, Manchester M1 7DN, UK

4Institut für Synthetische Systembiologie und Nukleare Organisation,

Swammerdam Institute for Life Sciences, Universität Amsterdam, Science Park 904, NL-1098 XH Amsterdam, Niederlande

Eine vollständige Liste der Autoreninformationen finden Sie am Ende des Artikels

Mit der Entwicklung quantitativer funktioneller Genomik-Ansätze ist es möglich geworden, die zelluläre Anpassung der Zellphysiologie an veränderte Umweltbedingungen experimentell zu analysieren, indem Veränderungen in Flüssen, Metaboliten, Proteinen oder mRNAs beobachtet werden. Solche Anpassungen treten tendenziell auf mehreren Regulierungsebenen auf, wenn nicht gleichzeitig, dann aber nacheinander, abhängig von den Beobachtungszeiträumen [1-3]. Grundsätzlich kann eine adaptive Änderung der Geschwindigkeit eines Enzyms (oder Flusses) durch Änderungen (i) der Konzentration von Metaboliten (z. B. Substrate, Produkte und Effektoren) mit direkten, kooperativen und allosterischen Effekten auf die Aktivität von das Enzym [4], (ii) Konzentrationsänderungen des Enzyms durch Veränderungen der Genexpression und (iii) kovalente Modifikation durch Signaltransduktion. Die erste wird als metabolische (oder enzymatische) Regulation bezeichnet. Die zweite ist als (vermittelte) Regulation der Genexpression und die dritte als (vermittelte) Regulierung der Signaltransduktion bekannt. Aufgrund ähnlicher Eigenschaften wurden die beiden letztgenannten Regulierungsarten zusammen unter dem Begriff „hierarchische Regulierung“ betrachtet[2,5,6]. Obwohl in diesem Beitrag nur die beiden erstgenannten Arten von adaptiven Veränderungen explizit diskutiert werden, wird aufgrund der oben erwähnten Ähnlichkeiten die dritte Art implizit angesprochen. Bis jetzt wurden bedeutende Fortschritte bei der Modellierung von Stoffwechselnetzwerken auf Genomskala in Mikroorganismen erzielt, die Stoffwechsel- und Genexpressionsregulation integrieren [7,8]. Die Steady-State-Eigenschaften einer Reihe repräsentativer metabolischer Regulationsmechanismen, wie der Endprodukthemmung, wurden sowohl im Hinblick auf die metabolische Kontrollanalyse (MCA) [9,10] als auch durch die vertretene Angebots-Nachfrage-Theorie eingehend untersucht von Hofmeyr und Cornish-Bowden [11-13]. Um der Regulation der Genexpression Rechnung zu tragen, wurde die hierarchische Kontrollanalyse (HCA) [14,15] als Erweiterung der MCA entwickelt, jedoch noch nicht mit der Angebots-Nachfrage-Theorie verknüpft. Die Entwicklung eines solchen Zusammenhangs erscheint sinnvoll, da sich in quantitativen experimentellen Studien die Genexpressionsregulation als ebenso wichtig herausstellte wie die metabolische Regulation [1,2,5,16].

Die adaptiven Veränderungen der Reaktionsgeschwindigkeiten durch metabolische und genetische Regulation sind in der Regel auf Feedback- und/oder Feed-Forward-Mechanismen zurückzuführen. In der Biologie besteht die Auffassung, dass evolutionäre Optimierung diese Mechanismen perfektioniert hat. Wenn dem so wäre, würde dies nahelegen, dass solche Mechanismen mit „perfekten“ Regulierungsmechanismen identisch sein könnten, die von der Steuerungstechnik entworfen wurden [17]. Tatsächlich haben Csete und Doyle [18] vorgeschlagen, dass eine solche konvergente Entwicklung von Technik und Biologie stattgefunden haben könnte. Insbesondere verfügten sie über eine integrierte Regelstruktur, die sowohl eine Aktoreinheit (entspricht einem Integrator) als auch eine Regler-/Sensoreinheit enthält. Sie zeigten, dass diese regulatorische Struktur zu einem Phänomen führen würde, das als perfekte Anpassung bezeichnet wird

und schlug dann vor, dass solche Strukturen in der Biologie üblich sein sollten. Im Kontext der Systembiologie wurden verschiedene biochemische Prozesse im Hinblick auf ihre Kontrollsystemstrukturen diskutiert. So wurden beispielsweise robuste perfekte Anpassungen im bakteriellen Chemotaxis-Signalsystem, in der Eisen- und Kalziumhomöostase von Säugetieren und in der Hefe-Osmoregulation als integrale Feedback-Kontrollsysteme interpretiert [19-22], ohne jedoch zu beweisen, dass sie genau den gleiche regulatorische Topologie oder sogar Performance. Eine aktuelle Studie identifizierte die drei verschiedenen Arten von Regelstrukturen, die in der Regelungstechnik verwendet werden, d. h. Proportional-, Integral- und Ableitungsregelung zur Regulierung des Energiestoffwechsels [23]. Mit Ausnahme von [22] konzentrierten sich die obigen Arbeiten nur auf die Stoffwechselregulation, während [22] die Stoffwechselregulation nicht mit der Genexpressionsregulation verglich. In dieser Studie wird die Integration von Stoffwechsel- und Genexpressionsregulation sowie die Integration zwischen Metabolic Control Analysis und Control Engineering untersucht.

Die Regelungstechnik hat untersucht, welche Netzstrukturen die Anpassung eines Netzes bei anhaltender Störung einer Netzkomponente „perfekt“ machen können. Perfektion wurde als das Phänomen definiert, dass einige wichtige Systemvariablen (bekannt als „kontrollierte Variablen“) vollständig robust gegenüber den Störungen sein sollten, d. h. mit stationären Zustandswerten, die von den Störungen nicht beeinflusst werden. Eine solche perfekte Robustheit kann erreicht werden, wenn ein Zeitintegrator auf jede Variation der Regelgröße (oder Systemfehler) angewendet wird. Diese Steuerungsfunktion wird als „Integralsteuerung“ bezeichnet. Durch dieses Zeitintegral würde sich das Netzwerk weiter verändern, bis die Regelgröße wieder vollständig auf ihren Anfangswert zurückgeführt ist. Da die Störung kompensiert werden muss, muss sich dann eine andere Systemvariable von ihrem Anfangszustand entfernen. Diese sogenannte „manipulierte Variable“ ist nicht robust (fragil) gegenüber der Störung, ermöglicht aber, dass die Regelgröße robust ist.

Wenn die Regelaktion proportional zur Variation der gestörten Variablen selbst oder einer Funktion davon ist, die null ist, wenn diese Variation gleich null ist, wird die endgültige Abweichung der gesteuerten Variablen von ihrem Wert vor der Störung nicht null sein. Dies ist die sogenannte „proportionale Steuerung“ der Regelungstechnik. Auch Störungen können zu einem anhaltenden Schwingen der Regelgröße führen und um dies zu verhindern, kann die dritte regelungstechnisch fokussierte Regelungsart sinnvoll sein, die sogenannte 'Ableitungsregelung', auf die hier nicht eingegangen wird dieses Papier, wurde aber in Referenz [23] veranschaulicht.

der gleiche Satz von perfekter Anpassung. Ein solcher Fall ist, dass alle Schritte eines Stoffwechselwegs gleich reguliert werden, d. h. ihre Aktivitäten durch denselben Faktor moduliert werden. Tysonet al. [24] bezeichnet dies als perfekte Anpassung, aber der Mechanismus hängt von der präzisen Regulierung verschiedener Schritte ab, wir würden vorschlagen, dies als . zu bezeichnen

„perfekte Regulierung“, da der Anpassungsteil nicht entscheidend ist. Kacser und Acerenza [25] nannten dies die universelle Methode des Metabolic Engineering. Fell und Thomas [26] schlugen vor, dass dies ein häufiges Motiv in der biologischen Regulation sein könnte, und Adamczyk et al. [27] entwickelte es in das Stealthy-Engineering-Prinzip aus. Dieses Papier wird diesen perfekten Regelmechanismus nicht diskutieren, sondern sich auf den robusten perfekten Anpassungsmechanismus konzentrieren, der durch integrierte Regelkreise funktioniert.

