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Säugetierschuppen

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Viele kleine Säugetiere haben schuppige Haut am Schwanz und manchmal an den Gliedmaßen. Die Beispiele finden sich unter Nagetieren (Ratten, Degu, Schuppenhörnchen), Insektenfressern (Spitzmännchen, Desmans), Oppossums, Moschusrattenkänguru. Es gibt viel prominentere Beispiele wie Schuppentierschuppen, aber ich möchte mich auf so einfache Dinge wie möglich konzentrieren.

Ich würde gerne die Antworten oder zumindest das Wissen zu den folgenden Fragen wissen.

  1. Sind die Schuppen dieser verschiedenen Säugetiere tatsächlich etwas Ähnliches oder ist es nur eine Illusion?
  2. Stellt das schuppige Muster zumindest in einigen Fällen ein primitives Merkmal eines gemeinsamen Vorfahren von Säugetieren dar?
  3. Besteht bei positiver Antwort auf die vorherige Frage ein Zusammenhang mit den Schuppen der Diapsid-Reptilien? Soweit ich weiß, werden letztere aus $eta$-Keratin aufgebaut, das bei Säugetieren fehlt, aber vielleicht gibt es immer noch Ähnlichkeiten oder sogar einen gemeinsamen Ursprung.

Meine Recherche zu diesem Thema ergab vorerst einige widersprüchliche Behauptungen ohne solide Referenzen. Ich würde aktualisieren, falls ich etwas finde, das relevant erscheint.


Haare, Federn und Schuppen haben viel gemeinsam

Die potenzielle evolutionäre Verbindung zwischen Haaren bei Säugetieren, Federn bei Vögeln und Schuppen bei Reptilien wird seit Jahrzehnten diskutiert. Heute zeigen Forscher der Universität Genf (UNIGE) und des Schweizerischen Instituts für Bioinformatik SIB, Schweiz, dass alle diese Hautanhangsgebilde homolog sind: Sie haben eine gemeinsame Abstammung. Anhand neuer Analysen der Embryonalentwicklung konnten die Schweizer Biologen molekulare und mikroanatomische Signaturen nachweisen, die zwischen Haaren, Federn und Schuppen in ihren frühen Entwicklungsstadien identisch sind. Diese neuen Beobachtungen, veröffentlicht in Wissenschaftliche Fortschritte, weisen darauf hin, dass sich die drei Strukturen aus ihrem gemeinsamen Reptilienvorfahren entwickelt haben.

Säugetierhaare und Vogelfedern entwickeln sich aus einer ähnlichen Urstruktur, die als „Plakode“ bezeichnet wird: eine lokale Verdickung der Epidermis mit säulenförmigen Zellen, die ihre Proliferationsrate reduzieren und sehr spezifische Gene exprimieren. Diese Beobachtung hat Evolutions- und Entwicklungsbiologen viele Jahre lang verwirrt, weil Vögel und Säugetiere keine Schwestergruppen sind: Sie haben sich aus verschiedenen Reptilienlinien entwickelt. Nach früheren Studien entwickeln sich Reptilienschuppen jedoch nicht aus einer anatomischen Plakode. Dies würde bedeuten, dass Vögel und Säugetiere während ihrer Evolution unabhängig voneinander Plakoden „erfunden“ haben.

Der einzige evolutionäre Ursprung der Plakoden enthüllt

2015 veröffentlichte ein Team der Yale University (USA) einen Artikel, der zeigt, dass Schuppen, Haare und Federn während ihrer Entwicklung molekulare Signaturen teilen. Diese Ergebnisse haben eine alte Debatte zwischen zwei Schulen angeheizt. Die eine verteidigt, dass diese molekularen Signaturen auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung von Hautanhangsgebilden hindeuten, während die andere vorschlägt, dass dieselben Gene für die Entwicklung verschiedener Hautanhangsgebilde wiederverwendet werden.

Heute haben Nicolas Di-Poï und Michel C. Milinkovich am Department of Genetics and Evolution der UNIGE Faculty of Science und am SIB diese lange Kontroverse beigelegt, indem sie zeigten, dass Schuppen bei Reptilien aus einer Plakode mit allen anatomischen und molekularen Signaturen von Vogel- und Säugetierplakoden. Die beiden Wissenschaftler haben die morphologischen und molekularen Eigenschaften der Haut während der Embryonalentwicklung bei Krokodilen, Schlangen und Eidechsen genau beobachtet und analysiert. „Unsere Studie liefert nicht nur neue molekulare Daten, die die Arbeit des amerikanischen Teams ergänzen, sondern deckt auch wichtige mikroanatomische Fakten auf“, erklärt Michel Milinkovich. Tatsächlich haben wir bei Reptilien neue molekulare Signaturen identifiziert, die mit denen identisch sind, die während der Entwicklung von Haaren und Federn beobachtet wurden, sowie das Vorhandensein derselben anatomischen Plakode wie bei Säugetieren und Vögeln. Dies weist darauf hin, dass die drei Arten von Hautanhängseln homolog sind: Die Reptilienschuppen, die Vogelfedern und die Säugetierhaare haben sich trotz ihrer sehr unterschiedlichen endgültigen Formen aus den Schuppen ihrer gemeinsamen Reptilienvorfahren entwickelt.'

Ein Schlüsselgen für die Entwicklung von Hautanhangsgebilden

In ihrer neuen Studie untersuchten die Forscher von UNIGE und SIB auch den Bartagamen, eine Echsenart, die es in drei Varianten gibt. Die erste ist die normale Wildtyp-Form. Die zweite hat Schuppen von reduzierter Größe, weil sie eine Kopie einer natürlichen genetischen Mutation trägt. Das dritte hat zwei Kopien der Mutation. und es fehlen alle Skalen. Durch den Vergleich des Genoms dieser drei Varianten haben Di-Poï und Milinkovich das von dieser Mutation betroffene Gen entdeckt. "Wir haben festgestellt, dass das eigentümliche Aussehen dieser nackten Eidechsen auf die Störung des Ektodysplasin-A (EDA) zurückzuführen ist, ein Gen, dessen Mutationen bei Menschen und Mäusen bekanntermaßen erhebliche Anomalien in der Entwicklung von Zähnen, Drüsen, Nägeln und Haaren hervorrufen." “, sagt Michel Milinkovitch. Die Schweizer Forscher haben gezeigt, dass, wenn EDA bei Eidechsen eine Fehlfunktion aufweist, sie keine richtige Schuppenplakode entwickeln, genau wie Säugetiere oder Vögel, die mit ähnlichen Mutationen in demselben Gen betroffen sind, keine richtigen Haare oder Federn entwickeln können. Diese Daten zeigen alle kohärent die gemeinsame Abstammung zwischen Schuppen, Federn und Haaren.

Die nächste Herausforderung für das Schweizer Team und viele andere Forscher auf der ganzen Welt besteht darin, die feinen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Vielfalt der Formen von Hautanhangsgebilden erklären. Wie hat die schuppige Haut der Vorfahren zu den sehr unterschiedlichen Morphologien von Schuppen, Federn und Haaren sowie zu der erstaunlichen Vielfalt von Formen geführt, die diese Anhängsel annehmen können? Diese zukünftigen Studien werden hoffentlich unser Verständnis der physikalischen und molekularen Mechanismen verfeinern, die die Komplexität und Vielfalt des Lebens während der Evolution erzeugen.


LABOR FÜR SÄUGETIERZELLBIOLOGIE UND -ENTWICKLUNG

Die Hautepidermis ermöglicht es uns, als irdische Wesen zu überleben. Es wirkt wie eine Saran-Wickeldichtung an unserer Körperoberfläche, schließt Mikroben aus und hält Körperflüssigkeiten zurück. Unter ständigem mechanischem Stress schützen sich epidermale Zellen, indem sie ein ausgeklügeltes Zytoskelett produzieren, das sich mit spezialisierten Zellverbindungen verbindet und es den Zellen ermöglicht, klebende Schichten aus elastischem Gewebe zu bilden. Die Epidermis produziert auch schützende Anhängsel, wie Federn bei Vögeln, Schuppen bei Fischen und Haarfollikel bei Säugetieren. Die menschliche Haut hat sich so entwickelt, dass sie Schweißdrüsen hat, die es uns ermöglichen, die Körpertemperatur zu regulieren und in einem breiteren Klima als andere Säugetiere zu überleben. Um der normalen Abnutzung standzuhalten, erneuert sich die Epidermis ständig selbst und ist damit eines der wichtigsten Reservoirs für Stammzellen des Körpers. Wenn die Hautbarriere bei einer Verletzung durchbrochen wird, müssen epidermale Stammzellen auch mit residenten Immunzellen kommunizieren, um mit entzündlichen Immunzellen fertig zu werden, Infektionen zu verhindern und das geschädigte Gewebe zu reparieren. Schließlich werden Hautstammzellen an der Körperoberfläche auch schädlichen UV-Strahlen ausgesetzt, und es überrascht nicht, dass Epidermiskrebs die häufigste aller menschlichen Krebsarten ist.

