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Sind die Gene für Transkriptionsfaktoren nah an ihren Zielen im Genom?

Sind die Gene für Transkriptionsfaktoren nah an ihren Zielen im Genom?


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Transkriptionsfaktoren (Aktivatoren und Repressoren) sind Proteine, die die Transkription regulieren. Da sie Proteine ​​sind, werden sie selbst auch durch die Expression bestimmter DNA-Sequenzen/Gene hergestellt.

Zum Beispiel wird der lac-Operon-Repressor durch das lacI-Gen kodiert. Beim lac-Operon liegt nun das Gen für den Transkriptionsfaktor neben der Promotorsequenz. Es ist tatsächlich ein Teil des lac-Operons. In ähnlicher Weise ist das trpR-Gen ein Teil des trp-Operons.

Ist das immer so? Ist das für den Transkriptionsfaktor kodierende Gen immer neben (oder in der Nähe) der Transkriptionseinheit vorhanden?

Die beiden erwähnten Operons kommen nur in Prokaryoten vor. Könnte es sein, dass diese Tatsache nur für Prokaryoten gilt und nicht für die DNA von Eukaryoten?


Ist das für den Transkriptionsfaktor kodierende Gen immer neben (oder in der Nähe) der Transkriptionseinheit vorhanden?

Nicht unbedingt. Sie können mehrere Gegenbeispiele finden. Selbst für Prokaryoten gilt dies nicht unbedingt. Die von einem gemeinsamen Faktor regulierten Gene werden als Regulone bezeichnet und obwohl die Zielgene nicht in der Nähe des Regulators liegen müssen, wurde dies für E coli und B. subtilis dass Operons innerhalb eines Regulons im Genom geclustert sind (Zhang et al., 2012). In derselben Studie stellen die Autoren fest, dass sich der Regulator bei kleinen Regulonen in der Nähe befindet (siehe Abbildung unten).


Zusammenfassung

Brassinosteroide (BRs) sind wichtige Regulatoren für Pflanzenwachstum und -entwicklung. BRs signalisieren, die Aktivitäten der Transkriptionsfaktoren der BES1- und BZR1-Familie zu kontrollieren. Das Transkriptionsnetzwerk, über das BES1 und BZR eine große Zahl von Zielgenen regulieren, ist weitgehend unbekannt. Durch die Kombination von Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Arabidopsis-Tiling-Arrays (ChIP-Chip) und Genexpressionsstudien haben wir 1609 mutmaßliche BES1-Zielgene identifiziert, von denen 404 durch BRs und/oder im Funktionsgewinn reguliert werden bes1-D Mutant. BES1-Targets tragen zu BR-Reaktionen und Wechselwirkungen mit anderen hormonellen oder Lichtsignalwegen bei. Die computergestützte Modellierung von Genexpressionsdaten unter Verwendung von Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks (ARACNe) zeigt, dass auf BES1 gerichtete Transkriptionsfaktoren ein Genregulationsnetzwerk (GRN) bilden. Mutanten vieler Gene im Netzwerk zeigten Defekte in den BR-Antworten. Darüber hinaus fanden wir, dass BES1 die Entwicklung von Chloroplasten hemmt, indem es die Expression von GLK1- und GLK2-Transkriptionsfaktoren unterdrückt, was eine vom GRN generierte Hypothese bestätigt. Unsere Ergebnisse bieten somit einen globalen Überblick über die BR-regulierte Genexpression und ein GRN, das zukünftige Studien zum Verständnis des BR-regulierten Pflanzenwachstums leitet.


Inhalt

Eine DNA-Transkriptionseinheit, die für ein Protein kodiert, kann sowohl a Codierungssequenz, das in das Protein übersetzt wird, und regulatorische Sequenzen, die die Synthese dieses Proteins steuern und regulieren. Die regulatorische Sequenz vor ("stromaufwärts" von) der kodierenden Sequenz wird die fünfprimäre untranslatierte Region (5'UTR) genannt, die Sequenz nach ("stromabwärts" von) der kodierenden Sequenz wird die dreiprimäre untranslatierte Region (3'UTR) genannt. [3]

Im Gegensatz zur DNA-Replikation führt die Transkription zu einem RNA-Komplement, das das Nukleotid Uracil (U) in allen Fällen enthält, in denen Thymin (T) in einem DNA-Komplement aufgetreten wäre.

Nur einer der beiden DNA-Stränge dient als Matrize für die Transkription. Der Antisense-DNA-Strang wird durch die RNA-Polymerase vom 3'-Ende zum 5'-Ende während der Transkription (3' → 5') gelesen. Die komplementäre RNA wird in der entgegengesetzten Richtung erzeugt, in 5' → 3'-Richtung, die der Sequenz des Sense-Strangs entspricht, mit Ausnahme des Umschaltens von Uracil auf Thymin. Diese Direktionalität ist darauf zurückzuführen, dass die RNA-Polymerase nur Nukleotide an das 3'-Ende der wachsenden mRNA-Kette hinzufügen kann. Diese Verwendung nur des 3' → 5'-DNA-Strangs eliminiert die Notwendigkeit der Okazaki-Fragmente, die bei der DNA-Replikation beobachtet werden. [3] Dadurch entfällt auch die Notwendigkeit eines RNA-Primers, um die RNA-Synthese zu initiieren, wie dies bei der DNA-Replikation der Fall ist.

Die nicht-Matrizen-(Sense-)Strang der DNA wird als kodierender Strang bezeichnet, da seine Sequenz mit dem neu erstellten RNA-Transkript identisch ist (mit Ausnahme des Ersatzes von Uracil für Thymin). Dies ist der Strang, der konventionell verwendet wird, wenn eine DNA-Sequenz präsentiert wird. [5]

Die Transkription hat einige Korrekturlesemechanismen, die jedoch weniger und weniger effektiv sind als die Kontrollen zum Kopieren von DNA. Als Ergebnis hat die Transkription eine geringere Kopiertreue als die DNA-Replikation. [6]

Die Transkription ist unterteilt in Einleitung, Promoter Flucht, Verlängerung, und Beendigung. [7]

Einrichten für die Transkription Bearbeiten

Enhancer, Transkriptionsfaktoren, Mediatorkomplex und DNA-Schleifen in der Säugetiertranskription Bearbeiten

Das Einrichten für die Transkription in Säugern wird durch viele cis-regulatorische Elemente reguliert, einschließlich des Kernpromotors und der promotornahen Elemente, die sich in der Nähe der Transkriptionsstartstellen von Genen befinden. Core-Promotoren in Kombination mit allgemeinen Transkriptionsfaktoren reichen aus, um die Transkriptionsinitiation zu steuern, weisen jedoch im Allgemeinen eine geringe Grundaktivität auf. [8] Andere wichtige cis-regulatorische Module sind in DNA-Regionen lokalisiert, die von den Transkriptionsstartstellen entfernt sind. Dazu gehören Verstärker, Schalldämpfer, Isolatoren und Halteelemente. [9] Unter dieser Konstellation von Elementen spielen Enhancer und ihre assoziierten Transkriptionsfaktoren eine führende Rolle bei der Initiation der Gentranskription. [10] Ein Enhancer, der in einer DNA-Region entfernt vom Promotor eines Gens lokalisiert ist, kann einen sehr großen Einfluss auf die Gentranskription haben, wobei einige Gene aufgrund eines aktivierten Enhancers eine bis zu 100-fach erhöhte Transkription durchlaufen. [11]

Enhancer sind Regionen des Genoms, die wichtige Genregulationselemente sind. Enhancer kontrollieren zelltypspezifische Gentranskriptionsprogramme, meistens durch Schleifen über lange Distanzen, um in physische Nähe zu den Promotoren ihrer Zielgene zu gelangen. [12] Während es Hunderttausende von Enhancer-DNA-Regionen [13] gibt, werden für einen bestimmten Gewebetyp nur spezifische Enhancer in die Nähe der Promotoren gebracht, die sie regulieren. In einer Studie an kortikalen Neuronen des Gehirns wurden 24.937 Schleifen gefunden, die Enhancer zu ihren Zielpromotoren bringen. [11] Mehrere Enhancer, jeder oft zehn- oder hunderttausend Nukleotide entfernt von ihren Zielgenen, bilden eine Schleife zu ihren Zielgen-Promotoren und können miteinander koordinieren, um die Transkription ihres gemeinsamen Zielgens zu kontrollieren. [12]

Die schematische Darstellung in diesem Abschnitt zeigt einen Enhancer, der sich umkreist, um in enge physische Nähe zum Promotor eines Zielgens zu gelangen. Die Schleife wird durch ein Dimer eines Konnektorproteins (zB Dimer von CTCF oder YY1) stabilisiert, wobei ein Mitglied des Dimers an seinem Bindungsmotiv am Enhancer verankert ist und das andere Mitglied an seinem Bindungsmotiv am Promotor verankert ist (dargestellt durch das rote Zickzacklinien in der Abbildung). [14] Mehrere zellfunktionsspezifische Transkriptionsfaktoren (es gibt etwa 1.600 Transkriptionsfaktoren in einer menschlichen Zelle [15] ) binden im Allgemeinen an spezifische Motive auf einem Enhancer [16] und eine kleine Kombination dieser Enhancer-gebundenen Transkriptionsfaktoren, wenn sie nahe gebracht werden an einen Promotor durch eine DNA-Schleife, das Transkriptionsniveau des Zielgens steuern. Mediator (ein Komplex, der normalerweise aus etwa 26 Proteinen in einer wechselwirkenden Struktur besteht) kommuniziert regulatorische Signale von Enhancer-DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren direkt an das an den Promotor gebundene RNA-Polymerase II (pol II)-Enzym. [17]

Enhancer werden, wenn sie aktiv sind, im Allgemeinen von beiden DNA-Strängen mit RNA-Polymerasen, die in zwei verschiedene Richtungen wirken, transkribiert, wodurch zwei Enhancer-RNAs (eRNAs) erzeugt werden, wie in der Abbildung dargestellt. [18] Ein inaktiver Enhancer kann von einem inaktiven Transkriptionsfaktor gebunden werden. Die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors kann ihn aktivieren, und dieser aktivierte Transkriptionsfaktor kann dann den Enhancer aktivieren, an den er gebunden ist (siehe kleiner roter Stern, der die Phosphorylierung des an den Enhancer gebundenen Transkriptionsfaktors in der Illustration darstellt). [19] Ein aktivierter Enhancer beginnt mit der Transkription seiner RNA, bevor er die Transkription von Messenger-RNA aus seinem Zielgen aktiviert. [20]

Methylierung und Demethylierung von CpG-Inseln Bearbeiten

Die Transkriptionsregulation bei etwa 60 % der Promotoren wird auch durch die Methylierung von Cytosinen innerhalb von CpG-Dinukleotiden kontrolliert (wobei auf 5’ Cytosin 3’ Guanin- oder CpG-Stellen folgen). 5-Methylcytosin (5-mC) ist eine methylierte Form der DNA-Base Cytosin (siehe Abbildung). 5-mC ist ein epigenetischer Marker, der hauptsächlich innerhalb von CpG-Stellen vorkommt. Etwa 28 Millionen CpG-Dinukleotide kommen im menschlichen Genom vor. [21] In den meisten Geweben von Säugetieren sind im Durchschnitt 70 bis 80 % der CpG-Cytosine methyliert (unter Bildung von 5-MethylCpG oder 5-mCpG). [22] Methylierte Cytosine innerhalb von 5’Cytosin-Guanin-3’-Sequenzen treten oft in Gruppen auf, die als CpG-Inseln bezeichnet werden. Etwa 60% der Promotorsequenzen haben eine CpG-Insel, während nur etwa 6% der Enhancersequenzen eine CpG-Insel aufweisen. [23] CpG-Inseln stellen regulatorische Sequenzen dar, da die Methylierung von CpG-Inseln im Promotor eines Gens die Gentranskription reduzieren oder zum Schweigen bringen kann. [24]

Die DNA-Methylierung reguliert die Gentranskription durch Interaktion mit Proteinen der Methylbindungsdomäne (MBD), wie MeCP2, MBD1 und MBD2. Diese MBD-Proteine ​​binden am stärksten an hochmethylierte CpG-Inseln. [25] Diese MBD-Proteine ​​haben sowohl eine Methyl-CpG-Bindungsdomäne als auch eine Transkriptionsrepressionsdomäne. [25] Sie binden an methylierte DNA und leiten oder lenken Proteinkomplexe mit Chromatin-Remodelling und/oder Histon-modifizierender Aktivität zu methylierten CpG-Inseln. MBD-Proteine ​​unterdrücken im Allgemeinen lokales Chromatin, z. B. indem sie die Einführung repressiver Histonmarkierungen katalysieren oder eine insgesamt repressive Chromatinumgebung durch Nukleosomen-Remodeling und Chromatin-Reorganisation erzeugen. [25]

Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt, sind Transkriptionsfaktoren Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen binden, um die Expression eines Gens zu regulieren. Die Bindungssequenz für einen Transkriptionsfaktor in DNA ist normalerweise etwa 10 oder 11 Nukleotide lang. Wie 2009 zusammengefasst, haben Vaquerizas et al. zeigten, dass im menschlichen Genom etwa 1400 verschiedene Transkriptionsfaktoren von Genen kodiert werden, die etwa 6% aller menschlichen Protein-kodierenden Gene ausmachen. [26] Ungefähr 94% der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBSs), die mit signalresponsiven Genen assoziiert sind, kommen in Enhancern vor, während nur etwa 6% solcher TFBSs in Promotoren vorkommen. [16]

Das EGR1-Protein ist ein besonderer Transkriptionsfaktor, der für die Regulation der Methylierung von CpG-Inseln wichtig ist. Eine EGR1-Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle befindet sich häufig in Enhancer- oder Promotorsequenzen. [27] Es gibt etwa 12.000 Bindungsstellen für EGR1 im Säugetiergenom und etwa die Hälfte der EGR1-Bindungsstellen befinden sich in Promotoren und die Hälfte in Enhancern. [27] Die Bindung von EGR1 an seine Ziel-DNA-Bindungsstelle ist unempfindlich gegenüber Cytosin-Methylierung in der DNA. [27]

Während in unstimulierten Zellen nur geringe Mengen des EGR1-Transkriptionsfaktorproteins nachweisbar sind, ist die Translation des AGR1 Gen in Protein eine Stunde nach der Stimulation ist drastisch erhöht. [28] Die Expression von EGR1-Transkriptionsfaktorproteinen in verschiedenen Zelltypen kann durch Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter, Hormone, Stress und Verletzungen stimuliert werden. [28] Im Gehirn, wenn Neuronen aktiviert werden, werden EGR1-Proteine ​​hochreguliert und sie binden (rekrutieren) die bereits existierenden TET1-Enzyme, die in Neuronen stark exprimiert werden. TET-Enzyme können die Demethylierung von 5-Methylcytosin katalysieren. Wenn EGR1-Transkriptionsfaktoren TET1-Enzyme zu EGR1-Bindungsstellen in Promotoren bringen, können die TET-Enzyme die methylierten CpG-Inseln an diesen Promotoren demethylieren. Nach der Demethylierung können diese Promotoren dann die Transkription ihrer Zielgene initiieren. Hunderte von Genen in Neuronen werden nach Neuronenaktivierung durch EGR1-Rekrutierung von TET1 an methylierte regulatorische Sequenzen in ihren Promotoren unterschiedlich exprimiert. [27]