In dieser Arbeit werden wir versuchen, zwei eher unzusammenhängende Ansätze bei der Analyse der Regulierung von Netzwerkeigenschaften zu überbrücken. Die eine ist die der Regelungstechnik, die Netzstrukturen entwickelt hat, die zu perfekter oder unvollkommener Anpassung führen. Die andere ist die der Biochemie mit MCA und der Angebots-Nachfrage-Theorie sowie lebensnahen Beispielen intrazellulärer biochemischer Netzwerke, die sowohl Metabolismus als auch Genexpression umfassen. Wir werden uns auf Wege konzentrieren, die Vorläufer für die Makromolekülsynthese (Proteine, Nukleinsäuren) synthetisieren, bei denen dieser Vorläufer oft ein Enzym früh im Weg sowohl direkt als auch durch Genexpression hemmt. Solche regulatorischen Strukturen für Endprodukte ermöglichen einige Vereinfachungen [28]. Damit eignen sie sich zur Veranschaulichung unserer relativ einfachen Schlussfolgerungen, die jedoch allgemeingültiger sind. Wir stellen die Hypothese auf, dass die Genexpressionsregulation aufgrund der zeitlichen Integration der Proteinsynthese ein Paradebeispiel für integrale Kontrolle sein sollte, während die metabolische Regulierung unser Kandidat für die Rolle der proportionalen Kontrolle ist. Wir werden dann sowohl diese stabilen Robustheitseigenschaften als auch die Kontrolleigenschaften im Sinne eines neuen hierarchischen Angebots-Nachfrage-Rahmens interpretieren.

Kinetische Beschreibung und klassische Kontrollanalyse

In diesem Abschnitt zeigen wir, dass der einzigartige stationäre Zustand eines metabolischen Netzwerks unter Regulierung sowohl durch die kinetikbasierte Analyse als auch durch die metabolische (oder hierarchische) Kontrollanalyse analysiert werden kann. Eine hierarchische Angebots-Nachfrage-Theorie, die die hierarchische Kontrollanalyse mit der klassischen Angebots-Nachfrage-Analyse verbindet, wird für den Fall entwickelt, dass die Genexpressionsregulation aktiv ist. Dadurch können die Steady-State-Eigenschaften eines metabolischen Netzwerks, das verschiedenen Regulationsmechanismen unterliegt, innerhalb eines einheitlichen theoretischen Rahmens analysiert werden.

Grundlegende regulatorische Architektur und kinetische Analyse

Das gesamte regulatorische Verhalten eines Signalwegs kann in eine Reihe von elementaren Strukturen zerlegt werden.

Eine Rückkopplungshemmung durch Endprodukte wurde für einige Stoffwechselwege, insbesondere im Anabolismus, berichtet [29]. Ein weiteres regulatorisches Motiv ist die Feed-Forward-Aktivierung nachgeschalteter Enzyme (siehe Anhang A und [30]). Darüber hinaus sind bei vielen Stoffwechselwegen eine oder wenige Reaktionen produktunempfindlich. Beispiele hierfür sind die durch Hexokinase, Phosphofructokinase und Pyruvatkinase katalysierten Reaktionen in der Glykolyse von Säugetieren [31] und mehrere Schritte des zentralen Kohlenstoffmetabolismus in B. subtilis[28]. Die Aktivitäten und Konzentrationen einiger dieser Enzyme werden durch allosterische Effektoren, kovalente Modifikation oder Transkription reguliert. In dieser Studie nehmen wir einen linearen Weg mit metabolischer und Genexpressionsregulation der ersten Reaktion über den Endmetaboliten als Beispiel der Wahl [28] (Abbildung 1). Die erste Reaktion (katalysiert durch das Enzym E1) gilt als unempfindlich gegen

sein unmittelbares Produkt. Mit diesem Beispiel werden wir in der Lage sein, die Essenz der Prinzipien zu veranschaulichen, die wir verfolgen.

Die folgenden Differentialgleichungen beschreiben diesen Endprodukt-Regulationspfad:

x2ð Þ ¼t E1ð Þt ⋅f1ðx1ð t xnð Þt p tð ÞÞ−E2ð Þt ⋅f2ðx2ð Þt x3ð Þt Þ

x3ð Þ ¼t E2ð Þt ⋅f2ðx2ð t x3ð Þt Þ−E3ð Þt ⋅f3ðx3ð Þt x4ð Þt Þ

xnð Þ ¼t En−1ð Þt ⋅fn−1ðxn−1ð Þt xnð Þt Þ−Enð Þt ⋅fnðxnð Þt Þ

E1ð Þ ¼t g xnð ð Þt Þ−kED⋅E1ð Þt

Hier nehmen wir an, dass die Konzentration des Substrats x1 nicht durch den Pfad beeinflusst wird und dass nur

E1 wird durch Genexpression reguliert. xi ist der

Konzentration von thmetabolit und beschreibt die Kinetik

der Reaktion. Parameterpentspricht anderen Faktoren, die die Aktivität des ersten Enzyms beeinflussen könnten, z.B. Cofaktoren oder externe Stoffwechselmodulatoren. Solche Effekte auf andere Enzyme werden hier nicht angesprochen. Es wird hier angenommen, dass die Genexpressionsfunktion nur vom letzten Metaboliten abhängt, wobei letzterer auf die Synthese des ersten Enzyms einwirkt. Realistischere Situationen, die die Dynamik von mRNA betreffen, werden in späteren Abschnitten diskutiert. Dieses Papier ist für die Genexpressionsregulation im Allgemeinen relevant, dh umfasst die Regularregulation auf der Ebene der Transkription, Translation und posttranslationalen Modifikation, aber unsere Beispiele behandeln meist nur einen Typ davon und betrachten hauptsächlich die Transkriptionsregulation. kED ist die Abbaugeschwindigkeitskonstante des

erstes Enzym. In schnell wachsenden Organismen und bei stabilen Proteinen kann kED lediglich den Verdünnungseffekt darstellen

aufgrund von Zellwachstum und -teilung (d. h. kED=μ, μ bedeutet

die spezifische Wachstumsrate) [5,28], aber in anderen Fällen hängt sie von der Proteolyse ab, die später diskutiert wird.

Nach Definition des Steady-State in lebenden Zellen [32],x1(t)

Konstanten und gleich E2…entsprechend. Wenn also ein solches konstantes stationäres Regime existiert, und es ist die eindeutige Lösung der folgenden Gleichung:

die nur von den ersten und den Endenzymmerkmalen abhängt und nur eine Funktion der Endproduktkonzentration xn ist. Normalerweise sind sowohl f1ðx1xnpÞ als auch g(xn)

monoton fallende Funktionen von xn, die

Beschreiben Sie die negative, metabolische bzw. Genexpressionsregulation. Ebenso ist fn(xn) normalerweise a

monoton steigende Funktion von xn. Wie gezeigt von

Gleichung (2), das stationäre Regime entspricht dem Schnittpunkt der beiden Funktionen und ist aufgrund der monotonen Eigenschaften off1,fnandg, as . einzigartig

Wenn alternativ die it-Reaktion (i> 1) produktunempfindlich ist, die erste Reaktion jedoch nicht, dann wird f1 neu definiert und es

wird ebenfalls eine Funktion von x2, während die kinetische Funktion

von theithstep hängt nur vonxi ab. Es kann nachgewiesen werden, dass bei

stationärer Zustand, x2 hängt dann nur noch von Funktionen f2,…,fi ab

und ist unabhängig von fi+1,…,fn−1. Diese Schlussfolgerung ist

sowohl theoretisch attraktiv als auch praktisch nützlich, da die Steady-State-Eigenschaften eines ansonsten komplexen Stoffwechselweges möglicherweise nur von einer begrenzten Anzahl von Enzymmerkmalen abhängen [33]. Dies ist ein Fall, bei dem die Komplexität eines Stoffwechselwegs in seinem Fluss begrenzt ist und die Konzentrationen der stromaufwärts gelegenen Metaboliten nur durch die Eigenschaften der stromaufwärts gelegenen Enzyme und der entsprechenden Gene kontrolliert werden.