Im Fuchs-Labor versuchen wir zu verstehen, wie aus Stammzellen der Säugetierhaut Epidermis, Haarfollikel und Schweißdrüsen entstehen. Wir untersuchen, wie Hautstammzellen auf verschiedene Signale aus ihrer Umgebung reagieren und orchestrieren die Veränderungen von Chromatin, Transkription, Translation, Zellpolarität, Adhäsion und Zytoskelett-Dynamik bei der normalen Hautentwicklung, Homöostase und Wundheilung. Die Aufklärung des normalen Prozesses der Gewebedynamik liefert uns eine Grundlage, um zu verstehen, wie diese Prozesse beim Altern sowie bei genetischen Hautkrankheiten, einschließlich chronischer Wundheilung, hyperinflammatorischer Erkrankungen und Krebs, schief gehen Screens und testen die funktionale Relevanz unserer Erkenntnisse. Wir werden jedoch auch durch unsere Fähigkeit unterstützt, epitheliale Stammzellen aus menschlicher und Maushaut unter Bedingungen zu kultivieren, unter denen sie ihre Fähigkeit zur Geweberegeneration nach der Transplantation beibehalten. In unseren Forschungsansätzen nutzen wir ein breites Spektrum an Techniken aus der Zell-, Molekular- und Entwicklungsbiologie.

Bitte sehen Sie sich den Film zur Bildung der Epidermis in unserem Multimedia-Bereich an.

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Clostridium perfringens Enterotoxin

Kurze Einführung in die Zelltodwege von Säugetieren

Säugetierzellen reagieren manchmal auf tödliche Angriffe, indem sie Apoptose auslösen, einen programmierten Zelltod mit Aktivierung spezifischer Proteasen (oft Caspase 3/7), Kernkondensation und Spaltung der DNA in ein leiterartiges Spaltungsmuster von 200 bp-Schritten (Majno und Joris , 1995). Die Apoptose beinhaltet oft (wenn auch nicht immer) eine Depolarisation der mitochondrialen Membran und eine anschließende Cytochrom-C-Freisetzung. Wenn sie auftritt, kann die Depolarisation der mitochondrialen Membran entweder aus einer Caspase-Aktivierung resultieren (d. h. ein Caspase-abhängiger Prozess sein) oder kann selbst die Caspase-Aktivierung auslösen (d. h. ein Caspase-unabhängiger Prozess sein).

Alternativ können Säugerzellen, die extremen Angriffen ausgesetzt sind, eine Onkose entwickeln (früher als Nekrose bezeichnet), die einen chaotischen Zusammenbruch der zellulären Integrität darstellt, der von einer zufälligen Spaltung der DNA in einem „gescherten“ Muster begleitet wird (Majno und Joris, 1995). Onkose beinhaltet weder eine Depolarisation der mitochondrialen Membran noch eine Cytochrom-C-Freisetzung und kann oft vorübergehend durch Glycin blockiert werden. Eine spezielle Form der Onkose, Pyrotose genannt, erfordert eine Caspase-1-Aktivierung (Cookson und Brennan, 2001).


Puffer

Die meisten Zellen in unserem Körper arbeiten innerhalb eines sehr engen Fensters der pH-Skala, typischerweise im Bereich von 7,2 bis 7,6. Liegt der pH-Wert des Körpers außerhalb dieses Bereichs, funktioniert das Atmungssystem ebenso wie andere Organe im Körper. Zellen funktionieren nicht mehr richtig und Proteine ​​werden abgebaut. Abweichungen außerhalb des pH-Bereichs können zum Koma oder sogar zum Tod führen.

Wie kommt es also, dass wir saure oder basische Stoffe aufnehmen oder einatmen können und nicht sterben? Puffer sind der Schlüssel. Puffer absorbieren leicht überschüssiges H + oder OH – , wodurch der pH-Wert des Körpers sorgfältig in dem oben genannten engen Bereich gehalten wird. Kohlendioxid ist Teil eines bedeutenden Puffersystems im menschlichen Körper, das den pH-Wert im richtigen Bereich hält. Dieses Puffersystem beinhaltet Kohlensäure (H2CO3) und Bicarbonat (HCO3 – ) Anion. Wenn zu viel H + in den Körper gelangt, verbindet sich Bikarbonat mit dem H +, um Kohlensäure zu bilden und die Abnahme des pH-Werts zu begrenzen.

Auch wenn zu viel OH – in das System eingeführt wird, dissoziiert Kohlensäure schnell in Bicarbonat und H + -Ionen. Die H + -Ionen können sich mit den OH – -Ionen verbinden, wodurch der pH-Anstieg begrenzt wird. Während Kohlensäure ein wichtiges Produkt dieser Reaktion ist, ist ihre Anwesenheit nur flüchtig, da die Kohlensäure bei jeder Atmung als Kohlendioxidgas aus dem Körper freigesetzt wird. Ohne dieses Puffersystem würde der pH-Wert in unserem Körper zu stark schwanken und wir würden nicht überleben.

Zusammenfassung: Puffer, pH, Säuren und Basen

Der pH-Wert einer Lösung ist ein Maß für die Konzentration von Wasserstoffionen in der Lösung. Eine Lösung mit vielen Wasserstoffionen ist sauer und hat einen niedrigen pH-Wert. Eine Lösung mit einer hohen Anzahl an Hydroxidionen ist basisch und hat einen hohen pH-Wert. Die pH-Skala reicht von 0 bis 14, wobei ein pH-Wert von 7 neutral ist. Puffer sind Lösungen, die pH-Änderungen mäßigen, wenn dem Puffersystem eine Säure oder Base zugesetzt wird. Puffer sind in biologischen Systemen wegen ihrer Fähigkeit, konstante pH-Bedingungen aufrechtzuerhalten, wichtig.

Übungsfrage

Mit einem pH-Meter finden Sie den pH-Wert einer unbekannten Lösung auf 8,0. Wie würden Sie diese Lösung beschreiben?

Der pH-Wert von Zitronensaft beträgt etwa 2,0, während der pH-Wert von Tomatensaft etwa 4,0 beträgt. Wie stark erhöht sich die Wasserstoffionenkonzentration ungefähr zwischen Tomatensaft und Zitronensaft?


Körpertemperatur

Körpermasse und Temperatur sind primäre Determinanten der Stoffwechselrate (Gillooly et al., 2001). Obwohl es bei Endothermen keinen funktionellen Zusammenhang zwischen der Stoffwechselrate und TB innerhalb der thermisch neutralen Zone, in der der BMR gemessen wird, wurden wiederholt Versuche unternommen, die BMR-Unterschiede zwischen Vögeln und Säugetieren sowie Eutheriern und Beuteltieren anhand von Unterschieden in zu erklären TB (Hemmingsen, 1960 Dawson und Hulbert, 1970 White und Seymour, im Druck). Bei Endothermen wird der BMR-Spiegel durch Faktoren bestimmt, die derzeit ungewiss sind, aber anscheinend mit der Zellfunktion zusammenhängen (Hulbert und Else, 2000), während TB wird eindeutig vom Zentralnervensystem reguliert (Bligh, 1976). Wie definiert, berücksichtigen die Messbedingungen für BMR nicht TB Unterschiede zwischen den Arten, daher sollte die beschreibende Skalierung der BMR nicht dafür kompensiert werden. Eine Kompensation ist jedoch erforderlich, wenn Gruppen verglichen werden, die sich in TB oder die Suche nach einheitlichen Erklärungen für Skalierungseffekte, die nicht von TB. TB ist stark korreliert (R≈0,55) mit der Restvariation des BMR von Säugetieren (White und Seymour, 2003) und bei Normalisierung auf einen gemeinsamen TB nach dem Q10 Prinzipiell unterscheiden sich die BMR-Werte von Vögeln und Säugetieren weder im allometrischen Koeffizienten noch im Exponenten, noch unterscheiden sich die BMR-Werte von Eutheriern und Beuteltieren (White und Seymour, im Druck). Ein Ansatz, der Rechnung trägt TB Unterschiede hat zwei weitere Vorteile: Erstens ermöglicht es die Untersuchung des Einflusses der Körpermasse auf den BMR ohne den verwirrenden Einfluss von TB, die auch positiv mit der Körpermasse korreliert (Withers et al., 2000 White and Seymour, 2003). Zweitens, die Aufnahme von TB in prädiktive multiple Regressionsmodelle ermöglicht eine verbesserte Schätzung des BMR, wenn sowohl Körpermasse als auch Temperatur verfügbar sind.


Biologie

Trematoden (Egel) Opisthorchis viverrini (südostasiatischer Leberegel) und Opisthorchis felineus (Katzenleberegel).

Lebenszyklus:

Die erwachsenen Egel legen voll entwickelte Eier ab, die mit dem Kot ausgeschieden werden. Nach Aufnahme durch eine geeignete Schnecke (erster Zwischenwirt) setzen die Eier Mirazidien frei, die in der Schnecke mehrere Entwicklungsstadien durchlaufen (Sporozysten, Redien, Zerkarien). Zerkarien werden von der Schnecke freigesetzt und dringen in Süßwasserfische (zweiter Zwischenwirt) ein und kapseln sich als Metazerkarien in den Muskeln oder unter den Schuppen ein. Der Endwirt der Säugetiere (Katzen, Hunde und verschiedene fischfressende Säugetiere einschließlich des Menschen) wird durch die Aufnahme von rohem Fisch, der Metazerkarien enthält, infiziert. Nach der Einnahme exzystieren die Metazerkarien im Zwölffingerdarm und steigen durch die Vater-Ampulle in die Gallengänge auf, wo sie sich anheften und sich zu Erwachsenen entwickeln, die nach 3 bis 4 Wochen Eier legen. Die erwachsenen Egel (O. viverrini: 5 mm bis 10 mm mal 1 mm bis 2 mm O. felineus: 7 mm bis 12 mm mal 2 mm bis 3 mm) befinden sich in den Gallen- und Pankreasgängen des Säugetierwirts, wo sie an der Schleimhaut anhaften.