Die Methylierung von Promotoren wird auch als Reaktion auf Signale verändert. Die drei Säugetier-DNA-Methyltransferasen (DNMT1, DNMT3A und DNMT3B) katalysieren die Addition von Methylgruppen an Cytosine in der DNA. Während DNMT1 eine „Erhaltungs“-Methyltransferase ist, können DNMT3A und DNMT3B neue Methylierungen durchführen. Es gibt auch zwei Spleißprotein-Isoformen, die aus dem DNMT3A Gen: DNA-Methyltransferase-Proteine ​​DNMT3A1 und DNMT3A2. [29]

Die Spleißisoform DNMT3A2 verhält sich wie das Produkt eines klassischen Immediate-Early-Gens und wird beispielsweise nach neuronaler Aktivierung robust und transient produziert. [30] Wo die DNA-Methyltransferase-Isoform DNMT3A2 bindet und Methylgruppen an Cytosine hinzufügt, scheint durch posttranslationale Histonmodifikationen bestimmt zu werden. [31] [32] [33]

Andererseits verursacht die neurale Aktivierung einen Abbau von DNMT3A1, begleitet von einer reduzierten Methylierung mindestens eines evaluierten Zielpromotors. [34]

Einleitung Bearbeiten

Die Transkription beginnt mit der Bindung von RNA-Polymerase zusammen mit einem oder mehreren allgemeinen Transkriptionsfaktoren an eine spezifische DNA-Sequenz, die als "Promotor" bezeichnet wird, um einen "geschlossenen Komplex" aus RNA-Polymerase-Promotor zu bilden. Im "geschlossenen Komplex" ist die Promotor-DNA noch vollständig doppelsträngig. [7]

Die RNA-Polymerase, unterstützt durch einen oder mehrere allgemeine Transkriptionsfaktoren, wickelt dann ungefähr 14 Basenpaare der DNA ab, um einen RNA-Polymerase-Promotor-"offenen Komplex" zu bilden. Im "offenen Komplex" ist die Promotor-DNA teilweise ungewickelt und einzelsträngig. Die freigelegte, einzelsträngige DNA wird als "Transkriptionsblase" bezeichnet. [7]

RNA-Polymerase, unterstützt von einem oder mehreren allgemeinen Transkriptionsfaktoren, selektiert dann a Transkriptionsstartseite in der Transkriptionsblase, bindet an ein initiierendes NTP und ein verlängertes NTP (oder einen kurzen RNA-Primer und ein verlängertes NTP), die komplementär zur Transkriptionsstartstellensequenz sind, und katalysiert die Bindungsbildung, um ein anfängliches RNA-Produkt zu ergeben. [7]

In Bakterien besteht das RNA-Polymerase-Holoenzym aus fünf Untereinheiten: 2 α-Untereinheiten, 1 β-Untereinheit, 1 β'-Untereinheit und 1 -Untereinheit. In Bakterien gibt es einen allgemeinen RNA-Transkriptionsfaktor, der als Sigma-Faktor bekannt ist. Das RNA-Polymerase-Kernenzym bindet an den bakteriellen allgemeinen Transkriptionsfaktor (Sigma), um ein RNA-Polymerase-Holoenzym zu bilden, und bindet dann an einen Promotor. [7] (RNA-Polymerase wird als Holoenzym bezeichnet, wenn die Sigma-Untereinheit an das Kernenzym gebunden ist, das aus 2 α-Untereinheiten, 1 β-Untereinheit, nur 1 β'-Untereinheit besteht). Im Gegensatz zu Eukaryoten ist das initiierende Nukleotid der naszierenden bakteriellen mRNA nicht mit einem modifizierten Guaninnukleotid versehen. Das initiierende Nukleotid bakterieller Transkripte trägt ein 5'-Triphosphat (5'-PPP), das zur genomweiten Kartierung von Transkriptionsinitiationsstellen verwendet werden kann. [35]

In Archaeen und Eukaryoten enthält die RNA-Polymerase Untereinheiten, die zu jeder der fünf RNA-Polymerase-Untereinheiten in Bakterien homolog sind, und enthält auch zusätzliche Untereinheiten. In Archaeen und Eukaryoten werden die Funktionen des bakteriellen allgemeinen Transkriptionsfaktors Sigma von mehreren allgemeinen Transkriptionsfaktoren übernommen, die zusammenarbeiten. [7] In Archaeen gibt es drei allgemeine Transkriptionsfaktoren: TBP, TFB und TFE. Bei Eukaryoten gibt es bei der RNA-Polymerase II-abhängigen Transkription sechs allgemeine Transkriptionsfaktoren: TFIIA, TFIIB (ein Ortholog des archaealen TFB), TFIID (ein Faktor mit mehreren Untereinheiten, bei dem die Schlüsseluntereinheit TBP ein Ortholog des archaealen TBP ist), TFIIE (ein Ortholog von archaealem TFE), TFIIF und TFIIH. Der TFIID ist die erste Komponente, die aufgrund der Bindung von TBP an DNA bindet, während TFIIH die letzte Komponente ist, die rekrutiert wird. Bei Archaeen und Eukaryoten wird der geschlossene RNA-Polymerase-Promotor-Komplex gewöhnlich als "Präinitiationskomplex" bezeichnet. [36]

Die Transkriptionsinitiation wird durch zusätzliche Proteine ​​reguliert, die als Aktivatoren und Repressoren bekannt sind, und in einigen Fällen assoziierte Coaktivatoren oder Co-Pressoren, die die Bildung und Funktion des Transkriptionsinitiationskomplexes modulieren. [7]

Promoter entkommen Bearbeiten

Nachdem die erste Bindung synthetisiert wurde, muss die RNA-Polymerase dem Promotor entkommen. Während dieser Zeit besteht die Tendenz, das RNA-Transkript freizusetzen und verkürzte Transkripte zu produzieren. Dies wird als abortive Initiation bezeichnet und ist sowohl bei Eukaryoten als auch bei Prokaryoten üblich. [37] Die Initiation wird fortgesetzt, bis ein RNA-Produkt mit einer Schwellenlänge von ungefähr 10 Nukleotiden synthetisiert wird, woraufhin der Promotor entweicht und ein Transkriptionselongationskomplex gebildet wird.

Mechanistisch erfolgt das Entweichen des Promotors durch DNA-Scrunching, wodurch die Energie bereitgestellt wird, die benötigt wird, um die Wechselwirkungen zwischen dem RNA-Polymerase-Holoenzym und dem Promotor zu unterbrechen. [38]

Bei Bakterien wurde historisch angenommen, dass der Sigma-Faktor definitiv nach der Promotor-Clearance freigesetzt wird. Diese Theorie war bekannt als die verbindliches Release-Modell. Spätere Daten zeigten jedoch, dass nach und nach der Promotor-Clearance der Sigma-Faktor nach einem stochastischen Modell, das als bekannt ist, freigesetzt wird stochastisches Release-Modell. [39]

In Eukaryoten phosphoryliert TFIIH an einem RNA-Polymerase-II-abhängigen Promotor nach der Promotor-Clearance Serin 5 an der Carboxy-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II, was zur Rekrutierung des Capping-Enzyms (CE) führt. [40] [41] Der genaue Mechanismus, wie CE die Promotor-Clearance in Eukaryoten induziert, ist noch nicht bekannt.

Dehnung Bearbeiten

Ein Strang der DNA, der Vorlagenstrang (oder nichtkodierender Strang) wird als Matrize für die RNA-Synthese verwendet. Während die Transkription fortschreitet, durchquert die RNA-Polymerase den Matrizenstrang und nutzt die Basenpaarungskomplementarität mit der DNA-Matrize, um eine RNA-Kopie zu erzeugen (die sich während der Durchquerung verlängert). Obwohl die RNA-Polymerase den Matrizenstrang von 3' → 5' durchquert, können der kodierende (Nicht-Templat-)Strang und neu gebildete RNA auch als Referenzpunkte verwendet werden, so dass die Transkription als 5' → 3' auftretend beschrieben werden kann. Dies erzeugt ein RNA-Molekül von 5' → 3', eine exakte Kopie des kodierenden Strangs (außer dass Thymine durch Uracile ersetzt werden und die Nukleotide aus einem Ribose-Zucker (5-Kohlenstoff) bestehen, wobei die DNA Desoxyribose (ein Sauerstoff weniger) enthält Atom) in seinem Zucker-Phosphat-Rückgrat). [ Zitat benötigt ]

Die mRNA-Transkription kann mehrere RNA-Polymerasen auf einer einzelnen DNA-Matrize und mehrere Transkriptionsrunden (Amplifikation einer bestimmten mRNA) umfassen, sodass viele mRNA-Moleküle schnell aus einer einzigen Kopie eines Gens hergestellt werden können. [ Zitat benötigt ] Die charakteristischen Elongationsraten bei Prokaryoten und Eukaryoten liegen bei etwa 10-100 nts/sec. [42] In Eukaryoten fungieren Nukleosomen jedoch als Hauptbarrieren für die Transkription von Polymerasen während der Transkriptionsverlängerung. [43] [44] In diesen Organismen kann die durch Nukleosomen induzierte Pause durch Transkriptionselongationsfaktoren wie TFIIS reguliert werden. [44]

Die Dehnung beinhaltet auch einen Korrekturlesemechanismus, der falsch eingearbeitete Basen ersetzen kann. Bei Eukaryoten kann dies mit kurzen Pausen während der Transkription korrespondieren, die die Bindung geeigneter RNA-Editierungsfaktoren ermöglichen. Diese Pausen können der RNA-Polymerase eigen sein oder auf die Chromatinstruktur zurückzuführen sein. [ Zitat benötigt ]

Kündigung Bearbeiten

Bakterien verwenden zwei verschiedene Strategien für die Transkriptionstermination – Rho-unabhängige Termination und Rho-abhängige Termination. Bei der Rho-unabhängigen Transkriptionstermination stoppt die RNA-Transkription, wenn das neu synthetisierte RNA-Molekül eine G-C-reiche Haarnadelschleife bildet, gefolgt von einem Lauf von Us. Wenn sich die Haarnadel bildet, bricht der mechanische Stress die schwachen rU-dA-Bindungen und füllt nun das DNA-RNA-Hybrid. Dadurch wird das Poly-U-Transkript aus dem aktiven Zentrum der RNA-Polymerase gezogen, wodurch die Transkription beendet wird. Bei der "Rho-abhängigen" Termination destabilisiert ein Proteinfaktor namens "Rho" die Interaktion zwischen der Matrize und der mRNA, wodurch die neu synthetisierte mRNA aus dem Elongationskomplex freigesetzt wird. [45]

Die Termination der Transkription in Eukaryoten ist weniger gut verstanden als in Bakterien, beinhaltet jedoch die Spaltung des neuen Transkripts, gefolgt von einer templatunabhängigen Addition von Adeninen an seinem neuen 3'-Ende in einem als Polyadenylierung bezeichneten Prozess. [46]


ERGEBNISSE

Genomweite Charakterisierung von Foxa2-Bindungsstellen in mDA-Vorläufern

Um direkte Zielgene von Foxa2 zu identifizieren, wählten wir einen genomweiten Ansatz mit ChIP-seq (Barski et al., 2007 Johnson et al., 2007 Robertson et al., 2007). Da bei E10.5 keine ausreichende Anzahl von mDA-Vorläufern aus Mausembryonen gewonnen werden konnte, erhielten wir mDA-Vorläufer durch in vitro-Differenzierung von NestinLmx1a-transfizierte ES-Zellen (Andersson et al., 2006b). Wir erzeugten effizient 60-80% reine mDA-Vorläufer nach 5 Tagen Differenzierung von NestinLmx1a-transfizierte ES-Zellen in Gegenwart von Fgf8 und Shh (Ergänzungsmaterial Abb. S1A,B) (Andersson et al., 2006b). Diese in vitro erzeugten mDA-Vorläufer exprimierten Foxa2 am Tag 5 robust und differenzierten sich am Tag 8 weiter in Nurr1 + Th + reife mDA-Neuronen, wie zuvor beschrieben (Ergänzungsmaterial Abb. S1A,B) (Andersson et al., 2006b). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sich in vitro differenzierte mDA-Vorläuferzellen zu echten mDA-Neuronen entwickeln, die das Striatum von 6-Hydroxydopamin-läsionierten neugeborenen Ratten integrieren und innervieren, wenn sie in das Striatum transplantiert werden (Friling et al., 2009), was darauf hindeutet, dass sie a ähnliches funktionelles Potenzial wie embryonale mDA-Vorläufer.

Zehn Millionen NestinLmx1a-transfizierte ES-Zellen wurden verwendet, um Chromatin herzustellen und ein Foxa2-spezifischer Antikörper wurde für ChIP verwendet (Mavromatakis et al., 2011). Nach der Sequenzierung wurde Peak Calling unter Verwendung von MACS mit einem Schwellenwert von FDR <5% durchgeführt, was zu einem Datensatz von 9160 Peaks mit hoher Konfidenz führte. Alle FBRs wurden mit Genen annotiert, deren Transkriptionsstartstelle (TSS) dem Peak am nächsten liegt. Mehrere bekannte und validierte FBRs im ZNS wurden in diese Studie eingeschlossen, wie z Schh Gehirnverstärker (Epstein et al., 1999), Foxa2 Verstärker (Sasaki und Hogan, 1996), Foxa1 Promotor (Peterson et al., 1997) und Ferd3l (Nato3) Promoter (Mansour et al., 2011), aber nicht der Nkx2,2 und NS Promotoren (Lin et al., 2009). Da die beiden letztgenannten Gene in unserem in vitro ES-Zell-Differenzierungssystem nicht exprimiert werden, könnten diese Genloci in einer geschlossenen Chromatin-Konfiguration vorliegen und für die Foxa2-Bindung unzugänglich sein.

Die Validierung dieses Datensatzes wurde durch ChIP-qPCR an einer ausgewählten Untergruppe von FBRs durchgeführt, die sich in Genen befinden, von denen bekannt ist, dass sie im Mittelhirn-FP exprimiert werden, einschließlich Lmx1a, Lmx1b (Andersson et al., 2006b), Msx1 (Andersson et al., 2006b), Ferd3l (Ono et al., 2010 Segev et al., 2001), Corin (Ono et al., 2007), Schlitz2 (Wang et al., 1999), Kobl (Gasca et al., 1995), Rfx3 (Baas et al., 2006), Bmp6 und Bmp7 (Kim et al., 2001) unter Verwendung von Chromatin aus dem ventralen Mittelhirn der Maus E12.5, das hauptsächlich FP-Gewebe enthält. In 17 von 19 dieser FBRs wurde eine Foxa2-abhängige Anreicherung bestätigt (Abb. 1A,B). Wir bestätigten auch die Bindung von Foxa2 in 16 von 20 zusätzlichen FBRs, die in ausgewählten transkriptionell aktiven Genen lokalisiert sind (Ergänzungsmaterial Abb. S2). Zusammen weisen diese Ergebnisse auf einen qualitativ hochwertigen Datensatz hin.