Wir werden nun untersuchen, wie die metabolische Kontrollanalyse und die Angebots-Nachfrage-Theorie mit diesen Arten von metabolischen Kontrollstrukturen umgehen.

Metabolische Regulation: MCA und die Angebots-Nachfrage-Theorie Die Metabolic Control Analysis (MCA) hat sich hauptsächlich mit den Steady-State-Eigenschaften des metabolischen Teils von Abbildung 1Das Endproduktmodul mit Genexpression und Stoffwechselregulation befasst.x1,x2,…,xnrepresent die Konzentrationen von Metaboliten im Weg E1,E2,… sind die Konzentrationen von Enzymen, die jede Reaktion katalysieren. Zur Veranschaulichung ist nur das Enzym der ersten Reaktion (E1)

als negativ reguliert sowohl über metabolische (allosterische) Wirkung als auch über die Genexpressionsregulierung durch das Endproduktxn.

Schemata wie die im vorherigen Unterabschnitt erwähnten. Modulare MCA [34] hat metabolische Netzwerke dieser Art in Module mit relativ autonomen Aktivitäten unterteilt, die durch gut identifizierte Metaboliten verbunden sind. In der Angebots-Nachfrage-Theorie haben Hofmeyr und Kollegen [12,13] eine ähnliche Vereinfachung verwendet, um viel von der Essenz der Regulierung der Zellfunktion zu demonstrieren. Demnach kann der metabolische Teil des Endproduktwegs in Abbildung 1 in einen zweistufigen linearen Weg mit Angebots- und Nachfrageblocks aufgeteilt werden, wie in Abbildung 3 gezeigt.

Die Konzentrations- und Flusskontrollkoeffizienten der metabolischen Kontrollanalyse messen die Steady-State-Änderung der Konzentration eines Metaboliten X bzw. des Flusses J als Reaktion auf eine Änderung der Aktivität eines Prozesses i. Diese Aktivitätsänderung kann durch Änderung eines Parameters pi (z. B. Konzentration von an

inhibi-tor), der für stepi spezifisch ist:

vi ist eher eine Aktivität als die Reaktionsgeschwindigkeit i

im stationären Zustand. Wenn der Parameter pi geändert wird, ist vi

nicht gleich der resultierenden Änderung der stationären Reaktionsgeschwindigkeit i es ist die Änderung dieser Geschwindigkeit nur dann, wenn alle anderen Variablen, die diese Geschwindigkeit beeinflussen, konstant gehalten werden. Die Konzentrationssteuerungskoeffizienten des oben genannten Angebots-Nachfrage-Systems können dann als Cxn

s ¼∂lnð Þxn =∂lnvVersorgung und CDxn¼∂lnð Þxn =∂lnvBedarf,

und die Flusssteuerkoeffizienten, CJS und CJD ähnlich. Diese Kontrollkoeffizienten beschreiben die Kontrolle, die eine bestimmte Reaktion oder ein bestimmtes Enzym auf die Gesamtsystemvariablen oder -flüsse ausübt, während die ‚lokalen‘ Regulationseigenschaften einzelner Enzyme durch die Elastizitätskoeffizienten quantifiziert werden, wie z

xn misst, wie die Reaktionsgeschwindigkeiten der Angebots- und Nachfrageblöcke durch die Endproduktkonzentration xn beeinflusst werden.Weil die Preise eher die von Blöcken sind

als bei einzelnen Enzymen werden diese Elastizitäten als „Gesamtelastizitäten“ bezeichnet [32]. Sie können weiter in weitere, wenn auch nicht ganz elementare Elastizitätskoeffizienten ausgedrückt werden:

xn bezeichnet die Gesamtelastizität der ersten Reaktion gegenüber xn durch die Stoffwechselregulation. Die

kleingeschriebene Flusssteuerungskoeffizientenscnow beziehen sich nur auf die lokale Steuerung innerhalb des Versorgungsmoduls (wenn sie isoliert mit xnfixed betrachtet wird). Sie können der Summation entnommen werden

und Konnektivitätstheoreme als Kontrollkoeffizienten des Moduls (siehe Anhang B). Unter der Annahme, dass die erste Reaktion produktunempfindlich ist, kann die Versorgungsmodulelastizität in (5) weiter vereinfacht werden als

In einem solchen Fall hat das erste Enzym die volle Kontrolle über den Fluss (d. h. den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt) innerhalb des Versorgungsmoduls, so dass cJ1

Unter Verwendung der Summations- und Konnektivitätstheoreme in MCA können alle vier Konzentrations- und Flusssteuerungsfaktoren in Form von Elastizitätskoeffizienten ausgedrückt werden (siehe Anhang B). Für die Konzentrationsregelung der Angebotsstufe und die Flussregelung der Nachfragestufe ergibt sich daraus mit (5) und (7):

ð8Þ Diese Gleichungen zeigen, dass, wenn die erste Reaktion eine vollständige Flusskontrolle innerhalb des Versorgungsmoduls hat, die Kontrolle der stationären Endproduktkonzentration und des Flusses nur von zwei Elastizitätskoeffizienten abhängig ist, d.h. denjenigen, die der ersten und der letzten Reaktion entsprechen. Wenn das Feedback sehr stark ist, d. h. εv1

xn , die Steuerung des Nachfrageflusses CJD ist nahe 1. Die in diesem Abschnitt diskutierte MCA und deren Angebot-Nachfrage-Vereinfachung erklären teilweise die zustandsstabilen Eigenschaften des oben genannten vollständigen Regulationssystems, jedoch nur für den Fall der metabolischen Regulation. Unter Einbeziehung der Genexpressionsregulation kann eine vollständigere Interpretation erreicht werden, indem die hierarchische Kontrollanalyse und eine neue „hierarchische Angebots-Nachfrage“-Theorie verwendet werden, wie im nächsten Unterabschnitt untersucht.

Genexpression und Stoffwechselregulation: hierarchische Angebots-Nachfrage-Theorie

Westerhoff und Mitarbeiter haben die hierarchische Kontrollanalyse (HCA) entwickelt, eine Erweiterung der MCA, die die Regulation der Genexpression und die Signaltransduktion berücksichtigen kann [14,26]. Wir werden dies hier umsetzen, indem wir die Mean-Erweiterung der Elastizitätskoeffizienten im vorherigen Unterabschnitt um die Regulation durch Genexpressionen erweitern.