Biosynthese und Biologie von Säugetier-GPI-verankerten Proteinen

Mindestens 150 menschliche Proteine ​​sind Glycosylphosphatidylinositol-verankerte Proteine ​​(GPI-APs). Die Proteineinheit von GPI-APs, denen Transmembrandomänen fehlen, ist an der Plasmamembran verankert, wobei GPI kovalent an den C-Terminus gebunden ist. Der GPI besteht aus den konservierten Kern-Glykan-, Phosphatidylinositol- und Glykan-Seitenketten. Die gesamte GPI-AP ist durch Einfügung von Fettketten von Phosphatidylinositol an der äußeren Klappe der Lipiddoppelschicht verankert. Aufgrund der GPI-abhängigen Membranverankerung haben GPI-APs einige einzigartige Eigenschaften. Das auffälligste Merkmal von GPI-APs ist ihre Assoziation mit Membranmikrodomänen oder Membranrafts. In polarisierten Zellen wie Epithelzellen werden viele GPI-APs ausschließlich in den apikalen Oberflächen exprimiert, während einige GPI-APs bevorzugt in den basolateralen Oberflächen exprimiert werden. Mehrere GPI-APs fungieren als transzytotische Transporter, die ihre Liganden von einem Kompartiment zum anderen transportieren. Einige GPI-APs werden nach Spaltung innerhalb des GPI durch eine GPI-spezifische Phospholipase oder eine Glykosidase von der Membran abgelöst. In diesem Aufsatz werde ich das aktuelle Verständnis der GPI-AP-Biosynthese in Säugerzellen zusammenfassen und Beispiele für GPI-abhängige Funktionen von Säuger-GPI-APs diskutieren.

1. Einleitung

Mindestens 150 menschliche Proteine ​​sind Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteine ​​(GPI-APs) [1]. GPI-APs sind integrale Membranproteine, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind. Die Proteineinheit von GPI-APs ist im Grunde hydrophil ohne Transmembrandomänen und ist an der Plasmamembran (PM) verankert, wobei die GPI-Einheit kovalent an den C-Terminus gebunden ist (Abbildung 1). Die Größen der Proteine ​​reichen von nur 12 Aminosäuren (CD52 [2]) bis über 200 kDa (Alpha-Tectorin [3]). Ihre Funktionen variieren ebenfalls, einschließlich hydrolytischer Enzyme, Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, Proteaseinhibitoren, Komplementregulatoren und Prionen (Tabelle 1).

Abbildung 1. Säugetier-GPI-APs. Das konservierte Kernglycan von Säugetier-GPI, das aus EtNP, das an das Protein gebunden ist, drei Mans, EtNP, das an Man1 gebunden ist, und GlcN besteht, ist an die Lipideinheit, die PI ist, gebunden. In einigen GPI-APs wird das Kernglycan durch Man4- und/oder GalNAc-Seitenketten modifiziert. Die GalNAc-Seitenkette kann durch Gal und Sia verlängert werden. Das gesamte GPI-AP ist nur durch Kohlenwasserstoffketten von PI an der Außenblättchen von PM verankert.

Tabelle 1. Beispiele für Säugetier-GPI-APs.

Die GPI-Einheit von GPI-APs besteht aus dem konservierten Kernglycan, Phosphatidylinositol (PI) und Glycan-Seitenketten. Die Struktur des Kernglycans ist EtNP-6Manα2-Manα6-(EtNP)2Manα4-GlNα6-myoIno-P-Lipid (EtNP, Ethanolaminphosphat Man, Mannose GlcN, Glucosamin Ino, Inositol) [4] (Abbildung 1). Der GPI ist mit dem C-Terminus über eine Amidbindung verbunden, die zwischen der C-terminalen Carboxylgruppe und einer Aminogruppe des endständigen EtNP erzeugt wird [4]. Das gesamte GPI-AP ist durch Insertion von Kohlenwasserstoffketten von PI am äußeren Flügel der Lipiddoppelschicht verankert (Abbildung 1).

Die GPI-Verankerung ist eine posttranslationale Modifikation. Der Kern-GPI wird auf der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) aufgebaut und unmittelbar nach ihrer ER-Translokation en bloc auf die Vorläuferproteine ​​übertragen (Abbildung 2). Die entstehenden GPI-APs, bei denen die GPI-Struktur noch nicht ausgereift ist, durchlaufen mehrere Umbauschritte im ER und im Golgi-Apparat (Abbildung 3). Bei vielen GPI-APs wird dem Golgi ein Seitenketten-Glycan hinzugefügt. Schließlich werden GPI-APs zum PM transportiert (Abbildung 3).

Abbildung 2. Biosynthese von Säugetier-GPI im ER. Die vollständige GPI-Vorstufe, die für die Anlagerung an Proteine ​​zuständig ist, wird aus PI durch schrittweise Reaktionen (1)–(11) synthetisiert. Die Man4-Seitenkette wird im ER an einige GPI angehängt (Schritt (12)). Der vorassemblierte GPI wird en bloc auf Proteine ​​übertragen (Schritt (13)). Gene, die an diesen Reaktionsschritten beteiligt sind, sind unter den Schrittnummern gezeigt.

Abbildung 3. Reifung von Säugetier-GPI-APs während des ER-PM-Transports. Entstehende GPI-APs, die durch den Transfer von GPIs auf Proteine ​​(Schritt 12) erzeugt werden, durchlaufen zwei Reaktionen, Inositol-Deacylierung (Schritt 14) und Entfernung der EtNP-Seitenkette von Man2 (Schritt 15) im ER. Der ER-Golgi-Transport von GPI-APs wird durch COPII-beschichtete Vesikel vermittelt (Schritt 16). Im Golgi-Apparat unterliegen GPI-APs einem Fettsäure-Remodeling (Schritte 17 und 18). Einige GPI-APs werden durch die GalNAc-Seitenkette modifiziert (Schritte 19–21). Die reifen GPI-APs werden zum PM transportiert, wo sie mit Raft-Mikrodomänen assoziiert werden. Gene, die an diesen Reaktionsschritten beteiligt sind, sind unter den Schrittnummern gezeigt.

Aufgrund der GPI-abhängigen Membranverankerung haben GPI-APs einige einzigartige Eigenschaften. Ein herausragendes Merkmal von GPI-APs ist ihre Assoziation mit Membranmikrodomänen oder Membranrafts [5,6]. Die Membranmikrodomänen sind dynamische Domänen von 20–100 nm Breite [7]. Sphingolipide und Cholesterin sind in den Mikrodomänen im äußeren Segel der Lipiddoppelschicht angereichert. Es wird angenommen, dass GPI-APs über Lipid-Lipid- und Glykan-Glykan-Wechselwirkungen mit Glykosphingolipiden und Cholesterinen assoziieren. Für Lipid-Lipid-Wechselwirkungen sind gesättigte Lipidketten sowohl von Sphingolipiden als auch von GPI-Ankern entscheidend [8,9]. Innerhalb der Membranmikrodomänen bilden GPI-APs Dimere mit einer Halbwertszeit von 100 ms [10]. Für die Bildung des GPI-AP-Homodimers sind Protein-Protein-Wechselwirkungen entscheidend [10,11]. GPI-APs-haltige Mikrodomänen werden durch kortikales Aktin reguliert [12]. Für die Regulation durch kortikales Aktin ist die Transbilayer-Interaktion zwischen der Lipideinheit von GPI-APs im äußeren Segel und Phosphatidylserin im inneren Segel entscheidend [13]. Tyrosinkinasen der Src-Familie [14] und andere Proteine ​​wie Phospholipase Cγ (PLCγ) sind mit Membranmikrodomänen im inneren Segel verbunden. Bei der Ligation bilden GPI-APs größere Cluster, die zur Aktivierung von Src-Tyrosin-Kinasen und PLCγ führen [15,16].

In polarisierten Zellen wie Epithelzellen werden viele GPI-APs ausschließlich in den apikalen Oberflächen exprimiert [17], während einige GPI-APs bevorzugt in den basolateralen Oberflächen exprimiert werden [18] (siehe Übersichtsartikel zu den Mechanismen der GPI-AP-Sortierung [ 19–22]). Mehrere GPI-APs fungieren als transzytotische Transporter, die ihre Liganden von einem Kompartiment in ein anderes transportieren [23–25]. Einige GPI-APs werden nach Spaltung innerhalb des GPI durch eine GPI-spezifische Phospholipase oder eine Glykosidase von der Membran abgestoßen [26–29].

In diesem Aufsatz werde ich das aktuelle Verständnis der GPI-AP-Biosynthese in Säugerzellen zusammenfassen und Beispiele für GPI-abhängige Funktionen von Säuger-GPI-APs diskutieren.