Chromatin-Immunpräzipitation von in vitro-differenzierten mDA-Vorläuferzellen der Maus. (EIN) Die durch ChIP-seq identifizierten Peaks der Foxa2-Anreicherung sind für ausgewählte mDA-Vorläufer-exprimierte Gene gezeigt. Die Plots zeigen die Peakhöhen als Anzahl sequenzierter Reads. Pfeile zeigen Peak-Positionen an, die von MACS aufgerufen werden. (B) Unabhängige ChIP-qPCR-Experimente wurden mit Chromatin durchgeführt, das aus E12.5-Gewebe des ventralen Mittelhirns zur Validierung ausgewählter Target-Kandidaten hergestellt wurde, wobei die Anreicherung als Prozentsatz des Inputs (*P<0,05). Mehrere Peaks innerhalb einer Genregion, die der Liste in Tabelle S1 des ergänzenden Materials entsprechen, sind mit E1 (für Element 1) usw. von links nach rechts nummeriert. -ve1, Foxa2 offener Leserahmen (Mavromatakis et al., 2011). Fehlerbalken zeigen s.e.m.

Chromatin-Immunpräzipitation von in vitro-differenzierten mDA-Vorläuferzellen der Maus. (EIN) Peaks der Foxa2-Anreicherung, identifiziert durch ChIP-seq, sind für ausgewählte mDA-Vorläufer-exprimierte Gene gezeigt. Die Plots zeigen die Peakhöhen als Anzahl sequenzierter Reads. Pfeile zeigen Peak-Positionen an, die von MACS aufgerufen werden. (B) Unabhängige ChIP-qPCR-Experimente wurden mit Chromatin durchgeführt, das aus E12.5-Gewebe des ventralen Mittelhirns zur Validierung ausgewählter Target-Kandidaten hergestellt wurde, wobei die Anreicherung als Prozentsatz des Inputs (*P<0,05). Mehrere Peaks innerhalb einer Genregion, die der Liste in Tabelle S1 des ergänzenden Materials entsprechen, sind mit E1 (für Element 1) usw. von links nach rechts nummeriert. -ve1, Foxa2 offener Leserahmen (Mavromatakis et al., 2011). Fehlerbalken zeigen s.e.m.

Verbindliche Site-Analyse

Die Peaks in FBRs hatten eine durchschnittliche Breite von 290 bp und eine durchschnittliche Höhe von 16 Tags (Fig. 1A). Eine De-novo-Motivanalyse ihrer Sequenzen unter Verwendung von MEME (Zhang et al., 2008) zeigte erwartungsgemäß eine erhebliche Anreicherung der Foxa2-Motivstellen (Fig. 2A). Von den Gipfeln enthielten 7298 (80%) mindestens ein Foxa2-Motiv innerhalb von 60 bp des Gipfelgipfels (Fig. 2A). Um die Verteilung der Peaks weiter zu charakterisieren, verglichen wir ihre Lage mit UCSC RefSeq-Genen unter Verwendung von CEAS (Shin et al., 2009) und fanden heraus, dass 46,7 % der Peaks mit hoher Konfidenz innerhalb einer Genregion liegen, die sich vom TSS bis zum 3 . erstreckt UTR stromabwärts (Fig. 2B). Insgesamt befanden sich 44,2% aller Peaks innerhalb eines Introns, 0,7% innerhalb eines Exons, 0,8% innerhalb der 5′UTR und 1% innerhalb der 3′UTR. Die verbleibenden Foxa2-Peaks befanden sich in intergenen Regionen, die weiter als 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der annotierten Gene lokalisiert waren. Interessanterweise war die Bindung von Foxa2 in den Promotorregionen angereichert, wobei sich 3,7% der Peaks innerhalb von 1 kb und 11% innerhalb von 10 kb stromaufwärts des TSS im Vergleich zum Genomhintergrund befanden ( 2B ). Die Bindung von Foxa2 war in Regionen direkt stromabwärts von Genen nicht angereichert ( 2B ).

Analysen von Motiven und Peakverteilung in Foxa2-gebundenen Regionen. (EIN) MEME identifizierte de novo Transkriptionsfaktor-Bindungsmotive innerhalb von 60 bp vom Zentrum der Foxa2-Peaks. Die Genomatix-Ergebnisse umfassen: (1) die Anzahl der Peaks, die das Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv enthielten, (2) den Z-Score der Überrepräsentation vor dem ausgewählten Hintergrund (randomisierte Sequenzen) und (3) die Überrepräsentation gegenüber dem Mausgenom, Dies ist der Faltungsfaktor der Anzahl der Foxa2-Motive innerhalb des ChIP-seq-Datensatzes im Vergleich zu einer gleich großen Probe des Genoms. (B) Die Verteilung und Anreicherung relativ zum Genomhintergrund von Foxa2-Peaks in Bezug auf verschiedene Genmerkmale. Die P-Wert wird in Klammern angegeben.

Analysen von Motiven und Peakverteilung in Foxa2-gebundenen Regionen. (EIN) MEME identifizierte de novo Transkriptionsfaktor-Bindungsmotive innerhalb von 60 bp vom Zentrum der Foxa2-Peaks. Die Genomatix-Ergebnisse umfassen: (1) die Anzahl der Peaks, die das Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv enthielten, (2) den Z-Score der Überrepräsentation vor dem ausgewählten Hintergrund (randomisierte Sequenzen) und (3) die Überrepräsentation gegenüber dem Mausgenom, Dies ist der Faltungsfaktor der Anzahl der Foxa2-Motive innerhalb des ChIP-seq-Datensatzes im Vergleich zu einer gleich großen Probe des Genoms. (B) Die Verteilung und Anreicherung relativ zum Genomhintergrund von Foxa2-Peaks in Bezug auf verschiedene Genmerkmale. Die P-Wert wird in Klammern angegeben.

Foxa2- und Shh-Signalgebung spielen eine ähnliche Rolle bei der ventralen Mittelhirnmusterbildung (Blaess et al., 2006, Lin et al., 2009). Mavromatakis et al., 2011). Wir haben daher untersucht, ob Targets von Gli1, die zuvor durch ChIP-Chip in neuralen Vorläuferzellen identifiziert wurden (Vokes et al., 2007), auch von Foxa2 gebunden werden. Die Foxa2-Bindung überlappte mit zehn von 25 Gli1-Bindungsregionen, einschließlich derer, die sich in befinden Ptch1, Nkx2.9, Gli1, Hhip, Shh und Prdx2, von denen viele als Gli-abhängige Enhancer bekannt sind (Sasaki et al., 1997 Dai et al., 1999 Santagati et al., 2003 Agren et al., 2004 Hallikas et al., 2006) (Abb. 3 und Ergänzungsmaterial Tabelle S3). Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass Foxa2 und Gli1 eine Reihe von gemeinsamen Zielen durch nahegelegene Bindungsstellen im Genom koregulieren. Darüber hinaus bindet Foxa2 auch Sites in Gli2 und Gli3 (Mavromatakis et al., 2011), von denen nicht bekannt ist, dass sie von Gli1 gebunden werden (Abb. 3), was auf die Möglichkeit hindeutet, dass Foxa2 alle drei Gli-Gene direkt reguliert.

Foxa2-Spitzen in den Genen des Shh-Signalwegs. (EIN) Foxa2-Bindungsstellen wurden in Genomregionen beobachtet, die zuvor als von Gli1 gebunden identifiziert wurden (Vokes et al., 2007), einschließlich in den Genen Ptch1, Nkx2-9, Gli1, Hhip und Foxa2. Gipfel gefunden in der Schh und Gli3 Gene sind ebenfalls enthalten. (B) ChIP-qPCR-Experimente mit Chromatin aus dem ventralen Mittelhirngewebe der Maus E12.5 wurden verwendet, um die Daten zu validieren (*P<0,05). Fehlerbalken zeigen s.e.m. -ve1, Foxa2 offener Leserahmen -ve2, Gli-ve (eine vorgelagerte Region von Gli2) (Mavromatakis et al., 2011).

Foxa2-Spitzen in den Genen des Shh-Signalwegs. (EIN) Foxa2-Bindungsstellen wurden in Genomregionen beobachtet, die zuvor als von Gli1 gebunden identifiziert wurden (Vokes et al., 2007), einschließlich in den Genen Ptch1, Nkx2-9, Gli1, Hhip und Foxa2. Gipfel gefunden in der Schh und Gli3 Gene sind ebenfalls enthalten. (B) ChIP-qPCR-Experimente mit Chromatin aus dem ventralen Mittelhirngewebe der Maus E12.5 wurden verwendet, um die Daten zu validieren (*P<0,05). Fehlerbalken zeigen s.e.m. -ve1, Foxa2 offener Leserahmen -ve2, Gli-ve (eine vorgelagerte Region von Gli2) (Mavromatakis et al., 2011).

Foxa2 reguliert direkt und positiv die Expression von Schlüsseldeterminanten der mDA-Linie

Um einen Kernsatz von Foxa2-Zielgenen zu identifizieren, die für die neuronale Vorläufer- und FP-Spezifikation von mDA funktionell relevant sind, haben wir FBRs dem nächstgelegenen TSS von Ensembl-Genen zugeordnet. Anschließend verglichen wir diesen Satz von Foxa2-Kandidaten-Zielgenen mit einer Liste von 444 Genen, die spezifisch im Mittelhirn-FP exprimiert werden, wie sie durch Expressionsprofile von E10.5-Mausembryonen generiert wurden (Gennet et al., 2011). Interessanterweise wurden 40% (178) dieser FP-Gene von Foxa2 gebunden (hypergeometrische Analyse, P=2,27×10 –40 Abb. 4C), was darauf hindeutet, dass Foxa2 viele der in diesem Gewebe exprimierten Gene direkt reguliert. Anschließend untersuchten wir die funktionellen Anmerkungen dieser mutmaßlichen Foxa2-Ziele mithilfe von Gene Ontology (GO). Ein breites Spektrum biologischer Prozesse wurde signifikant angereichert, einschließlich Zellwachstum, Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und Zellkommunikation (Abb. 4B). Foxa2-Targets zeigen auch eine Vielzahl von molekularen Funktionen, einschließlich Transkriptionsregulatoraktivität, Rezeptorbindung und Calciumionenbindung (Fig. 4D).

Foxa2 reguliert direkt Gene mit mehreren Entwicklungsfunktionen. (EIN) Die Überlappung zwischen Genen, die mit Foxa2-Bindungsereignissen assoziiert sind, und Genen, die vorwiegend in der Bodenplatte (FP) oder der ventrolateralen Region (VL) des Mittelhirns von E10.5-Mausembryonen exprimiert werden. FP- und VL-Daten wurden von Gennet et al. (Gennet et al., 2011). (B) Enrichment of Gene Ontology (GO)-Begriffe von GO Slim für biologische Prozesse, die mit FP-spezifischen Foxa2-gebundenen Genen verbunden sind. Die Anzahl der Zielgene in jeder Kategorie wird angezeigt. (C) Die Anzahl der Foxa2-Zielgene in jeder Region mit statistischer Analyse. (D) Anreicherung von GO-Termen für molekulare Funktionen (GO Slim) in Verbindung mit FP-spezifischen Foxa2-gebundenen Genen. (E) qRT-PCR-Analyse ausgewählter FP-spezifischer Foxa2-gebundener Gene unter Verwendung von ventralem Mittelhirngewebe aus E10.5-Wildtyp und Foxa1/2 cko-Embryonen (*P<0,05). Fehlerbalken zeigen s.e.m.

Foxa2 reguliert direkt Gene mit mehreren Entwicklungsfunktionen. (EIN) Die Überlappung zwischen Genen, die mit Foxa2-Bindungsereignissen assoziiert sind, und Genen, die vorwiegend in der Bodenplatte (FP) oder der ventrolateralen Region (VL) des Mittelhirns von E10.5-Mausembryonen exprimiert werden. FP- und VL-Daten wurden von Gennet et al. (Gennet et al., 2011). (B) Enrichment of Gene Ontology (GO)-Begriffe von GO Slim für biologische Prozesse, die mit FP-spezifischen Foxa2-gebundenen Genen verbunden sind. Die Anzahl der Zielgene in jeder Kategorie wird angezeigt. (C) Die Anzahl der Foxa2-Zielgene in jeder Region mit statistischer Analyse. (D) Anreicherung von GO-Termen für molekulare Funktionen (GO Slim) in Verbindung mit FP-spezifischen Foxa2-gebundenen Genen. (E) qRT-PCR-Analyse ausgewählter FP-spezifischer Foxa2-gebundener Gene unter Verwendung von ventralem Mittelhirngewebe aus E10.5-Wildtyp und Foxa1/2 cko-Embryonen (*P<0,05). Fehlerbalken zeigen s.e.m.

Um die funktionelle Bedeutung der Foxa2-Bindung weiter zu untersuchen, analysierten wir mittels qRT-PCR die Expression einiger dieser Targets im Mittelhirn-FP von Wildtyp- und Foxa1/2 bedingte mutierte Mausembryonen bei E10.5. Wir wählten Targets aus, die an der Transkriptionsregulation und der Rezeptorbindung beteiligt sind, zwei Klassen von Genen mit potenziell wichtigen Rollen bei der Regulierung der Zellidentität. Die Expression von neun von 17 Foxa2-Targets mit Transkriptionsaktivität und neun von 18 Targets mit Rezeptorbindungsaktivität war stark reduziert in En1CreFoxa1 flox/flox Foxa2 flox/flox (bezeichnet als Foxa1/2 cko) Mutanten im Vergleich zu Kontrollembryonen (Fig. 4E). Die Analyse dieser Stichprobe legt daher nahe, dass

50 % der in Fig. 4A identifizierten FP-Kandidatenziele werden in reguliert Foxa1/2 cko-Embryonen. Interessanterweise sind fünf der 17 gebundenen und regulierten Ziele, die in Abb. 4E identifiziert wurden, nämlich Lmx1a (Andersson et al., 2006b), Msx1 (Andersson et al., 2006b), Ferdl3 (Ono et al., 2010), Foxa1 und Foxa2 (Andersson et al., 2006b) sind bekannt dafür, dass sie eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der mDA-Vorläuferspezifikation spielen, was darauf hindeutet, dass Foxa2 die Expression wesentlicher Determinanten der Abstammungslinie direkt kontrolliert. Lmx1b spielt auch eine Rolle bei der Regulierung der Spezifikation und Differenzierung von mDA-Neuronen (Andersson et al., 2006b) und wird von Foxa2 gebunden (Ergänzungsmaterial Tabelle S1) und reguliert (Lin et al., 2009). Seine Auslassung aus der FP-spezifischen Genliste ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass seine Expression nicht auf das FP beschränkt ist, sondern auch in Vorläufern des lateralen Mittelhirns vorhanden ist. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Foxa2 mehrere direkte Eingänge in die molekularen Wege hat, die die Spezifikation und Differenzierung der mDA-Vorläuferlinie regulieren.