Betrachtet man allein den metabolischen Teil des Netzwerks, d.h. wenn die Genexpression immer gleich wäre, folgt die Kontrolle der Konzentration von IntermediateX in einem Angebots-Nachfrage-System (8). Betrachtet man die Rollen der Synthese und des Abbaus von Stoffwechselenzymen explizit, wie in Abbildung 4 dargestellt, muss HCA eingeführt werden und der entsprechende hierarchische Kontrollkoeffizient wird zu:

Capital His wird hier für die hierarchischen Kontrollkoeffizienten verwendet, wie in Tabelle 1 definiert. εs

X ist ein „Gesamt“-Elastizitätskoeffizient, einschließlich einer klassischen „direkten Elastizität“, die sich nur auf Stoffwechselreaktionen bezieht (d. h. εs

xn definiert in der MCA in (8)) und eine „indirekte Elastizität“ aufgrund der Genexpressionsregulation:

Die Kleinbuchstaben cis werden für „metabolische Kontrollkoeffizienten“ verwendet, d. h. Kontrollkoeffizienten, die nur das lokale Netzwerk (metabolische oder Genexpression, aber nicht deren Kombination) berücksichtigen. s

Es ist oft gleich 1, d. h. wenn die Geschwindigkeit der isolierten Reaktion proportional zur Konzentration des Enzyms ist, das sie katalysiert.

Unter Verwendung der metabolischen Kontrollanalyse für den Genexpressionsteil des Netzwerks beträgt der Kontrollkoeffizient der Proteinsynthesereaktion in Bezug auf die Konzentration des synthetisierten Proteins:

Kombiniert man die obigen Ausdrücke, kann man den hierarchischen Koeffizienten ausdrücken, der die vom Versorgungsenzym ausgeübte Kontrolle der Konzentration des metabolischen Zwischenprodukts X in Bezug auf alle Elastizitätskoeffizienten im Netzwerk quantifiziert:

ð12Þ Die Terme in Klammern sind normalerweise positiv. Die Gleichung zeigt, dass die Kontrolle durch das Angebot (i) mit den absoluten Größen der Elastizitäten bezüglich des Angebots, der Nachfrage und der Proteinsynthese abnimmt, aber (ii) mit zunehmender Elastizität des Proteins zunimmt Synthese- und Abbaureaktionen in Abhängigkeit von der Konzentration des Enzyms. Die Gleichung zeigt auch, dass für endliche Größen der Elastizitäten ungleich Null die hierarchischen Kontrollkoeffizienten für die Kontrolle durch das Angebot durch Elastizitäten im Genexpressionsnetzwerk verringert werden können, aber normalerweise nicht gebracht werden

Abbildung 4Darstellung der hierarchischen Steuerung. Der untere Teil stellt eine metabolische Versorgung darNachfragesystem, in dem das Angebot durch Enzyme (oder Enzyme, die von einem Operon stammen) katalysiert wird.

Der obere Teil beschreibt die Synthese des Enzyms Esin-Prozess a

ganz runter auf null. Das gleiche gilt für die Steuerung durch Nachfrage, die gleich minus der Steuerung durch das Angebot ist.

Erinnern wir uns nun an das Endproduktmodul mit sowohl metabolischen als auch regulatorischen Rückkopplungen der Genexpression von Abbildung 1. Da das Endprodukt (xn) die erste Reaktion reguliert

sowohl durch Stoffwechselregulation als auch durch Genexpressionsregulation kann die entsprechende „Gesamtelastizität“ (siehe Tabelle 1) der ersten Reaktion ausgedrückt werden als:

xn bezeichnet die Elastizität durch Stoffwechselregulation,cE1

vTransbezeichnet die Kontrolle der Genexpression (d.h.

Transkription und Translation) von der Konzentration des ersten Enzyms [15,35]. Durch Ersetzen der εv1

xn in (7) mit dem vollständigeren Ausdruck (13), d. h. mit εs

xn, der hierarchische Kontrollkoeffizient Hxn

s kann ähnlich wie (12) in Elastizitätskoeffizienten ausgedrückt werden. Da sowohl die metabolische als auch die Genexpressionsregulation negative Rückkopplungen darstellen,εsxn negativ ist und mit zunehmendem xn aufgrund zunehmender Produkthemmung negativer wird.

xn ist positiv und nimmt mit zunehmendem xn asymptotisch auf Null ab. Daher ist die Beziehung zwischen

die Reaktionsgeschwindigkeit und die Endproduktkonzentration können anhand der Elastizitäten beschrieben werden, wie in Abbildung 5 dargestellt. Abbildung 5 erläutert die einzigartigen stationären Ergebnisse, die aus der klassischen stationären Analyse erhalten wurden (siehe Abbildung 2).

Eine Darstellung der Angebots-Nachfrage-Beziehung ähnlich Abbildung 5 wurde in [13] präsentiert. Allerdings erweitern wir hier die Interpretation des Systems und der entsprechenden Elastizitätskoeffizienten auf den allgemeineren Fall, der die Genexpressionsregulation einschließt. Als Erweiterung der klassischen Angebots-Nachfrage-Theorie kann die Analyse in diesem Abschnitt als „hierarchische Angebots-Nachfrage“-Theorie bezeichnet werden.

Die Disziplin Regelungstechnik identifiziert zunächst eine sogenannte Regelgröße, die sie als Ausgang des Systems sieht. In der metabolischen Biochemie bezieht sich der Output oft auf einen Fluss, kann aber auch die Konzentration eines wichtigen Metaboliten im Stoffwechselweg sein. Als nächstes untersucht die Steuerungstechnik die verschiedenen Kategorien von Mechanismen, die zur Leistungsfähigkeit des Netzwerks von Tabelle 1 beitragen können Die Liste der Symbole und Definitionen

Symboldefinition und Kommentare

i Metabolische Kontrollkoeffizienten, wie in (3) definiert, sind die interessierende Systemfunktion (d. h. ein bestimmter Fluss Jj oder eine Metabolitenkonzentration X). Kleinbuchstaben werden verwendet, um die Steuerung innerhalb eines lokalen Netzwerks (z. B. Versorgungsmodul) darzustellen. Der Index verweist auf den Prozess, der steuernd ist.

i Hierarchischer Kontrollkoeffizient. Seine mathematische Definition hat dieselbe Form wie die metabolischen Kontrollkoeffizienten in (3), aber das untersuchte System kann allgemeiner sein. MCA untersucht nur die Kontrolle in einem Stoffwechselweg oder einer Signaltransduktionskaskade, nicht aber deren Kombination. HCA untersucht die Kontrolle in einem hierarchischen regulatorischen Netzwerk mit Interaktionen auf verschiedenen Ebenen, d. h. metabolisch, Signaltransduktion und Genexpression.

i MCA (oder HCA) basierter Robustheitskoeffizient.

i Zerbrechlichkeitskoeffizient. Er ist die Umkehrung des Robustheitskoeffizienten und identisch mit dem Kontrollkoeffizienten.Ffi≡∂∂lnlnefi≡

xi Elastizitätskoeffizient definiert in MCA. Es bezeichnet die unmittelbaren Einflüsse von metabolitexi in Bezug auf die Reaktionsgeschwindigkeit in der j

im vorstationären Zustand. s

xi Elastizitätskoeffizient von Metabolitexi in Bezug auf das metabolische Angebot (s) oder Nachfragemodul (d), wie in (4) definiert.

Die Gesamtelastizität (siehe [32]) für einen Reaktionsschritt sowohl unter metabolischer als auch unter Genexpressionsregulation oder die Gesamtelastizität in einem hierarchischen Angebots- oder Nachfragemodul.

