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2.2: Allgemeine Färbemethoden - Biologie

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LERNZIELE

  • Vergleichen und kontrastieren Sie In-vitro- und In-vivo-Färbungen

Färben ist eine Technik, die in der Mikroskopie verwendet wird, um den Kontrast in einem mikroskopischen Bild zu verbessern. Färbemittel und Farbstoffe werden häufig verwendet, um Strukturen in Mikroben zur Betrachtung hervorzuheben, oft mit Hilfe verschiedener Mikroskope. Farbstoffe können verwendet werden, um verschiedene Arten von Mikroben, verschiedene Stadien des zellulären Lebens (z. B. der Mitosezyklus) und sogar Organellen innerhalb einzelner Zellen (z. B. Mitochondrien oder Chloroplasten) zu definieren und zu untersuchen.

In-vivo Färbung ist der Prozess des Färbens von lebendem Gewebe — in vivo bedeutet „im Leben“ (im Gegensatz zu in-vitro Färbung). Wenn eine bestimmte Zelle oder Struktur kontrastierende Farbe(n) annimmt, kann ihre Form (Morphologie) oder Position innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes leicht gesehen und untersucht werden. Der übliche Zweck besteht darin, zytologische Details zu enthüllen, die sonst möglicherweise nicht sichtbar wären; die Färbung kann jedoch auch zeigen, wo bestimmte Chemikalien oder spezifische chemische Reaktionen innerhalb der Zellen stattfinden. In-vitro Beim Färben werden Zellen oder Strukturen gefärbt, die aus ihrem biologischen Kontext entfernt wurden. Bestimmte Färbungen werden oft kombiniert, um mehr Details und Merkmale zu zeigen, als eine einzelne Färbung allein zeigen könnte, und eine Gegenfärbung ist eine Färbung, die die Sichtbarkeit von Zellen oder Strukturen erhöht, wenn die Hauptfärbung nicht ausreicht. Wissenschaftler und Ärzte können die Färbung mit spezifischen Protokollen zur Fixierung und Probenvorbereitung kombinieren und diese Standardtechniken als konsistente, wiederholbare Diagnosewerkzeuge verwenden.

Es gibt eine unglaubliche Anzahl von Flecken, die in einer Vielzahl von verschiedenen Methoden verwendet werden können. Im Folgenden sind einige allgemeine Aspekte des Vorbereitungsprozesses auf in-vitro Färbung.

  • Fixierung: Diese kann selbst aus mehreren Schritten bestehen. Die Fixierung zielt darauf ab, die Form der Zellen (in diesem Fall der Mikroben) so gut wie möglich zu erhalten. Manchmal wird die Hitzefixierung verwendet, um die Zellen abzutöten, anzuhaften und zu verändern, damit sie Flecken akzeptieren. Die meisten chemischen Fixiermittel erzeugen chemische Bindungen zwischen Proteinen und anderen Substanzen innerhalb der Probe und erhöhen deren Steifigkeit. Gängige Fixiermittel sind Formaldehyd, Ethanol, Methanol und Pikrinsäure.
  • Permeabilisierung: Hierbei werden die Zellen mit (meist) einem milden Tensid behandelt. Diese Behandlung löst Zellmembranen auf, wodurch größere Farbstoffmoleküle in das Zellinnere gelangen können.
  • Montage: Dieser Schritt beinhaltet normalerweise das Anbringen der Proben auf einem Glasobjektträger zur Beobachtung und Analyse. In einigen Fällen können Zellen direkt auf einem Objektträger gezüchtet werden. Bei Proben von losen Zellen kann die Probe direkt auf einen Objektträger aufgetragen werden.

Im einfachsten Fall besteht der eigentliche Färbeprozess darin, die Probe (vor oder nach der Fixierung und Einbettung) in eine Farbstofflösung einzutauchen, gefolgt von Spülen und Beobachten. Viele Farbstoffe erfordern jedoch die Verwendung eines Beizmittels – einer chemischen Verbindung, die mit dem Fleck reagiert, um einen unlöslichen farbigen Niederschlag zu bilden. Wenn die überschüssige Farblösung weggewaschen wird, bleibt der Beizfleck zurück. Es gibt eine unglaubliche Vielfalt an Farbstoffen, die in diesem Schritt verwendet werden können, von denen, die bestimmte Mikrobentypen färben (siehe Abbildung unten) bis hin zu solchen, die Unterkompartimente oder Organellen einer Zelle hervorheben, wie den Zellkern oder das endoplasmatische Retikulum. Alternativ kann eine negative Färbung verwendet werden. Dies ist eine einfache Färbemethode für Bakterien, bei der die Zellen auf den Objektträger gestrichen und dann Nigrosin (ein schwarzer synthetischer Farbstoff) oder Tusche (eine wässrige Suspension von Kohlenstoffpartikeln) aufgetragen werden. Nach dem Trocknen können die Mikroorganismen im Hellfeldmikroskop betrachtet werden, da hellere Einschlüsse sich gut von der sie umgebenden dunklen Umgebung abheben

Live, in-vivo Die Färbemikroskopie teilt viele dieser Schritte mit Ausnahme der Fixierung, die die zu untersuchende Mikrobe unweigerlich abtötet.

Wichtige Punkte

  • Die In-vivo-Färbung, die lebende Zellen sichtbar macht, und die In-vitro-Färbung, die fixierte Zellen sichtbar macht, haben beide wichtige Anwendungen.
  • Es gibt eine breite Palette von Farbstoffen, die auf Mikroben verwendet werden können, die fast jedes Merkmal einer Zelle hervorheben können, sogar Organellen innerhalb einer Zelle.
  • Färbeprotokolle können komplex sein, aber sie teilen einige grundlegende Schritte: Vorbereitung, Fixierung, Färbung und Montage.

Schlüsselbegriffe

  • Tensid: ein oberflächenaktives Mittel oder Benetzungsmittel, das die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit verringern kann; typischerweise organische Verbindungen mit einem hydrophilen „Kopf“ und einem hydrophoben „Schwanz“
  • Organelle: eine spezialisierte Struktur innerhalb von Zellen, die einen bestimmten Lebensprozess ausführt (z. B. Ribosomen, Vakuolen)

2.2: Allgemeine Färbemethoden - Biologie

Diese brandneuen Ressourcen unterstützen die Verwendung von Praktika in verschiedenen Biologiespezifikationen auf A-Ebene (OCR, AQA und Edexcel).

  • Getestete Materialien zur Unterstützung der wichtigsten praktischen Aspekte der Common Practical Assessment Criteria
  • Unterstützungsmaterialien für Lehrer, Techniker und Schüler
  • Überarbeitungsmaterialien für Studierende zur Überarbeitung für die indirekte Prüfung von Praktika

Diese neue Ressource unterstützt den Einsatz von Praktika in verschiedenen A-Level Biologie 2015 Spezifikationen für England (OCR, AQA, Edexcel und Eduqas).

Dieses Experiment ermöglicht es den Schülern, in weniger als 4 Minuten von der Pflanze auf dem Schreibtisch eine gefärbte Probe unter dem Mikroskop zu betrachten (wie in den Bildern oben gezeigt). Das betrachtete Präparat zeigt deutlich die Lage der Leitbündel und des Xylems, Phloems und Sklerenchyms oder Kollenchyms.

Die Verwendung des Farbstoffs Toluidinblau sorgt für einen Farbunterschied zwischen verholzten und nicht verholzten Zellwänden, wodurch spezialisierte Zellen und eine Anpassung, die sie aufweisen, deutlich hervorgehoben werden.

Dieses Experiment bietet eine schnelle und auffällige Möglichkeit, das Gefäßgewebe in Pflanzen und die Struktur von Pflanzenstängeln zu vermitteln. Es bietet den Studierenden die Möglichkeit, ihre wissenschaftlichen Zeichenfähigkeiten sowie den Umgang mit Lichtmikroskop und Okularraster zu entwickeln (und zu demonstrieren).

  • Getestete Materialien zur Unterstützung des A-Level-Practice-Endorsements (CPAC)
  • Unterstützungsmaterialien für Lehrer und Techniker
  • Schülerarbeitsblatt als Nachweis für die Erfüllung der Anforderungen an die praktischen Fähigkeiten
  • Prüfungsmaterialien für Schüler zur Vorbereitung auf Prüfungen

Unterstützende Materialien für weitere Schlüsselpraktika im Leistungsverzeichnis des Abiturs finden Sie auf der Hauptseite der Abitur-Set-Praktiken.


Differenzielle Färbetechniken

In der Mikrobiologie werden differenzielle Färbetechniken häufiger als einfache Färbungen verwendet, um Informationen über Bakterien zu sammeln. Differentielle Färbeverfahren, die typischerweise mehr als eine Färbung und mehrere Schritte erfordern, werden als solche bezeichnet, weil sie die Differenzierung von Zelltypen oder Zellstrukturen ermöglichen. Die wichtigste davon ist die Gram-Färbung. Andere differenzielle Färbemethoden sind die Endosporenfärbung (um endosporenbildende Bakterien zu identifizieren), die säurefeste Färbung (zur Unterscheidung Mykobakterium Spezies von anderen Bakterien), eine metachromatische Färbung zur Identifizierung von Phosphatspeicherkörnern und die Kapselfärbung (um eingekapselte Bakterien zu identifizieren). Wir werden die Gram- und Endosporen-Färbungsverfahren im Labor durchführen und vorbereitete Objektträger anzeigen, die einige der anderen zellulären Strukturen hervorheben, die in einigen Bakterien vorhanden sind.


Vorbereitung des Abstrichs:

  1. Nehmen Sie einen fettfreien trockenen Objektträger.
  2. Sterilisieren Sie die Impföse auf einer Flamme eines Bunsenbrenners.
  3. Übertragen Sie eine Schleife voller Kultur (oder der Probe) in eine sterile Schleife und machen Sie einen Abstrich in der Mitte. Der Abstrich sollte nicht sehr dünn oder sehr dick sein.
  4. Lassen Sie den Braten an der Luft trocknen.
  5. Fixieren Sie den trockenen Ausstrich, indem Sie den Objektträger 3-4 Mal schnell mit der Ausstrichseite nach oben durch die Flamme führen.

Grammfärbung:

  1. Legen Sie die Objektträger auf die Färbestäbe.
  2. Bedecken Sie den Ausstrich mit Kristallviolettfarbe und lassen Sie ihn 1 Minute einwirken.
  3. Vorsichtig unter fließendem Leitungswasser waschen.
  4. Den Abstrich mit Gram’s Jodlösung überfluten und 1 Minute einwirken lassen.
  5. Das Jod ablassen Waschen Sie den Objektträger für die erneute in einem sanften Strom von Leitungswasser.
  6. Fluten Sie den Objektträger mit dem Entfärbungsmittel und warten Sie dann 20-30 Sekunden. Dies kann auch durch tropfenweise Zugabe auf den Objektträger erfolgen, bis das von den Objektträgern laufende Entfärbungsmittel klar läuft.
  7. Waschen Sie den Objektträger vorsichtig unter fließendem Leitungswasser und lassen Sie ihn vollständig abtropfen.
  8. Für und mit Safranin gegenfärben und ca. 30 Sekunden bis 1 Minute warten.
  9. Objektträger in einem sanften und indirekten Strom von Leitungswasser waschen, bis keine Farbe mehr im Abwasser erscheint und dann mit saugfähigem Papier trocken tupfen.
  10. Unter Mikroskop beobachten.

Biologie lehren

Dieser Artikel wurde von Dr. Soren Rosier mitverfasst. Soren Rosier ist Doktorand an der Graduate School of Education in Stanford. Er untersucht, wie Kinder einander unterrichten und wie man effektive Peer-Lehrer ausbildet. Vor seiner Promotion war er Mittelschullehrer in Oakland, Kalifornien, und Forscher bei SRI International. 2010 erhielt er seinen Bachelor-Abschluss an der Harvard University.

In diesem Artikel werden 18 Referenzen zitiert, die am Ende der Seite zu finden sind.

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Die Biologie ist einer der zentralen Wissenschaftszweige und hat Relevanz für Themen wie Medizin, Genetik, Zoologie, Ökologie und Politik. Als solches hat es das Potenzial, fast jeden Studenten zu interessieren. Um erfolgreich im Biologieunterricht zu sein, müssen Sie jedoch sorgfältig darüber nachdenken, wie Sie dieses spannende Feld auf eine zusammenhängende und unterhaltsame Weise teilen können. Auf dem Weg dorthin sollten Sie es sich zum Ziel machen, dass die Studierenden zumindest grundlegende Kenntnisse in biologischen Konzepten erwerben.


Elektronisches Zusatzmaterial ist online unter https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4614731 verfügbar.

Veröffentlicht von der Royal Society unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, die eine uneingeschränkte Nutzung gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Verweise

Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Kreiger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J.