Foxa2 reguliert direkt und positiv die Expression von FP-Axon-Führungsmolekülen

In Zebrafischembryonen ist Foxa2 an der Aufrechterhaltung des differenzierten Charakters des FP beteiligt (Norton et al., 2005). In Mausembryonen wird Foxa2 für die Induktion des FP durch Regulation des sekretierten Morphogens Shh benötigt (Ang und Rossant, 1994, Weinstein et al., 1994), ob es jedoch auch spätere Rollen in der FP-Funktion spielt, ist weitgehend unbekannt. Das FP exprimiert sezernierte und transmembrane Proteine, die das Wachstum von kommissuralen Axonen entlang der Mittellinie regulieren (Übersicht von Brose und Tessier-Lavigne, 2000). Zu den FP-spezifischen Foxa2-Zielen gehören Gene, die Faktoren mit Axon-Steuerungsaktivitäten codieren (Übersicht von Kolodkin und Tessier-Lavigne, 2011), wie die Slit-Liganden Slit2 und Slit3, die TGFβ-Superfamilienmitglieder Tgfβ2 und Bmp7, die Zelladhäsionsmoleküle des Immunglobulins Überfamilie Alcam, Chl1 und Nrcam und Shh (Ergänzungsmaterial Tabelle S2). qRT-PCR-Experimente zeigen, dass die Expression von sieben von neun (78%) dieser Gene reduziert ist in Foxa1/2 cko-Embryonen (Abb. 4E), was eine neue Rolle für Foxa2 bei der Förderung der Expression von Faktoren demonstriert, die die Führung von Axonen über die ventrale Mittellinie steuern. Da das FP zu mehr dorsalen GABAergen Vorläufern transformiert wird, können wir die Möglichkeit nicht formal ausschließen, dass einige der Veränderungen in der Genexpression (Fig. 4E) in Foxa1/2 cko-Mutanten bei E10.5 sind eine Folge der Transformation des Zellschicksals (Lin et al., 2009). Deshalb haben wir untersucht Schlitz1, Schlitz2 und Schh Ausdruck auch in NestinCre/+Foxa1 −/− Foxa2 flox/flox Embryonen, bei denen eine partielle Spezifikation des FP noch auftritt, wenn Foxa1/2 werden bei E10.5 gelöscht. Shh, Schlitz1 und Schlitz2 werden im FP dieser mutierten Embryonen nicht exprimiert. Im Gegensatz dazu werden diese Gene im FP von Wildtyp-Embryonen bei E12.5 noch exprimiert (Ergänzungsmaterial Abb. S3).

Analyse der Enhancer-Aktivität durch transiente lacZ Transgenese in Maus- und Hühnerembryonen

Um die Beiträge von FBRs zur cis-Regulation der Genexpression zu untersuchen, haben wir diejenigen ausgewählt, die mit Lmx1a, Lmx1b und Corin, drei Gene, die in mDA-Vorläufern exprimiert wurden, zur funktionellen Analyse durch Transgenese. Foxa2 an drei umliegende Regionen gebunden Lmx1a die in 15-18 Arten konserviert sind, bezeichnet als E1, E2 und E3, und zwei konservierte Regionen um Lmx1b als E1 und E2 bezeichnet (Ergänzungsmaterial Tabelle S4). Diese konservierten Elemente wurden in einen minimalen β-Globin-Promotor kloniert.lacZ Reporterplasmid und in befruchtete Mauszygoten injiziert, um ihre Enhancer-Aktivität durch X-gal-Färbung bei E10.5 zu bestimmen.

Die Drei Lmx1a genomische Regionen, 522 bp E1, 881 bp E2 und 446 bp E3, gefördert lacZ Expression in transgenen Embryonen (Fig. 5A-C'). Lmx1a Transgene E1-Embryonen zeigten β-Galactosidase (β-gal)-Aktivität im gesamten ventralen Neuralrohr, ähnlich dem Foxa2-Expressionsmuster (Fig. 5A-A″), während das Muster der β-gal-Aktivität in Lmx1a Transgene E2- und E3-Embryonen wurden auf den rostralen Teil der endogenen Expressionsdomäne von Lmx1a beschränkt (Andersson et al., 2006b), d. h. das kaudale Vorderhirn und das vordere Mittelhirn (Fig. 5B-C'). Die Identifizierung von drei Enhancern für Lmx1a schlägt vor, dass mehrere cis-regulatorische Elemente zusammenwirken, um das genaue räumliche Expressionsmuster dieses Gens zu spezifizieren.

Erfolgreiche Vorhersage von FP-Enhancern aus Foxa2-Bindungsereignissen in mDA-Vorläufern. (A-E) E10.0-10.5 transgene Mausembryonen exprimieren lacZ von einem minimalen Promotor und Kandidaten-Enhancern, die von Foxa2 in der Lmx1a, Lmx1b und Corin Gene. (A′-E″) Histologische Schnitte durch das Mittelhirn (A′-E′) und das Rückenmark (A″-E″). (F) Ganze Halterung lacZ Färbung von transgenen Embryonen, die die Lmx1b E1-Enhancer mit einer Mutation in der Foxa2-Bindungsstelle. (g) Ausrichtung mehrerer Spezies der Lmx1b E1-Enhancer unter Verwendung von ClustalW, wobei das Foxa2-Motiv durch das rote Kästchen und die Nukleotid-Substitutionen in der mutierten Version des Motivs in Rot angezeigt wird. Eine ähnliche Färbung im Mittelhirngewebe wurde in mindestens drei transgenen Embryonen für jeden der in dieser Figur dargestellten Enhancer beobachtet. Maßstabsbalken: 100 µm.

Erfolgreiche Vorhersage von FP-Enhancern aus Foxa2-Bindungsereignissen in mDA-Vorläufern. (A-E) E10.0-10.5 transgene Mausembryonen exprimieren lacZ aus einem minimalen Promotor und Kandidaten-Enhancern, die von Foxa2 in der Lmx1a, Lmx1b und Corin Gene. (A′-E″) Histologische Schnitte durch das Mittelhirn (A′-E′) und das Rückenmark (A″-E″). (F) Ganze Halterung lacZ Färbung von transgenen Embryonen, die die Lmx1b E1-Enhancer mit einer Mutation in der Foxa2-Bindungsstelle. (g) Ausrichtung mehrerer Spezies der Lmx1b E1-Enhancer unter Verwendung von ClustalW, wobei das Foxa2-Motiv durch das rote Kästchen und die Nukleotid-Substitutionen in der mutierten Version des Motivs in Rot angezeigt wird. Eine ähnliche Färbung im Mittelhirngewebe wurde in mindestens drei transgenen Embryonen für jeden der in dieser Figur dargestellten Enhancer beobachtet. Maßstabsbalken: 100 µm.

Einer Lmx1b Element, der 206 bp E1-Region, steuerte die Reportergen-Expression im FP des Mittelhirns und Rückenmarks und in zukünftigem Hörgewebe (Abb. 5D-D″), ähnlich den endogenen Domänen der Lmx1b-Expression (Guo et al., 2007 .). ). Im Gegensatz dazu enthält keiner der fünf transgenen Embryonen, die das Lmx1b E2-Konstrukte, die analysiert wurden, exprimierten β-gal bei E10.5. Wir generierten eine Mutation in der einzelnen Foxa2-Bindungsstelle im Lmx1b E1-Enhancer, um die Anforderung an die Bindung von Foxa2 für die Aktivität dieses Elements zu bestimmen (Fig. 5G). Die Lmx1b E1 Foxa2 mutiertes Konstrukt konnte die β-gal-Expression im FP nicht über die anteroposteriore Achse des Embryos, des Herzens und des dorsalen Teils des Ohrgefäßes steuern, während die ektope β-gal-Expression in den Somiten beibehalten wurde (Fig. 5F), was darauf hindeutet, dass die Expression in das FP ist von der Foxa2-Site abhängig. Foxa2 wird jedoch nicht im Herz- und Ohrengefäß exprimiert, so dass die Abhängigkeit der β-gal-Expression von der Foxa2-Stelle in diesen Strukturen nahelegt, dass andere Forkhead-Proteine ​​mit ähnlichen Bindungseigenschaften diese Stellen besetzen.

Corin ist eine Zelloberflächenprotease, die spezifisch in mDA-Vorläufern im FP exprimiert wird (Ono et al., 2007). Zwei FBRs wurden in der gefunden Corin Gen, von denen nur eines konserviert ist. Dieses als E1 bezeichnete Element war in der Lage, die β-gal-Expression im FP in den Mittelhirn- und Schwanzregionen außer in Rhombomer 1 zu fördern (Fig. 5E-E').

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass zumindest einige der FBRs in den drei analysierten Genen Enhancer-Regulationsfunktionen im FP haben und dass die Foxa2-Bindung für die Enhancer-Aktivität im Fall der Lmx1b E1-Element.

Wir haben auch untersucht, ob die FBRs in Lmx1a, Lmx1b und Corin Funktion als Enhancer in Hühnern durch Elektroporation der gleichen Konstrukte wie oben in das Mittelhirn von Hühnerembryonen im Stadium 10 und Analysieren der β-gal-Aktivität 48 Stunden später. In diesem Assay, Lmx1b E1 und Corin E1 förderte die β-gal-Expression im FP, während keiner der drei FBRs von Lmx1a zeigte Aktivität (Daten in Fig. 6A, B nicht gezeigt). Zwei zusätzliche FBRs, in Bmp7 und Schlitz2, förderte auch die β-gal-Expression im FP ( 6A ). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass einige FBRs sowohl bei Mäusen als auch bei Küken Enhancer-Funktionen aufweisen.

Screening von durch Foxa2 gebundenen Kandidaten-Enhancer-Elementen in Hühnerembryonen. (EIN) Das Mittelhirn-Neuroepithel von Hühnerembryonen im Stadium 10 wurde mit ausgewählten Kandidaten-Enhancern in der Lmx1a, Lmx1b, Bmp7, Slit2 und Corin in a . klonierte Gene lacZ Reporter-Konstrukt. Ein GFP-Konstrukt wurde zusammen mit den Testkonstrukten elektroporiert, um die Elektroporationseffizienz und den Leerwert zu bewerten lacZ Reporterkonstrukt wurde als Kontrolle verwendet (nicht gezeigt). Embryonen, die 48 Stunden nach der Elektroporation geerntet wurden, sind in seitlicher Ansicht (links) und dorsaler Ansicht (rechts) dargestellt. Gestrichelte Linien zeigen die Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze an. (B) Koronaler Schnitt eines Hühnerembryos, elektroporiert mit dem Lmx1b E1 lacZ Konstrukt, das GFP + elektroporierte Zellen im größten Teil des Mittelhirns (grün) zeigt, während die β-gal-Expression (rot) auf das ventrale Mittelhirn beschränkt ist. Das rechte Bild ist eine Zusammenführung.

Screening von durch Foxa2 gebundenen Kandidaten-Enhancer-Elementen in Hühnerembryonen. (EIN) Das Mittelhirn-Neuroepithel von Hühnerembryonen im Stadium 10 wurde mit ausgewählten Kandidaten-Enhancern in der Lmx1a, Lmx1b, Bmp7, Slit2 und Corin in a . klonierte Gene lacZ Reporter-Konstrukt. Ein GFP-Konstrukt wurde zusammen mit den Testkonstrukten elektroporiert, um die Elektroporationseffizienz und den Leerwert zu bewerten lacZ Reporterkonstrukt wurde als Kontrolle verwendet (nicht gezeigt). Embryonen, die 48 Stunden nach der Elektroporation geerntet wurden, sind in seitlicher Ansicht (links) und dorsaler Ansicht (rechts) dargestellt. Gestrichelte Linien zeigen die Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze an. (B) Koronaler Schnitt eines Hühnerembryos, elektroporiert mit dem Lmx1b E1 lacZ Konstrukt, das GFP + elektroporierte Zellen im größten Teil des Mittelhirns (grün) zeigt, während die β-gal-Expression (rot) auf das ventrale Mittelhirn beschränkt ist. Das rechte Bild ist eine Zusammenführung.

Foxa2 hemmt alternative neuronale Schicksale des Mittelhirns durch direkte Bindung an Determinanten des Zellschicksals

Unsere früheren funktionellen Studien zeigten, dass Foxa2 die Schicksalsspezifikation von mDA-Neuronen teilweise durch Hemmung der Expression einer dorsalen und ventrolateralen Mittelhirndeterminante, Helt, fördert, die für die Entwicklung der meisten GABAergen Mittelhirnneuronen essentiell ist (Miyoshi et al., 2004 Guimera et al., 2006 Nakatani et al., 2007). Da Foxa2 in In-vitro-Transfektionsexperimenten als Transkriptionsaktivator fungieren konnte, war unklar, ob Foxa2 direkt reprimiert Helt um das GABAerge Zellschicksal zu unterdrücken. Die Untersuchung der Foxa2-ChIP-seq-Daten ergab, dass Helt wird tatsächlich von Foxa2 gebunden und ist daher wahrscheinlich ein direktes Ziel der Foxa2-Repression (Ergänzungsmaterial Tabelle S1). Darüber hinaus unterdrückt Foxa2 auch eine ventrolaterale Mittelhirndeterminante, Nkx2,2, wahrscheinlich durch direkte Bindung (Lin et al., 2009).

Da Foxa2 direkt ventrolaterale Determinanten wie z Helt und Nkx2,2 (Lin et al., 2009) begründeten wir, dass die Überschneidung unserer Liste der FBR-assoziierten Gene (FBGs) mit einer Liste von Genen, die spezifisch im ventrolateralen Mittelhirn exprimiert werden, zur Identifizierung zusätzlicher Gene führen könnte, die normalerweise von Foxa2 im FP . reprimiert werden . Eine Liste von 312 Genen, die spezifisch im ventrolateralen Mittelhirn exprimiert werden, wurde kürzlich veröffentlicht (Gennet et al., 2011). Von den in dieser Studie identifizierten FBG waren 108 in dieser Liste enthalten (hypergeometrische Analyse, P=2,47×10 -19 Abb. 4E), einschließlich Genen, von denen gezeigt wurde, dass sie in reprimiert werden Foxa1/2 cko-Mutanten, wie Gli1, Gli2 und Gli3 (Mavromatakis et al., 2011) und unterstützt damit die ursprüngliche Begründung. Die Untersuchung der Expression von fünf anderen Transkriptionsfaktoren, nämlich Tle4, Otx1, Sox1, Tal2 und Pax3, zeigte, dass alle außer Pax3 eine erweiterte ventrale Mittelhirnexpression in E10.5 . aufwiesen Foxa1/2 cko-Embryonen (Abb. 7). Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass Foxa2-gebundene Gene, die im ventrolateralen Mittelhirn exprimiert werden, eine bereicherte Liste von Genen darstellen, die von Foxa2 im FP reprimiert werden. Ähnlich wie bei Genen, die durch Foxa2 im FP positiv reguliert werden, könnten einige der unterdrückten Gene indirekt durch Foxa2 reguliert werden, obwohl wir festgestellt haben, dass Otx1 und Punkt1 sind ektopisch im FP von . exprimiert NestinCreFoxa1 −/− Foxa2 flox/flox Mutanten in Abwesenheit von Foxa1 und Foxa2 bei E12.5 (Ergänzungsmaterial Abb. S3). Diese Ergebnisse stimmen mit der Idee überein, dass diese Gene direkt von Foxa2 unterdrückt werden.