Reaktionsgeschwindigkeit der Transkription oder Translation

vRDorvED Reaktionsgeschwindigkeit des mRNA- oder Proteinabbaus

kRDorkED-mRNA- oder Proteinabbaugeschwindigkeitskonstante

kiProteolyse Geschwindigkeitskonstante der Proteolyse der Ordnung μ Die spezifische Wachstums-(Teilungs-)Geschwindigkeit der Zellen E Konzentration des Enzyms

X oder xi Konzentration des intermediären Metaboliten

Halten der gesteuerten Variablen nahe ihrem ursprünglichen stationären Wert, wenn das System einer anhaltenden Störung ausgesetzt ist. Der „Fehler (Funktion)“ ist die Abweichung (δX) des Wertes der Regelgröße (X) von ihrem Wert vor der Störung oder die Differenz zu einem Referenzsignal r. Das Netzwerk „passt“ sich in einer sogenannten „Regelaktion“ an die Störung der Regelgröße, d. h. an die Fehlerfunktion, an. RNA-Polymerase plus die Ribosomen, die zusammen Veränderungen der Konzentration von Metaboliten in Veränderungen der Genexpression übersetzen, oder die direkte metabolische Regulation der Aktivität eines Enzyms entsprechen solchen Kontrollaktionen. Der Ausgang der Regelaktion (oder des „Reglers“) wird oft als Stellgröße bezeichnet. Im Stoffwechsel sind die Reaktionsraten v(X,E) Variablen, die entweder durch die Konzentration der Metaboliten (f(X)) oder durch die Enzyme, die die Reaktionskonzentration katalysieren (E), manipuliert werden. Ein mechanisches Steuersystem umfasst oft einen Aktuator, der das Steuersignal in eine Art mechanischer Bewegung umwandelt. Für ein in dieser Studie diskutiertes biochemisches System kann dies dem Enzym entsprechen, das die Reaktion katalysiert, die synthetisiert oder abbaut X. Üblicherweise ist ein Sensor vorhanden, der die Regelgröße misst und seine Fehlerfunktion in das Eingangssignal des Reglers übersetzt. In einer Genexpressionsregulation kann der Transkriptionsfaktor als Sensor angesehen werden.

Die drei am weitesten verbreiteten Steuerungskategorien sind die Proportional-, Integral- und Differentialregelungsmechanismen (PID) [17]. Sie unterscheiden sich je nachdem, ob die Reaktion des Regelsystems von der „Fehlerfunktion“ selbst, deren Zeitintegral oder deren zeitlicher Ableitung abhängt. In der systembiologischen Literatur wird der proportionale Kontrollmechanismus

wurde bereits im Hinblick auf die Stoffwechselregulation erwähnt [19,20,23] (z. B. Feedback-Hemmung). Wenn Control Engineering jedoch proportionale Regelmechanismen diskutiert, ist die Reaktion proportional zur Fehlerfunktion. In der Biochemie ist die Enzymaktivität selten eine lineare Funktion der Konzentrationen der Metaboliten X, die das Substrat des Enzyms, sein Produkt und allosterische Modifikatoren umfasst. MCA trägt dieser Nichtlinearität Rechnung, indem sie den Elastizitätskoeffizienten von 1 unterscheiden lässt. Die metabolische Regulierung durch die „Fehlerfunktion“ ist Teil der nichtlinearen Dynamik des Prozesses oder Systems, d. h. f(X), sowohl konzeptionell als auch in der mathematischen Modellierung. Es scheint daher, dass die proportionale Steuerung der Regelungstechnik in biochemischen Netzwerken nichtlinear sein kann.

Es wurde auch über eine integrale Kontrollwirkung durch die Ansammlung von Molekülen im Stoffwechselprozess berichtet [19,20,23]. Hier sollte die Systemantwort eine Funktion nicht der Fehlerfunktion selbst sein, sondern des Integrals dieser Fehlerfunktion. In der vorliegenden Studie untersuchen wir die Genexpressionsregulation unter diesem Gesichtspunkt, da die Proteinsynthese eine zeitliche Integration erfordert und von der Fehlerfunktion abhängt und da Änderungen der Proteinkonzentration die Geschwindigkeit der Rekonzentration direkt beeinflussen, wird das Protein kann katalysieren. Wir können erwarten, dass diese integrale Kontrolle irgendwie den „indirekten Elastizitäten“ von HCA entspricht. Ob die Genexpressionsregulation tatsächlich einem exakten (oder idealen) integralen Kontrollmechanismus entspricht, wird im Abschnitt Ergebnisse und Diskussion weiter diskutiert. Ob es eine abgeleitete Kontrollwirkung gibt und ob sie sich auf eine bestimmte Art der Regulation in einem Stoffwechselweg bezieht, wird in dieser Arbeit nicht untersucht. In Referenz [23] wurde bereits ein Beispiel identifiziert.

In Anbetracht der Dynamik eines Stoffwechselsystems können wir die Zeitabhängigkeit der Konzentrationen seiner Metaboliten schreiben als:

N ist die stöchiometrische Matrix. E ist eine diagonale Matrix mit den Konzentrationen der Enzyme, die die verschiedenen Reaktionen entlang ihrer Diagonalen katalysieren. f(X) ist eine Vektorfunktion der Konzentrationen der Metaboliten und der kinetischen Parameterwerte. Der regulierte Stoffwechselweg kann in Form eines geschlossenen Regelkreises beschrieben werden, wie in Abbildung 6 dargestellt, wobei kp, ki

und kd sind die PID-Regelparameter. Wir hier merken

dass Abbildung 6 und die nachfolgenden Abbildungen biochemische Details enthalten. Dies liegt daran, dass die Analyse in der vorliegenden Arbeit darauf abzielt, eine Reihe von Schlussfolgerungen von allgemeiner Bedeutung zu erhalten. In den von uns zur Veranschaulichung verwendeten Schemata spezifisch zu sein, würde dieses Ziel beeinträchtigen.

Betrachtet man eine anhaltende Störung γ∙δp (z. B. Änderung eines Parameters p) und bezeichnet mit δ die (kleine) Abweichung vom stationären Zustand vor dieser Störung, kann die zeitabhängige Variation der Metabolitenkonzentrationen beobachtet werden:

δX_ ¼N⋅δv Xð EÞ ¼N⋅Ess⋅f′ð ÞX⋅δXþN⋅f Xð Þss⋅δEþγ⋅δp

Der Index ss bezieht sich auf die stationären Werte. Durch Ersetzen der zeitlichen Integration der Genexpression, d.h.

qð Þτ ⋅dτ, für δE und unter Annahme des proportionalen

und abgeleitete Wirkungen ein Teil des Stoffwechselprozesses (14),

δX_¼N⋅Ess⋅f′ð ÞX ⋅δXþN⋅f Xð Þss⋅ki⋅ Z

Dies beschreibt die Gesamtdynamik eines Stoffwechselsystems mit geschlossenem Kreislauf unter Störung als Summe von drei Termen. Der erste Term von diesen ist eine nichtlineare Funktion (oder in erster Ordnung proportional zu) der Störung der gesteuerten Variablen (d. h. der Fehlerfunktion) X. Dieser Begriff beschreibt alle direkten Elastizitäten, einschließlich nicht-regulatorischer Systemkinetiken wie Substrat- und Produkteffekte und (anderer) metabolischer Regulation wie der allosterischen Aktivierung. Der zweite Term entspricht einem Zeitintegral einer Funktion der Störfunktion der Regelgröße δX und kann auch von anderen Systemvariablen abhängen, wie im Abschnitt Ergebnisse und Diskussion diskutiert.

Wir untersuchen nun, ob diese beiden Terme in Gleichung (16) den proportionalen und integralen Regelkreisen der Regelungstechnik entsprechen.

Ein einfaches Beispiel für kombinierte metabolische und

Genexpressionsregulation eines wichtigen intrazellulären Prozesses: ATP-(Energie-)Stoffwechsel

Betrachten wir das einfache Beispiel in Abbildung 7, d. h. einen zweistufigen Weg mit ATP und ADP als kombinierte Zwischenstufe und wobei die Expression des Gens, das für das erste Enzym E kodiert, proportional zur Konzentration von ADP ansteigt. Die „Einheitenerhaltungssumme“C ist die Summe der Konzentrationen von ATP und ADP und hier eine Konstante (d.h. C= [ATP] + [ADP]), da die Reaktionen nur das eine in das andere umwandeln. Die Stoffwechselregulation adressiert das Zusammenspiel von Angebots- und Nachfrageprozessen (sandd).