2004 Molekulare Zellbiologie , 5. Aufl. New York, NY: W. H. Freeman Company. Google Scholar

Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG

. 2000 Biochemie , 3. Aufl. Reading, MA: Addison-Wesley Publishing Company. Google Scholar

Mach H, Middaugh CR, Lewis RV

. 1992 Statistische Bestimmung der Mittelwerte der Extinktionskoeffizienten von Tryptophan und Tyrosin in nativen Proteinen. Anal. Biochem. 200, 74-80. (doi:10.1016/0003-2697(92)90279-G) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2006 Spektrophotometrische und kolorimetrische Bestimmung der Proteinkonzentration. Curr. Protokolle Mol. Biol. Kapitel 10, Einheit 10 11A. (doi:10.1002/0471142727.mb1001as76) Google Scholar

. 2007 Ein protein-responsiver Chromophor basierend auf Squarain und seine Anwendung zum visuellen Proteinnachweis auf einem Gel für SDS-PAGE . Angew. Chem. Int. Bearbeiten. 46, 4097-4099. (doi:10.1002/anie.200700245) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Wang F, Wen J, Huang L, Huang J, Ouyang J

. 2012 Eine hochempfindliche „einschaltbare“ Fluoreszenzsonde zur Proteinquantifizierung und -visualisierung basierend auf aggregationsinduzierter Emission Chem.-Nr. Komm. 48, 7395-7397. (doi:10.1039/c2cc33172a) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2005 Design und Synthese intramolekularer fluoreszierender Reagenzien auf Ladungstransferbasis für den hochempfindlichen Nachweis von Proteinen . Marmelade. Chem.-Nr. Soz. 127, 17 799-17 802. (doi:10.1021/ja054739q) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zhu H, Fan JL, Du JJ, Peng XJ

. 2016 Fluoreszenzsonden zur Wahrnehmung und Bildgebung in spezifischen Zellorganellen . Konten Chem. Res. 49, 2115-2126. (doi:10.1021/acs.accounts.6b00292) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Specht EA, Braselmann E, Palmer AE

. 2017 Ein kritischer und vergleichender Überblick über fluoreszierende Werkzeuge für die Bildgebung von lebenden Zellen . Annu. Rev. Physiol. 79, 93-117. (doi:10.1146/annurev-physiol-022516-034055) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Hormeno S, Ibarra B, Chichon FJ, Habermann K, Lange BM, Valpuesta JM, Carrascosa JL, Arias-Gonzalez JR

. 2009 Die Manipulation einzelner Zentrosomen enthüllt die elektrische Ladung und die damit verbundene dynamische Struktur . Biophys. J. 97, 1022-1030. (doi:10.1016/j.bpj.2009.06.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2002 Live Cell Imaging: Ansätze zur Untersuchung der Proteindynamik in lebenden Zellen . Zellstruktur. Funktion 27, 333-334. (doi:10.1247/csf.27.333) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Reaktionsbasierte BODIPY-Sonden für die selektive Bio-Bildgebung . Koordin. Chem.-Nr. Rev. 354, 121-134. (doi:10.1016/j.ccr.2017.06.021) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2010 Anwendung von Sonden in der Bildgebung lebender Zellen . J. Epithel. Biol. Pharmacol. 3, 9. (doi:10.2174/1875044301003010040) Crossref, Google Scholar

Dufour P, Dufour S, Castonguay A, McCarthy N, De Koninck Y

. 2006 Zwei-Photonen-Laserscanning-Fluoreszenzmikroskopie für die funktionelle zelluläre Bildgebung: Vorteile und Herausforderungen oder ein Photon ist gut … aber zwei sind besser! Med. Wissenschaft 22, 837-844. (doi:10.1051/medsci/20062210837) Google Scholar

. 2006 Imaging der lebenden Pflanzenzelle. Pflanze J. 45, 573-598. (doi:10.1111/j.1365-313X.2006.02653.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

He MM, Han Z, Qiao J, Ngo LZ, Xiong MP, Zheng YG

. 2018 Eine bioorthogonale Anschalt-Fluoreszenzstrategie zum Nachweis der Lysin-Acetyltransferase-Aktivität . Chem.-Nr. Komm. 54, 5594-5597. (doi:10.1039/c8cc02987c) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Niu LY, Guan YS, Chen YZ, Wu LZ, Tung CH, Yang QZ

. 2012 BODIPY-basierter ratiometrischer Fluoreszenzsensor zum hochselektiven Nachweis von Glutathion gegenüber Cystein und Homocystein . Marmelade. Chem.-Nr. Soz. 134, 18 928-18 931. (doi:10.1021/ja309079f) Crossref, ISI, Google Scholar

2013 Ultrasensitive fluoreszierende Proteine ​​zur Abbildung neuronaler Aktivität . Natur 499, 295-300. (doi:10.1038/nature12354) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Du JJ, Gu QY, Chen JY, Fan JL, Peng XJ

. 2018 Eine neuartige Fluoreszenzsonde zur ratiometrischen Proteinerkennung basierend auf intramolekularem Ladungstransfer. Sensoren betätigen. B Chem.-Nr. 265, 204-210. (doi:10.1016/j.snb.2018.02.176) Crossref, ISI, Google Scholar

Baldridge A, Solntsev KM, Song C, Tanioka T, Kowalik J, Hardcastle K, Tolbert LM

. 2010 Hemmung der Verdrillung eines grün fluoreszierenden proteinähnlichen Chromophors durch Metallkomplexierung . Chem.-Nr. Komm. 46, 5686-5688. (doi:10.1039/b927313a) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kang DH, Gho YS, Suh MK, Kang CH

. 2002 Hochempfindlicher und schneller Proteinnachweis mit Coomassie Brillantblau in der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Stier. Koreanisch Chem. Soz. 23, 1511-1512. (doi:10.5012/bkcs.2002.23.11.1511) Crossref, ISI, Google Scholar

Choi JK, Chae HZ, Hwang SY, Choi HI, Jin LT, Yoo GS

. 2004 Schnell sichtbare Farbstofffärbung von Proteinen in ein- und zweidimensionalen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen, kompatibel mit matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie. Elektrophorese 25, 1136-1141. (doi:10.1002/elps.200305776) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Neuhoff V, Arold N, Taube D, Ehrhardt W

. 1988 Verbesserte Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen, einschließlich isoelektrisch fokussierender Gele mit klarem Hintergrund bei Nanogramm-Empfindlichkeit unter Verwendung von Coomassie Brilliant Blue G-250 und R-250. Elektrophorese 9, 255-262. (doi:10.1002/elps.1150090603) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Dong WH, Wang TY, Wang F, Zhang JH

. 2011 Einfache, zeitsparende Farbstofffärbung von Proteinen für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Coomassie-Blau . Plus eins 6, e22394. (doi:10.1371/journal.pone.0022394) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Boisvert FM, van Koningsbruggen S, Navascues J, Lamond AI

. 2007 Der multifunktionale Nukleolus . Nat. Pfr. Mol. Zelle. Biol. 8, 574-585. (doi:10.1038/nrm2184) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Auf- und Abbau des Nukleolus während des Zellzyklus. Kern 2, 189-194. (doi:10.4161/nucl.2.3.16246) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Der Nukleolus . Kalter Frühlingshafen. Perspektive. Biol. 3, a000638. (doi:10.1101/cshperspect.a000638) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Sirri V, Urcuqui-Inchima S, Roussel P, Hernandez-Verdun D

. 2008 Nucleolus: der faszinierende Kernkörper . Histochem. Zellbiol. 129, 13-31. (doi:10.1007/s00418-007-0359-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1975 Offizielle Analysemethoden . Washington, DC: Verband der offiziellen analytischen Chemiker. Google Scholar

. 2008 Handbuch für den Kjeldahl-Aufschluss: eine aktuelle Überprüfung der klassischen Methode mit Verbesserungen von Foss . Hilleroed, Dänemark: Foss. Google Scholar


Die Techniken und Vorbereitung der Zellfärbung hängen von der Art der verwendeten Färbung und Analyse ab. Zur Vorbereitung einer Probe können eines oder mehrere der folgenden Verfahren erforderlich sein:

  • Durchlässigkeit - Behandlung von Zellen, im Allgemeinen mit einem milden Tensid, das die Zellmembranen auflöst, damit größere Farbstoffmoleküle in das Zellinnere eindringen können.
  • Fixierung – dient dazu, die Zell- oder Gewebemorphologie durch den Herstellungsprozess zu "fixieren" oder zu erhalten. Dieser Prozess kann mehrere Schritte umfassen, aber die meisten Fixierungsverfahren beinhalten die Zugabe eines chemischen Fixiermittels, das chemische Bindungen zwischen Proteinen herstellt, um deren Steifigkeit zu erhöhen. Übliche Fixiermittel sind Formaldehyd, Ethanol, Methanol und/oder Pikrinsäure.
  • Montage - beinhaltet das Anbringen von Proben an einem Mikroskop-Objektträger aus Glas zur Beobachtung und Analyse. Zellen können entweder direkt auf den Objektträger gezüchtet werden oder lose Zellen können unter Verwendung einer sterilen Technik auf einen Objektträger aufgebracht werden. Dünne Schnitte (Scheiben) von Material wie Gewebe können zur Beobachtung auch auf einen Objektträger aufgebracht werden.
  • Färbung - Auftragen einer Färbung auf eine Probe, um Zellen, Gewebe, Komponenten oder Stoffwechselprozesse zu färben. Dieser Vorgang kann das Eintauchen der Probe (vor oder nach dem Fixieren oder Montieren) in eine Farbstofflösung und das anschließende Spülen und Beobachten der Probe unter einem Mikroskop beinhalten.Einige Farbstoffe erfordern die Verwendung eines Beizmittels, einer chemischen Verbindung, die mit dem Fleck reagiert, um einen unlöslichen, farbigen Niederschlag zu bilden. Der Beizfleck bleibt auf/in der Probe, wenn überschüssige Farbstofflösung weggewaschen wird.

Zellfärbungsprotokoll für die Mikroskopie

Mikroskopie bezieht sich auf die Praxis, bei der ein Mikroskop verwendet wird, um kleine Strukturen zu beobachten, die mit bloßem Auge nicht sichtbar sind, und oft ist eine Zellfärbung erforderlich, da Strukturen aufgrund unzureichenden Kontrasts schwer zu erkennen sind.

Die Zellfärbung ist eine Technik, die hauptsächlich verwendet wird, um den Kontrast zu erhöhen, indem die Farbe einiger der beobachteten Teile der Struktur geändert wird, um eine klarere Sicht zu ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von Färbungen, die in der Mikroskopie verwendet werden können.

Zunächst kann die Färbung in-vivo oder in-vitro erfolgen. Der Unterschied zwischen diesen besteht darin, dass sich die In-vivo-Färbung auf die Färbung eines noch lebenden biologischen Materials bezieht, während sich die In-vitro-Färbung auf eine Färbetechnik bezieht, bei der das biologische Material nicht lebend ist.

Im Folgenden sind gängige Flecken aufgeführt, die Techniken, Vorbereitungen und Verfahren für jeden erklären:

Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

Dies sind zwei Farbstoffe, die bei der Untersuchung dünner Schnitte von biologischem Gewebe verwendet werden. Kontrast wird durch die Färbungen erzeugt, bei denen Hämatoxylin die Kerne blau färbt, während Eosin das Zytoplasma sowie andere Teile rosa oder rot färbt.

1- Messen Sie 10 Gramm Hämatoxylin-Kristalle 500 ml Wasser (70-80 Grad Celsius) und mischen Sie, um es vollständig zu verdünnen

2- In einem separaten Kolben 20 Gramm Alaun abmessen und mit 500 ml heißem Leitungswasser (70-80 Grad) mischen.

3- Mischen Sie die beiden Mischungen zusammen (1 und 2)

Während Alaun das Beizmittel ist, verhindert Thymol das Pilzwachstum.

5- Die Mischung wird dann eine Woche lang in einem durchsichtigen Kolben vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt aufbewahrt. Dieser wird mit einem Papiertuch abgedeckt, das eine Luftzirkulation ermöglicht (Frühreifung). Die Lösung wird dann in einen dunklen Kolben gegeben, nach einer Woche dicht verschlossen und 3 Wochen dunkel gelagert. (späte Reifung)

1- Messen Sie 10 Gramm Eosinkristalle und fügen Sie sie hinzu, um 1000 ml heißes Leitungswasser (70-80 Grad) zu mischen. Dies sollte zum Verdünnen gemischt und in einem dunklen Kolben aufbewahrt werden. Dieser kann direkt verwendet werden.

1- Ein rehydratisierter Schnitt wird 20 bis 40 Minuten in einer Hämatoxylinlösung gefärbt

2- Der Schnitt wird dann etwa 3 Minuten in Leitungswasser gewaschen, bis er blau wird.

3- Der Schnitt wird in 70 Prozent Ethanol differenziert, das etwa 5 Sekunden lang 1 Prozent HCL enthält, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und den Kern austreten zu lassen.

Dieser wird dann in Leitungswasser gewaschen,

5- 10 Minuten mit Eosin färben,

6- Dann etwa 1 bis 5 Minuten in Leitungswasser waschen,

7- Dehydration, klar und auf einem Gestell montieren

Hämatoxylin-Eosin-Färbung Kaposi-Sarkom-Läsion - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Papanicolaou-Färbung

Dies wird auch als Pap-Färbung oder Pap-Abstrich bezeichnet. Es dient der Untersuchung von Zellproben, die aus Körperflüssigkeiten gewonnen wurden.

Die Technik beinhaltet die Kombination von Chemikalien, die Folgendes umfassen:

Ö Hellgrün SF gelblich,

Die Differenzierungslösung ACCUMATE ist einsatzbereit. Ein Ersatz von Scotts Leitungswasser wird durch Mischen eines Teils von Scotts Leitungswasserersatzkonzentrat mit 9 Teilen entionisiertem Wasser hergestellt. Anschließend werden die Reagenzien des Papanicolaou-Färbesystems vor der Verwendung gefiltert.

1- Fixieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in Essig-Fixiermittel.

2- Absoluter Alkohol für zwei Minuten,

3- 70 Prozent Alkohol für 2 Minuten,

4- in 50 Prozent für 2 Minuten

5- Leitungswasser für 2 Minuten,

6- tief in Hämatoxylin für 4 Minuten,

7- Kurz in Leitungswasser spülen,

8- Etwa 5 Sekunden lang in saurem Alkohol differenzieren,

10- Zweimal mit absolutem Alkohol entwässern,

11- 10 Sekunden lang orange G färben,

12- Zweimal in absolutem Alkohol spülen

13- Zwei Minuten in E.A 50 färben,

14- Zweimal in absolutem Alkohol färben,

15- dreimal in Xylol klären,

16- Montieren Sie den Objektträger dreimal auf Xylol,

ein) Vorhandensein eines Psammoma-Körpers ohne atypische Zellen im Zervikovaginalabstrich (Papanicolaou-Färbung, 200×) B) Seröses ovarielles Zystoadenofibrom mit parietalen Psammomkörperchen (Hämatoxylin und Eosin, 100×).