Hemmung ventrolateraler Determinanten im FP des Mittelhirns. (ANZEIGE') Tle4, Otx1, Sox1 und Tal2 werden im FP zusätzlich zu ihrer normalen Expression in den dorsalen und/oder ventrolateralen Mittelhirnregionen der Maus E10.5 . ektopisch exprimiert Foxa1/2 cko-Mutanten, verglichen mit Kontroll-Wurfgeschwistern. (E,E′) Für wurde keine Änderung beobachtet Pax3 Ausdruck im dorsalen Mittelhirn zwischen Foxa1/2 cko-Mutanten und Kontroll-Wurfgeschwister.

Hemmung ventrolateraler Determinanten im FP des Mittelhirns. (ANZEIGE') Tle4, Otx1, Sox1 und Tal2 werden im FP zusätzlich zu ihrer normalen Expression in den dorsalen und/oder ventrolateralen Mittelhirnregionen der Maus E10.5 . ektopisch exprimiert Foxa1/2 cko-Mutanten, verglichen mit Kontroll-Wurfgeschwistern. (E,E′) Für wurde keine Änderung beobachtet Pax3 Ausdruck im dorsalen Mittelhirn zwischen Foxa1/2 cko-Mutanten und Kontroll-Wurfgeschwister.


16.4 Eukaryotische Transkriptionsgenregulation

Wie bei prokaryontischen Zellen erfordert die Transkription von Genen in Eukaryonten die Aktionen einer RNA-Polymerase, um an eine Sequenz stromaufwärts eines Gens zu binden, um die Transkription zu initiieren. Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen benötigt die eukaryontische RNA-Polymerase jedoch andere Proteine ​​oder Transkriptionsfaktoren, um die Transkriptionsinitiation zu erleichtern. Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an die Promotorsequenz und andere regulatorische Sequenzen binden, um die Transkription des Zielgens zu kontrollieren. RNA-Polymerase allein kann die Transkription in eukaryontischen Zellen nicht initiieren. Transkriptionsfaktoren müssen zuerst an die Promotorregion binden und RNA-Polymerase an die Stelle rekrutieren, an der die Transkription etabliert werden soll.

Sehen Sie sich den Transkriptionsprozess an – die Herstellung von RNA aus einer DNA-Vorlage.

Der Promoter und die Transkriptionsmaschinerie

Gene sind organisiert, um die Kontrolle der Genexpression zu erleichtern. Die Promotorregion befindet sich unmittelbar stromaufwärts der kodierenden Sequenz. Diese Region kann kurz (nur wenige Nukleotide lang) oder ziemlich lang (Hunderte von Nukleotiden lang) sein. Je länger der Promotor, desto mehr Platz für Proteine ​​zum Binden. Dies verleiht dem Transkriptionsprozess auch mehr Kontrolle. Die Länge des Promotors ist genspezifisch und kann sich zwischen den Genen dramatisch unterscheiden. Folglich kann sich auch der Grad der Kontrolle der Genexpression zwischen den Genen ziemlich dramatisch unterscheiden. Der Zweck des Promotors besteht darin, Transkriptionsfaktoren zu binden, die die Initiation der Transkription steuern.

Innerhalb der Promotorregion, direkt stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle, befindet sich die TATA-Box. Diese Box ist einfach eine Wiederholung von Thymin- und Adenindinukleotiden (wörtlich TATA-Wiederholungen). Die RNA-Polymerase bindet an den Transkriptionsinitiationskomplex, was die Transkription ermöglicht. Um die Transkription zu initiieren, bindet zuerst ein Transkriptionsfaktor (TFIID) an die TATA-Box. Die Bindung von TFIID rekrutiert andere Transkriptionsfaktoren, einschließlich TFIIB, TFIIE, TFIIF und TFIIH an die TATA-Box. Sobald dieser Komplex zusammengesetzt ist, kann die RNA-Polymerase an seine stromaufwärts gelegene Sequenz binden. Wenn sie zusammen mit den Transkriptionsfaktoren gebunden wird, wird die RNA-Polymerase phosphoryliert. Dadurch wird ein Teil des Proteins aus der DNA freigesetzt, um den Transkriptionsinitiationskomplex zu aktivieren und die RNA-Polymerase in die richtige Orientierung zu bringen, um mit der Transkription zu beginnen Mediatorproteine ​​(Abbildung 16.9).

Zusätzlich zu den allgemeinen Transkriptionsfaktoren können andere Transkriptionsfaktoren an den Promotor binden, um die Gentranskription zu regulieren. Diese Transkriptionsfaktoren binden an die Promotoren eines spezifischen Satzes von Genen. Sie sind keine allgemeinen Transkriptionsfaktoren, die an jeden Promotorkomplex binden, sondern werden an eine bestimmte Sequenz auf dem Promotor eines bestimmten Gens rekrutiert. Es gibt Hunderte von Transkriptionsfaktoren in einer Zelle, die jeweils spezifisch an ein bestimmtes DNA-Sequenzmotiv binden. Wenn Transkriptionsfaktoren direkt stromaufwärts des kodierten Gens an den Promotor binden, wird dies als a . bezeichnet cis-wirkendes Element, da es sich auf dem gleichen Chromosom direkt neben dem Gen befindet. Die Region, an die ein bestimmter Transkriptionsfaktor bindet, wird als Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle bezeichnet. Transkriptionsfaktoren reagieren auf Umweltreize, die dazu führen, dass die Proteine ​​ihre Bindungsstellen finden und die Transkription des benötigten Gens initiieren.

Enhancer und Transkription

In einigen eukaryotischen Genen gibt es Regionen, die helfen, die Transkription zu erhöhen oder zu verbessern. Diese Regionen, die als Enhancer bezeichnet werden, befinden sich nicht unbedingt in der Nähe der Gene, die sie verstärken. Sie können stromaufwärts eines Gens, innerhalb der kodierenden Region des Gens, stromabwärts eines Gens oder Tausende von Nukleotiden entfernt liegen.

Enhancer-Regionen sind Bindungssequenzen oder Stellen für Transkriptionsfaktoren. Wenn ein DNA-beugendes Protein bindet, ändert sich die Form der DNA (Abbildung 16.9). Diese Formänderung ermöglicht die Interaktion der an die Enhancer gebundenen Aktivatoren mit den an die Promotorregion gebundenen Transkriptionsfaktoren und der RNA-Polymerase. Während DNA im Allgemeinen als gerade Linie in zwei Dimensionen dargestellt wird, ist sie eigentlich ein dreidimensionales Objekt. Daher kann eine Nukleotidsequenz, die Tausende von Nukleotiden entfernt ist, sich umfalten und mit einem spezifischen Promotor interagieren.

Gene ausschalten: Transkriptionelle Repressoren

Wie prokaryontische Zellen verfügen auch eukaryontische Zellen über Mechanismen, um die Transkription zu verhindern. Transkriptionelle Repressoren können an Promotor- oder Enhancer-Regionen binden und die Transkription blockieren. Wie die Transkriptionsaktivatoren reagieren Repressoren auf externe Stimuli, um die Bindung von aktivierenden Transkriptionsfaktoren zu verhindern.


Transkriptionsfaktoren schaffen die richtigen Kontakte

Die Zellidentität wird durch ein komplexes Zusammenspiel zwischen Transkriptionsfaktoren, Enhancern und Genomorganisation geprägt. Eine Studie zeigt nun eine dynamische Rolle des Transkriptionsfaktors KLF4 bei der Steuerung von Genregulationsinteraktionen während der Reprogrammierung pluripotenter Zellen und zeigt, dass Transkriptionsfaktoren als Chromatin-Organisatoren fungieren können.

Die Entdeckung, dass adulte Zellen in pluripotente Stammzellen (PSCs) mit vollem Entwicklungspotenzial umprogrammiert werden können, veränderte unsere Denkweise darüber, wie die Zellidentität kontrolliert wird 1 . Die Reprogrammierung wird durch die Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren – OCT4, KLF4, SOX2 und cMYC – in Zellen erreicht, die durch unterstützende Kulturbedingungen genährt werden. Die Bestimmung der molekularen Ereignisse, die nach der Bindung des Transkriptionsfaktors auftreten, hat weitreichende Konsequenzen für unser Verständnis davon, wie die Zellidentität in Entwicklung und Krankheit verändert wird. Die Modulierung dieser Prozesse könnte zu Verbesserungen bei der Produktion therapeutischer Zelltypen führen. In dieser Ausgabe von Natur Zellbiologie, DiGiammartinoet al. tragen zu diesem Verständnis bei, indem sie enthüllen, dass der Reprogrammierungsfaktor KLF4 regulatorische Elemente steuert, um ihre Zielgenexpression durch dreidimensionales Chromatin-Looping mit großer Reichweite zu kontrollieren 2 .


Kurzfristige TF-Bindung, Langzeitexpression

Während die rechnergestützte Modellierung, wie sich die Genregulationsdynamik über Stunden entfaltet, die Topologie von pflanzlichen Genregulationsnetzwerken aufdecken kann, haben sich auch experimentelle Analysen von sehr feinskalierten Zeitreihen von TF-Target-Interaktionen im Minutenbereich als fruchtbar erwiesen. Die Beobachtung von Genregulationsreaktionen, die innerhalb kürzerer Zeiträume auftreten, konnte TF-DNA-Dynamiken erfassen, die andernfalls über längere Zeiträume übersehen worden wären. Tatsächlich haben solche Ansätze neue


16.4 Eukaryotische transkriptionelle Genregulation

In diesem Abschnitt werden Sie der folgenden Frage nachgehen:

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Um die Transkription zu starten, müssen allgemeine Transkriptionsfaktoren zunächst an einen bestimmten Bereich der DNA, der als TATA-Box bezeichnet wird, binden und dann RNA-Polymerase an diese Stelle rekrutieren. Darüber hinaus tragen andere Bereiche der DNA, die als Enhancer-Regionen bezeichnet werden, zur Steigerung der Transkription bei. Transkriptionsfaktoren können an Enhancer-Regionen binden, um die Transkription zu erhöhen oder zu verhindern.

Die präsentierten Informationen und die hervorgehobenen Beispiele im Abschnitt unterstützen die Konzepte, die in Big Idea 3 des AP ® Biology Curriculum Framework skizziert sind. Die im Curriculum Framework aufgeführten Lernziele bieten eine transparente Grundlage für den AP ® Biologiekurs, eine forschungsbasierte Laborerfahrung, Lehraktivitäten und AP ® Prüfungsfragen. Ein Lernziel verbindet erforderliche Inhalte mit einer oder mehreren der sieben Wissenschaftspraktiken

Große Idee 3 Lebende Systeme speichern, rufen, übertragen und reagieren auf Informationen, die für Lebensprozesse unerlässlich sind.
Beständiges Verständnis 3.B Die Expression genetischer Informationen umfasst zelluläre und molekulare Mechanismen.
Grundlegendes Wissen 3.B.1 Die Genregulation führt zu einer differenziellen Genexpression, die zu einer Zellspezialisierung führt
Wissenschaftliche Praxis 7.1 Die Studierenden können Phänomene und Modelle über räumliche und zeitliche Skalen hinweg verbinden.
Lernziel 3.18 Der Student ist in der Lage, den Zusammenhang zwischen der Regulation der Genexpression und beobachteten Unterschieden zwischen verschiedenen Organismenarten zu beschreiben
Grundlegendes Wissen 3.B.1 Die Genregulation führt zu einer differenziellen Genexpression, die zu einer Zellspezialisierung führt
Wissenschaftliche Praxis 7.1 Der Student kann Phänomene und Modelle über räumliche und zeitliche Skalen hinweg verbinden
Lernziel 3.19 Der Student ist in der Lage, den Zusammenhang zwischen der Regulation der Genexpression und beobachteten Unterschieden zwischen Individuen einer Population zu beschreiben
Grundlegendes Wissen 3.B.1 Die Genregulation führt zu einer differentiellen Genexpression, die zu einer Zellspezialisierung führt.
Wissenschaftliche Praxis 6.2 Der Schüler kann Erklärungen von Phänomenen aufbauen, die auf Beweisen basieren, die durch wissenschaftliche Praktiken gewonnen wurden
Lernziel 3.20 Der Student ist in der Lage zu erklären, inwiefern die Regulation der Genexpression essentiell für die Prozesse und Strukturen ist, die eine effiziente Zellfunktion unterstützen.
Grundlegendes Wissen 3.B.1 1 Die Genregulation führt zu einer differentiellen Genexpression, die zu einer Zellspezialisierung führt.
Wissenschaftliche Praxis 1.4 Die Studierenden können anhand von Darstellungen und Modellen Situationen analysieren oder Probleme qualitativ und quantitativ lösen.
Lernziel 3.21 Der Student kann anhand von Darstellungen beschreiben, wie die Genregulation die Zellprodukte und -funktion beeinflusst.

Lehrerunterstützung

Lassen Sie die Schüler mit farbigem Papier eine visuelle Darstellung erstellen, die die DNA-Transkription und die Rolle von Enhancern und Repressoren bei der Transkription zeigt.

Die Challenge-Fragen zur Wissenschaftspraxis enthalten zusätzliche Testfragen für diesen Abschnitt, die Ihnen bei der Vorbereitung auf die AP-Prüfung helfen. Diese Fragen beziehen sich auf folgende Standards:
[APLO 3.18]

Wie bei prokaryontischen Zellen erfordert die Transkription von Genen in Eukaryonten die Aktionen einer RNA-Polymerase, um an eine Sequenz stromaufwärts eines Gens zu binden, um die Transkription zu initiieren. Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen benötigt die eukaryontische RNA-Polymerase jedoch andere Proteine ​​oder Transkriptionsfaktoren, um die Transkriptionsinitiation zu erleichtern. Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an die Promotorsequenz und andere regulatorische Sequenzen binden, um die Transkription des Zielgens zu kontrollieren. RNA-Polymerase allein kann die Transkription in eukaryontischen Zellen nicht initiieren. Transkriptionsfaktoren müssen zuerst an die Promotorregion binden und RNA-Polymerase an die Stelle rekrutieren, an der die Transkription etabliert werden soll.

Die Aktivität von Transkriptionsfaktoren kann die unterschiedliche Genexpression in Zellen regulieren, was zur Entwicklung unterschiedlicher Zellprodukte und -funktionen führt. Wissenschaftler haben beispielsweise herausgefunden, dass die primären Geschlechtsmerkmale von mehreren Genen reguliert werden Abbildung 16.9. In der Fruchtfliege Drosophila, das slx Gen bestimmt das Geschlecht. Dieses Gen wird exprimiert, wenn der Organismus zwei Kopien des X-Chromosoms besitzt. Das Genprodukt für slx bindet an die mRNA des tra Gen und reguliert sein Spleißen. In Anwesenheit von slx, tra wird in seine weibliche Form gespleißt und beeinflusst den Ausdruck von dsx und fru zu weiblichen Geschlechtsmerkmalen führen. In Abwesenheit von slx, tra wird in seine männliche Form gespleißt und es resultieren männliche Geschlechtsmerkmale.