2. Biogenese von GPI-APs: posttranslationale Modifikation von Proteinen mit dem GPI, vermittelt durch GPI-Transamidase

2.1. Translokation der Vorläuferproteine ​​in das ER

Die Vorläuferproteine ​​von GPI-APs, Präproproteine, besitzen ein N-terminales Signalpeptid für die ER-Translokation und ein C-terminales Signalpeptid für die GPI-Anlagerung (Abbildung 4) [30]. Das aus etwa 20 hydrophoben Aminosäuren bestehende N-terminale Signalpeptid ähnelt denen anderer sekretorischer Proteine ​​[30]. Das C-terminale GPI-Anheftungssignalpeptid umfasst 20–30 Aminosäuren, beginnend mit der Aminosäure ω+1 (die Aminosäure, an die GPI angehängt ist, wird als Aminosäure der -Stelle bezeichnet [30]). Das GPI-Anheftungssignalpeptid besteht aus einer Strecke von etwa 10 hydrophilen Aminosäuren und einer Strecke von etwa 20 hydrophoben Aminosäuren. Aminosäuren an der -Stelle sind immer klein, einschließlich Ser, Asn, Asp, Ala, Gly, Cys und Thr, und die ω+2-Aminosäure ist ebenfalls klein [31–33]. In einigen GPI-APs wurden mehr als zwei ω-Stellen identifiziert [33]. Das GPI-Anheftungssignalpeptid kann die GPI-Anheftung an Nicht-GPI-APs dirigieren, wenn es an den C-Terminus fusioniert ist (weitere Diskussion siehe Übersicht [34]). Bei der Translokation eines Präproproteins in das ER-Lumen wird das N-terminale Signalpeptid von den Proproteinen erzeugenden Vorläufern entfernt (Abbildung 4). Das C-terminale Signalpeptid wird von der GPI-Transamidase erkannt, die es spaltet und durch Transamidierung durch ein vormontiertes GPI ersetzt, wodurch entstehende GPI-APs erzeugt werden [30,35,36].

Abbildung 4. Schritte in der Biogenese von GPI-APs. Das Präproprotein von GPI-AP besitzt das N-terminale Signalpeptid für die ER-Lokalisierung (brauner Kasten) und das C-terminale Signalpeptid für die Anlagerung von GPI (gelber Kasten). Die ω-Stelle ist der Aminosäurerest, an den GPI gebunden ist. Bei der Translokation in das ER wird das N-terminale Signalpeptid abgespalten, wodurch Proprotein entsteht. Vormontiertes GPI wird an die ω-Stelle angeheftet, indem das C-terminale Signalpeptid durch GPI-Transamidase ersetzt wird, wodurch naszierendes GPI-AP erzeugt wird. Entstehendes GPI-AP durchläuft Reifungsreaktionen, um zu reifem GPI-AP zu werden.

Die Mechanismen der ER-Translokation von zwei GPI-APs, dem Prionprotein und CD59, sind unterschiedlich. Das Prion benötigt Sec62 und Sec63, während CD59 dies nicht tut [37,38]. Die Abhängigkeit des Prions von Sec62 und Sec63 wird durch seine N-terminale Signalsequenz bestimmt [37]. Studien zur ER-Translokation von Saccharomyces cerevisiae GPI-APs zeigten, dass ihre ER-Translokation hauptsächlich Sec62- und Sec63-abhängig ist [39]. Die Studie zeigte weiterhin, dass sie über einen posttranslationalen Mechanismus in das ER transloziert werden, zu dem auch das C-terminale GPI-Anheftungssignalpeptid beiträgt [39]. Bei der Vorstufe von GPI-APs, die ein stark hydrophobes C-terminales Peptid trägt, sind Komponenten des GET-Wegs beteiligt, die eine Rolle beim ER-Einbau von am Schwanz verankerten Proteinen spielen [40]. Die SRP-abhängige cotranslationale ER-Translokation spielt im Vergleich zu einem posttranslationalen Mechanismus in Hefe eine untergeordnete Rolle [39]. Ob die ER-Translokation von Säuger-GPI-APs außer dem Prion-Protein durch einen post- oder co-translationalen Mechanismus vermittelt wird, muss noch charakterisiert werden.

2.2. GPI-Transamidase

GPI-Transamidase ist ein ER-residenter Enzymkomplex, der die GPI-Anker-Anheftung an Proteine ​​vermittelt [41,42]. Die GPI-Transamidase spaltet das GPI-Anheftungssignalpeptid zwischen den - und ω + 1-Aminosäuren und erzeugt ein Substrat-Enzym-Zwischenprodukt, das durch eine Thioesterbindung zwischen der ω-Aminosäure-Carboxylgruppe und einer katalytischen Cysteinseitenkette des Enzyms verbunden ist. Die Thioesterbindung wird von einer Aminogruppe des terminalen EtN von GPI angegriffen, wodurch ein Transfer von GPI durch Transamidierung vollzogen wird [35].

Die GPI-Transamidase besteht aus fünf Untereinheiten, PIGK (anfänglich als GPI8 bezeichnet [43], GPAA1 (anfänglich als GAA1 bezeichnet) [44], PIGS [45], PIGT [45] und PIGU [46] (Tabelle 2). PIGK, ein einzelnes Transmembranprotein, ist eine Cysteinprotease, die das C-terminale Peptid spaltet und ein Carbonyl-Zwischenprodukt bildet [43]. GPAA1, ein multiples Transmembranprotein mit Sequenzhomologie zu einem Peptid-bildenden Enzym der M28-Familie, scheint die Bildung einer Amidbindung zwischen der ω-Aminosäure und dem EtN von GPI zu katalysieren [47]. PIGT, ein einzelnes Transmembranprotein, assoziiert mit PIGK über eine Disulfidbrücke und spielt dadurch eine Rolle bei der Komplexbildung [48]. Die Rollen von PIGS und PIGU, die beide multiple Transmembranproteine ​​sind, sind unbekannt geblieben, jedoch sind beide für die Aktivität der GPI-Transamidase essentiell [45].

Tabelle 2. Säugetierproteine, die an der GPI-AP-Biogenese beteiligt sind.

2.3. Biosynthetischer Aufbau von GPI-Vorstufen

Die Biosynthese von GPI ist eine schrittweise Abfolge von 11 Reaktionen (Abbildung 2 und Tabelle 2). Der Stoffwechselweg wird auf der zytoplasmatischen Seite des ER durch die GPI-N-Acetylglucosaminyl-Transferase (GPI-GnT) initiiert, die den Transfer von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) von Uridindiphosphat (UDP)-GlcNAc zur 6-Position von Inositol zu katalysiert erzeugen GlcNAc-PI. GPI-GnT ist die komplexeste Monoglycosyltransferase, bestehend aus sieben Untereinheiten, PIGA [49], PIGC [50], PIGH [51], PIGQ (ursprünglich als GPI1 bezeichnet) [52], PIGP [53], PIGY [54] und DPM2 [53], von denen PIGA eine katalytische Untereinheit ist. PIGC, PIGH, PIGP und PIGY sind essentiell für die Aktivität von GPI-GnT, obwohl ihre spezifischen Funktionen nicht klar sind [50,51,53,54]. PIGQ stabilisiert einen Kernkomplex von PIGA, PIGC und PIGH [55], während DPM2 die GPI-GnT-Aktivität um das Dreifache erhöht [53]. GlcNAc-PI wird durch PIGL, eine ER-residente GPI-Deacetylase, die das zweite Zwischenprodukt Glucosaminyl (GlcN)-PI erzeugt, de-N-acetyliert [56,57]. GlcN-PI kippt in die luminale Seite, der Mechanismus des Kippens ist unbekannt. Die 2-Position des Inositolrings von GlcN-PI wird durch die Acyltransferase PIGW, ein multiples Transmembranprotein, acyliert, um GlcN-(Acyl)PI zu erzeugen [58]. Die funktionell wichtigen Aminosäuren in PIGW und seinem Hefeortholog Gwt1p befinden sich auf der luminalen Seite, was darauf hindeutet, dass Palmitoyl-CoA auf der luminalen Seite verfügbar ist [58,59].

PI, GlcNAc-PI und GlcN-PI in Säugerzellen enthalten Diacylglycerin, während GlcN-(Acyl)PI 1-Alkyl-2-acylglycerin als Hauptform und Diacylglycerin als Nebenform enthält, was darauf hindeutet, dass Diacyl zu 1-Alkyl-2 -Acyl Lipid Remodeling tritt im Stadium von GlcN-(Acyl)PI auf [60]. Die Fettacylkettenanalyse zeigte, dass sich die Kettenzusammensetzung von Diacylglycerin von GlcN-(Acyl)PI deutlich von der von PI, GlcNAc-PI und GlcN-PI unterscheidet [61]. In letzterem ist 1-Stearoyl-2-arachidonoyl (38:4) PI bei weitem die häufigste Form. Im Gegensatz dazu hatten weniger als 30 % von GlcN-(Acyl)PI eine Kettenzusammensetzung von 38:4, während der Rest von GlcN-(Acyl)PI Kettenzusammensetzungen von 36:4, 38:5 und 40:5 aufwies. es ist sehr wahrscheinlich, dass es sich beim Lipid-Remodeling um ein Diacyl-zu-Diradyl-Remodelling handelt, bei dem nicht nur 1-Alkyl-2-acyl-PI, sondern auch Diacyl-GlcN-(Acyl)PI die umgebauten Produkte sind [61]. Zur Erzeugung der 1-Alkyl-2-acyl-Form ist ein Syntheseweg für 1-Alkylphospholipid im Peroxisom erforderlich [61]. Obwohl die genaue enzymatische Reaktion des Lipid-Remodeling unklar ist, ist es denkbar, dass entweder die Diacylglycerin- oder die Diacylphosphatidyl-Einheit durch eine entsprechende Diradyl-Struktur ersetzt wird. Ein Donor der Diradylstruktur ist ebenfalls unbekannt, jedoch ist die Fettkettenzusammensetzung von GlcN-(Acyl)PI etwas ähnlich der von Diradylphosphatidylethanolaminen (PE), was auf ihren möglichen Beitrag hindeutet [61].