Pusiol et al. CytoJournal 2008 5:7

Saures und basisches Fuchsin Fleck

Saures Fuchsin ist ein magentaroter Säurefarbstoff, der hauptsächlich für die Plasmafärbung verwendet wird, während basisches Fuchsin ein magentaroter basischer Farbstoff ist, der hauptsächlich zum Anfärben des Zellkerns verwendet wird.

Die Technik wird auch als säurefeste Färbung bezeichnet. Die säurefesten Bakterien haben eine wachsartige Substanz (Mykolsäure) an ihrer Zellwand, die sie für Färbeverfahren undurchlässig macht.

Der Begriff säurefest wird verwendet, da sie einer Entfärbung mit saurem Alkohol widerstehen. Carbolfuchsin , der primäre Farbstoff, enthält Phenol, das die Zellwand auflöst, während Wärme verwendet wird, um das Eindringen des Farbstoffs zu erhöhen.

Bei Verwendung von Alkohol zum Entfärben werden die Zellen entfärbt, außer bei säurefesten. Methylenblau wird als Gegenfärbung zu jeder entfärbten Zelle verwendet. Am Ende des Verfahrens bleiben säurefeste Zellen rot/rosa, während nicht säurefeste Zellen eine blaue Farbe behalten.

Herstellung von Karbolfuchsin durch Mischen von zwei Lösungen:

Lösung 1- 0,2 Gramm basisches Fuchsin und 10 ml 95-prozentiges Ethanol,

Lösung 2- 5 Gramm Phenol und 90 ml destilliertes Wasser,

1- Die Zellstofflarven zusammen tupfen, damit sich das Fruchtfleisch auf dem Objektträger verteilen und trocknen kann

2- Hitzefix durch mehrmaliges Flammen über einem Brenner,

3- Überflutung mit 0,2 Prozent Karbolfuchsin für etwa 30 Sekunden,

4- Waschen Sie den Fleck ab und trocknen Sie ihn vor der Untersuchung an der Luft

Eine Mikrofotografie von Mycobacterium smegmatis (rosa) und Micrococcus luteus (blau) 1000-fache Vergrößerung. Mycobacterium smegmatis ist säurefest, behält den Farbstoff Karbolfuchsin und erscheint dadurch rosa. Micrococcus luteus ist nicht säurefest, verliert beim Entfärben das Karbolfuchsin und wird mit Methylenblau gegengefärbt.

Bild von: http://inst.bact.wisc.edu

Wrights Fleck

Dies ist eine metachromatische Färbung vom Romanowsky-Typ, die durch Mischen eines speziell behandelten Methylenblau-Farbstoffs mit Eosin hergestellt wird.

Der saure Anteil der Färbung verbindet sich mit den basischen Bestandteilen der Zellen wie Hämoglobin, daher werden sie als eosinophil bezeichnet und sind rosa oder rot gefärbt.

Die sauren Bestandteile der Zelle, wie beispielsweise die Nukleinsäuren, nehmen hingegen den basischen Farbstoff auf und färben sich blau oder violett.

Der pH-Wert muss mit einem Puffer von 6,4 bis 6,7 kontrolliert werden, um eine schlechte Färbung zu vermeiden.

Ö Messen Sie 1,0 Gramm Wright-Färbepulver und 400 ml Methanol (Methylalkohol),

Ö Fügen Sie ein paar Glasperlen hinzu, um das Auflösen zu unterstützen, und fügen Sie das Ethanol zum Fleck hinzu.

Ö In Intervallen gut mischen, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat (durch Erwärmen in einem 37-C-Wasserbad, um das Auflösen zu unterstützen),

Ö Beschriften Sie die Flaschen und markieren Sie sie als entzündlich und giftig,

Ö Fest auflegen und bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern

1- Bereiten Sie eine Probefüllung vor und lassen Sie sie auf einem Objektträger trocknen.

2- Bereiten Sie drei Behälter vor und füllen Sie einen mit einem Schritt Wright’s Stain und die anderen beiden mit destilliertem Wasser.

3- Halten Sie den Fleck bei Nichtgebrauch fest bedeckt, um eine Verdunstung zu vermeiden (ersetzen Sie den Fleck immer, wenn er nicht mehr ausreichend ist).

4- Ersetzen Sie immer destilliertes Wasser, wenn sich schillernder Schaum auf der Oberfläche bildet oder wenn er blau wird.

5- Tauchen Sie den Objektträger 15 bis 20 Sekunden lang in den Fleck.

6- Tauchen Sie den Objektträger im zweiten Behälter für 15-45 Sekunden in destilliertes Wasser,

7- Tauchen Sie den Objektträger 25 Sekunden lang in Behälter 3 mit Quick Dips,

8- Wischen Sie die Rückseite der Folie ab,

9- Trocknen Sie den Objektträger in vertikaler Position auf der saugfähigen Oberfläche und vermeiden Sie das Beflecken des Ausstrichs.

10- Tragen Sie Öl auf, um es mikroskopisch zu untersuchen,

Diese Schritte sollten bei Knochenmarkausstrichen zweimal wiederholt werden.

1- Bereiten Sie die Probe vor und lassen Sie sie an der Luft trocknen,

2- Legen Sie den Objektträger auf ein Gestell,

3- Tragen Sie den einstufigen Wright-Fleck mit Tropfflaschen auf,

4- Warten Sie etwa 15-30 Sekunden und fügen Sie ähnliche Mengen destilliertes Wasser hinzu.

5- Gießen Sie die Mischung aus Färbemittel und Wasser vom Objektträger,

6- Tauchen Sie den Objektträger etwa 25 Sekunden lang in destilliertes Wasser mit Quick Dips,

7- Wischen Sie die Rückseite der Folie ab,

8- Trocknen Sie den Objektträger in vertikaler Position auf der absorbierenden Seite und vermeiden Sie ein Beflecken des Ausstrichs.

Diese Schritte sollten für Knochenmarkproben zweimal wiederholt werden.

Bild von: http://www.vetmed.vt.edu

Grammfärbung

Dies ist eine der gebräuchlichsten Färbetechniken.

Es wird hauptsächlich verwendet, um Bakterienarten entweder als grampositiv oder gramnegativ zu unterscheiden. Dies wird durch die chemischen Eigenschaften von Bakterienzellwänden erreicht, bei denen nach der Färbung unterschiedliche Farben angezeigt werden.

Diese Technik basiert auf der Tatsache, dass die Gram-positive Zellwand eine starke Anziehungskraft für Kristallviolett nach der Zugabe von Jod im Vergleich zur Zellwand von Gram-negativen hat.

Jod ist das Beizmittel und bildet mit Kristallviolett einen Komplex, der mit Ethylalkohol leicht von der gramnegativen Zellwand abgewaschen wird.

Zellfärbung in der Mikroskopie ist nützlich und notwendig, um die strukturellen Elemente Ihrer Probe/Probe hervorzuheben, die richtig beobachtet werden müssen. Es gibt noch andere, die MicroscopeMaster in Zukunft behandeln könnte, also setzen Sie ein Lesezeichen auf diese Seite und besuchen Sie erneut, um weitere Färbeinformationen zu sehen.

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Mallory F. B. A. M., M. D. S. D. Pathologische Technik. Philadelphia und London. W. B. Firma Sunders. Copyright, 1938, von W.B. Firma Sunders. Nachgedruckt Juni 1942 und September 1944. S. 70 und 9

Johnson PL, Klein MN: Auftragen von Papanicolaou-Färbung auf Paraffinschnitte. Fleckentechnologie 31:223, 1956

Delisle, G. und L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, Amerikanische Gesellschaft für Mikrobiologie, Washington, DC.

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Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen: Methoden und Analyse

Die Protein-Protein-Interaktion spielt eine Schlüsselrolle bei der Vorhersage der Proteinfunktion des Zielproteins und der Wirkstofffähigkeit von Molekülen. Die Mehrheit der Gene und Proteine ​​realisiert resultierende Phänotypfunktionen als eine Reihe von Wechselwirkungen. Die in vitro und in vivo Methoden wie Affinitätsreinigung, Y2H (Hefe-2-Hybrid), TAP (Tandem-Affinitätsreinigung) usw. haben ihre eigenen Einschränkungen wie Kosten, Zeit usw Funktion von Wirkstoffmolekülen. Daher, in silico Methoden, die sequenzbasierte Ansätze, strukturbasierte Ansätze, Chromosomennähe, Genfusion, in silico 2 hybride, phylogenetische Baum-, phylogenetische Profil- und Genexpressions-basierte Ansätze wurden entwickelt. Die Aufklärung von Proteininteraktionsnetzwerken trägt auch wesentlich zur Analyse von Signaltransduktionswegen bei. Jüngste Entwicklungen haben auch zum Aufbau von Netzwerken mit allen Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung von Computermethoden zur Signalübertragung und zur Identifizierung von Proteinkomplexen bei bestimmten Krankheiten geführt.

1. Einleitung

Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) steuern ein breites Spektrum biologischer Prozesse, einschließlich Zell-zu-Zell-Interaktionen und Stoffwechsel- und Entwicklungssteuerung [1]. Die Protein-Protein-Interaktion wird zu einem der Hauptziele der Systembiologie. Nichtkovalente Kontakte zwischen den Seitenketten der Reste sind die Grundlage für Proteinfaltung, Proteinassemblierung und PPI [2]. Diese Kontakte induzieren eine Vielzahl von Interaktionen und Assoziationen zwischen den Proteinen. Aufgrund ihrer gegensätzlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften können PPIs auf verschiedene Arten klassifiziert werden [3]. Aufgrund ihrer Wechselwirkungsoberfläche können sie homo- oder heterooligomer sein, gemessen an ihrer Stabilität, obligat oder nicht obligat, gemessen an ihrer Persistenz, sie können transient oder permanent sein [4]. Ein gegebener PPI kann eine Kombination dieser drei spezifischen Paare sein. Die transienten Interaktionen würden Signalwege bilden, während permanente Interaktionen einen stabilen Proteinkomplex bilden.

Typischerweise agieren Proteine ​​kaum als isolierte Spezies, während sie ihre Funktionen erfüllen in vivo [5]. Es hat sich gezeigt, dass über 80% der Proteine ​​nicht allein, sondern in Komplexen wirken [6]. Die umfangreiche Analyse authentifizierter Proteine ​​zeigt, dass die an denselben zellulären Prozessen beteiligten Proteine ​​immer wieder miteinander interagieren [7]. Die Untersuchung von PPIs ist auch wichtig, um die Proteinfunktion innerhalb der Zelle abzuleiten. Die Funktionalität nicht identifizierter Proteine ​​kann durch den Nachweis ihrer Wechselwirkung mit einem Protein vorhergesagt werden, dessen Funktion bereits bekannt ist. Die detaillierte Untersuchung von PPIs hat die Modellierung funktioneller Pfade beschleunigt, um die molekularen Mechanismen zellulärer Prozesse zu veranschaulichen [4]. Die Charakterisierung der Interaktionen von Proteinen in einem bestimmten Proteom wird phänomenal sein, um die Biochemie der Zelle herauszufinden [4]. Das Ergebnis von zwei oder mehr Proteinen, die mit einem bestimmten funktionellen Ziel interagieren, kann auf verschiedene Weise festgestellt werden. Die signifikanten Eigenschaften von PPIs wurden von Phizicky und Fields [8] hervorgehoben.

PPIs können (i) die kinetischen Eigenschaften von Enzymen modifizieren (ii) als allgemeiner Mechanismus wirken, um eine Substratkanalisierung zu ermöglichen (iii) eine neue Bindungsstelle für kleine Effektormoleküle konstruieren (iv) ein Protein inaktivieren oder unterdrücken (v) die Spezifität verändern eines Proteins für sein Substrat durch Wechselwirkung mit verschiedenen Bindungspartnern (vi) eine regulatorische Rolle entweder auf vorgelagerter oder nachgelagerter Ebene spielen.

Die Aufdeckung von Protein-Protein-Interaktionsinformationen hilft bei der Identifizierung von Wirkstoffzielen [9]. Studien haben gezeigt, dass Proteine ​​mit einer größeren Anzahl von Interaktionen (Hubs) unter anderem Enzymfamilien, Transkriptionsfaktoren und intrinsisch ungeordnete Proteine ​​umfassen können [10, 11]. Allerdings beinhalten PPI heterogene Prozesse und der Umfang ihrer Regulierung ist groß. Um ihre Bedeutung in der Zelle genauer zu verstehen, müssen verschiedene Interaktionen identifiziert und die Folgen der Interaktionen bestimmt werden [4].

In den letzten Jahren wurden PPI-Daten durch experimentelle Methoden mit garantiertem Hochdurchsatz wie Zwei-Hybrid-Systeme, Massenspektrometrie, Phagen-Display und Proteinchip-Technologie verbessert [4]. Aus diesen experimentellen Ressourcen wurden umfassende PPI-Netzwerke aufgebaut. Die umfangreiche Natur der PPI-Daten stellt jedoch eine Herausforderung für die Laborvalidierung dar. Die computergestützte Analyse von PPI-Netzwerken wird zunehmend zu einem obligatorischen Werkzeug, um die Funktionen unerforschter Proteine ​​zu verstehen. Derzeit ist die Protein-Protein-Interaktion (PPI) eines der Schlüsselthemen für die Entwicklung und den Fortschritt der modernen Systembiologie.