Link zum Lernen

Sehen Sie sich den Transkriptionsprozess – die Herstellung von RNA aus einer DNA-Vorlage – auf dieser Seite an.

  1. DNA entwickelt sich, Transkriptionsfaktoren binden, der Terminationskomplex bildet sich und DNA-Polymerase fügt der mRNA Nukleotide hinzu.
  2. DNA wird abgewickelt, Transkriptionsfaktoren binden und RNA-Polymerase fügt der mRNA Nukleotide hinzu.
  3. Der Transkriptionskomplex bildet sich, Transkriptionsfaktoren fügen der sich bildenden mRNA Nukleotide hinzu und die mRNA trennt sich von der DNA.
  4. Es kommt zur Elongation, gefolgt von der Bildung des Transkriptionsinitiationskomplexes und der Trennung des mRNA-Strangs von der DNA.

Der Promoter und die Transkriptionsmaschinerie

Gene sind organisiert, um die Kontrolle der Genexpression zu erleichtern. Die Promotorregion befindet sich unmittelbar stromaufwärts der kodierenden Sequenz. Diese Region kann kurz (nur wenige Nukleotide lang) oder ziemlich lang (Hunderte von Nukleotiden lang) sein. Je länger der Promotor, desto mehr Platz für Proteine ​​zum Binden. Dies verleiht dem Transkriptionsprozess auch mehr Kontrolle. Die Länge des Promotors ist genspezifisch und kann sich zwischen den Genen dramatisch unterscheiden. Folglich kann sich auch der Grad der Kontrolle der Genexpression zwischen den Genen ziemlich dramatisch unterscheiden. Der Zweck des Promotors besteht darin, Transkriptionsfaktoren zu binden, die die Initiation der Transkription steuern.

Innerhalb der Promotorregion, direkt stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle, befindet sich die TATA-Box. Diese Box ist einfach eine Wiederholung von Thymin- und Adenindinukleotiden (wörtlich TATA-Wiederholungen). Die RNA-Polymerase bindet an den Transkriptionsinitiationskomplex, was die Transkription ermöglicht. Um die Transkription zu initiieren, bindet zuerst ein Transkriptionsfaktor (TFIID) an die TATA-Box. Die Bindung von TFIID rekrutiert andere Transkriptionsfaktoren, einschließlich TFIIB, TFIIE, TFIIF und TFIIH an die TATA-Box. Sobald dieser Komplex zusammengesetzt ist, kann die RNA-Polymerase an seine stromaufwärts gelegene Sequenz binden. Wenn sie zusammen mit den Transkriptionsfaktoren gebunden wird, wird die RNA-Polymerase phosphoryliert. Dadurch wird ein Teil des Proteins aus der DNA freigesetzt, um den Transkriptionsinitiationskomplex zu aktivieren und die RNA-Polymerase in die richtige Orientierung zu bringen, um mit der Transkription zu beginnen Mediatorproteine ​​(Abbildung 16.10).

Zusätzlich zu den allgemeinen Transkriptionsfaktoren können andere Transkriptionsfaktoren an den Promotor binden, um die Gentranskription zu regulieren. Diese Transkriptionsfaktoren binden an die Promotoren eines spezifischen Satzes von Genen. Sie sind keine allgemeinen Transkriptionsfaktoren, die an jeden Promotorkomplex binden, sondern werden an eine bestimmte Sequenz auf dem Promotor eines bestimmten Gens rekrutiert. Es gibt Hunderte von Transkriptionsfaktoren in einer Zelle, die jeweils spezifisch an ein bestimmtes DNA-Sequenzmotiv binden. Wenn Transkriptionsfaktoren direkt stromaufwärts des kodierten Gens an den Promotor binden, wird dies als a . bezeichnet cis-wirkendes Element, da es sich auf dem gleichen Chromosom direkt neben dem Gen befindet. Die Region, an die ein bestimmter Transkriptionsfaktor bindet, wird als Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle bezeichnet. Transkriptionsfaktoren reagieren auf Umweltreize, die dazu führen, dass die Proteine ​​ihre Bindungsstellen finden und die Transkription des benötigten Gens initiieren.

Enhancer und Transkription

In einigen eukaryotischen Genen gibt es Regionen, die helfen, die Transkription zu erhöhen oder zu verbessern. Diese Regionen, die als Enhancer bezeichnet werden, befinden sich nicht unbedingt in der Nähe der Gene, die sie verstärken. Sie können stromaufwärts eines Gens, innerhalb der kodierenden Region des Gens, stromabwärts eines Gens oder Tausende von Nukleotiden entfernt liegen.

Enhancer-Regionen sind Bindungssequenzen oder Stellen für Transkriptionsfaktoren. Wenn ein DNA-beugendes Protein bindet, ändert sich die Form der DNA (Abbildung 16.10). Diese Formänderung ermöglicht die Interaktion der an die Enhancer gebundenen Aktivatoren mit den an die Promotorregion gebundenen Transkriptionsfaktoren und der RNA-Polymerase. Während DNA im Allgemeinen als gerade Linie in zwei Dimensionen dargestellt wird, ist sie eigentlich ein dreidimensionales Objekt. Daher kann eine Nukleotidsequenz, die Tausende von Nukleotiden entfernt ist, sich umfalten und mit einem spezifischen Promotor interagieren.

Gene ausschalten: Transkriptionelle Repressoren

Wie prokaryontische Zellen verfügen auch eukaryontische Zellen über Mechanismen, um die Transkription zu verhindern. Transkriptionelle Repressoren können an Promotor- oder Enhancer-Regionen binden und die Transkription blockieren. Wie die Transkriptionsaktivatoren reagieren Repressoren auf externe Stimuli, um die Bindung von aktivierenden Transkriptionsfaktoren zu verhindern.


Inhalt

Transkription Bearbeiten

Die Herstellung einer RNA-Kopie aus einem DNA-Strang wird als Transkription bezeichnet und wird von RNA-Polymerasen durchgeführt, die gemäß dem Komplementaritätsgesetz der Nukleotidbasen jeweils ein Ribonukleotid zu einem wachsenden RNA-Strang hinzufügen. Diese RNA ist komplementär zum 3′ → 5′ DNA-Strang der Matrize, [7] mit der Ausnahme, dass Thymine (T) in der RNA durch Uracile (U) ersetzt sind.

Bei Prokaryoten wird die Transkription von einem einzigen Typ von RNA-Polymerase durchgeführt, der mit Hilfe des Sigma-Faktor-Proteins (σ-Faktor) eine DNA-Sequenz namens Pribnow-Box binden muss, um die Transkription zu starten. Bei Eukaryoten wird die Transkription im Zellkern von drei Arten von RNA-Polymerasen durchgeführt, von denen jede eine spezielle DNA-Sequenz, den sogenannten Promotor, und eine Reihe von DNA-bindenden Proteinen – Transkriptionsfaktoren – benötigt, um den Prozess zu initiieren (siehe unten Transkriptionsregulation). . Die RNA-Polymerase I ist für die Transkription von Genen der ribosomalen RNA (rRNA) verantwortlich. RNA-Polymerase II (Pol II) transkribiert alle proteinkodierenden Gene, aber auch einige nicht-kodierende RNAs (z.B., snRNAs, snoRNAs oder lange nicht-kodierende RNAs). RNA-Polymerase III transkribiert 5S-rRNA, Transfer-RNA (tRNA)-Gene und einige kleine nicht-kodierende RNAs (z.B., 7SK). Die Transkription endet, wenn die Polymerase auf eine Sequenz trifft, die als Terminator bezeichnet wird.

MRNA-Verarbeitung Bearbeiten

Während die Transkription prokaryontischer Protein-kodierender Gene Boten-RNA (mRNA) erzeugt, die für die Translation in Protein bereit ist, hinterlässt die Transkription eukaryontischer Gene ein primäres RNA-Transkript (Prä-RNA), das zunächst einer Reihe von Modifikationen unterzogen werden muss, um zu einem reife RNA. Arten und Schritte, die an den Reifungsprozessen beteiligt sind, variieren zwischen kodierenden und nicht-kodierenden präRNAs d.h. obwohl preRNA-Moleküle sowohl für mRNA als auch für tRNA gespleißt werden, sind die beteiligten Schritte und Mechanismen unterschiedlich. [8] Die Verarbeitung von nicht-kodierender RNA wird im Folgenden beschrieben (Reifung der nicht-kodierenden RNA).

Die Verarbeitung von prämRNA umfasst 5′ kappen, die eine Reihe von enzymatischen Reaktionen ist, die 7-Methylguanosin (m 7 G) an das 5'-Ende der prä-mRNA anfügen und so die RNA vor dem Abbau durch Exonukleasen schützen. Das m 7 G-Cap wird dann durch das Cap-Bindungskomplex-Heterodimer (CBC20/CBC80) gebunden, das den mRNA-Export in das Zytoplasma unterstützt und auch die RNA vor Entkappung schützt.

Eine weitere Modifikation ist 3′ Spaltung und Polyadenylierung. Sie treten auf, wenn die Polyadenylierungs-Signalsequenz (5'-AAUAAA-3') in prä-mRNA vorhanden ist, die normalerweise zwischen Protein-kodierender Sequenz und Terminator liegt. Die prä-mRNA wird zuerst gespalten und dann eine Reihe von

200 Adenine (A) werden hinzugefügt, um einen Poly(A)-Schwanz zu bilden, der die RNA vor Abbau schützt. Der Poly(A)-Schwanz wird von mehreren Poly(A)-bindenden Proteinen (PABPs) gebunden, die für den mRNA-Export und die Translationsneuinitiation notwendig sind. Im umgekehrten Prozess der Deadenylierung werden Poly(A)-Schwänze durch die CCR4-Not 3′-5′-Exonuklease verkürzt, was häufig zum vollständigen Zerfall des Transkripts führt.

Eine sehr wichtige Modifikation der eukaryotischen prä-mRNA ist RNA-Spleißen. Die Mehrheit der eukaryotischen Prä-mRNAs besteht aus alternierenden Segmenten, die Exons und Introns genannt werden. Während des Spleißens katalysiert ein katalytischer RNA-Protein-Komplex, bekannt als Spleißosom, zwei Umesterungsreaktionen, die ein Intron entfernen und in Form einer Lariat-Struktur freisetzen und dann benachbarte Exons zusammenspleißen. In bestimmten Fällen können einige Introns oder Exons entweder entfernt oder in reifen mRNA beibehalten werden. Dieses sogenannte alternative Spleißen erzeugt eine Reihe unterschiedlicher Transkripte, die von einem einzigen Gen stammen. Da diese Transkripte potenziell in verschiedene Proteine ​​übersetzt werden können, erweitert das Spleißen die Komplexität der eukaryotischen Genexpression und die Größe eines Spezies-Proteoms.

Umfangreiche RNA-Prozessierung könnte ein evolutionärer Vorteil sein, der durch den Kern von Eukaryoten ermöglicht wird. Bei Prokaryoten erfolgen Transkription und Translation gemeinsam, während bei Eukaryoten die Kernmembran die beiden Prozesse trennt, sodass die RNA-Prozessierung Zeit findet.

Nicht-kodierende RNA-Reifung Bearbeiten

In den meisten Organismen werden nicht-kodierende Gene (ncRNA) als Vorläufer transkribiert, die einer weiteren Verarbeitung unterzogen werden. Im Fall von ribosomalen RNAs (rRNA) werden sie oft als Prä-rRNA transkribiert, die eine oder mehrere rRNAs enthält. Die prä-rRNA wird an bestimmten Stellen durch etwa 150 verschiedene kleine nukleolusbeschränkte RNA-Spezies, sogenannte snoRNAs, gespalten und modifiziert (2′-O-Methylierung und Pseudouridin-Bildung). SnoRNAs assoziieren mit Proteinen und bilden snoRNPs. Während der snoRNA-Teil Basenpaare mit der Ziel-RNA bildet und so die Modifikation an einer bestimmten Stelle positioniert, führt der Protein-Teil die katalytische Reaktion durch. In Eukaryoten, insbesondere einem snoRNP namens RNase, spaltet MRP die 45S-Prä-rRNA in die 28S-, 5.8S- und 18S-rRNAs. Die rRNA und die RNA-Prozessierungsfaktoren bilden große Aggregate, die als Nukleolus bezeichnet werden. [9]

Im Fall von Transfer-RNA (tRNA) beispielsweise wird die 5′-Sequenz durch RNase P entfernt [10], während das 3′-Ende durch das tRNase Z-Enzym [11] und der nicht-templatierte 3′-CCA-Schwanz entfernt wird wird durch eine Nukleotidyltransferase hinzugefügt. [12] Im Fall von Mikro-RNA (miRNA) werden miRNAs zunächst als primäre Transkripte oder pri-miRNA mit Kappe und Poly-A-Schwanz transkribiert und zu kurzen 70-Nukleotiden-Stamm-Schleifen-Strukturen prozessiert, die als Prä-miRNA in . bekannt sind den Zellkern durch die Enzyme Drosha und Pasha. Nach dem Export wird es dann im Zytoplasma durch Interaktion mit der Endonuklease Dicer zu reifen miRNAs prozessiert, die auch die Bildung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC), bestehend aus dem Argonaute-Protein, initiiert.

Sogar snRNAs und snoRNAs selbst unterliegen einer Reihe von Modifikationen, bevor sie Teil eines funktionellen RNP-Komplexes werden. Dies geschieht entweder im Nukleoplasma oder in den spezialisierten Kompartimenten, den sogenannten Cajal-Körpern. Ihre Basen werden durch eine Gruppe kleiner körperspezifischer Cajal-RNAs (scaRNAs), die strukturell den snoRNAs ähneln, methyliert oder pseudouridiniliert.

RNA-Export Bearbeiten

Bei Eukaryoten muss die meiste reife RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma exportiert werden. Während einige RNAs im Zellkern funktionieren, werden viele RNAs durch die Kernporen und in das Zytosol transportiert. [13] Der Export von RNAs erfordert die Assoziation mit spezifischen Proteinen, die als Exportine bekannt sind. Für den Export eines bestimmten RNA-Typs sind bestimmte Exportin-Moleküle verantwortlich. Der mRNA-Transport erfordert auch die korrekte Assoziation mit dem Exon Junction Complex (EJC), der sicherstellt, dass die mRNA vor dem Export korrekt verarbeitet wird. In einigen Fällen werden RNAs zusätzlich zu einem bestimmten Teil des Zytoplasmas transportiert, wie beispielsweise einer Synapse. Sie werden dann von Motorproteinen geschleppt, die über Linker-Proteine ​​an bestimmte Sequenzen (sogenannte "Postleitzahlen") auf der RNA binden. [14]

Übersetzung Bearbeiten

Für einige RNA (nicht kodierende RNA) ist die reife RNA das endgültige Genprodukt. [15] Bei der Boten-RNA (mRNA) ist die RNA ein Informationsträger, der für die Synthese eines oder mehrerer Proteine ​​kodiert. mRNA, die eine einzelne Proteinsequenz trägt (häufig in Eukaryoten) ist monocistronisch, während mRNA, die mehrere Proteinsequenzen trägt (häufig in Prokaryoten), als polycistronisch bekannt ist.