Zwei Mannosen (Man1 und Man2) werden nacheinander von Dolichol-Phosphat-Mannose (Dol-P-Man) auf GlcN-(Acyl)PI übertragen, um Manα6Manα4GlcN-(Acyl)PI zu erzeugen. PIGM und PIGV sind GPI-Mannosyltransferase (MT) I bzw. II, die diese Reaktionen katalysieren [62,63]. PIGM funktioniert in Verbindung mit PIGX, das PIGM stabilisiert [64]. GPI-Ethanolamintransferase I (ETI), PIGN, überträgt EtNP von PE auf die 2-Position des ersten, α4-verknüpften Man und erzeugt Manα6(EtNP)2Manα4GlcN-(Acyl)PI [65]. Der dritte Man (Man3) wird dann von Dol-P-Man durch PIGB übertragen, das ist GPI-MTIII, um Manα2 Manα6(EtNP)2Manα4GlcN-(acyl)PI zu erzeugen [66]. Zwei EtNPs werden nacheinander von PIGO [46] und PIGG (zunächst als GPI7 bezeichnet [67]), katalytischen Untereinheiten von GPI-ETII und GPI-ETIII, auf die 6-Positionen von Man3 und dann von Man2 übertragen. Sowohl PIGO als auch PIGG werden durch Assoziation mit PIGF stabilisiert [46,67,68]. Der resultierende EtNP6Manα2(EtNP)6Manα6(EtNP)2Manα4GlcN-(Acyl)PI ist ein reifer GPI-Vorläufer, der für die Anlagerung an Proteine ​​kompetent ist.

Der vierte Man (Man4) kann weiter von Dol-P-Man an die 2-Position von Man3 im reifen GPI-Vorläufer als Seitenkette übertragen werden, um Manα2(EtNP)6Manα2 (EtNP)6Manα6(EtNP)2Manα4GlcN-(acyl .) zu erzeugen )PI, das auch für die Bindung an Proteine ​​zuständig ist. Der Transfer von Man4 wird durch PIGZ (zunächst als SMP3 bezeichnet), GPI-MTIV vermittelt [69]. Alle vier GPI-MTs (PIGM, PIGV, PIGB und PIGZ) sind multiple Transmembranproteine, die katalytische Zentren innerhalb der luminalen Regionen tragen [63]. Drei GPI-ETs (PIGN, PIGO und PIGG) sind ebenfalls mehrere Transmembranproteine, die katalytische Zentren innerhalb der luminalen Regionen tragen [67]. Die bioinformatische Studie identifizierte eine gemeinsame GPI-Erkennungsregion in Transmembrandomänen von PIGW, PIGM, PIGV, PIGB, PIGZ, PIGN, PIGO und PIGG und schlug eine Genfamilie vor, die diese umfasst [70].

3. GPI-AP-Reifungsweg und ER-zu-Golgi-Transport von GPI-APs

3.1. GPI-Remodeling im ER- und ER-to-Golgi-Transport

Die GPI-Einheit in den entstehenden GPI-APs ist in ihrer Struktur unreif und durchläuft Umbaureaktionen, um während des Transports zum PM reif zu werden (Abbildung 3 und Tabelle 2). Kurz nach der Erzeugung der entstehenden GPI-APs wird die mit dem Inositolring verbundene Acylkette normalerweise durch die GPI-Deacylase PGAP1 (für Post GPI Attachment to Proteins 1), ein ER-residentes multiples Transmembranprotein entfernt [71]. In einigen Fällen verbleibt die Acylkette in den reifen GPI-APs [72]. Beispielsweise erhalten GPI-APs in Erythrozyten die Inositol-verknüpfte Acylkette [73,74]. GPI-APs mit (Acyl)PI mit drei Kohlenwasserstoffketten assoziieren stabiler mit der Membran als solche mit PI mit zwei Kohlenwasserstoffketten. The former structure might be useful for maintaining levels of GPI-APs during the very long life of erythrocytes by reducing spontaneous release from the PM.

While still in the ER, EtNP linked to Man2 is removed by a phosphodiesterase PGAP5/MPPE1 [75]. PGAP5, a membrane protein bearing two transmembrane domains, exists near the ER exit sites in the ER and in the ERGIC [75]. After the remodelling of the GPI by PGAP1 and PGAP5, GPI-APs are recruited into the COPII-coated transport vesicles that are directed towards the Golgi apparatus [75,76]. A complex of p24α2, p24β1, p24γ2 and p24δ1 of the p24 family of proteins acts as a cargo receptor for recruitment of GPI-APs into the transport vesicles at the ER exit sites [76–78]. The remodelling reactions by PGAP1 and PGAP5 are important to generate the proper structure of the GPI for association with the cargo receptor [76]. A defect in PGAP1 or PGAP5 results in slowed transport of GPI-APs from the ER to the Golgi. After arrival at the Golgi, GPI-APs are released from the cargo receptors under acidic conditions.

3.2. Fatty acid remodelling in the Golgi

As described in the previous section, the PI moiety of GPI-APs is initially derived from cellular PI and is subjected to lipid remodelling at the stage of GlcN-(acyl)PI, in which the original diacyl PI moiety is remodelled to a mixture of diacyl and 1-alkyl-2-acyl PIs, with the latter being the major form [60,61] (step 5 in figure 2). The fatty chain composition of the remodelled diradyl PI should correspond to that in the donor lipid, possibly PE, used in the lipid remodelling reaction [61]. The alkyl chain and the 1-acyl chain in the diradyl PIs are mostly saturated C18 or C16 alkyl and C18 acyl chains, whereas the 2-acyl chains are unsaturated fatty acids of the C16–C24 chains [61]. In the Golgi apparatus, the unsaturated 2-acyl chain is replaced with a saturated fatty acid, mostly stearic acid by fatty acid remodelling [79] (steps 17 and 18 in figure 3). In the first step of the fatty acid remodelling, the unsaturated 2-acyl chain is removed by a GPI-specific phospholipase A2 PGAP3, a Golgi-resident multiple transmembrane protein, generating a lyso form intermediate [79]. In the second step, a saturated chain is transferred back to the sn2-position. PGAP2, a multiple transmembrane Golgi protein, is required for the reacylation [80]. Whether PGAP2 is the acyltransferase itself remains unclear.

As described in the Introduction, GPI-APs are typical components of membrane microdomains or rafts on the cell surface. In the outer leaflet of the PM, GPI-APs interact with glycosphingolipids and cholesterol forming dynamic membrane microdomains of 20–100 nm. Presumably, microdomains are formed through lipid–lipid interactions. The fatty acid remodelling that forms GPI-APs bearing two saturated fatty chains is critical for raft association of GPI-APs [79].

3.3. Side chain modification

In many GPI-APs, βGalNAc is transferred to the 4-position of Man1 as a side chain [81]. This modification occurs in the Golgi after fatty acid remodelling (figure 3) [82]. The GalNAc side chain can be elongated by β1–3Gal and Sia (figure 3) [81]. Certain GPI-APs, such as Thy1 [4], always have non-elongated GalNAc as a side chain whereas other GPI-APs, such as the prion and dipeptidase, have mixed GalNAc side chains containing those without elongation and those elongated by Gal or by Gal and Sia [83,84]. The physiological and functional roles of the GalNAc side chains have remained largely unknown. For the prion, a study reported by one group indicated that Sia in the side chain is involved in the conversion of PrP c to pathogenic PrP sc [85].

Transfer of GalNAc is mediated by PGAP4/TMEM246, a Golgi-resident GPI-specific GalNAc transferase [82]. PGAP4 is widely expressed in various tissues/organs with higher expression in the brain. All Golgi-resident glycosyltransferases (GTs) are type 2 single transmembrane proteins (i.e. they have a short cytoplasmic segment at the N-terminus, followed by a transmembrane domain and a luminal catalytic GT domain [86,87]). By contrast, PGAP4 has three transmembrane domains [82]. Similar to other type 2 GTs, PGAP4 has a short cytoplasmic segment at the N-terminus that is followed by the first transmembrane domain and a GT domain. The GT domain of PGAP4, of the GT-A type, is split into two regions, and between the regions there are tandem transmembrane domains linked by a short stretch of hydrophilic residues. The tandem transmembrane domains inserted into the GT domain locate the GT domains close to the membrane, which may facilitate the interaction of the GT domain with the substrate GPI, which is inserted into the membrane. The tandem transmembrane domain might also be involved in binding the lipid moiety of the GPI [82].