2. Klassifizierung von PPI-Nachweisverfahren

Die Methoden zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen werden kategorisch in drei Typen eingeteilt, nämlich: in vitro, in vivo, und in silico Methoden. In in vitro Techniken wird ein bestimmtes Verfahren in einer kontrollierten Umgebung außerhalb eines lebenden Organismus durchgeführt. Die in vitro Methoden zur PPI-Detektion sind Tandem-Affinitätsreinigung, Affinitätschromatographie, Coimmunpräzipitation, Protein-Arrays, Proteinfragment-Komplementation, Phagen-Display, Röntgenkristallographie und NMR-Spektroskopie. In in vivo Techniken wird ein bestimmter Vorgang am gesamten lebenden Organismus selbst durchgeführt. Die in vivo Methoden beim PPI-Nachweis sind Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H, Y3H) und synthetische Letalität. In silico Techniken werden auf einem Computer (oder) mittels Computersimulation durchgeführt. Die in silico Methoden beim PPI-Nachweis sind sequenzbasierte Ansätze, strukturbasierte Ansätze, Chromosomennähe, Genfusion, in silico 2 hybride, Spiegelbaum-, phylogenetische Baum- und Genexpressions-basierte Ansätze. Die schematische Einteilung ist in Tabelle 1 angegeben.

2.1. In vitro Techniken zur Vorhersage von Protein-Protein-Wechselwirkungen

TAP-Tagging wurde entwickelt, um PPIs unter den intrinsischen Bedingungen der Zelle zu untersuchen [12]. Gavinet al. versuchten zunächst die TAP-Tagging-Methode im Hochdurchsatz, um das Hefe-Interaktom zu analysieren [13]. Diese Methode basiert auf der doppelten Markierung des interessierenden Proteins an seinem chromosomalen Locus, gefolgt von einem zweistufigen Reinigungsprozess [14]. Proteine, die mit dem Zielprotein assoziiert bleiben, können dann durch SDS-PAGE [15] gefolgt von einer Massenspektrometrieanalyse [15] untersucht und identifiziert werden, wodurch der PPI-Mitarbeiter des ursprünglichen interessierenden Proteins identifiziert wird. Eine wichtige Dominanz des TAP-Taggings ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu identifizieren und die Aktivität von existierenden monomeren oder multimeren Proteinkomplexen zu testen in vivo [14]. Der TAP identifiziert bei Verwendung mit Massenspektroskopie (MS) Proteininteraktionen und Proteinkomplexe.

Der Vorteil der Affinitätschromatographie besteht darin, dass sie hochreaktiv ist, selbst schwächste Wechselwirkungen in Proteinen nachweisen kann und auch alle Probenproteine ​​gleichermaßen auf Wechselwirkung mit dem gekoppelten Protein in der Säule testet. Aufgrund der hohen Spezifität zwischen Proteinen treten jedoch auch falsch positive Ergebnisse in der Säule auf, obwohl diese nicht in das zelluläre System eingreifen. Daher können sich Proteinwechselwirkungsstudien nicht vollständig auf die Affinitätschromatographie verlassen und erfordern daher andere Methoden, um die erhaltenen Ergebnisse zu überprüfen und zu verifizieren.Die Affinitätschromatographie kann auch mit SDS-PAGE-Technik und Massenspektroskopie verbunden werden, um Hochdurchsatzdaten zu erzeugen.

Die Coimmunpräzipitation bestätigt Interaktionen unter Verwendung eines Ganzzellextrakts, bei dem Proteine ​​in ihrer nativen Form in einer komplexen Mischung zellulärer Komponenten vorliegen, die für erfolgreiche Interaktionen erforderlich sein können. Außerdem ermöglicht die Verwendung von eukaryotischen Zellen eine posttranslationale Modifikation, die für die Interaktion essentiell sein kann und die in prokaryotischen Expressionssystemen nicht auftreten würde.

Protein-Mikroarrays etablieren sich schnell als leistungsfähiges Mittel, um Proteine ​​zu erkennen, ihre Expressionsniveaus zu überwachen und Proteininteraktionen und -funktionen zu untersuchen. Ein Protein-Microarray ist ein Stück Glas, auf dem verschiedene Proteinmoleküle geordnet an verschiedenen Stellen angebracht sind [16]. Protein-Mikroarrays haben derzeit enorme Fortschritte und großes Interesse erfahren und sind zu einem der aktiven Bereiche der Biotechnologie geworden. Das Ziel der Protein-Microarray-Entwicklung ist eine effiziente und empfindliche Hochdurchsatz-Proteinanalyse, bei der eine große Anzahl von Bestimmungen parallel durch einen automatisierten Prozess durchgeführt werden.

Der Proteinfragment-Komplementationsassay ist ein weiteres Verfahren der Proteomik zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in biologischen Systemen. Protein-Fragment Complementation Assays (PCAs) sind eine Familie von Assays zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs), die eingeführt wurden, um einfache und direkte Methoden zur Untersuchung von PPIs in jeder lebenden Zelle, jedem mehrzelligen Organismus oder in vitro [17]. PCAs können verwendet werden, um PPI zwischen Proteinen jedes Molekulargewichts nachzuweisen und auf ihren endogenen Niveaus exprimiert zu werden. Die beiden Möglichkeiten für die Proteinidentifizierung mittels Massenspektroskopie sind Peptid-Fingerprinting und Shotgun-Proteomik [18]. Für das Peptid-Fingerprinting wird der eluierte Komplex unter Verwendung von SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel ist entweder Coomassie-gefärbt oder Silber-gefärbt und Banden, die für die Testprobe einzigartig sind und hoffentlich ein einzelnes Protein enthalten, werden ausgeschnitten, enzymatisch verdaut und durch Massenspektrometrie analysiert. Die Masse dieser Peptide wird bestimmt und mit einer Peptiddatenbank abgeglichen, um das Quellprotein zu bestimmen. Das Gel liefert auch eine grobe Schätzung des Molekulargewichts des Proteins. Da nur eindeutige Banden ausgeschnitten werden, werden Hintergrundbanden nicht identifiziert. Reichlich vorhandene Hintergrundproteine ​​können Zielproteine ​​verdecken, während weniger häufig vorkommende Proteine ​​unter die Nachweisgrenzen durch Färben fallen können. Diese Methode funktioniert gut mit gereinigten Proben, die nur eine Handvoll Proteine ​​enthalten. Alternativ wird für die Shotgun-Proteomik das gesamte Eluat, das viele Proteine ​​enthält, verdaut. Schrotflinten-Proteomik ist derzeit die mächtigste Strategie zur Analyse solch komplizierter Mischungen.

Es gibt verschiedene Implementierungen der Phagen-Display-Methodik sowie verschiedene Anwendungen [19]. Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze ist der filamentöse Phagen M13. Die für das interessierende Protein kodierende DNA wird in das Gen ligiert, das für eines der Hüllproteine ​​des Virions kodiert. Normalerweise folgt dem Prozess eine rechnerische Identifizierung potenzieller Interaktionspartner und ein Hefe-Zwei-Hybrid-Validierungsschritt, aber die Methode ist neu geboren [20].

Die Röntgenkristallographie [21] ist im Wesentlichen eine Form der sehr hochauflösenden Mikroskopie, die die Visualisierung von Proteinstrukturen auf atomarer Ebene ermöglicht und das Verständnis der Proteinfunktion verbessert. Konkret zeigt es, wie Proteine ​​mit anderen Molekülen interagieren und die Konformationsänderungen bei Enzymen. Mit diesen Informationen können wir auch neuartige Medikamente entwickeln, die auf ein bestimmtes Zielprotein abzielen.

In der jüngeren Vergangenheit haben die Forscher Interesse an der Analyse der Protein-Protein-Interaktion durch Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) gezeigt [21]. Die Lage der Bindungsschnittstelle ist ein entscheidender Aspekt bei der Analyse von Proteinwechselwirkungen. Grundlage der NMR-Spektroskopie ist, dass magnetisch aktive Kerne, die durch ein starkes Magnetfeld ausgerichtet werden, elektromagnetische Strahlung mit charakteristischen Frequenzen absorbieren, die von ihrer chemischen Umgebung bestimmt werden [22, 23].

2.2. In vivo Techniken zur Vorhersage von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Y2H-Methode ist eine in vivo Methode zum Nachweis von PPIs [24]. Im Y2H-Assay sind zwei Proteindomänen erforderlich, die zwei spezifische Funktionen haben: (i) eine DNA-Bindungsdomäne (DBD), die die Bindung an DNA unterstützt, und (ii) eine Aktivierungsdomäne (AD), die für die Aktivierung der DNA-Transkription verantwortlich ist. Beide Domänen werden für die Transkription eines Reportergens benötigt [25]. Die Y2H-Analyse ermöglicht die direkte Erkennung von PPI zwischen Proteinpaaren. Das Verfahren kann jedoch eine große Anzahl falsch positiver Wechselwirkungen hervorrufen. Andererseits können viele echte Wechselwirkungen mit dem Y2H-Assay nicht verfolgt werden, was zu falsch negativen Ergebnissen führt. In einem Y2H-Assay müssen die interagierenden Proteine ​​im Zellkern lokalisiert sein, da Proteine, die mit geringerer Wahrscheinlichkeit im Zellkern vorhanden sind, aufgrund ihrer Unfähigkeit, Reportergene zu aktivieren, ausgeschlossen werden. Proteine, die posttranslationale Modifikationen benötigen, um ihre Funktionen auszuführen, werden sich in einem Y2H-Experiment wahrscheinlich nicht normal verhalten oder interagieren. Wenn sich die Proteine ​​nicht in ihrer natürlichen physiologischen Umgebung befinden, falten sie sich möglicherweise nicht richtig, um zu interagieren [26]. Während des letzten Jahrzehnts wurde Y2H durch die Entwicklung neuer Hefestämme mit mehreren Reportergenen und neuen Expressionsvektoren angereichert, um die Transformation von Hefezellen mit Hybridproteinen zu erleichtern [27]. Andere weit verbreitete Techniken wie der Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET), der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) erfordern eine umfangreiche Instrumentierung. FRET verwendet zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung, um Proteininteraktionen vorherzusagen [28].

Synthetische Letalität ist eine wichtige Art von in vivo genetisches Screening, das versucht, die Mechanismen zu verstehen, die eine phänotypische Stabilität trotz genetischer Variation, Umweltveränderungen und zufälligen Ereignissen wie Mutationen ermöglichen. Diese Methodik erzeugt Mutationen oder Deletionen in zwei oder mehr Genen, die allein lebensfähig sind, aber unter bestimmten Bedingungen in Kombination tödlich sein können [29–33]. Verglichen mit den Ergebnissen, die in den oben genannten Verfahren erhalten wurden, erfordern die durch synthetische Letalität nachgewiesenen Beziehungen keine physikalische Wechselwirkung zwischen den Proteinen. Daher bezeichnen wir diese Art von Beziehungen als funktionale Interaktionen.

2.3. In-Silico-Methoden zur Vorhersage von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H) und andere in vitro und in vivo Ansätze führten zu einer groß angelegten Entwicklung nützlicher Werkzeuge zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) zwischen bestimmten Proteinen, die in verschiedenen Kombinationen auftreten können. Die durch diese Ansätze generierten Daten sind jedoch möglicherweise nicht zuverlässig, da mögliche PPIs nicht verfügbar sind. Um den Gesamtzusammenhang potenzieller Interaktionen zu verstehen, ist es besser, Ansätze zu entwickeln, die die gesamte Bandbreite möglicher Interaktionen zwischen Proteinen vorhersagen [4].

Eine Vielzahl von in silico Es wurden Methoden entwickelt, um die Wechselwirkungen zu unterstützen, die durch experimentelle Ansätze nachgewiesen wurden. Die Berechnungsmethoden für in silico Vorhersage umfassen sequenzbasierte Ansätze, strukturbasierte Ansätze, Chromosomennähe, Genfusion, in silico 2 Hybrid, Spiegelbaum, phylogenetischer Baum, Genontologie und auf Genexpression basierende Ansätze. Die Liste aller Webserver von in silico Die Methoden sind in Tabelle 2 aufgeführt.

2.3.1. Strukturbasierte Vorhersageansätze

Die Idee hinter der strukturbasierten Methode besteht darin, die Protein-Protein-Interaktion vorherzusagen, wenn zwei Proteine ​​eine ähnliche Struktur aufweisen. Wenn also zwei Proteine ​​A und B miteinander interagieren können, kann es zwei andere Proteine ​​geben

deren Strukturen denen der Proteine ​​A und B ähneln, dann wird impliziert, dass Proteine ​​auch miteinander interagieren können. Aber die meisten Proteine ​​haben möglicherweise keine bekannten Strukturen. Der erste Schritt für diese Methode besteht darin, die Struktur des Proteins anhand seiner Sequenz zu erraten. Dies kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Die PDB-Datenbank bietet Forschern nützliche Werkzeuge und Informationsressourcen, um die Struktur für ein Abfrageprotein aufzubauen [34]. Lu et al. [35] haben 2.865 Protein-Protein-Wechselwirkungen in Hefe gemacht und 1.138 Wechselwirkungen wurden im DIP bestätigt [36].

Kürzlich haben Hosur et al. [37] entwickelten einen neuen Algorithmus zum Ableiten von Protein-Protein-Wechselwirkungen mithilfe eines strukturbasierten Ansatzes. Der Coev2Net-Algorithmus, der ein dreistufiger Prozess ist, umfasst die Vorhersage der Bindungsschnittstelle, die Bewertung der Kompatibilität der Schnittstelle mit einem auf Schnittstellenkoevolution basierenden Modell und die Bewertung des Konfidenzwerts für die Interaktion [37]. Der Algorithmus bei Anwendung auf binäre Proteininteraktionen hat die Leistung des Algorithmus gegenüber bestehenden Methoden gesteigert [38]. Zhang et al. [39] haben dreidimensionale Strukturinformationen verwendet, um PPIs mit einer Genauigkeit und Abdeckung vorherzusagen, die Vorhersagen auf der Grundlage nichtstruktureller Beweise überlegen ist.