Es wird hier angenommen, dass die Dynamik von ADP und EnzymE der Massenwirkungskinetik folgt:

Der Abbau des Enzyms wird hier als Summe zweier Terme geschrieben, was dazu dient, die Implikation dieses Abbaus als unabhängig zu betonen (forkb= 0)

oder abhängig (für k0= 0 siehe unten) vom Enzym

Konzentration. Die Degradationsrate erster Ordnung spiegelt die

Annahme, dass es eine eher unspezifische Protease-Aktivität gibt, für die das spezielle Enzym E, das wir hier betrachten, ein Minderheitssubstrat ist. Der Abbau nullter Ordnung würde einen Fall widerspiegeln, in dem es ein spezifisches Proteasesystem für Enzym E gibt (z. B. eine Ubiquitinierung gefolgt von einer generischen Protease), das durch die bereits hohe Konzentration des Enzyms relativ zur KM des

Ubiquitin-Transferase. In (17) werden alle Geschwindigkeitskonstanten als nicht negativ betrachtet und k0 = 0, wenn E nicht positiv ist. Die

Die regelungstechnische Struktur des Pfades kann wie in Abbildung 8 dargestellt werden.

Das Regelsystemdiagramm legt nahe, dass die ADP-Konzentration die Regelgröße und die Enzymkonzentration E eine manipulierte Variable im Regelkreis der Genexpression ist. Die Abbaurate nullter Ordnung k0 kann als Referenzsignal für

das System. Die Stoffwechselregulation ist als Teil des kinetischen Prozesses von ADP enthalten. Unter Berücksichtigung einer Störung von kd von seinem stationären Wert (d. h.

δkd) und Neuformulierung der Kinetik von ADP und E

δ½ADP: ¼−ðks⋅EssþkdÞ⋅δ½ADP−ks⋅½ADPss⋅ Z ∞

ð18Þ Vergleicht man dies mit einem allgemeinen Regelsystem (16), erkennt man mit ADP forX auf der rechten Seite zuerst einen proportionalen Antwortterm, dann einen integralen Antwortterm und dann den Störungsterm. Die proportionale Antwort entspricht der direkten

„Elastizität“ der Angebots- und Nachfragereaktionen in Bezug auf die Fehlerfunktion δ[ADP], die eine metabolische und momentane Regulation ist. Die integrale Antwort hängt mit der Proteinsynthese und -abbau und damit mit der Genexpressionsregulation zusammen.

Wenn der Enzymabbau in Bezug auf E nullter Ordnung ist (d. h. wenn kb = 0), ist die Genexpressionsregulation

wird zu einem idealen integralen Regelkreis, und das metabolische Netzwerk kann eine robuste perfekte Anpassung an die externen oder parametrischen Störungen aufweisen. Dies kann verstanden werden, indem verlangt wird, dass (18) in einem stationären Zustand gültig ist, dh mit zeitunabhängigen Werten für [ADP] und E. Da das Zeitintegral unendlich reicht, erfordert dies, dass das Argument des Integrals, dhka⋅δ [ADP]−kb⋅δE, muss gleich Null sein. Die

der mechanismus für diese perfekte anpassung besteht darin, dass nach der störung die konzentration des enzyms variiert, bis es die zeitabhängigkeiten von selbst gleich null macht, wodurch der üblichere prozess der metabolischen regulierung vermieden wird, bei dem änderungen der kontrollierten variablen für die stetige Zustand, der in Gegenwart der anhaltenden Störung wieder erreicht werden soll.

Für den allgemeineren Fall, in dem der Enzymabbau von der Enzymkonzentration abhängen kann, kann die (hierarchische) Kontrolle des Enzymspiegels durch die Bedarfsreaktion in Form der kinetischen Parameter und der stationären ADP-Konzentration ausgedrückt werden (siehe Anhang C):

Die von der Nachfragereaktion ausgeübte Flusskontrolle wird quantifiziert durch:

Sowohl die Kontrolle des Enzymspiegels als auch die Kontrolle des Bedarfsflusses durch die Störung sind gleich 1 minus einer hyperbolischen Funktion von kb. Für das ideale integrale Kontrollszenario von kb= 0 verfolgt die Enzymkonzentration E die Aktivität von

der Weg, der ATP perfekt abbaut, d. h. HE

kd¼1. Noch wichtiger ist, dass der Pfadfluss die Störung im Bedarfsfluss und HJ . perfekt verfolgtk

d ¼1. Dies ist der Fall der robusten perfekten Anpassung. Für andere Fälle, in denen kb≠0, die

Die Anpassung des Pfades an die Störung wird nicht perfekt sein und beide Kontrollkoeffizienten sind kleiner als 1.

Auch der Robustheitskoeffizient [36] der ADP-Konzentrationen gegenüber Störungen in der Nachfragereaktion kann durch kinetische Konstanten und die Konzentration von ADP ausgedrückt werden (Definition siehe Tabelle 1):

Nur wennkb= 0,kd= 0 oder [ATP]ss=0, ADP und ATP

sind absolut robust (ℜ½kADPD ¼∞) gegenüber Störungen.

Die Fragilität [36] der ADP-Konzentration gegenüber der Per-Turbation in der Nachfragereaktion, die die Umkehrung der Robustheit ist, lässt sich durch den Konzentrationssteuerkoeffizienten für die Konzentration von ADP in Bezug auf den Abbauprozess quantifizieren . Es liest sich wie folgt:

Diese Zerbrechlichkeit ist eine hyperbolische Funktion der Abbaugeschwindigkeitskonstante erster Ordnung des Enzyms und daher null, wenn dieser Abbau nullter Ordnung ist (siehe Abbildung 9 zur Veranschaulichung). Die Fragilität hat das ATP/(ADP + ATP)-Verhältnis als maximalen Wert (daher entspricht die minimale Robustheit dem (ADP + ATP)/ATP-Verhältnis). Die halbe maximale Zerbrechlichkeit wird erreicht für:

Dies bedeutet, dass die Fragilität für eine beträchtliche Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung des Proteinabbaus gering sein kann, wenn die Geschwindigkeitskonstante für die Proteinsynthese ebenfalls hoch ist. Die Kontrollkoeffizienten für den Enzymspiegel HE

kd und der Nachfragefluss H J

kd erreicht ein Maximum von 1 und einen Wert von ½, wenn die Zerbrechlichkeit von ADP halbmaximal ist.

Diese Schlussfolgerungen können etwas verallgemeinert werden, indem HCA und das hierarchische Angebots-Nachfrage-Ergebnis in (12) direkt implementiert werden. Für das obige Modell nehmen die Elastizitätskoeffizienten folgende Größenordnungen an:

ð24Þ Abbildung 8Kontrollsystemstruktur des ATP-Energiestoffwechsels.k0undkbare die Konstanten der Proteinabbaurate nullter und erster Ordnung.kais

Für die Robustheit der ADP-Konzentration gegenüber einer erhöhten Nachfrage findet man dann:

Dies zeigt, dass die Robustheit unendlich ist, wenn die Enzymabbaureaktion nullter Ordnung ist (d. h. εb

E¼0), und dass die Robustheit mit zunehmender Ordnung (Elastizität) dieser Reaktion kleiner wird.

Die wichtigste Schlussfolgerung hier ist, dass es keine Diskontinuität in der Fähigkeit von integralen Regelkreisen gibt, zu einer guten Anpassung zu führen. Je näher der Abbau des Enzyms, das die Anpassung ermöglicht, an einer Reaktion nullter Ordnung liegt, desto stärker wird die Störung im Bedarfsfluss nachgeführt und desto robuster ist die homöostatisch zu haltende Variable. Wichtig ist vielleicht das Phänomen, dass die Robustheit nicht durch die Größe der Abbaureaktion bestimmt wird, sondern durch ihre kinetische Ordnung (d. h. Elastizität des effektiven Hill-Koeffizienten). Die entsprechenden Schlussfolgerungen beziehen sich auf die Verfolgung des Bedarfs durch das Enzymniveau E und die Steuerung des Stoffwechselflusses durch die Bedarfsreaktion.