Recently, the Gal transferase was identified to be B3GALT4 [88], the Golgi-resident Gal transferase previously known to synthesize GM1 from GM2 [89,90]. B3GALT4 also synthesizes GA1 and GD1 from GA2 and GD2, respectively [89]. In these substrate glycosphingolipids, position 3 of GalNAc β1–4-linked to Gal in the lactosylceramide (LacCer) moiety is the acceptor for βGal. Similarly, position 3 of GalNAc β1–4-linked to Man1 is the acceptor in the GPI for βGal. Whereas UDP-Gal and GM2 are sufficient for B3GALT4 to generate GM1, the presence of LacCer is required for Gal transfer to the βGalNAc side chain of the GPI [88]. Because LacCer is a common partial structure of the acceptor substrates of B3GALT4 (GM2, GA2 and GD2), LacCer might directly bind to B3GALT4 and might modulate substrate specificity towards GPI. Sia transferase mediating Sia transfer to the Gal-GalNAc-side chain of the GPI has not been identified.

4. Free, non-protein-linked GPI

Protozoan parasites such as Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi und Leishmanien species have non-protein-linked GPIs as free glycolipids on the cell surface (see the reviews for more details [81,91]). In mammalian cells, there have been few reports about the expression of the un-linked GPI on the cultured cell surface [92–95]. Recently, this issue was revisited [96] using a monoclonal antibody T5_4E10 that was originally generated against T. gondii free GPI [97]. T5_4E10 mAb recognizes the non-protein-linked GPI bearing the Man1-linked GalNAc side chain without Gal elongation [82]. Because the T5_4E10 antibody does not bind to the protein linked GPI, it is useful to detect the free GPI bearing non-elongated GalNAc side chain (free GPI-GalNAc from now on) in mammalian cells by flow cytometry or western blotting [96]. Relatively higher levels of free GPI-GalNAc were expressed in the pons, medulla oblongata, spinal cord, testis, epididymis and kidney of adult mice and Neuro2a and CHO cells [96]. In cells defective in GPI transamidase, high levels of free GPI-GalNAc are expressed on the cell surface. Studies using mutant CHO cells, defective in GPI transamidase and one of the genes involved in GPI maturation reactions, demonstrated that free GPIs follow the same structural remodelling pathway as do protein linked GPIs [96]. Therefore, non-protein-linked GPIs exist as glycolipids of some mammalian cell membranes. The physiological roles of the free GPIs are yet to be clarified. By contrast, the pathological effects of abnormally accumulated free GPIs in cells defective in GPI transamidase have been demonstrated in patients with PIGT mutations (see below) [98].

5. Comparison of mammalian and yeast GPI biosynthesis

In yeast S. cerevisiae, the GPI undergoes two types of lipid remodelling reaction that occur in the ER after attachment to proteins. Fatty acid remodelling of the GPI occurs to the sn2-linked acyl chain of diacyl PI, in that the C16/C18 chain is exchanged with the C26 chain by PER1- and GUP1-dependent reactions [99,100]. PER1 is orthologous to PGAP3 [79], whereas GUP1 is not orthologous to PGAP2 but is a member of the MBOAT family of acyl transferases [100]. The other lipid remodelling of the GPI is its change from a diacylglycerol form to a ceramide form. CWH43 is required for this lipid remodelling [101,102]. The ceramide form of the GPI is not known in mammalian cells however, parts of CWH43 are homologous to two mammalian proteins. The N-terminal part of CWH43 corresponds to mammalian PGAP2 [101,102], whereas the C-terminal part of CWH43 corresponds to the PGAP2-interacting protein. Although the latter is termed the PGAP2-interacting protein, there is no evidence for interaction with PGAP2. PGAP2 is localized in the Golgi whereas the PGAP2-interacting protein is localized in the ER [80]. Whether the PGAP2-interacting protein has any functional relation to mammalian GPI biogenesis, for example, involvement in lipid remodelling at the stage of GlcN-(acyl)PI, is yet to be determined.

Yeast defective in ARV1 (for A RE2 r equired for v iability 1 ) accumulates GlcN-(acyl)PI, suggesting that the first mannosylation of GPI is defective [103]. ARV1 is an ER membrane protein involved in the homeostasis of sterols [104] and sphingolipids [105]. Proper conditions for Dol-P-Man-dependent mannose transfer to GlcN-(acyl)PI might not be generated when ARV1 does not function. Mammalian ARV1 cDNA complemented ARV1-defective yeast, which shows the functional role of mammalian ARV1 [105,106]. Recently, patients with biallelic loss-of-function mutations in ARV1 have been reported [107,108]. The affected children had similar symptoms to those with inherited GPI deficiencies, such as developmental delay and seizures, which is consistent with mammalian ARV1 having a putative role in GPI biosynthesis.

Gpi18p, the yeast PIGV homologue, requires Pga1p for GPI-MTII activity [109]. Gpi18p and Pga1p form a complex. The PGA1 homologue is not found in the mammalian genome. The reason for Gpi18p, but not PIGV, requiring a partner protein is not known.

Yeast has two homologues of PGAP5: TED1 and CDC1. Like PGAP5, TED1 is involved in the removal of EtNP from Man2 [110] whereas CDC1 is required for the removal of EtNP from Man1 [111]. In mammalian cells, EtNP linked to Man1 remains as a conserved side chain in mature GPI-APs. By contrast, some yeast GPI-APs do not have EtNP on Man1. There is a hypothesis that the removal of EtNP from Man1 is necessary for the incorporation of GPI-APs into the cell wall (see [112] for further discussion).

6. Quality control of GPI-APs

When the precursor proteins of GPI-APs are not processed by GPI transamidase for GPI attachment, they are retrotranslocated for degradation by ubiquitin- and proteasome-dependent ER-associated degradation (ERAD) [113]. It is likely that the GPI attachment signal sequence is recognized as an unfolded region, which leads to ubiquitination.

By contrast, when protein folding fails after attachment of the GPI, the misfolded GPI-APs are mainly transported out of the ER for degradation in the lysosomes [114,115]. The process is termed RESET (for rapid ER stress-induced export) [114]. When the ER stress is induced by thapsigargin, the RESET pathway functions efficiently. The ER exit of the misfolded GPI-APs is facilitated by p24 family proteins, which act as cargo receptors of GPI-APs. The misfolded GPI-APs appear transiently on the cell surface before degradation [114]. During the transport through the secretory pathway, misfolded GPI-APs are escorted by ER-derived chaperones, such as BiP and calnexin, and p24 proteins [116]. Most GPI-APs have at least one N-glycan and their folding is mediated by N-glycan-dependent calnexin cycle [117]. Calnexin also binds to PGAP1 and facilitates PGAP1-mediated removal of the acyl chain from inositol [117]. When the calnexin cycle is inefficient, GPI-APs bearing inositol-linked acyl chain appear on the cell surface.

In yeast, misfolded GPI-APs are targeted to ERAD to some extent, while a sizable fraction of the misfolded GPI-APs exit the ER for degradation in vacuoles [115,118]. For efficient ER–Golgi transport of GPI-APs mediated by p24 cargo receptors, remodelling of both lipid and glycan moieties is required [119]. These GPI remodelling reactions occur even when the protein moiety is misfolded, allowing efficient recruitment into COPII-coated transport vesicles. In this regard, quality control of GPI-APs in the ER is limited and the misfolded GPI-APs pass other compartments in the secretory pathway [115].

7. Shedding of GPI-APs mediated by GPI cleaving/processing enzymes (GPIases)

A prominent characteristic of GPI-APs is their shedding from the cell surface. There are several pairs of GPI-APs and GPI cleaving/processing enzymes, GPIases, that are responsible for their shedding. RECK (for reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) is a GPI-anchored inhibitor of matrix metalloproteinases, such as MMP-9 and ADAM10 [120]. GDE2 is a member of the glycerophosphodiester phosphodiesterase family, having six transmembrane domains and an extracellular phosphodiester domain [121]. There is evidence that GDE2 has RECK-specific GPI phospholipase C activity [26]. RECK suppresses ADAM10 on certain neuronal progenitor cells [122]. When RECK is released by GDE2, ADAM10 cleaves a Notch ligand, such as the Delta-like 1, on the same cell, which in turn shuts down Notch signalling into the neighbour neuronal progenitor cell, leading to initiation of neuronal differentiation [26,123].

The urokinase receptor (uPAR), a GPI-AP, mediates degradation of the extracellular matrix through protease recruitment and enhances cell adhesion, migration and invasion. Cell surface activity of the uPAR is negatively regulated by its shedding from the cell surface, which is mediated by GDE3, another member of the glycerophosphodiester phosphodiesterase family [27]. GDE3 mediates cleavage and release of the uPAR by its GPI-specific phospholipase C activity. Interestingly, the uPAR is resistant to GDE2 [27], suggesting that substrate specificities of GDE2 and GDE3 are dependent upon the protein portions of RECK and the uPAR, respectively.

PGAP6/TMEM8A is a GPI-specific phospholipase A2 expressed on the surface of some cells, including embryonic cells. PGAP6 has sequence similarity to PGAP3, a Golgi-resident GPI-specific phospholipase A2 involved in fatty acid remodelling of the GPI [28]. PGAP6 and PGAP3 belong to the CREST (for alkaline ceramidase, PAQR receptor, Per1, SID-1 and TMEM8) superfamily of hydrolases [124]. The substrate of PGAP6 is CRIPTO-1 [28], a GPI-anchored co-receptor of TGFβ receptors [125]. CRYPTIC, a GPI-AP closely related to CRIPTO-1, is resistant to PGAP6, suggesting that PGAP6 is a CRIPTO-1-specific phospholipase A2 [28]. When CRIPTO-1 and PGAP6 are expressed on the same cell, CRIPTO-1 is processed by PGAP6's phospholipase A2 activity, loses one fatty acyl chain (lyso form of GPI) and is spontaneously released from the cell surface. When GPI-specific phospholipase D (GPI-PLD) is present in the surrounding medium or is expressed in the cell, the lyso form of CRIPTO-1 is cleaved and more efficiently released [28]. The released CRIPTO-1 possessed its activity as a co-receptor of TGFβ receptors [126]. CRIPTO-1 is involved in various steps in embryogenesis. In an early mouse embryonic stage (6.5 days post coitum), Cripto-1 is essential in the generation of the anterior–posterior axis [127]. A fraction of PGAP6 knockout embryos do not form the anterior–posterior axis, confirming the critical role of PGAP6-dependent shedding of CRIPTO-1 in Nodal signalling regulation in vivo [28].