2.3.2. Sequenzbasierte Vorhersageansätze

Vorhersagen von PPIs wurden durch Integrieren von Nachweisen bekannter Interaktionen mit Informationen bezüglich sequenzieller Homologie durchgeführt. Dieser Ansatz basiert auf dem Konzept, dass eine Interaktion in einer Art verwendet werden kann, um auf die Interaktion in anderen Arten zu schließen. Allerdings haben Hosur et al. [37] entwickelten einen neuen Algorithmus zur Vorhersage von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung eines Threading-basierten Ansatzes, der Sequenzen als Eingabe verwendet. Der Algorithmus iWARP (Interface Weighted RAPtor), der vorhersagt, ob zwei Proteine ​​interagieren, indem er einen neuartigen linearen Programmieransatz für die Schnittstellenausrichtung mit einem Boosting-Klassifikator [37] für die Interaktionsvorhersage kombiniert. Guilherme Valente et al. führte eine neue Methode namens Universal ein In Silizium Predictor of Protein-Protein Interactions (UNISPPI), basierend auf Primärsequenzinformationen zur Klassifizierung von Proteinpaaren als wechselwirkende oder nicht wechselwirkende Proteine ​​[40]. Kernel-Methoden sind hybride Methoden, die eine Kombination von Eigenschaften wie Proteinsequenzen, Gen-Ontologien usw. verwenden [41]. Es gibt jedoch zwei verschiedene Verfahren unter sequenzbasierten Kriterien.

(1) Ortholog-basierter Ansatz. Der Ansatz zur sequenzbasierten Vorhersage besteht darin, die Annotation von einer funktionell definierten Proteinsequenz auf die Zielsequenz basierend auf der Ähnlichkeit zu übertragen. Die Annotation durch Ähnlichkeit basiert auf der homologen Natur des Abfrageproteins in den annotierten Proteindatenbanken unter Verwendung eines paarweisen lokalen Sequenzalgorithmus [42]. Mehrere Proteine ​​eines untersuchten Organismus können signifikante Ähnlichkeiten mit Proteinen aufweisen, die an der Komplexbildung in anderen Organismen beteiligt sind.

Der Vorhersageprozess beginnt mit dem Vergleich eines Sondengens oder -proteins mit diesen annotierten Proteinen in anderen Spezies. Wenn das Sondengen oder -protein eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz eines Gens oder Proteins mit bekannter Funktion in einer anderen Spezies aufweist, wird angenommen, dass das Sondengen oder -protein entweder die gleiche Funktion oder ähnliche Eigenschaften hat. Die meisten Untereinheiten von Proteinkomplexen wurden auf diese Weise annotiert. Wenn die Funktion von einem charakterisierten Protein auf ein uncharakterisiertes Protein übertragen wird, sollten orthologe und paraloge Konzepte angewendet werden. Orthologe sind die Gene in verschiedenen Arten, die sich durch Artbildung aus einem gemeinsamen Vorfahren-Gen entwickelt haben. Im Gegensatz dazu beziehen sich Paraloge normalerweise auf die Gene, die durch Duplikation innerhalb eines Genoms miteinander verbunden sind [43]. Im weiteren Sinne behalten Orthologe die Funktionalität im Laufe der Evolution, während Paraloge neue Funktionen erhalten können. Wenn also zwei Proteine ​​– A und B – miteinander interagieren, interagieren wahrscheinlich auch die Orthologe von A und B in einer neuen Spezies miteinander.

(2) Domänenpaarbasierter Ansatz. Eine Domäne ist eine eigenständige, kompakte und stabile Proteinstruktureinheit, die sich unabhängig von anderen solchen Einheiten faltet. Aber meistens werden Domänen als unterschiedliche Regionen der Proteinsequenz definiert, die im Evolutionsprozess hochgradig konserviert sind. Als einzelne strukturelle und funktionelle Einheiten spielen Proteindomänen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Vorhersage der Proteinstrukturklasse, der Vorhersage der subzellulären Position von Proteinen, der Vorhersage des Membranproteintyps und der Vorhersage von Enzymklassen und -unterklassen.

Herkömmlicherweise werden Proteindomänen für die Grundlagenforschung und auch für das strukturbasierte Wirkstoffdesign verwendet. Darüber hinaus sind Domänen direkt an der intermolekularen Wechselwirkung beteiligt und müssen daher für die Protein-Protein-Wechselwirkung von grundlegender Bedeutung sein. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Domänen-Domänen-Interaktionen (DDIs) aus verschiedenen Experimenten konsistenter sind als ihre entsprechenden PPIs [44]. Daher ist es recht zuverlässig, die Domänen und ihre Wechselwirkungen zur Vorhersage der Protein-Protein-Interaktionen zu verwenden und umgekehrt [45].

2.3.3. Chromosomen-Nähe/Gen-Nachbarschaft

Mit der ständig steigenden Zahl der vollständig sequenzierten Genome hat der globale Kontext von Genen und Proteinen in den vollständigen Genomen den Forschern die angereicherten Informationen geliefert, die für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen erforderlich sind. Es ist allgemein bekannt, dass die funktionell verwandten Proteine ​​dazu neigen, sehr eng in Regionen auf den Genomen in Prokaryonten organisiert zu sein, wie etwa Operons, den Clustern funktionell verwandter Gene, die als eine einzelne mRNA transkribiert werden. Wenn die Nachbarschaftsbeziehung über mehrere Genome hinweg konserviert wird, ist sie relevanter, um die potentielle Möglichkeit der funktionellen Verknüpfung zwischen den Proteinen, die von den verwandten Genen kodiert werden, zu implizieren. Und dieser Beweis wurde verwendet, um die funktionelle Assoziation der entsprechenden Proteine ​​zu untersuchen. Diese Beziehung wurde durch die experimentellen Ergebnisse bestätigt und zeigte sich unabhängiger von der relativen Genorientierung. Kürzlich wurde festgestellt, dass zwischen den benachbarten bidirektionalen Genen entlang des Chromosoms eine funktionelle Verbindung besteht [46]. Interessanterweise besteht die Beziehung zwischen benachbarten bidirektional transkribierten Genen mit konservierter Genorientierung in den meisten Fällen darin, dass ein Gen für einen Transkriptionsregulator kodiert und das andere zu einem nichtregulatorischen Protein gehört [47]. Es hat sich gezeigt, dass die meisten Regulatoren die Transkription des vom Taucher schonend transkribierten Zielgens/Operons kontrollieren und auch automatisch ihre eigene Biosynthese regulieren. Diese Beziehung bietet eine weitere Möglichkeit, die Zielprozesse und regulatorischen Merkmale für Transkriptionsregulatoren vorherzusagen. Einer der Tücken dieser Methode ist, dass sie direkt für das Bakteriengenom geeignet ist, da das benachbarte Gen in den Bakterien konserviert ist.

2.3.4. Genfusion

Die Genfusion, die oft als Rosetta-Stone-Methode bezeichnet wird, basiert auf dem Konzept, dass einige der Einzeldomänen-enthaltenden Proteine ​​in einem Organismus in anderen Organismen zu einem Multidomänen-Protein fusionieren können [48, 49]. Dieses Domänenfusionsphänomen zeigt die funktionelle Assoziation für diese separaten Proteine ​​an, die wahrscheinlich einen Proteinkomplex bilden. Es konnte gezeigt werden, dass Fusionsereignisse besonders häufig bei den am Stoffwechselweg teilnehmenden Proteinen auftreten [50, 51]. Diese Methode kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen vorherzusagen, indem Informationen über Domänenanordnungen in verschiedenen Genomen verwendet werden. Sie kann jedoch nur auf solche Proteine ​​angewendet werden, in denen die Domänenanordnung existiert.

2.3.5. In Silico Two-Hybrid (I2h)

Die Methode basiert auf der Annahme, dass interagierende Proteine ​​einer Koevolution unterliegen sollten, um die Proteinfunktion zuverlässig zu erhalten. Mit anderen Worten, wenn sich einige der Schlüsselaminosäuren in einem Protein ändern, sollten die verwandten Aminosäuren in dem anderen Protein, das mit dem mutierten Gegenpartner interagiert, ebenfalls die Zwangsmutationen vornehmen. Während der Analysephase werden die gemeinsamen Genome, die diese beiden Proteine ​​enthalten, durch mehrere Sequenzvergleiche identifiziert und ein Korrelationskoeffizient für jedes Paar von Resten im selben Protein und zwischen den Proteinen berechnet [52]. Dementsprechend gibt es drei verschiedene Sets für die Paare: zwei aus den Intraprotein-Paaren und eine aus den Interprotein-Paaren. Die Protein-Protein-Interaktion wird aus der Differenz aus der Korrelationsverteilung zwischen den Interaktionspartnern und den einzelnen Proteinen abgeleitet. Da die I2h-Analyse auf der Vorhersage der physikalischen Nähe zwischen Restpaaren der beiden einzelnen Proteine ​​basiert, zeigt das Ergebnis dieser Methode automatisch die mögliche physikalische Wechselwirkung zwischen den Proteinen an.

2.3.6. Stammbaum

Ein weiteres wichtiges Verfahren zum Nachweis der Interaktion zwischen den Proteinen ist der phylogenetische Baum. Der phylogenetische Baum gibt die Evolutionsgeschichte des Proteins wieder. Die Mirror-Tree-Methode sagt Protein-Protein-Interaktionen unter der Annahme voraus, dass die interagierenden Proteine ​​aufgrund der Koevolution durch die Interaktion eine Ähnlichkeit im molekularen phylogenetischen Baum aufweisen [53]. Das zugrundeliegende Prinzip der Methode ist, dass sich die Koevolution zwischen den interagierenden Proteinen aus dem Ähnlichkeitsgrad aus den Distanzmatrizen entsprechender phylogenetischer Bäume der interagierenden Proteine ​​widerspiegeln lässt [54]. Die den beiden Proteinen gemeinsamen Organismen werden aus den multiplen Sequenz-Alignments (MSA) ausgewählt und die Ergebnisse werden verwendet, um die entsprechende Distanzmatrix für jedes Protein zu konstruieren. Die BLAST-Scores könnten auch verwendet werden, um die Matrizen zu füllen. Dann wird die lineare Korrelation zwischen diesen Distanzmatrizen berechnet. Hohe Korrelationswerte zeigen die Ähnlichkeit zwischen den phylogenetischen Bäumen an und daher wird angenommen, dass die Proteine ​​die Interaktionsbeziehung aufweisen. Die MirrorTree-Methode wird verwendet, um die Koevolutionsbeziehung zwischen Proteinen zu erkennen, und die Ergebnisse werden verwendet, um die Möglichkeit ihrer physikalischen Interaktion abzuleiten.

2.3.7. Phylogenetisches Profil

Die Idee für diese Methode ist, dass die funktionell verknüpften Proteine ​​während der Evolution eines Organismus dazu neigen, zusammen zu existieren [55]. Mit anderen Worten, wenn zwei Proteine ​​eine funktionelle Verknüpfung in einem Genom aufweisen, besteht ein starker Druck auf sie, während des Evolutionsprozesses zusammen vererbt zu werden [51]. Somit werden ihre entsprechenden Orthologe in anderen Genomen erhalten oder fallengelassen. Daher können wir im phylogenetischen Profil das Vorhandensein oder Fehlen (Ko-Auftreten) von Proteinen nachweisen. Ein phylogenetisches Profil beschreibt das Vorkommen eines bestimmten Proteins in einer Reihe von Genomen: Wenn zwei Proteine ​​das gleiche phylogenetische Profil aufweisen, weist dies darauf hin, dass die beiden Proteine ​​die funktionelle Verknüpfung aufweisen. Um das phylogenetische Profil zu konstruieren, wird ein vorbestimmter Schwellenwert von BLASTP

-Wert wird verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der homologischen Proteine ​​auf dem Zielgenom mit den Quellgenomen nachzuweisen. Diese Methode liefert vielversprechende Ergebnisse beim Nachweis der funktionellen Verknüpfung zwischen den Proteinen und ordnet gleichzeitig die Funktionen Abfrageproteinen zu. Obwohl das phylogenetische Profil ein großes Potenzial für den Aufbau des funktionellen Verknüpfungsnetzwerks auf der Ebene des vollständigen Genoms gezeigt hat, sollten die folgenden zwei Fallstricke erwähnt werden: Zum einen basiert diese Methode auf vollständigen Genomsequenzen und zum anderen ist die funktionelle Verknüpfung zwischen Proteinen wird durch ihr phylogenetisches Profil nachgewiesen, so dass es schwierig ist, das Verfahren für diejenigen essentiellen Proteine ​​in der Zelle anzuwenden, bei denen kein Unterschied zum phylogenetischen Profil festgestellt werden kann. Auch wenn die zunehmende Anzahl im Quellgenomsatz die Vorhersagegenauigkeit verbessern kann, kann es für dieses Verfahren eine Obergrenze geben.

Viele genomische Ereignisse tragen zum Rauschen während der Koevolution bei, wie etwa die Genduplikation oder der mögliche Verlust von Genfunktionen im Laufe der Evolution, die das phylogenetische Profil einzelner Gene verfälschen könnten. Auf phylogenetischem Profil basierende Methoden erbrachten nur bei Prokaryoten eine zufriedenstellende Leistung, nicht jedoch bei Eukaryoten [56].