Ein weiteres Thema in der Regelungstechnik ist die Robustheit von Systemen gegenüber Störungen bei verschiedenen Frequenzen. In der Technik muss ein Flugzeugflügel sowohl bei hohen Frequenzen als auch bei niedrigen Frequenzen robust gegenüber Luftdruckschwankungen sein. Um diese kombinierte Robustheit zu erreichen, müssen möglicherweise verschiedene Regelkreise gleichzeitig eingerichtet werden, obwohl ein Kompromiss die Möglichkeiten begrenzt

tun [18]. In der Systembiologie lässt sich dies für die Endprodukt-Feedback-Regulierung in Abbildung 1 veranschaulichen. Steigt der Flussbedarf des Stoffwechselwegs schnell an, sinkt die Konzentration des Endprodukts schnell und infolge des direkten allosterischen Produkthemmungseffekts , steigt auch die Aktivität des ersten Enzyms schnell an. Diese metabolische Kontrolle der Enzymaktivität ist ein schneller Aktuator des Systems. Bei einem weiteren Anstieg des Flussmittelbedarfs kann das erste Enzym jedoch seine Kontrollkapazität „verlieren“, da sich seine Aktivität seiner maximalen Kapazität (kcat) nähert. In diesem Stadium kann das System dann

eine zweite „Anpassung“ durch Genexpression erfahren, die zwar langsamer ist, da die Zelle Enzyme produzieren muss, aber letztendlich dennoch zu einer Erhöhung der Konzentration des ersten Enzyms führt. Diese Erhöhung sollte dann die direkte metabolische Stimulation der katalytischen Aktivität des oben diskutierten Enzyms verringern. In diesem Sinne ist die Regulation des ersten Enzyms des Signalwegs dynamisch bifunktionell [18]: Die metabolische Regulation weist hochfrequente Störungen schnell zurück, aber möglicherweise mit geringer Amplitude oder Fähigkeit, während die Genexpressionsregulation ist langsam in der Anpassung, kann aber möglicherweise sehr große konstante Störungen zurückweisen.

Bedingungen für integrale und pseudointegrale Kontrolle: Endproduktpfad

In diesem Abschnitt erinnern wir uns an das Endproduktmodul-Beispiel (von dem das einfache Beispiel für den ATP-Metabolismus ein Sonderfall ist), um die Genexpressionsregulation in einem allgemeineren Stoffwechselweg zu analysieren. Insbesondere werden die Bedingungen identifiziert, für die die Genexpressionsregulation eine ideale integrale Kontrolle oder pseudointegrale Kontrolle darstellt. Ein einfaches, aber repräsentatives Beispiel für ein Endprodukt ist in Abbildung 10 dargestellt, d. h. ein linearer Weg mit drei Metaboliten, bei dem für alle drei Enzyme die Genexpression durch den letzten Metaboliten reguliert wird. Das kinetische Modell dieses Beispiels mit allen Parametern ist in [5] enthalten.

Gentranskription und Translation werden hier explizit modelliert, indem die dynamische Funktion der mRNA als

E ¼vTrnl−vED¼gTrnlð ÞR −kED⋅E ð

HeregTrnl(R) =kTrnl⋅Ris eine Funktion der mRNA

Konzentration R. kED besteht im Wesentlichen aus drei Teilen. Einer

Term ist auf die Verdünnung zurückzuführen, die proportional zur spezifischen Zellwachstumsrate μ ist. Die anderen Begriffe entsprechen der Proteolyse wie folgt:

Der letzte Term bezeichnet die Proteolyse nullter Ordnung, wie sie durch Proteasen verursacht würde, die mit dem interessierenden Protein gesättigt sind. Wir gehen hier davon aus, dass die spezifische Wachstumsrateμ unabhängig von der Aktivität des untersuchten Pfades ist, eine Annahme, die manchmal, aber nicht immer realistisch ist. Da nach Multiplikation mit E der letzte Term unabhängig von der Proteinkonzentration ist, ist es zweckmäßig, diesen Term in die Proteinsynthesefunktion gTrnl(R) zu verschieben. Daher ist das neue Protein

Abbaurate kann definiert werden als:

und die Proteindynamik kann umgeschrieben werden als:

In der exponentiellen Wachstumsphase oder wenn die Proteolyse erster Ordnung ist (d. h. kED≠0), das obige Stoffwechselbeispiel

entspricht einem pseudo- oder nicht-integralen Steuerungsszenario. Die Kontrollstruktur des Regulationssystems ist dann in Abbildung 11 angegeben. Die Dynamik des „Sensors“ wird hier zerlegt, indem sowohl die Transkription als auch die Translation durch mRNA angesprochen werden. Im stationären Zustand ist oft gTrnl(R)ss=kED⋅Ess≠0. Daher nach

Störung eines Systemparameters (d. h. kinetische Konstanten), werden die neuen stationären Werte von x3, R und gTrnl(R)

nicht mehr den alten Steady-State-Werten entsprechen, was darauf hinweist, dass das Regelsystem dann keine perfekte Anpassung erreicht. Wenn kTnD jedoch ist

sehr kleines, nahezu perfektes Anpassungsverhalten sollte beobachtet werden.

Ein ideales integrales Kontrollszenario tritt nur ein, wenn die Zelle in eine stationäre Phase eintritt und es nur eine Proteolyse nullter Ordnung gibt, d. h. kED¼μþk1Proteolyse¼0 . In

In diesem Fall ist im stationären Zustand gTrnl(R)ss≡0 wegen des Integrals

Kontrolle, und R und x3 bleiben auch immer gleich

konstante Werte im stationären Zustand, egal wie die Systemparameter gestört werden. Die Anpassung des Systems ist dann perfekt im Sinne einer Robustheit der Systemeigenschaften R und x3 gegenüber den Störungen.

Die Funktionen gTrnl(·) und gTrsc(·) können auch

multivariat, d.h. andere Systemvariablen enthalten. Nur wenn diese Variablen nicht funktionell von der Proteinkonzentration (E) abhängen, bleibt die Anpassung gegenüber Störungen der kinetischen Parameter des Systems perfekt.

Das oben betrachtete ideale integrale Regelungsszenario führte zur perfekten Robustheit bestimmter Systemvariablen gegenüber bestimmten (externen oder parametrischen) Störungen. Ein zweiter Aspekt des perfekten Anpassungsszenarios ist die perfekte Verfolgung durch eine zweite Systemvariable von Störungen. Perfektes Tracking bedeutet, dass die relative Änderung der Variablen identisch mit der relativen Änderung des Störparameters ist. Wenn der Parameter die Aktivität eines Prozesses ist, dann bedeutet dies, dass der entsprechende Regelkoeffizient gleich 1 ist. Die perfekte Verfolgung von Referenzen und die perfekte Robustheit der Regelgrößen gegenüber Störungen sind zwei Aspekte integraler Regelsysteme , dh die beiden Merkmale können gleichzeitig für dasselbe System beobachtet werden. Ein spezifischer Pfad zeigt dann perfekte Robustheit einer Systemvariablen gegenüber mehreren Störungen (oder Parametern), aber perfektes Tracking in Bezug auf nur einen begrenzten Satz von Parametern (z. B. einen Referenzsignalgeber).