Jede mRNA besteht aus drei Teilen: einer 5′-untranslatierten Region (5′UTR), einer Protein-kodierenden Region oder offenen Leseraster (ORF) und einer 3′-untranslatierten Region (3′UTR). Die kodierende Region trägt Information für die Proteinsynthese, die durch den genetischen Code kodiert wird, um Tripletts zu bilden. Jedes Triplett von Nukleotiden der kodierenden Region wird als Codon bezeichnet und entspricht einer Bindungsstelle, die zu einem Anticodon-Triplett in der Transfer-RNA komplementär ist. Transfer-RNAs mit gleicher Anticodon-Sequenz tragen immer einen identischen Aminosäuretyp. Aminosäuren werden dann durch das Ribosom entsprechend der Reihenfolge der Tripletts in der kodierenden Region aneinandergekettet. Das Ribosom hilft der Transfer-RNA, sich an die Boten-RNA zu binden und nimmt die Aminosäure aus jeder Transfer-RNA und macht daraus ein strukturloses Protein. [16] [17] Jedes mRNA-Molekül wird im Durchschnitt in viele Proteinmoleküle übersetzt

Bei Prokaryonten erfolgt die Translation im Allgemeinen an der Stelle der Transkription (co-transkriptionell), oft unter Verwendung einer Boten-RNA, die sich noch im Entstehungsprozess befindet. Bei Eukaryoten kann die Translation in einer Vielzahl von Regionen der Zelle erfolgen, je nachdem, wo sich das zu schreibende Protein befinden soll. Hauptorte sind das Zytoplasma für lösliche zytoplasmatische Proteine ​​und die Membran des endoplasmatischen Retikulums für Proteine, die aus der Zelle exportiert oder in eine Zellmembran eingeführt werden sollen. Proteine, die am endoplasmatischen Retikulum exprimiert werden sollen, werden während des Translationsprozesses erkannt. Dies wird durch das Signalerkennungspartikel gesteuert – ein Protein, das an das Ribosom bindet und es zum endoplasmatischen Retikulum lenkt, wenn es ein Signalpeptid auf der wachsenden (werdenden) Aminosäurekette findet. [20]

Falten Bearbeiten

Jedes Protein existiert als ungefaltetes Polypeptid oder Zufallsspirale, wenn es von einer mRNA-Sequenz in eine lineare Aminosäurekette übersetzt wird. Diesem Polypeptid fehlt jede entwickelte dreidimensionale Struktur (die linke Seite der Nachbarfigur). Das Polypeptid faltet sich dann aus einer zufälligen Spule in seine charakteristische und funktionelle dreidimensionale Struktur. [21] Aminosäuren interagieren miteinander, um eine wohldefinierte dreidimensionale Struktur zu erzeugen, das gefaltete Protein (rechte Seite der Abbildung), das als nativer Zustand bekannt ist. Die resultierende dreidimensionale Struktur wird durch die Aminosäuresequenz bestimmt (Anfinsens Dogma). [22]

Die richtige dreidimensionale Struktur ist für die Funktion unerlässlich, obwohl einige Teile funktioneller Proteine ​​ungefaltet bleiben können. [23] Wenn sich die Faltung nicht in die beabsichtigte Form faltet, entstehen normalerweise inaktive Proteine ​​mit unterschiedlichen Eigenschaften, einschließlich toxischer Prionen. Es wird angenommen, dass mehrere neurodegenerative und andere Krankheiten auf die Anhäufung von falsch gefaltet Proteine. [24] Viele Allergien werden durch die Faltung der Proteine ​​verursacht, denn das Immunsystem produziert keine Antikörper gegen bestimmte Proteinstrukturen. [25]

Enzyme, die Chaperone genannt werden, unterstützen das neu gebildete Protein dabei, die dreidimensionale Struktur zu erreichen, die es für seine Funktion benötigt. [26] In ähnlicher Weise helfen RNA-Chaperone RNAs, ihre funktionelle Form zu erreichen. [27] Die Unterstützung der Proteinfaltung ist eine der Hauptaufgaben des endoplasmatischen Retikulums in Eukaryoten.

Translokation Bearbeiten

Sekretorische Proteine ​​von Eukaryonten oder Prokaryonten müssen transloziert werden, um in den sekretorischen Weg einzutreten. Neu synthetisierte Proteine ​​werden durch Signalpeptide zum eukaryotischen Sec61- oder prokaryotischen SecYEG-Translokationskanal geleitet. Die Effizienz der Proteinsekretion in Eukaryoten hängt stark vom verwendeten Signalpeptid ab. [28]

Proteintransport Bearbeiten

Viele Proteine ​​sind für andere Teile der Zelle als das Zytosol bestimmt und eine breite Palette von Signalsequenzen oder (Signalpeptiden) wird verwendet, um Proteine ​​dorthin zu lenken, wo sie sein sollen. Bei Prokaryonten ist dies aufgrund der begrenzten Kompartimentierung der Zelle normalerweise ein einfacher Vorgang. In Eukaryoten gibt es jedoch eine Vielzahl unterschiedlicher Targeting-Prozesse, um sicherzustellen, dass das Protein an der richtigen Organelle ankommt.

Nicht alle Proteine ​​verbleiben in der Zelle und viele werden exportiert, zum Beispiel Verdauungsenzyme, Hormone und extrazelluläre Matrixproteine. Bei Eukaryoten ist der Exportweg gut entwickelt und der Hauptmechanismus für den Export dieser Proteine ​​ist die Translokation in das endoplasmatische Retikulum, gefolgt vom Transport über den Golgi-Apparat. [29] [30]

Die Regulation der Genexpression bezieht sich auf die Kontrolle der Menge und des Zeitpunkts des Auftretens des funktionellen Produkts eines Gens. Die Kontrolle der Expression ist von entscheidender Bedeutung, damit eine Zelle die benötigten Genprodukte produzieren kann, wenn sie diese wiederum benötigt. Dies gibt Zellen die Flexibilität, sich an eine variable Umgebung, externe Signale, Schäden an der Zelle und andere Reize anzupassen. Allgemeiner gesagt gibt die Genregulation der Zelle die Kontrolle über alle Strukturen und Funktionen und ist die Grundlage für die zelluläre Differenzierung, Morphogenese und die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit jedes Organismus.

Es werden zahlreiche Begriffe verwendet, um Arten von Genen zu beschreiben, je nachdem, wie sie reguliert werden. Dazu gehören:

  • EIN konstitutives Gen ist ein Gen, das kontinuierlich transkribiert wird, im Gegensatz zu einem fakultativen Gen, das nur bei Bedarf transkribiert wird.
  • EIN Housekeeping-Gen ist ein Gen, das zur Aufrechterhaltung der grundlegenden Zellfunktion benötigt wird und daher typischerweise in allen Zelltypen eines Organismus exprimiert wird. Beispiele sind Aktin, GAPDH und Ubiquitin.Einige Haushaltsgene werden mit einer relativ konstanten Rate transkribiert und diese Gene können als Referenzpunkt in Experimenten verwendet werden, um die Expressionsraten anderer Gene zu messen.
  • EIN fakultatives Gen ist ein Gen, das nur bei Bedarf transkribiert wird, im Gegensatz zu einem konstitutiven Gen.
  • Ein induzierbares Gen ist ein Gen, dessen Expression entweder auf Umweltveränderungen reagiert oder von der Position im Zellzyklus abhängt.

Jeder Schritt der Genexpression kann moduliert werden, vom DNA-RNA-Transkriptionsschritt bis zur posttranslationalen Modifikation eines Proteins. Die Stabilität des endgültigen Genprodukts, sei es RNA oder Protein, trägt ebenfalls zum Expressionsniveau des Gens bei – ein instabiles Produkt führt zu einem niedrigen Expressionsniveau. Im Allgemeinen wird die Genexpression durch Veränderungen [31] in der Anzahl und Art der Interaktionen zwischen Molekülen [32] reguliert, die kollektiv die Transkription von DNA [33] und Translation von RNA beeinflussen. [34]

Einige einfache Beispiele dafür, wo Genexpression wichtig ist, sind:

  • Kontrolle der Insulinexpression, so dass es ein Signal für die Blutzuckerregulation gibt. bei weiblichen Säugetieren, um eine "Überdosis" der enthaltenen Gene zu verhindern. Expressionsniveaus kontrollieren das Fortschreiten durch den eukaryotischen Zellzyklus.

Transkriptionsregulierung Bearbeiten

Die Regulation der Transkription kann in drei Hauptbeeinflussungswege unterteilt werden: genetisch (direkte Interaktion eines Kontrollfaktors mit dem Gen), Modulationsinteraktion eines Kontrollfaktors mit der Transkriptionsmaschinerie und epigenetisch (nicht sequenzielle Veränderungen in der DNA-Struktur, die die Transkription beeinflussen) .

Die direkte Wechselwirkung mit DNA ist die einfachste und direkteste Methode, mit der ein Protein Transkriptionsniveaus ändert. Gene haben oft mehrere Proteinbindungsstellen um die kodierende Region herum mit der spezifischen Funktion, die Transkription zu regulieren. Es gibt viele Klassen regulatorischer DNA-Bindungsstellen, die als Enhancer, Isolatoren und Silencer bekannt sind. Die Mechanismen zur Regulierung der Transkription sind sehr unterschiedlich, von der Blockierung von Schlüsselbindungsstellen auf der DNA für die RNA-Polymerase bis hin zur Wirkung als Aktivator und der Förderung der Transkription durch Unterstützung der RNA-Polymerase-Bindung.

Die Aktivität von Transkriptionsfaktoren wird weiter durch intrazelluläre Signale moduliert, die eine posttranslationale Proteinmodifikation verursachen, einschließlich phosphoryliert, acetyliert oder glykosyliert. Diese Veränderungen beeinflussen die Fähigkeit eines Transkriptionsfaktors, direkt oder indirekt an Promotor-DNA zu binden, RNA-Polymerase zu rekrutieren oder die Verlängerung eines neu synthetisierten RNA-Moleküls zu begünstigen.

Die Kernmembran von Eukaryoten ermöglicht eine weitere Regulierung von Transkriptionsfaktoren durch die Dauer ihrer Anwesenheit im Kern, die durch reversible Veränderungen ihrer Struktur und durch Bindung anderer Proteine ​​reguliert wird. [35] Umweltstimuli oder endokrine Signale [36] können eine Modifikation regulatorischer Proteine ​​[37] bewirken, die Kaskaden von intrazellulären Signalen auslösen, [38] die zu einer Regulation der Genexpression führen.

In jüngerer Zeit hat sich herausgestellt, dass ein signifikanter Einfluss nicht-DNA-sequenzspezifischer Effekte auf die Transkription besteht. Diese Effekte werden als epigenetisch bezeichnet und betreffen die Struktur höherer Ordnung der DNA, nicht sequenzspezifische DNA-bindende Proteine ​​und die chemische Modifikation der DNA. Im Allgemeinen verändern epigenetische Effekte die Zugänglichkeit der DNA zu Proteinen und modulieren so die Transkription.

In Eukaryoten reguliert die Struktur des Chromatins, gesteuert durch den Histon-Code, den Zugang zur DNA mit signifikanten Auswirkungen auf die Expression von Genen in Euchromatin- und Heterochromatin-Bereichen.

Enhancer, Transkriptionsfaktoren, Mediatorkomplex und DNA-Schleifen in der Säugetiertranskription Bearbeiten

Die Genexpression in Säugern wird durch viele cis-regulatorische Elemente reguliert, einschließlich Kernpromotoren und promotornahen Elementen, die sich in der Nähe der Transkriptionsstartstellen von Genen stromaufwärts der DNA (in Richtung der 5'-Region des Sense-Strangs) befinden. Andere wichtige cis-regulatorische Module sind in DNA-Regionen lokalisiert, die von den Transkriptionsstartstellen entfernt sind. Dazu gehören Verstärker, Schalldämpfer, Isolatoren und Halteelemente. [39] Unter dieser Konstellation von Elementen spielen Enhancer und ihre assoziierten Transkriptionsfaktoren eine führende Rolle bei der Regulation der Genexpression. [40]

Enhancer sind Regionen des Genoms, die wichtige Genregulationselemente sind. Enhancer kontrollieren zelltypspezifische Genexpressionsprogramme, meistens durch Schleifen über lange Distanzen, um in physische Nähe zu den Promotoren ihrer Zielgene zu gelangen. [41] Mehrere Enhancer, jeder oft Zehn- oder Hunderttausende von Nukleotiden entfernt von ihren Zielgenen, schleifen zu ihren Zielgen-Promotoren und koordinieren miteinander, um die Expression ihres gemeinsamen Zielgens zu kontrollieren. [41]

Die schematische Darstellung links zeigt einen umschlingenden Enhancer, um in enge physische Nähe zum Promotor eines Zielgens zu gelangen. Die Schleife wird durch ein Dimer eines Konnektorproteins (zB Dimer von CTCF oder YY1) stabilisiert, wobei ein Mitglied des Dimers an seinem Bindungsmotiv am Enhancer verankert ist und das andere Mitglied an seinem Bindungsmotiv am Promotor verankert ist (dargestellt durch das rote Zickzacklinien in der Abbildung). [42] Mehrere zellfunktionsspezifische Transkriptionsfaktoren (es gibt etwa 1.600 Transkriptionsfaktoren in einer menschlichen Zelle [43] ) binden im Allgemeinen an spezifische Motive auf einem Enhancer [44] und eine kleine Kombination dieser Enhancer-gebundenen Transkriptionsfaktoren, wenn sie nahe gebracht werden an einen Promotor durch eine DNA-Schleife, das Transkriptionsniveau des Zielgens steuern. Mediator (ein Komplex, der normalerweise aus etwa 26 Proteinen in einer wechselwirkenden Struktur besteht) kommuniziert regulatorische Signale von Enhancer-DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren direkt an das an den Promotor gebundene RNA-Polymerase II (pol II)-Enzym. [45]

Enhancer werden, wenn sie aktiv sind, im Allgemeinen von beiden DNA-Strängen mit RNA-Polymerasen, die in zwei verschiedene Richtungen wirken, transkribiert, wodurch zwei eRNAs erzeugt werden, wie in der Abbildung dargestellt. [46] Ein inaktiver Enhancer kann von einem inaktiven Transkriptionsfaktor gebunden werden. Die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors kann ihn aktivieren, und dieser aktivierte Transkriptionsfaktor kann dann den Enhancer aktivieren, an den er gebunden ist (siehe kleiner roter Stern, der die Phosphorylierung des an den Enhancer gebundenen Transkriptionsfaktors in der Illustration darstellt). [47] Ein aktivierter Enhancer beginnt mit der Transkription seiner RNA, bevor er die Transkription von Messenger-RNA aus seinem Zielgen aktiviert. [48]