2.3.8. Genexpression

Das Verfahren nutzt den Vorteil des Hochdurchsatznachweises des gesamten Gentranskriptionsniveaus in einem Organismus. Genexpression bedeutet die Quantifizierung des Ausmaßes, in dem ein bestimmtes Gen in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und Zeitintervallen exprimiert wird. Durch Anwendung der Clustering-Algorithmen können verschiedene Expressionsgene entsprechend ihrem Expressionsniveau gruppiert werden, und die resultierende Genexpression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen kann helfen, die funktionellen Beziehungen der verschiedenen Gene aufzuklären. Es wurde auch viel geforscht, um die Beziehung zwischen Gen-Coexpression und Proteininteraktion zu untersuchen [57]. Basierend auf den Hefe-Expressionsdaten und Proteomdaten ist es wahrscheinlicher, dass Proteine ​​aus den Genen, die zu den gemeinsamen Expressionsprofil-Clustern gehören, miteinander interagieren als Proteine ​​aus den Genen, die zu verschiedenen Clustern gehören. In anderen Studien wurde bestätigt, dass benachbarte Gene dazu neigen, sowohl in den Eukaryoten als auch in den Prokaryoten exprimiert zu werden. Das Konzept der Gen-Coexpression ist ein indirekter Weg, um auf die Proteininteraktion zu schließen, was darauf hindeutet, dass es für den genauen Nachweis von Proteininteraktionen möglicherweise nicht geeignet ist. Als ergänzender Ansatz kann die Gen-Coexpression jedoch verwendet werden, um Interaktionen zu validieren, die aus anderen experimentellen Methoden generiert wurden.

3. Vergleich von Protein-Protein-Interaktionsmethoden

Jedes der obigen Verfahren wurde angewendet, um die Protein-Protein-Interaktion sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten von ihnen besser zu den Prokaryoten passen als zu den Eukaryoten [14]. Der signifikante Anstieg der Abdeckung dieser Studien in den letzten Jahren könnte hauptsächlich auf die Zunahme der Zahl der entschlüsselten Genome zurückzuführen sein. Denn je mehr Genome in der Studie verwendet werden, desto höher ist die Abdeckung, die die Methoden erreichen können. Mit der Anhäufung von vollständig sequenzierten Genomen wird erwartet, dass der Informationsgehalt im Referenzgenomsatz zunehmen wird. Dementsprechend würde die Vorhersagegenauigkeit zunehmen, wenn mehr Genome in die Studie einbezogen werden. Es ist zu erwarten, dass mit immer mehr verfügbaren Genomen in Zukunft das Vorhersagepotenzial verbessert wird und die entsprechenden kombinierten Methoden eine höhere Abdeckung und Genauigkeit erhalten. Zu erwähnen ist, dass die Wahl des Standards, der für die Bewertung der Methoden verwendet wird, einen großen Einfluss auf die Abdeckung und Genauigkeit hat. Neben der Schlüsselwortwiederherstellung Operon und Swiss-Prot, die in den obigen Studien verwendet wurden, wurde das KEGG als Standard in der Datenbank Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING) verwendet [58]. Es ist zu erwarten, dass die Vorhersageabdeckung und Genauigkeit für jede Methode unter verschiedenen Standards unterschiedlich sind. Offensichtlich weist die erreichte höchste Abdeckung für die Genreihenfolgemethode basierend auf dem Operonstandard darauf hin, dass die Methode stark mit dem Operon verwandt ist.

Jüngste technologische Fortschritte haben Hochdurchsatzmessungen von Protein-Protein-Interaktionen in der Zelle ermöglicht, wodurch Protein-Interaktionsnetzwerke für verschiedene Spezies in rasantem Tempo hergestellt werden. Bei Hochdurchsatzverfahren wie Hefe-Zwei-Hybrid, MS und Phagen-Display kam es jedoch zu hohen Rauschraten und falsch positiven Ergebnissen. Es gibt einige Verifikationsmethoden, um die Zuverlässigkeit dieser Interaktionen mit hohem Durchsatz zu ermitteln. Dies sind Expression Profile Reliability (EPR-Index), Paralogous Verification Method (PVM) [59] Protein Localization Method (PLM) [60] und Interaction Generalities Measures IG1 [61] und IG2 [62]. Die EPR-Methode [63] vergleicht Proteininteraktionen mit RNA-Expressionsprofilen, während PVM Paraloge von Interaktoren zum Vergleich analysiert. Das IG1-Maß basiert auf der Idee, dass interagierende Proteine, die keine weiteren Interaktionen über Level 1 hinaus haben, wahrscheinlich falsch positiv sind. Das IG2-Maß verwendet die Topologie der Interaktionen. Bayessche Ansätze wurden auch zur Berechnung der Reliabilität verwendet [64–66]. Das PLM liefert die True Positives (TP) als interagierende Proteine, die im selben Zellkompartiment lokalisiert oder annotiert werden müssen, um eine gemeinsame zelluläre Rolle zu haben. Um diesen Fehlern entgegenzuwirken, wurden viele Verfahren entwickelt, die bei jeder Interaktion Vertrauenswerte liefern. Auch die Methoden, die einzelnen Interaktionen Scores zuordnen, schneiden im Allgemeinen besser ab als diejenigen mit dem Satz von Interaktionen, die aus einem Experiment oder einer Datenbank erhalten wurden [67].

4. Computergestützte Analyse von PPI-Netzwerken

Ein PPI-Netzwerk kann als heterogenes Netzwerk von Proteinen beschrieben werden, die durch Wechselwirkungen als Kanten verbunden sind. Die rechnerische Analyse von PPI-Netzen beginnt mit der Darstellung der PPI-Netzanordnung. Die einfachste Skizze hat die Form eines mathematischen Graphen, der aus Knoten und Kanten besteht [68]. Protein wird in einem solchen Graphen als Knoten dargestellt und die Proteine, die mit ihm physikalisch interagieren, werden als benachbarte Knoten dargestellt, die durch eine Kante verbunden sind. Eine Untersuchung des Netzwerks kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Zum Beispiel können benachbarte Proteine ​​im Graphen wahrscheinlich mehr die gleiche Funktionalität teilen. Neben der Funktionalität bilden dicht verbundene Teilgraphen im Netzwerk in bestimmten biologischen Prozessen wahrscheinlich als Einheit Proteinkomplexe. Somit kann die Funktionalität eines Proteins durch Spotting an den Proteinen, mit denen es wechselwirkt, und den Proteinkomplexen, an denen es beteiligt ist, abgeleitet werden. Die topologische Vorhersage neuer Wechselwirkungen ist eine neue und nützliche Option, die ausschließlich auf den strukturellen Informationen basiert, die von der Topologie des PPI-Netzwerks (PPIN) bereitgestellt werden [69]. Einige Algorithmen wie der zufällige Layoutalgorithmus, der kreisförmige Layoutalgorithmus, der hierarchische Layoutalgorithmus usw. werden verwendet, um das Netzwerk für die weitere Analyse zu visualisieren. Gerade die computergestützte Analyse von PPI-Netzwerken ist eine Herausforderung, da diese Hauptbarrieren häufig anzutreffen sind [4]: ​​(1) die Proteinwechselwirkungen sind nicht stabil (2) ein Protein kann unterschiedliche Rollen haben (3) zwei Proteine ​​mit unterschiedlichen Funktionen regelmäßig miteinander interagieren.

5. Rolle von PPI-Netzwerken in der Proteomik

Die Vorhersage der Proteinfunktionalität ist eines der Hauptziele des PPI-Netzwerks. Trotz der jüngsten umfassenden Studien zu Hefe gibt es in der Hefedatenbank immer noch eine Reihe funktionell nicht klassifizierter Proteine, die den bevorstehenden Bedarf an einer Klassifizierung der Proteine ​​widerspiegeln. Die funktionelle Annotation menschlicher Proteine ​​kann eine solide Grundlage für das vollständige Verständnis der Zellmechanismen liefern, wertvolle Informationen für die Wirkstoffforschung und -entwicklung [4]. Die zunehmende Verfügbarkeit von PPI-Netzwerken hat verschiedene Computermethoden zur Vorhersage von Proteinfunktionen entwickelt. Die Verfügbarkeit zuverlässiger Informationen über Proteininteraktionen und deren Anwesenheit in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen sind entscheidend für die Entwicklung von Therapeutika, die auf Protein-Protein-Interaktionen basieren. Das Kompendium aller bekannten Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) für eine bestimmte Zelle oder einen bestimmten Organismus wird als Interaktom bezeichnet.

Proteinfunktionen können auf Basis von Modularisierungsalgorithmen vorhergesagt werden [4]. Auf diese Weise gefundene Vorhersagen sind jedoch möglicherweise nicht genau, da die Genauigkeit des Modularisierungsprozesses selbst typischerweise gering ist. Es gibt andere Methoden, die die Nachbarzählung, das Chi-Quadrat, das Markov-Zufallsfeld, Prodistin und die auf gewichtete Interaktionen basierende Methode zur Vorhersage der Proteinfunktion umfassen [77]. Für eine größere Genauigkeit sollten Proteinfunktionen direkt aus der Topologie oder Konnektivität von PPI-Netzwerken vorhergesagt werden [4]. Mehrere topologiebasierte Ansätze zur Vorhersage der Proteinfunktion auf der Grundlage von PPI-Netzwerken wurden eingeführt. Auf einfachster Ebene sagt die „Nachbar-Zählmethode“ die Funktion eines unerforschten Proteins durch die Häufigkeit bekannter Funktionen der unmittelbaren Nachbarproteine ​​voraus [78]. Die Mehrzahl der Funktionen der unmittelbaren Nachbarn lässt sich statistisch auswerten [79]. Kürzlich wurde die Anzahl der gemeinsamen Nachbarn des bekannten Proteins und des unbekannten Proteins als Grundlage für den Funktionsschluss genommen [80]. Die Weighted-Graph-Mining-basierte Proteinfunktionsvorhersage [81] ist ein neuer Ansatz auf diesem Gebiet.

Die Identifizierung von Protein-Protein-Komplexen ist der entscheidende Schritt, um die Signalübertragungswege zu finden. Protein-Protein-Komplexe bestehen meist aus Antikörper-Antigen- und Protease-Inhibitor-Komplexen [82]. Die Kristallographie ist das wichtigste Werkzeug zur Bestimmung von Proteinkomplexen mit atomarer Auflösung.

Die vollständige Analyse von PPIs kann ein besseres Verständnis der zellulären Organisation, Prozesse und Funktionen ermöglichen. Zu den anderen Anwendungen des PPI-Netzwerks gehören die Analyse der biologischen Unverzichtbarkeit [4], die Bewertung der Wirkstofffähigkeit molekularer Targets anhand der Netzwerktopologie [4], die Schätzung der Interaktionszuverlässigkeit [83], die Identifizierung von Domänen-Domänen-Interaktionen [84], die Vorhersage von Proteininteraktionen [85], Nachweis von Proteinen, die an Krankheitswegen beteiligt sind [86], Abgrenzung häufiger Interaktionsnetzwerkmotive [87], Vergleich zwischen Modellorganismen und Menschen [88] und Proteinkomplexidentifikation [89].

6. Datenbanken zur Proteininteraktion

Die riesige Menge experimenteller PPI-Daten, die ständig generiert werden, hat zum Aufbau computerlesbarer biologischer Datenbanken geführt, um diese Daten zu organisieren und zu verarbeiten. So wird beispielsweise die Biomolecular Interaction Network Database (BIND) auf einem erweiterbaren Spezifikationssystem erstellt, das eine ausführliche Beschreibung der experimentellen Ableitung der PPI-Daten ermöglicht, oft mit direkten Links zu den abschließenden Beweisen aus der Literatur [75]. Die Datenbank der interagierenden Proteine ​​(DIP) ist eine weitere Datenbank experimentell bestimmter binärer Protein-Protein-Interaktionen [36]. Das biologische allgemeine Repository für Interaktionsdatensätze (BioGRID) ist eine Datenbank, die Protein- und genetische Interaktionen zwischen dreizehn verschiedenen Arten enthält [70]. Interaktionen werden regelmäßig durch die umfassende Pflege der Primärliteratur zu den Datenbanken hinzugefügt. Interaktionsdaten werden aus anderen Datenbanken wie BIND und MIPS (Münchener Informationszentrum für Proteinsequenzen) [90] sowie direkt aus Großexperimenten [72] extrahiert. HitPredict ist eine Ressource für Protein-Protein-Interaktionen mit hoher Konfidenz, aus der wir die Gesamtzahl der Interaktionen in einer Spezies für ein Protein erhalten und alle Interaktionen mit Konfidenzwerten anzeigen können [71].

Die Molecular Interaction (MINT)-Datenbank ist eine weitere Datenbank mit experimentell abgeleiteten PPI-Daten, die aus der Literatur extrahiert wurden, mit dem zusätzlichen Element, die Beweiskraft für jede Interaktion bereitzustellen [72]. Die Human Protein Interaction Database (HPID) wurde entwickelt, um Informationen zur Interaktion mit Humanprotein bereitzustellen, die aus vorhandenen strukturellen und experimentellen Daten im Voraus berechnet wurden [91]. Die Information Hyperlinked over Proteins (iHOP)-Datenbank kann durchsucht werden, um zuvor in PubMed gemeldete Interaktionen für ein interessierendes Protein zu identifizieren [92]. IntAct [73] bietet eine Open-Source-Datenbank und ein Toolkit für die Speicherung, Präsentation und Analyse von Proteininteraktionen. Das Webinterface bietet sowohl textuelle als auch grafische Darstellungen von Proteininteraktionen und ermöglicht die Untersuchung von Interaktionsnetzwerken im Kontext der GO-Annotationen der interagierenden Proteine. Wir haben jedoch beobachtet, dass die Schnittmenge und Überlappung zwischen diesen Quell-PPI-Datenbanken relativ gering ist. Kürzlich wurde die Integration durchgeführt und kann im Webserver namens APID (Agile Protein Interaction Data Analyzer) untersucht werden, einem interaktiven Webtool der Bioinformatik, das entwickelt wurde, um die Untersuchung und Analyse aktuell bekannter Informationen über Protein-Protein-Interaktionen integriert und vereinheitlicht zu ermöglichen in einer gemeinsamen und vergleichenden Plattform [74]. Die Protein Interaction Network Analysis (PINA2.0)-Plattform ist eine umfassende Webressource, die eine Datenbank mit vereinheitlichten Protein-Protein-Interaktionsdaten, integriert aus sechs manuell kuratierten öffentlichen Datenbanken, sowie eine Reihe integrierter Tools für Netzwerkaufbau, Filterung und Analyse enthält und Visualisierung [76]. Die Datenbanken und die Anzahl der Interaktionen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

7. Fazit

Während verfügbare Methoden Interaktionen nicht mit 100%iger Genauigkeit vorhersagen können, werden Computermethoden die Menge potenzieller Interaktionen auf eine Teilmenge der wahrscheinlichsten Interaktionen herunterskalieren. Diese Wechselwirkungen dienen als Ausgangspunkt für weitere Laborexperimente. Die Genexpressionsdaten und Proteininteraktionsdaten werden das Vertrauen der Protein-Protein-Interaktionen und des entsprechenden PPI-Netzwerks verbessern, wenn sie gemeinsam verwendet werden. Neuere Entwicklungen haben auch zum Aufbau von Netzwerken mit allen Protein-Protein-Wechselwirkungen geführt, wobei Computermethoden für Signalübertragungswege und Proteinkomplexidentifikation bei bestimmten Krankheiten verwendet werden.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Wissen

Die Autoren danken der University Grants Commission (UGC) für die finanzielle Unterstützung dieser Studie.