Abbildung 10A linearer Endproduktweg mit Genexpression und metabolischer Regulation. Die Metaboliten werden mit xi bezeichnet, mRNA mit mR und Enzyme mit E. S und P sind die externen Metaboliten. Metabolitex3 hemmt die Geschwindigkeit von Enzym 1 durch Stoffwechselregulation und die

Für das obige Beispiel kann die Proteolyse nullter Ordnung als ‚Referenz‘signalr¼k0 . angesehen werdenProteolyse. Effektiv entspricht eine Störung dieser Geschwindigkeitskonstante einer externen Störung der Proteinsynthese. Der Effekt ist, dass selbst bei einem idealen integralen Regelfall, d. h. bei kED= 0,

die stationäre mRNA-Konzentration wird nicht 0. Vielmehr wird sie immer den Referenzgeber „verfolgen“ (d. h. R=r/kTrnl≠

0) wann immerE_ss¼0. Die Struktur des Referenz-Tracking-Steuerungssystems ist in Abbildung 11 enthalten, wobei auf Referenzr durch einen gestrichelten Pfeil Bezug genommen wird und gTrnl(R) dann für steht

Praktische Bedenken und Annahmen zur Abbauratenkonstante kED

Im Allgemeinen gilt kED¼μþk1Proteolyse>0 . Es mag so aussehen

die Bedingung der Integralregelung kann erreicht werden, wenn entweder i) kED< < α mit α ein sehr kleines positives

Wert, oder ii) kED < < kTrnl (oder kED·E < < gTrnl(R)). In dem

Im letzteren Fall sollte, damit der Proteingehalt begrenzt bleibt, eine Hintergrundabbaurate des Proteins unabhängig von der Konzentration dieses Proteins vorliegen. Dies wäre der Fall, wenn:

Während der exponentiellen Wachstumsphase von Bakterien wie E. weniger als 1% eines Proteins können während eines Zellteilungszyklus abgebaut werden [37]. Folglich ist der Hauptterm beim Proteinabbau der Verdünnungsterm µ und dieser Term ist im Allgemeinen sehr klein. Tatsächlich gilt per Definition eμ⋅T= 2, wobei T die Verdopplungszeit der Bakterien ist und dann μ= ln2/T. Praktisch der kleinste Wert

für T liegt nahe bei 20 Minuten [38], was der schnellsten Wachstumsrate von E. coli:

μ≈ln 2=ð2060Þ ¼5:810−4 s−1 ð31Þ

Eine solche Wachstumsrate in Mikroben wie E. coli und Hefe, die für Organismen schnell, aber langsam auf der Zeitskala der RNA- und Proteinsynthese ist, erzeugt eine kleine effektive Abbauratenkonstante für die Proteine. Ob eine solch kleine Degradationsratenkonstante ausreicht, um in der Praxis ein nahezu perfektes Adaptionsverhalten zu erzeugen, das als quasi-perfektes integrales Regelsystem interpretiert würde, wird im Folgenden gezeigt.

In diesem Abschnitt werden sowohl das integrale als auch das nichtintegrale Regelungsszenario anhand des Beispiels in Abbildung 10 mit allen in [5] angegebenen kinetischen Parametern simuliert. Es werden drei verschiedene Systeme betrachtet, mit kED= 0, 0.2 und 0.4,

bzw. Alle drei Systeme werden aus dem gleichen Anfangszustand simuliert. Die Konzentrationsänderungen von mRNA, E und x3 sind in Abbildung 12 dargestellt. Nach einer gewissen Zeit (z.

30 Sekunden) erreichen die drei Systeme unterschiedliche stationäre Zustände. Dann stören wir nach 50 Sekunden einen Systemparameter (d. h. den kcat der dritten Reaktion) für alle drei Fälle um 20%.

Nach einer Weile erreichen die drei Systeme neue stationäre Zustände. Nach der Störung kehrt nur das System mit Proteinabbau nullter Ordnung (d. h. kED= 0) in den gleichen stationären Zustand zurück

Werte für mRNA und x3 wie vor der Störung,

was auf perfekte Anpassung hinweist: Dies ist ein ideales integriertes Regelsystem. Dabei variiert die Stellgröße, der Enzymspiegel E, stark. Durch seine Anpassung sind x3 und mRNA absolut robust gegenüber dem

Abbildung 11Regelsystemstruktur eines pseudointegralen oder idealintegralen Regelungsproblems.hTrsc(·) bezeichnet den Transkriptionsprozess.

gTrnl(·) bezeichnet die Geschwindigkeit der Proteinsynthese. Die pseudointegrale Regelung wird erst dann zur idealen integralen Regelung, wenn die gestrichelte Linie

Störungen des kcat der dritten Reaktion. In dem anderen

in zwei Fällen (d. h. kED = 0,2 oder 0,4), die Änderung des Enzymspiegels

kleiner ist, aber die neuen Steady-State-Werte von mRNA und x3 weichen von ihren vorherigen Steady-State-Werten ab und

Anpassung ist nicht perfekt. Die Abweichungen sind jedoch nicht groß, nur 3% für x3 und 4% für mRNA, wenn kED = 0,2,

und 4% fürx3 und 8% für mRNA, wenn kED = 0,4.

Betrachten wir nun das Referenz-Tracking-Szenario. Die Reaktionen von Enzym und mRNA auf eine 20%ige Störung der Proteinstabilität (r) bei t = 50 Sekunden sind in 13 für drei verschiedene Geschwindigkeitskonstanten des Enzymabbaus kED angegeben. Nur wenn kED= 0 ist die mRNA

Die Konzentration folgte dem Referenzwert mit einer „Abweichung“ des stationären Zustands von null. Dies weist auf die Existenz einer perfekten integralen Wirkung des Rückkopplungsregulationssystems hin. Wenn kED ungleich Null war (d. h. kED= 0.2 orkED=

0.4), folgte die mRNA-Antwort dem Referenzsignal nicht, was darauf hindeutet, dass der Controller des Systems in diesen beiden Fällen kein idealer integraler Controller war, obwohl er sich weniger änderte als das Referenzsignal.

HCA und eine hierarchische Angebots-Nachfrage-Interpretation Dieses Simulationsbeispiel kann durch eine hierarchische Angebots-Nachfrage-Struktur wie in Abbildung 4 dargestellt werden. Um eine ideale integrale Kontrolle zu erhalten, sollten sowohl die Proteinsynthese als auch der Proteinabbau unabhängig von der Proteinkonzentration sein das wird abgebaut (dh

E ¼gTrnlð ÞR). Da dies impliziert, dass der Proteinabbau in der Proteinkonzentration nullter Ordnung ist:

Damit wird der hierarchische Kontrollkoeffizient der Metabolitenkonzentration


Danksagung

Wir danken Uri Gophna, Stephen G. Oliver und Tomer Shlomi für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Wir danken auch Francois Delmotte für seine freundliche Hilfe bei der Datenerhebung. K.Y wird teilweise durch ein Stipendium des Edmond J. Safra Bioinformatics-Programms der Universität Tel-Aviv unterstützt. T.T. ist Koshland-Stipendiat am Weizmann Institute of Science und wird durch ein Reisestipendium des EU-Stipendiums PIRG04-GA-2008-239317 unterstützt. wird von der International Human Frontier Science Program Organization, dem Ungarischen Wissenschaftlichen Forschungsfonds (OTKA PD 75261) und dem „Lendület-Programm“ der Ungarischen Akademie der Wissenschaften unterstützt. Die Forschung von ER wird durch Stipendien der James S. McDonnell Foundation, des EU Microme-Konsortiums und der Israeli Science Foundation (ISF) unterstützt.

Autorenbeiträge: KY, TT, BP und ER haben die Forschung konzipiert und gestaltet. KY, TT, BP und ER haben das Papier geschrieben. KY führte die Analyse und die statistischen Berechnungen durch. TT führte die phylogenetische Rekonstruktion durch.