A complex of two GPI-APs, LY6 K and TEX101, is required for sperm migration into the oviduct. Males of LY6 K knockout mice and TEX101 knockout mice are infertile. Their sperm are defective in binding to an egg's zona pellucida in vitro as well as in migration into the oviduct in vivo [128]. A testis form of angiotensin-converting enzyme (ACE) is essential for the maturation of spermatids. Similar to LY6 K knockout and TEX101 knockout male mice, ACE knockout male mice are infertile and their sperm does not pass through the uterotubal junction in vivo and does not bind to the zona pellucida in vitro. ACE cleaves GPI by its putative endomannosidase activity, which seems to reside in a different site from the well-characterized carboxy dipeptidase catalytic site for conversion of angiotensin [129]. TEX101 is a specific target for the GPIase activity of ACE [29]. Shedding of TEX101 by ACE is critical for spermatozoa to become fertilization competent [29,128].

Pairs of the GPI-AP substrates and GPIases described above are examples of the protein specific cleavage/processing of the GPI. By contrast, GPI-PLD has been known for a long time as a GPIase that is active against a wide variety of GPI-APs [130,131]. However, GPI-PLD requires a detergent for its GPIase activity towards the cell surface GPI-APs [132]. As described above, GPI-PLD cleaves the lyso form of GPI-APs in the absence of a detergent, facilitating their shedding from the cell surface [28]. Further, GPI-PLD is able to cleave GPI-APs within the intracellular secretory pathway [133]. These results suggest that when GPI-APs are associated with the membrane microdomains, they are resistant to GPI-PLD. Studies with GPI-PLD knockout mice suggested that GPI-PLD generates diacylglycerol by cleaving GPI within hepatocytes where GPI-PLD expression is most abundant [134]. Diacylglycerol might activate PKCε, which in turn binds to the insulin receptor and inhibits its tyrosine kinase activity, leading to insulin resistance. GPI-PLD knockout ameliorated glucose intolerance and hepatic steatosis under a high-fat and high-sucrose diet through a reduction of diacylglycerol and a subsequent decrease of PKCε activity [134].

8. Transcytotic endocytosis of GPI-anchored receptors

Several GPI-anchored receptors act as transcytotic receptors that transport ligands from one membrane domain to another in endothelial and epithelial cells. GPIHBP1 (GPI-anchored heparin-binding protein 1) binds lipoprotein lipase (LPL) on the basolateral surface of capillary endothelial cells and transport it to the apical (vascular) surface [23]. On the apical surface of capillary endothelial cells, LPL acts on lipoproteins to liberate fatty acids to fuel tissues (see the review for further discussion [135]). Folate receptor 1, a GPI-anchored type of folate receptors, binds 5-methyltetrahydrofolate (5MHF) on the vascular (basolateral) side of the epithelial cells of the choroid plexus in the brain and is endocytosed. The folate receptor 1 and 5MHF complexes are released from the apical surface into the cerebrospinal fluid as exosomes, which then pass the ependyma and enter the brain parenchyma. This is a critical route of 5MHF incorporation from the blood to the brain parenchyma [24]. Glycoprotein 2 (GP2) is selectively expressed on the surface of M cells, cells in the mucosal lymphoid tissue Peyer's patch. GP2 is involved in sampling foreign antigens into the mucosal immune system (see the review for further discussion [136]). Botulinum toxin produced by the food-borne botulism-causing bacteria Clostridium botulinum in the intestine binds to GP2 on the apical surface of M cells and traverses the intestinal epithelial layer via transcytosis [25].

9. Lessons from GPI deficiencies

9.1. Molecular genetics of GPI deficiencies

Defective biosynthesis of the GPI is caused by several different genetic mechanisms. The first GPI deficiency that was clarified at the molecular genetics level is paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) (table 3) [137]. GPI deficiency in PNH is caused by somatic mutations in PIGA that occur in the haematopoietic stem cells (HSCs) [138]. PIGA is the only X-linked gene among all genes involved in GPI biosynthesis. Because of its X-linkage, one loss-of-function somatic mutation in PIGA causes a GPI defective phenotype [138]. This is true for both male and female cells because one X chromosome in female cells was inactivated during embryogenesis and hence a mutation in PIGA in the active X chromosome is sufficient to cause the phenotype. Because PIGA mutation exists only in the affected blood cells but not in germ cells, PNH is not an inherited disease. PIGA somatic mutations found in patients with PNH cause complete loss or a severe reduction of GPI-APs on the cell surface. It should be pointed out that the somatic PIGA mutation alone does not cause PNH because the generation of one GPI-AP-defective HSC among many hundreds of HSCs should not affect the blood system. Indeed, similar PIGA somatic mutations are found in blood granulocytes from healthy individuals [139]. When the mutant haematopoietic stem cell exhibits clonal expansion and generates large numbers of GPI-AP-defective blood cells, clinical PNH is manifested (see reviews for further discussion about clonal expansion [137]).

Table 3. Diseases caused by loss-of-function mutations in PIG and PGAP genes.

a Numbers of published patients as of December 2019.

b Chr, chromosome location.

c PNH, paroxysmal nocturnal haemoglobinuria.

e HSC, haematopoietic stem cell.

f IGD, inherited GPI deficiency.

g MCAHS, multiple congenital anomalies-hypotonia-seizures syndrome.

i DD/ID, developmental delay/intellectual disability.

l HPMRS, hyperphosphatasia mental retardation syndrome/Mabry syndrome.

Another form of GPI deficiency is inherited GPI deficiency (IGD) (table 3). The first inherited form of GPI deficiency was reported in 2006 [140]. A homozygous hypomorphic mutation in PIGM located in chromosome 1q was found in three children from two consanguineous families. The affected children suffered from seizures and thrombosis in the hepatic or portal vein. The mutation was within the promoter region of the PIGM gene and disrupted an Sp1-binding site important for PIGM transcription in some cell types, such as blood granulocytes, B-lymphocytes and fibroblasts. In those cells, the cell surface levels of some GPI-APs are reduced.

In 2010 when the application of whole-exome sequencing to rare inherited diseases became feasible, biallelic (homozygous or compound heterozygous) mutations in PIGV located in chromosome 1p were found in several affected children with Mabry syndrome, also known as hyperphosphatasia with mental retardation syndrome (HPMRS) [141]. The affected children inherited loss-of-function mutations from their parents who were heterozygotes of wild-type and mutant alleles. GPI-APs in blood cells and fibroblasts from affected individuals were partially lost by these biallelic PIGV mutations.

To date, pathogenic germ line mutations causing IGD have been found in 21 out of 27 genes in GPI biosynthesis [140–157] and the GPI-AP maturation pathway [158–161] (table 3). Inheritance of IGDs caused by mutations in autosomal genes, such as PIGB-IGD [151] and PIGC-IGD [147], is autosomal recessive. Inheritance of IGD caused by germ line mutations of PIGA (PIGA-IGD) is X-linked recessive, in which all affected individuals are boys [145]. Their mothers who were heterozygous carriers of a PIGA mutation, were phenotypically mosaic at the cell level (blood cells were mixtures of normal and GPI-AP-deficient cells) but did not have clear symptoms of IGD [162].

More recently, cases of PNH caused by mutations of PIGT were found [98,163,164]. These cases did not have the somatic PIGA mutation found in the affected blood cells from patients with PNH, but instead had biallelic loss-of-function mutations of the PIGT gene. One PIGT allele had germ line mutations whereas the other PIGT was lost by deletion of the 8–24 Mb region of chromosome 20q, which somatically occurred in a haematopoietic stem cell [98]. Therefore, GPI-APs were lost by a combination of germ line mutation and somatic mutation. The somatic mutation is always caused by a Mb scale deletion because simultaneous deletion of the myeloid common deleted region [98], implicated in clonal expansion of the HSCs [165,166], is required for clinical manifestation of PIGT-PNH.

9.2. Genotype–phenotype relationship

Twenty-one genes whose mutations caused IGD cover almost all steps in the biosynthesis of the core GPI, its transfer to proteins and maturation of the GPI, for which genes are known except a step mediated by PGAP5 [140–146,149,151,153,158,161]. It seems, therefore, that every step in GPI-AP biogenesis is critical for human health. There has been no report of pathogenic mutations in genes involved in side chain modifications (i.e. PIGZ and PGAP4) therefore, it is unknown what roles the side chains of the GPI play in human health.