Verweise

  1. P. Braun und A. C. Gingras, „History of Protein-Protein Interactions: from egg-white to complex networks“, Proteomik, Bd. 12, nein. 10, S. 1478–1498, 2012. Ansicht bei: Google Scholar
  2. Y. Ofran und B. Rost, „Analyse von sechs Arten von Protein-Protein-Schnittstellen“, Zeitschrift für Molekularbiologie, Bd. 325, Nr. 2, S. 377–387, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  3. I. M. A. Nooren und J. M. Thornton, „Vielfalt der Protein-Protein-Interaktionen“, Das EMBO-Journal, Bd. 22, nein. 14, S. 3486–3492, 2003. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  4. A. Zhang, Protein-Interaktionsnetzwerke – Computeranalyse, Cambridge University Press, New York, NY, USA, 2009.
  5. M. Yanagida, „Aktuelle Errungenschaften der funktionalen Proteomik“, Zeitschrift für Chromatographie B, Bd. 771, Nr. 1-2, S. 89–106, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  6. T. Berggård, S. Linse und P. James, „Methoden zur Erkennung und Analyse von Protein-Protein-Interaktionen“, Proteomik, Bd. 7, nein. 16, S. 2833–2842, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  7. C. von Mering, R. Krause, B. Snel et al., „Vergleichende Bewertung großmaßstäblicher Datensätze von Protein-Protein-Interaktionen“, Natur, Bd. 417, Nr. 6887, S. 399–403, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  8. E. M. Phizicky und S. Fields, „Protein-Protein-Interaktionen: Methoden zum Nachweis und zur Analyse“, Mikrobiologische Bewertungen, Bd. 59, Nr. 1, S. 94–123, 1995. Ansicht bei: Google Scholar
  9. C. S. Padamallu und J. Posfai, „Open-Source-Tool zur Vorhersage des genomweiten Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks basierend auf Orthologen-Informationen“, Quellcode für Biologie und Medizin, Bd. 5, Artikel 8, 2010. View at: Publisher Site | Google Scholar
  10. A. K. Dunker, M. S. Cortese, P. Romero, L. M. Iakoucheva und V. N. Uversky, „Flexible Netze: die Rollen der intrinsischen Unordnung in Proteininteraktionsnetzwerken“, FEBS-Journal, Bd. 272, Nr. 20, S. 5129–5148, 2005. View at: Publisher Site | Google Scholar
  11. M. Sarmady, W. Dampier und A. Tozeren, „HIV-Proteinsequenz-Hotspots für Crosstalk mit Host-Hub-Proteinen“, Plus eins, Bd. 6, nein. 8, Artikel-ID e23293, 2011. Ansicht auf: Publisher-Site | Google Scholar
  12. G. Rigaut, A. Shevchenko, B. Rutz, M. Wilm, M. Mann und B. Seraphin, „Eine generische Proteinreinigungsmethode zur Charakterisierung von Proteinkomplexen und Proteom-Exploration“, Natur Biotechnologie, Bd. 17, nein. 10, S. 1030–1032, 1999. View at: Publisher Site | Google Scholar
  13. A.-C. Gavin, M. Bösche, R. Krause et al., „Funktionale Organisation des Hefeproteoms durch systematische Analyse von Proteinkomplexen“, Natur, Bd. 415, Nr. 6868, S. 141–147, 2002. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  14. S. Pitre, M. Alamgir, J. R. Green, M. Dumontier, F. Dehne und A. Golshani, „Computermethoden zur Vorhersage von Protein-Protein-Interaktionen“, Fortschritte in Bioverfahrenstechnik/Biotechnologie, Bd. 110, S. 247–267, 2008. View at: Publisher Site | Google Scholar
  15. J. S. Rohila, M. Chen, R. Cerny und M. E. Fromm, „Verbesserter Tandem-Affinitäts-Reinigungs-Tag und Methoden zur Isolierung von Protein-Heterokomplexen aus Pflanzen“, Pflanzentagebuch, Bd. 38, Nr. 1, S. S172–S181, 2004. View at: Publisher Site | Google Scholar
  16. G. MacBeath und S. L. Schreiber, „Drucken von Proteinen als Mikroarrays für die Hochdurchsatz-Funktionsbestimmung“, Wissenschaft, Bd. 289, Nr. 5485, S. 1760–1763, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  17. S. W. Michnick, P. H. Ear, C. Landry, M. K. Malleshaiah und V. Messier, „Proteinfragment Complementation Assays for Large Scale Analysis, Functional Dissection and Dynamic Studies of Protein-Protein Interactions in Living Cells“, Methoden der Molekularbiologie, Bd. 756, S. 395–425, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  18. J. J. Moresco, P. C. Carvalho und J. R. Yates III, „Identifizierung von Komponenten von Proteinkomplexen in C. elegans mithilfe von Co-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie“, Zeitschrift für Proteomik, Bd. 73, nein. 11, S. 2198–2204, 2010. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  19. G. P. Smith, „Filamentöse Fusionsphage: neuartige Expressionsvektoren, die klonierte Antigene auf der Virionoberfläche zeigen“, Wissenschaft, Bd. 228, Nr. 4705, S. 1315–1317, 1985. Ansicht bei: Google Scholar
  20. A. H. Y. Tong, B. Drees, G. Nardelli et al., „Eine kombinierte experimentelle und computergestützte Strategie zur Definition von Proteininteraktionsnetzwerken für Peptiderkennungsmodule“, Wissenschaft, Bd. 295, Nr. 5553, S. 321–324, 2002. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  21. A. H. Y. Tong, M. Evangelista, A. B. Parsons et al., „Systematische genetische Analyse mit geordneten Arrays von Hefe-Deletionsmutanten“, Wissenschaft, Bd. 294, Nr. 5550, S. 2364–2368, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  22. M. R. Oɼonnell, R. Gamsjaeger und J. P. Mackay, „Die Strukturanalyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch NMR-Spektroskopie“, Proteomik, Bd. 9, nein. 23, S. 5224–5232, 2009. View at: Publisher Site | Google Scholar
  23. G. Gao, J. G. Williams und S. L. Campbell, „Protein-Protein-Interaktionsanalyse durch kernmagnetische Resonanzspektroskopie“, Methoden der Molekularbiologie, Bd. 261, S. 79–92, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  24. P. Uetz, L. Glot, G. Cagney et al., „Eine umfassende Analyse der Protein-Protein-Interaktionen in Saccharomyces cerevisiae“, Natur, Bd. 403, Nr. 6770, S. 623–627, 2000. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  25. T. Ito, T. Chiba, R. Ozawa, M. Yoshida, M. Hattori und Y. Sakaki, „Eine umfassende Zwei-Hybrid-Analyse zur Untersuchung des Hefeprotein-Interaktoms“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 98, Nr. 8, S. 4569–4574, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  26. J. I. Semple, C. M. Sanderson und R. D. Campbell, „Die Jury ist in “Schuld durch Assoziation” Prozesse“ Kurze Funktion Genomic Proteomic, Bd. 1, nein. 1, S. 40–52, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  27. P. James, J. Halladay und E. A. Craig, „Genomische Bibliotheken und ein Wirtsstamm, der für eine hocheffiziente Zwei-Hybrid-Selektion in Hefe entwickelt wurde“, Genetik, Bd. 144, nein. 4, S. 1425–1436, 1996. Ansicht bei: Google Scholar
  28. D. Llères, S. Swift und A. I. Lamond, „Detecting Protein-Protein Interactions in vivo with FRET using Multiphoton Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM),“ Aktuelle Protokolle in der Zytometrie, Bd. 12, Unit12.10, 2007. Ansicht bei: Google Scholar
  29. S. L. Rutherford, „Vom Genotyp zum Phänotyp: Puffermechanismen und die Speicherung genetischer Informationen“, BioEssays, Bd. 22, nein. 12, S. 1095–1105, 2000. Ansicht bei: Google Scholar
  30. J. L. Hartman IV, B. Garvik und L. Hartwell, „Zellbiologie: Prinzipien zur Pufferung genetischer Variation“, Wissenschaft, Bd. 291, nein. 5506, S. 1001–1004, 2001. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  31. A. Bender und J. R. Pringle, „Verwendung eines Screens für synthetische letale und Multicopy-Suppressee-Mutanten, um zwei neue Gene zu identifizieren, die an der Morphogenese in Saccharomyces cerevisiae beteiligt sind“, Molekular- und Zellbiologie, Bd. 11, nein. 3, S. 1295–1305, 1991. Ansicht bei: Google Scholar
  32. S. L. Ooi, X. Pan, B. D. Peyser et al., „Globale Analyse der synthetischen Letalität und Hefefunktionsprofilierung“, Trends in der Genetik, Bd. 22, nein. 1, S. 56–63, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  33. J. A. Brown, G. Sherlock, C. L. Myers et al., „Globale Analyse der Genfunktion in Hefe durch quantitatives phänotypisches Profiling“, Molekulare Systembiologie, Bd. 2, Artikel-ID 2006.0001, 2006. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  34. H. Berman, K. Henrick, H. Nakamura und J. L. Markley, „Die weltweite Proteindatenbank (wwPDB): Sicherstellung eines einzigen, einheitlichen Archivs von PDB-Daten“, Nukleinsäureforschung, Bd. 35, Nr. 1, S. D301–D303, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  35. L. Lu, H. Lu und J. Skolnick, „Multiprospector: ein Algorithmus zur Vorhersage von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch multimeres Threading“, Proteine, Bd. 49, nein. 3, S. 350–364, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  36. I. Xenarios, Ł. Salwínski, X. J. Duan, P. Higney, S.-M. Kim und D. Eisenberg, „DIP, die Datenbank interagierender Proteine: ein Forschungswerkzeug zum Studium zellulärer Netzwerke von Proteininteraktionen“, Nukleinsäureforschung, Bd. 30, nein. 1, S. 303–305, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  37. R. Hosur, J. Xu, J. Bienkowska und B. Berger, „IWRAP: ein Interface-Threading-Ansatz mit Anwendung auf die Vorhersage krebsbedingter Protein-Protein-Interaktionen“, Zeitschrift für Molekularbiologie, Bd. 405, Nr. 5, S. 1295–1310, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  38. R. Hosur, J. Peng, A. Vinayagam, U. Stelzl et al., „Ein Rechenrahmen zur Steigerung des Vertrauens in Protein-Protein-Interaktionsdatensätze mit hohem Durchsatz“, Genombiologie, Bd. 13, nein. 8, s. R76, 2012. Ansicht bei: Google Scholar
  39. Q. C. Zhang, D. Petrey, L. Deng et al., „Strukturbasierte Vorhersage von Protein-Protein-Interaktionen im genomweiten Maßstab“, Natur, Bd. 490, Nr. 7421, S. 556–560, 2012. Ansicht bei: Google Scholar
  40. G. T. Valente, M. L. Acencio, C. Martins und N. Lemke, „Die Entwicklung eines universellen in silico-Prädiktors für Protein-Protein-Interaktionen“, Plus eins, Bd. 8, nein. 5, Artikel-ID e65587, 2013. Ansicht bei: Google Scholar
  41. A. Ben-Hur und W. S. Noble, „Kernel-Methoden zur Vorhersage von Protein-Protein-Interaktionen“, Bioinformatik, Bd. 21, nein. 1, S. i38–i46, 2005. View at: Publisher Site | Google Scholar
  42. S.-A. Lee, C.-H. Chan, C.-H. Tsai et al., „Ortholog-basierte Protein-Protein-Interaktionsvorhersage und ihre Anwendung auf Inter-Spezies-Interaktionen“, BMC Bioinformatik, Bd. 9, Beilage 12, Artikel S11, 2008. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  43. R. L. Tatusov, E. V. Koonin und D. J. Lipman, „Eine genomische Perspektive auf Proteinfamilien“, Wissenschaft, Bd. 278, Nr. 5338, S. 631–637, 1997. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  44. V. Memisevic, A. Wallqvist und J. Reifman, „Rekonstituieren von Proteininteraktionsnetzwerken mit parameterabhängigen Domänen-Domänen-Interaktionen“, BMC Bioinformatik, Bd. 14, S. 154–168, 2013. Ansicht bei: Google Scholar
  45. J. Wojcik und V. Sch์hter, „Protein-Protein-Interaktionskarten-Inferenz mit interagierenden Domänenprofilpaaren“, Bioinformatik, Bd. 17, Beilage 1, S. S296–S305, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  46. M. Yamada, M. S. Kabir und R. Tsunedomi, „Divergente Promoter-Organisation kann eine bevorzugte Struktur für die Genkontrolle in Escherichia coli sein.“ Zeitschrift für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Bd. 6, nein. 3-4, S. 206–210, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  47. J. Raes, J. O. Korbel, M. J. Lercher et al., „Vorhersage der effektiven Genomgröße in meta genomischen Proben“, Genombiologie, Bd. 7, S. 911–917, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  48. A. J. Enright, I. Illopoulos, N. C. Kyrpides und C. A. Ouzounis, „Proteininteraktionskarten für komplette Genome basierend auf Genfusionsereignissen“, Natur, Bd. 402, Nr. 6757, S. 86–90, 1999. View at: Publisher Site | Google Scholar
  49. E. M. Marcotte, M. Pellegrini, H.-L. Ng, D. W. Rice, T. O. Yeates und D. Eisenberg, „Detecting Protein Function and Protein-Protein Interactions from Genome Sequences“, Wissenschaft, Bd. 285, Nr. 5428, S. 751–753, 1999. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  50. R. Overbeek, M. Fonstein, M. D'Souza, G. D. Push und N. Maltsev, „Die Verwendung von Genclustern, um funktionelle Kopplung abzuleiten“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 96, Nr. 6, S. 2896–2901, 1999. View at: Publisher Site | Google Scholar
  51. C. Freiberg, „Neuartige Computermethoden zur Identifizierung von antimikrobiellen Zielen“, Arzneimittelforschung heute, Bd. 6, nein. 2, S. S72–S80, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  52. F. Pazos und A. Valencia, „In silico Zwei-Hybrid-System zur Auswahl physikalisch interagierender Proteinpaare“, Proteine, Bd. 47, nein. 2, S. 219–227, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  53. T. Sato, Y. Yamanishi, M. Kanehisa, K. Horimoto und H. Toh, „Verbesserung der Mirrortree-Methode durch Extraktion evolutionärer Informationen“, in Sequenz- und Genomanalyse: Methode und Anwendungen, S. 129–139, Concept Press, 2011. Ansicht bei: Google Scholar
  54. R. A. Craig und L. Liao, „Die phylogenetischen Bauminformationen unterstützen das überwachte Lernen zur Vorhersage der Protein-Protein-Interaktion basierend auf Distanzmatrizen“, BMC Bioinformatik, Bd. 8, Artikel 6, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  55. K. Srinivas, A. A. Rao, G. R. Sridhar und S. Gedela, „Methodik für die phylogenetische Baumkonstruktion“, Zeitschrift für Proteomik & Bioinformatik, Bd. 1, S. S005–S011, 2008. Ansicht bei: Google Scholar
  56. T. W. Lin, J. W. Wu und D. Tien-Hao Chang, „Combining phylogenetic profiling-based and machine learning based Techniques to Vorhersage funktionell verwandter Proteine“, Plus eins, Bd. 8, nein. 9, Artikel-ID e75940, 2013. Ansicht bei: Google Scholar
  57. A. Grigoriev, „Eine Beziehung zwischen Genexpression und Proteininteraktionen auf der Proteomskala: Analyse des Bakteriophagen T7 und der Hefe Saccharomyces cerevisiae“, Nukleinsäureforschung, Bd. 29, nein. 17, S. 3513–3519, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  58. C. von Mering, L. J. Jensen, B. Snel et al., „STRING: bekannte und vorhergesagte Protein-Protein-Assoziationen, integriert und über Organismen übertragen“, Nukleinsäureforschung, Bd. 33, S. D433–D437, 2005. View at: Publisher Site | Google Scholar
  59. C. M. Deane, Ł. Salwiński, I. Xenarios und D. Eisenberg, „Proteininteraktionen: zwei Methoden zur Bewertung der Zuverlässigkeit von Hochdurchsatzbeobachtungen“, Molekulare & Zelluläre Proteomik, Bd. 1, nein. 5, S. 349–356, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  60. E. Sprinzak, S. Sattath und H. Margalit, „Wie zuverlässig sind experimentelle Protein-Protein-Interaktionsdaten?“ Zeitschrift für Molekularbiologie, Bd. 327, Nr. 5, S. 919–923, 2003. View at: Publisher Site | Google Scholar
  61. R. Saito, H. Suzuki und Y. Hayashizaki, „Konstruktion zuverlässiger Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke mit einem neuen Interaktions-Generalitätsmaß“, Bioinformatik, Bd. 19, nein. 6, S. 756–763, 2003. Ansicht auf: Publisher Site | Google Scholar
  62. R. Saito, H. Suzuki und Y. Hayashizaki, „Interaktionsgeneralität, eine Messung zur Beurteilung der Zuverlässigkeit einer Protein-Protein-Interaktion“, Nukleinsäureforschung, Bd. 30, nein. 5, S. 1163–1168, 2002. Ansicht bei: Google Scholar
  63. A. Mora und I. M. Donaldson, „Auswirkungen der Integration, Darstellung und Zuverlässigkeit von Proteininteraktionsdaten auf die Verwendung von Netzwerkeigenschaften für die Vorhersage von Wirkstoffzielen“, BMC Bioinformatik, Bd. 13, s. 294, 2012. Ansicht bei: Google Scholar
  64. A. M. Edwards, B. Kus, R. Jansen, D. Greenbaum, J. Greenblatt und M. Gerstein, „Brückenstrukturbiologie und Genomik: Bewertung von Proteininteraktionsdaten mit bekannten Komplexen“, Trends in der Genetik, Bd. 18, nein. 10, S. 529–536, 2002. View at: Publisher Site | Google Scholar
  65. R. Jansen, H. Yu, D. Greenbaum et al., „Ein Bayesian Networks-Ansatz zur Vorhersage von Protein-Protein-Interaktionen aus Genomdaten“, Wissenschaft, Bd. 302, Nr. 5644, S. 449–453, 2003. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  66. S. Asthana, O. D. King, F. D. Gibbons und F. P. Roth, „Vorhersage der Mitgliedschaft im Proteinkomplex durch probabilistische Netzwerkzuverlässigkeit“, Genomforschung, Bd. 14, nein. 6, S. 1170–1175, 2004. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  67. S. Suthram, T. Shlomi, E. Ruppin, R. Sharan und T. Ideker, „Ein direkter Vergleich von Vertrauenszuweisungsschemata für Proteininteraktionen“, BMC Bioinformatik, Bd. 7, Artikel 360, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  68. A. Wagner, „Wie sich die globale Struktur von Proteininteraktionsnetzwerken entwickelt“, Verfahren der Royal Society B, Bd. 270, Nr. 1514, S. 457–466, 2003. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  69. C. Vittorio Cannistraci, G. Alanis-Lobato und T. Ravasi, „Minimum Curvilinearity to Enhance topological Prediction of Protein Interactions by Network Embedding“, Bioinformatik, Bd. 29, S. i199–i209, 2013. Ansicht bei: Google Scholar
  70. C. Stark, B.-J. Breitkreutz, T. Reguly, L. Boucher, A. Breitkreutz und M. Tyers, „BioGRID: ein allgemeines Repository für Interaktionsdatensätze“, Nukleinsäureforschung, Bd. 34, S. D535–539, 2006. Ansicht bei: Google Scholar
  71. A. Patil, K. Nakai und H. Nakamura, „HitPredict: eine Datenbank mit qualitätsgeprüften Protein-Protein-Interaktionen in neun Arten“, Nukleinsäureforschung, Bd. 39, nein. 1, S. D744–D749, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  72. A. Chatr-aryamontri, A. Ceol, L. M. Palazzi et al., „MINT: the Molecular INTeraction database“, Nukleinsäureforschung, Bd. 35, Nr. 1, S. D572–D574, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar
  73. H. Hermjakob, L. Montecchi-Palazzi, C. Lewington et al., „IntAct: eine Open-Source-Datenbank für molekulare Interaktionen“, Nukleinsäureforschung, Bd. 32, S. D452–D455, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  74. C. Prieto und J. de Las Rivas, „APID: agile Proteininteraktion DataAnalyzer“, Nukleinsäureforschung, Bd. 34, S. W298–W302, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  75. G. D. Bader, I. Donaldson, C. Wolting, B. F. F. Ouellette, T. Pawson und C. W. V. Hogue, „BIND—the biomolecular interaction network database“, Nukleinsäureforschung, Bd. 29, nein. 1, S. 242–245, 2001. Ansicht bei: Google Scholar
  76. M. J. Cowley, M. Pinese, K. S. Kassahn et al., „PINA v2. 0: Abbau von Interaktommodulen“, Nukleinsäureforschung, Bd. 40, S. D862–D865, 2012. Ansicht bei: Google Scholar
  77. K. S. Ahmed und S. M. El-Metwally, „Proteinfunktionsvorhersage basierend auf Protein-Protein-Interaktionen: eine vergleichende Studie“, IFMBE-Verfahren, Bd. 41, S. 1245–1249, 2014. Ansicht bei: Google Scholar
  78. B. Schwikowski, P. Uetz und S. Fields, „Ein Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen in Hefe“, Natur Biotechnologie, Bd. 18, nein. 12, S. 1257–1261, 2000. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  79. H. Hishigaki, K. Nakai, T. Ono, A. Tanigami und T. Takagi, „Bewertung der Vorhersagegenauigkeit der Proteinfunktion aus Protein-Protein-Interaktionsdaten“, Hefe, Bd. 18, nein. 6, S. 523–531, 2001. View at: Publisher Site | Google Scholar
  80. C. Lin, D. Jiang und A. Zhang, „Vorhersage der Proteinfunktion mithilfe gemeinsamer Nachbarn in Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken“, in Tagungsband des 6. IEEE Symposium on BioInformatics and BioEngineering (BIBE '06), S. 251–260, Oktober 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  81. T. Kim, M. Li, K. Ho Ryu und J. Shin, „Prediction of Protein Function from Protein-Protein Interaction Network by Weighted Graph Mining“, in Proceedings of the 4th International Conference on Bioinformatics & BioMedical Technology (IPCBEE '12), Bd. 29, S. 150–154, 2012. Ansicht bei: Google Scholar
  82. R. C. Liddington, „Strukturelle Grundlagen von Protein-Protein-Interaktionen“, Methoden der Molekularbiologie, Bd. 261, S. 3–14, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  83. J. S. Bader, A. Chaudhuri, J. M. Rothberg und J. Chant, „Gewinn des Vertrauens in Hochdurchsatz-Protein-Interaktionsnetzwerke“, Natur Biotechnologie, Bd. 22, nein. 1, S. 78–85, 2004. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  84. K. S. Guimar฾s, R. Jothi, E. Zotenko und T. M. Przytycka, „Predicting domain-domain interactions using a parsimony approach“, Genombiologie, Bd. 7, nein. 11, Artikel R104, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  85. B. Lehner und A. G. Fraser, „A first-draft human protein-interaction map“, Genombiologie, Bd. 5, nein. 9, s. R63, 2004. Ansicht bei: Google Scholar
  86. D. R. Rhodes, S. A. Tomlins, S. Varamally et al., „Probabilistisches Modell des menschlichen Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks“, Natur Biotechnologie, Bd. 23, nein. 8, S. 951–959, 2005. Ansicht bei: Google Scholar
  87. R. Milo, S. Itzkovitz, N. Kashtan et al., „Superfamilien von entwickelten und entworfenen Netzwerken“, Wissenschaft, Bd. 303, Nr. 5663, S. 1538–1542, 2004. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  88. T. K. B. Gandhi, J. Zhong, S. Mathivanan et al., „Analyse des menschlichen Protein-Interaktoms und Vergleich mit Hefe-, Wurm- und Fliegen-Interaktionsdatensätzen“, Naturgenetik, Bd. 38, Nr. 3, S. 285–293, 2006. View at: Publisher Site | Google Scholar
  89. S. Srihari und H. Waileong, „Survey of Computational Methods for Protein Complex Prediction from Protein Interaction Networks“, Zeitschrift für Bioinformatik und Computerbiologie, Bd. 11, nein. 2, Artikel-ID 123002, 2013. Ansicht bei: Google Scholar
  90. H. W. Mewes, A. Ruepp, F. Theis et al., „MIPS: Curated Databases and Comprehensive Secondary Data Resources in 2010“, Nukleinsäureforschung, Bd. 39, nein. 1, S. D220–D224, 2011. View at: Publisher Site | Google Scholar
  91. K. Han, B. Park, H. Kim, J. Hong und J. Park, „HPID: the human protein interaction“, Bioinformatik, Bd. 20, nein. 15, S. 2466–2470, 2004. Ansicht auf: Verlagsseite | Google Scholar
  92. J. M. Fernández, R. Hoffmann und A. Valencia, „iHOP-Webdienste“, Nukleinsäureforschung, Bd. 35, S. W21–W26, 2007. View at: Publisher Site | Google Scholar

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Ergebnisse

Die Bakterienzellen färben sich normalerweise gleichmäßig und die Farbe der Zellen hängt von der Art des verwendeten Farbstoffs ab. Wenn Methyenblau verwendet wird, können einige Körnchen im Inneren der Zellen einiger Bakterien stärker gefärbt erscheinen als der Rest der Zelle, was auf das Vorhandensein verschiedener chemischer Substanzen zurückzuführen ist.

Die Bakterienzellen färben sich normalerweise gleichmäßig und die Farbe der Zellen hängt von der Art des verwendeten Farbstoffs ab. Wenn Methyenblau verwendet wird, können einige Körnchen im Inneren der Zellen einiger Bakterien stärker gefärbt erscheinen als der Rest der Zelle, was auf das Vorhandensein verschiedener chemischer Substanzen zurückzuführen ist.


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