Complete loss of GPI biosynthesis in the whole body of the mouse caused early embryonic lethality, as demonstrated by knockout of the Piga gene [167]. Complete GPI deficiency would also cause a similar phenotype in a human being. A partial but severe reduction in GPI biosynthesis would also cause embryonic lethality. A homozygous PIGC mutation associated with a family with recurrent foetal loss seems highly likely to be such a case [168]. If the reduction in GPI biosynthesis is less severe, the outcome would be IGD. In fact, hypomorphic mutations of PIGC have been associated with epilepsy and intellectual disability [147]. As summarized in recent articles, the most prominent clinical symptoms of IGD are neurological ones, including seizures, developmental delay/intellectual disability, cerebral atrophy and hypotonia [169,170]. Many GPI-APs, such as contactins, tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP) and Thy1, are expressed on neurons, oligodendrocytes and other glial cells. Partial reduction of these GPI-APs impairs neurological development and functions, highlighting the importance of GPI-APs in the neuronal system. One example is a causal role of defective expression of TNAP in seizures [171,172]. TNAP is involved in cellular uptake of pyridoxal phosphate, active vitamin B6, where TNAP dephosphorylates pyridoxal phosphate to generate membrane permeable pyridoxal. Once in the cytoplasm, pyridoxal is reverted to pyridoxal phosphate by pyridoxal kinase and is used by many B6-dependent enzymes including GABA (γ-aminobutyric acid) synthetic enzyme. Therefore, the reduction of cell surface TNAP might result in reduced GABA synthesis, leading to the easy occurrence of seizures.

Concerning genes required for the biosynthesis of the core GPI, many mutations found in individuals with IGD are null or nearly null [173]. Heterozygotes of such null alleles in the same families are healthy, suggesting that 50% of normal levels of GPI biosynthesis may be sufficient for not causing clinical symptoms. When the null allele is combined with a hypomorphic allele, GPI levels further decrease, resulting in symptoms of IGD.

Concerning the PGAP1 and PGAP3 genes involved in the maturation of the GPI, homozygous null alleles do not cause embryonic lethality, but do cause IGD [158,161]. The cell surface levels of GPI-APs do not decrease, or only slightly decrease, in PGAP1 or PGAP3 knockout cells, whereas structures of GPI moiety in GPI-APs are different from those in wild-type cells. In PGAP1 knockout cells, the inositol-linked acyl chain remains in GPI-APs [71]. In PGAP3 knockout cells, the fatty acid remodelling does not occur (i.e. the sn2-linked fatty acid remains as unsaturated fatty acid [79]). These structural abnormalities are probably causally related to the functional impairment of certain GPI-APs, resulting in clinical symptoms. Recently, it was demonstrated that fatty acid remodelling of GPI-APs is required for the generation of nanoclusters of GPI-APs, which is critical for activation of β1-integrins on lymphocytes and their subsequent spreading and migration [174]. The role of GPI fatty acid remodelling in cellular physiology might be causally related to clinical symptoms of IGD caused by PGAP3 mutations.

Concerning genes of GPI transamidase, such as PIGT, mutations that cause complete or nearly complete loss of GPI transamidase activity of a cell lead not only to complete or nearly complete lack of GPI-APs but also to the accumulation of unlinked free GPI in the cell. By contrast, mutations that cause partial loss of GPI transamidase activity lead to partial reduction of cell surface GPI-APs. The same germ line PIGT mutation has been found in IGD [175,176] and PNH [164]. PIGT bearing c.250G>T, p.E84X is a genetic variant found in the East Asian population at an allele frequency of 0.00023. PIGT E84X has very weak activity due to read through of the nonsense codon. Two Japanese children with IGD, who had no familial relationship, inherited this variant PIGT and different PIGT variants from their parents. Both of the other variant PIGTs had partially reduced activities [175,176]. Their cells had subnormal levels of GPI-APs [175,176]. A Japanese adult patient with PIGT-PNH had the same E84X variant in the germ line [164]. In his clonal PNH blood cells, the wild-type allele of PIGT was lost somatically as described above. This combination of a nearly null germ line mutation and somatic loss of the normal allele caused a nearly complete lack of GPI-APs, resulting in PNH [164]. The two children with IGD did not have PNH symptoms, such as intravascular haemolysis, because their blood cells had nearly normal levels of GPI-anchored complement regulators, CD59 and CD55 [175,176].

Patients with PIGT-PNH had typical complement-mediated intravascular haemolysis and, in addition, recurrent autoinflammatory symptoms, such as urticaria, arthralgia and noninfectious meningitis, associated with elevated IL18 and serum amyloid A [98]. Unlinked free GPIs were expressed on affected erythrocytes, monocytes, granulocytes and B-lymphocytes. Both intravascular haemolysis and autoinflammatory symptoms were controlled by anti-complement C5 antibody drug eculizumab, suggesting the involvement of terminal complement activation for both. Studies comparing PIGT- and PIGA-knockout monocyte/macrophage cell lines showed that accumulated free GPI on PIGT-knockout cells caused enhanced complement activation and subsequent IL1β secretion. Therefore, although free GPI is normal component of certain cells, abnormally accumulated free GPI is pathogenic. It is conceivable that when free GPI levels are abnormally high, interactions with some unknown protein(s) involved in complement activation, such as lectin pathway components, may be enhanced due to multivalent binding.

10. Concluding remarks

Biogenesis of mammalian GPI-APs have been studied well, but some points remain to be clarified: mechanisms of ER translocation of preproproteins of mammalian GPI-APs genes involved in flip of GlcN-PI into the luminal side of the ER mechanisms and genes involved in lipid remodelling of GlcN-(acyl)PI identification of the sialyl transferase for elongation of GalNAc-Gal side chain and functions of individual components of GPI-GnT and GPI transamidase. Physiological roles of Man4 and GalNAc side chains need to be studied. Physiological roles of unlinked free GPI found in some tissues by T5_4E10 monoclonal antibody need to be understood. Because T5_4E10 antibody binds only to free GPI bearing GalNAc as a side chain, probes for other forms of potentially expressed free GPIs, such as those lacking a side chain and those bearing GalNAc side chain with elongation by Gal and Sia, are required to elucidate an entire picture of free GPIs. There might be more examples of biologically important GPI-AP shedding mediated by GPIases that are specific to the target GPI-APs.


Mammalian scales - Biology

Home » Unraveling the mammalian protein secretion pathway

In the mammalian genome, roughly 1/3 of the protein-coding genes make products that directly mediate most interactions between cells, organs, and pathogens. These include hormones, membrane proteins, immune factors, extracellular matrix proteins, enzymes, etc. All of these proteins are synthesized and secreted through the secretory pathway, a system localized predominantly to the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and other components of the endomembrane system in eukaryotic cells. Hundreds of proteins are known to facilitate protein production in the secretory pathway, but the complexity of the pathway obfuscates how each part of the pathway impacts the synthesis and secretion of the various hormones, antibodies, and diverse proteins. Indeed, it is expected that only subsets of the secretory pathway machinery will be necessary to synthesize each protein. Can we capture all of the steps and unique machinery required to make any given secreted protein? A detailed systems-level view of the secretory pathway would be invaluable to unravel how protein synthesis is controlled and to help elucidate the causes of amyloid diseases, to control post-translational modifications such as glycosylation, and to aid in engineering mammalian cells that more efficiently produce immunotherapies and other high-value biopharmaceuticals.

To begin addressing these questions, we are establishing a systems biology platform to study the mammalian secretory pathway. This includes the generation of experimental omics data and the development of systems biology models of the pathway (Gutierrez and Lewis, Biotech J, 2015 Kuo, Curr Opin in Biotech). As one example, we have developed a systems-level mechanistic understanding of the mammalian secretory pathway is necessary given its importance in the synthesis, folding and delivery of recombinant proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells. With this model, we can estimate the theoretical energetic trade-off between growth and productivity in CHO cells producing a set of recombinant proteins with relevance in the biopharmaceutical industry. We have shown a dependence of the growth-productivity trade-off upon protein size, amino acid composition, and complexity. This model can be used to predict potential knock-out targets that could free up resources and boost productivity.


What is a Vertebrate?

Perhaps a better question would be “what does vertebrate mean”? The Latin term for the bony joint of the spinal column is vertebratus. We have all seen pictures, models, and reconstructions of various skeletons online, in textbooks, or in museums. The spine is instantly recognizable even in very different classes of animals.

Vertebrate characteristics begin at the notochord – a supportive, elastic rod found on all Chordates. When this notochord becomes covered with bony material during fetal development, the result is a vertebrate.


Mammalian Synthetic Biology: Engineering Biological Systems

The programming of new functions into mammalian cells has tremendous application in research and medicine. Continued improvements in the capacity to sequence and synthesize DNA have rapidly increased our understanding of mechanisms of gene function and regulation on a genome-wide scale and have expanded the set of genetic components available for programming cell biology. The invention of new research tools, including targetable DNA-binding systems such as CRISPR/Cas9 and sensor-actuator devices that can recognize and respond to diverse chemical, mechanical, and optical inputs, has enabled precise control of complex cellular behaviors at unprecedented spatial and temporal resolution. These tools have been critical for the expansion of synthetic biology techniques from prokaryotic and lower eukaryotic hosts to mammalian systems. Recent progress in the development of genome and epigenome editing tools and in the engineering of designer cells with programmable genetic circuits is expanding approaches to prevent, diagnose, and treat disease and to establish personalized theranostic strategies for next-generation medicines. This review summarizes the development of these enabling technologies and their application to transforming mammalian synthetic biology into a distinct field in research and medicine.