DNA-Methylierung und -Demethylierung in der Transkriptionsregulation Bearbeiten

DNA-Methylierung ist ein weit verbreiteter Mechanismus für den epigenetischen Einfluss auf die Genexpression und wird in Bakterien und Eukaryoten beobachtet und spielt eine Rolle bei der erblichen Transkriptionsstilllegung und Transkriptionsregulation. Am häufigsten tritt Methylierung an einem Cytosin auf (siehe Abbildung). Die Methylierung von Cytosin tritt hauptsächlich in Dinukleotidsequenzen auf, wo einem Cytosin ein Guanin, eine CpG-Stelle, folgt. Die Zahl der CpG-Stellen im menschlichen Genom beträgt etwa 28 Millionen. [49] Je nach Zelltyp weisen etwa 70 % der CpG-Stellen ein methyliertes Cytosin auf. [50]

Die Methylierung von Cytosin in der DNA spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression. Die Methylierung von CpGs in einer Promotorregion eines Gens unterdrückt normalerweise die Gentranskription [51] während die Methylierung von CpGs im Körper eines Gens die Expression erhöht. [52] TET-Enzyme spielen eine zentrale Rolle bei der Demethylierung von methylierten Cytosinen. Die Demethylierung von CpGs in einem Genpromotor durch TET-Enzymaktivität erhöht die Transkription des Gens. [53]

Transkriptionelle Regulation in Lernen und Gedächtnis Bearbeiten

Bei einer Ratte ist die kontextuelle Angstkonditionierung (FCKW) eine schmerzhafte Lernerfahrung. Schon eine einzige CFC-Episode kann zu einer lebenslangen ängstlichen Erinnerung führen. [54] Nach einer CFC-Episode ist die Cytosin-Methylierung in den Promotorregionen von etwa 9,17% aller Gene in der Hippocampus-Neuron-DNA einer Ratte verändert. [55] Im Hippocampus werden zunächst neue Erinnerungen gespeichert. Nach CFC haben etwa 500 Gene die Transkription erhöht (oft aufgrund der Demethylierung von CpG-Stellen in einer Promotorregion) und etwa 1.000 Gene haben die Transkription verringert (oft aufgrund neu gebildeter 5-Methylcytosin an CpG-Stellen in einer Promotorregion). Das Muster induzierter und unterdrückter Gene innerhalb von Neuronen scheint eine molekulare Grundlage für die Bildung der ersten vorübergehenden Erinnerung an dieses Trainingsereignis im Hippocampus des Rattenhirns zu liefern. [55]

Insbesondere das aus dem Gehirn stammende Gen für den neurotrophen Faktor (BDNF) ist als "lernendes Gen" bekannt. [56] Nach CFC kam es zu einer Hochregulierung von BDNF Genexpression, bezogen auf eine verminderte CpG-Methylierung bestimmter interner Promotoren des Gens, und dies war mit dem Lernen korreliert. [56]

Transkriptionsregulation bei Krebs Bearbeiten

Die Mehrzahl der Genpromotoren enthält eine CpG-Insel mit zahlreichen CpG-Stellen. [57] Wenn viele der Promotor-CpG-Stellen eines Gens methyliert sind, wird das Gen stummgeschaltet. [58] Dickdarmkrebs hat typischerweise 3 bis 6 Fahrermutationen und 33 bis 66 Tramper- oder Beifahrermutationen. [59] Transkriptionelles Silencing kann jedoch für das Fortschreiten zu Krebs von größerer Bedeutung sein als Mutationen. Beispielsweise werden bei Darmkrebs etwa 600 bis 800 Gene durch die Methylierung der CpG-Insel transkriptionell zum Schweigen gebracht (siehe Transkriptionsregulation bei Krebs). Transkriptionsrepression bei Krebs kann auch durch andere epigenetische Mechanismen erfolgen, wie beispielsweise durch eine veränderte Expression von microRNAs. [60] Bei Brustkrebs kann eine transkriptionelle Repression von BRCA1 häufiger durch überexprimierte microRNA-182 als durch Hypermethylierung des BRCA1-Promotors auftreten (siehe Niedrige Expression von BRCA1 bei Brust- und Eierstockkrebs).

Posttranskriptionelle Regulierung Bearbeiten

Bei Eukaryoten, bei denen ein Export von RNA erforderlich ist, bevor eine Translation möglich ist, wird angenommen, dass der Kernexport eine zusätzliche Kontrolle über die Genexpression bietet. Der gesamte Transport in und aus dem Kern erfolgt über die Kernpore und der Transport wird durch eine Vielzahl von Importin- und Exportinproteinen gesteuert.

Die Expression eines für ein Protein kodierenden Gens ist nur möglich, wenn die Boten-RNA, die den Code trägt, lange genug überlebt, um translatiert zu werden. In einer typischen Zelle ist ein RNA-Molekül nur dann stabil, wenn es gezielt vor Abbau geschützt wird. Der RNA-Abbau hat eine besondere Bedeutung bei der Regulation der Expression in eukaryontischen Zellen, wo mRNA erhebliche Distanzen zurücklegen muss, bevor sie translatiert wird. In Eukaryoten wird RNA durch bestimmte posttranskriptionelle Modifikationen stabilisiert, insbesondere durch die 5'-Kappe und den polyadenylierten Schwanz.

Der absichtliche Abbau von mRNA wird nicht nur als Abwehrmechanismus gegen fremde RNA (normalerweise von Viren) verwendet, sondern auch als Weg der mRNA Destabilisierung. Wenn ein mRNA-Molekül eine komplementäre Sequenz zu einer kleinen interferierenden RNA aufweist, wird es über den RNA-Interferenzweg zerstört.

Drei untranslatierte Prime-Regionen und microRNAs Bearbeiten

Drei nicht translatierte Prime-Regionen (3′UTRs) von Messenger-RNAs (mRNAs) enthalten oft regulatorische Sequenzen, die posttranskriptionell die Genexpression beeinflussen. Solche 3′-UTRs enthalten häufig sowohl Bindungsstellen für microRNAs (miRNAs) als auch für regulatorische Proteine. Durch Bindung an spezifische Stellen innerhalb der 3'-UTR können miRNAs die Genexpression verschiedener mRNAs verringern, indem sie entweder die Translation hemmen oder direkt den Abbau des Transkripts bewirken. Die 3'-UTR kann auch Silencer-Regionen aufweisen, die Repressorproteine ​​binden, die die Expression einer mRNA hemmen.

Die 3′-UTR enthält oft microRNA-Response-Elemente (MREs). MREs sind Sequenzen, an die miRNAs binden. Dies sind vorherrschende Motive innerhalb von 3'-UTRs. Unter allen regulatorischen Motiven innerhalb der 3'-UTRs (z. B. einschließlich Silencer-Regionen) machen MREs etwa die Hälfte der Motive aus.

Ab 2014 listete die miRBase-Website, [61] ein Archiv von miRNA-Sequenzen und -Anmerkungen, 28.645 Einträge in 233 biologischen Arten auf. Davon befanden sich 1.881 miRNAs in annotierten humanen miRNA-Loci. Für miRNAs wurde vorhergesagt, dass sie durchschnittlich etwa vierhundert Ziel-mRNAs aufweisen (die die Expression von mehreren hundert Genen beeinflussen). [62] Friedman et al. [62] schätzen, dass >45.000 miRNA-Zielstellen in humanen mRNA-3′UTRs über dem Hintergrundniveau konserviert sind, und >60% der humanen Protein-kodierenden Gene standen unter Selektionsdruck, um die Paarung mit miRNAs aufrechtzuerhalten.

Direkte Experimente zeigen, dass eine einzelne miRNA die Stabilität von Hunderten von einzigartigen mRNAs verringern kann. [63] Andere Experimente zeigen, dass eine einzelne miRNA die Produktion von Hunderten von Proteinen unterdrücken kann, dass diese Unterdrückung jedoch oft relativ mild ist (weniger als das 2-fache). [64] [65]

Die Auswirkungen der miRNA-Fehlregulation der Genexpression scheinen bei Krebs wichtig zu sein. [66] Beispielsweise wurden bei Magen-Darm-Krebs neun miRNAs als epigenetisch verändert und wirksam bei der Herunterregulierung von DNA-Reparaturenzymen identifiziert. [67]

Die Auswirkungen der miRNA-Fehlregulation der Genexpression scheinen auch bei neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, bipolarer Störung, schwerer Depression, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Autismus-Spektrum-Störungen wichtig zu sein. [68] [69]

Translationale Regulierung Bearbeiten

Die direkte Regulation der Translation ist weniger verbreitet als die Kontrolle der Transkription oder der mRNA-Stabilität, wird aber gelegentlich verwendet. Die Hemmung der Proteintranslation ist ein Hauptziel für Toxine und Antibiotika, sodass sie eine Zelle töten können, indem sie ihre normale Genexpressionskontrolle außer Kraft setzen. Zu den Hemmstoffen der Proteinsynthese zählen das Antibiotikum Neomycin und das Toxin Ricin.

Posttranslationale Modifikationen Bearbeiten

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) sind kovalente Modifikationen an Proteinen. Wie das RNA-Spleißen tragen sie dazu bei, das Proteom deutlich zu diversifizieren. Diese Modifikationen werden normalerweise durch Enzyme katalysiert. Darüber hinaus können Prozesse wie kovalente Additionen an Aminosäureseitenkettenreste oft durch andere Enzyme rückgängig gemacht werden. Einige, wie die proteolytische Spaltung des Proteinrückgrats, sind jedoch irreversibel. [70]

PTMs spielen viele wichtige Rollen in der Zelle. [71] Die Phosphorylierung ist beispielsweise hauptsächlich an der Aktivierung und Deaktivierung von Proteinen sowie an Signalwegen beteiligt. [72] PTMs sind an der Transkriptionsregulation beteiligt: ​​Eine wichtige Funktion der Acetylierung und Methylierung ist die Modifikation des Histonschwanzes, die die Zugänglichkeit der DNA für die Transkription verändert. [70] Sie kommen auch im Immunsystem vor, wo die Glykosylierung eine Schlüsselrolle spielt. [73] Ein PTM-Typ kann einen anderen PTM-Typ initiieren, wie man daran sehen kann, wie die Ubiquitinierung Proteine ​​für den Abbau durch Proteolyse markiert. [70] Die Proteolyse ist nicht nur am Abbau von Proteinen beteiligt, sondern auch für deren Aktivierung und Deaktivierung sowie für die Regulierung biologischer Prozesse wie DNA-Transkription und Zelltod wichtig. [74]

Die Messung der Genexpression ist ein wichtiger Bestandteil vieler Biowissenschaften, da die Fähigkeit, das Ausmaß, in dem ein bestimmtes Gen in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus exprimiert wird, zu quantifizieren, viele wertvolle Informationen liefern kann. Die Messung der Genexpression kann beispielsweise:

  • Identifizieren Sie eine Virusinfektion einer Zelle (virale Proteinexpression).
  • Bestimmen Sie die Anfälligkeit einer Person für Krebs (Onkogenexpression).
  • Finden Sie heraus, ob ein Bakterium gegen Penicillin resistent ist (Beta-Lactamase-Expression).

In ähnlicher Weise ist die Analyse des Ortes der Proteinexpression ein leistungsfähiges Werkzeug, und dies kann auf Organismen- oder Zellebene erfolgen. Die Untersuchung der Lokalisation ist besonders wichtig für das Studium der Entwicklung in vielzelligen Organismen und als Indikator für die Proteinfunktion in Einzelzellen. Idealerweise erfolgt die Expressionsmessung durch den Nachweis des endgültigen Genprodukts (bei vielen Genen ist dies das Protein), jedoch ist es oft einfacher, einen der Vorläufer, typischerweise mRNA, nachzuweisen und aus diesen Messungen auf die Genexpressionsniveaus zu schließen.

MRNA-Quantifizierung Bearbeiten

mRNA-Spiegel können quantitativ durch Northern-Blotting gemessen werden, das Größen- und Sequenzinformationen über die mRNA-Moleküle liefert. Eine RNA-Probe wird auf einem Agarosegel aufgetrennt und mit einer radioaktiv markierten RNA-Sonde hybridisiert, die zur Zielsequenz komplementär ist. Die radioaktiv markierte RNA wird dann durch ein Autoradiogramm nachgewiesen. Da die Verwendung radioaktiver Reagenzien das Verfahren zeitaufwendig und potenziell gefährlich macht, wurden alternative Markierungs- und Nachweisverfahren, wie Digoxigenin- und Biotin-Chemie, entwickelt. Als Nachteile des Northern-Blottings werden wahrgenommen, dass große Mengen an RNA erforderlich sind und die Quantifizierung möglicherweise nicht ganz genau ist, da die Bandenstärke in einem Bild eines Gels gemessen wird. Andererseits ermöglicht die zusätzliche mRNA-Größeninformation aus dem Northern-Blot die Unterscheidung von abwechselnd gespleißten Transkripten.

Ein weiterer Ansatz zur Messung der mRNA-Abundanz ist die RT-qPCR. Bei dieser Technik folgt auf die reverse Transkription eine quantitative PCR. Die reverse Transkription erzeugt zunächst eine DNA-Matrize aus der mRNA, diese einzelsträngige Matrize wird cDNA genannt. Die cDNA-Matrize wird dann im quantitativen Schritt amplifiziert, wobei sich die von markierten Hybridisierungssonden oder interkalierenden Farbstoffen emittierte Fluoreszenz mit fortschreitendem DNA-Amplifikationsprozess ändert. Mit einer sorgfältig erstellten Standardkurve kann qPCR eine absolute Messung der Kopienzahl der ursprünglichen mRNA liefern, typischerweise in Einheiten von Kopien pro Nanoliter homogenisiertem Gewebe oder Kopien pro Zelle. qPCR ist sehr empfindlich (der Nachweis eines einzelnen mRNA-Moleküls ist theoretisch möglich), kann aber je nach verwendetem Reportertyp teuer sein fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsonden sind teurer als unspezifische interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe.

Für das Expressionsprofiling oder die Hochdurchsatzanalyse vieler Gene innerhalb einer Probe kann im Fall von Arrays mit niedriger Dichte eine quantitative PCR für Hunderte von Genen gleichzeitig durchgeführt werden. Ein zweiter Ansatz ist das Hybridisierungs-Microarray. Ein einzelner Array oder "Chip" kann Sonden enthalten, um Transkriptspiegel für jedes bekannte Gen im Genom eines oder mehrerer Organismen zu bestimmen. Alternativ können "tag-basierte" Technologien wie die serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und RNA-Seq verwendet werden, die ein relatives Maß für die zelluläre Konzentration verschiedener mRNAs liefern können. Ein Vorteil von Tag-basierten Verfahren ist die "offene Architektur", die die exakte Messung jedes Transkripts mit bekannter oder unbekannter Sequenz ermöglicht. Next-Generation-Sequencing (NGS) wie RNA-Seq ist ein weiterer Ansatz, der riesige Mengen an Sequenzdaten erzeugt, die einem Referenzgenom zugeordnet werden können. Obwohl NGS vergleichsweise zeitaufwendig, teuer und ressourcenintensiv ist, kann es Einzelnukleotid-Polymorphismen, Spleißvarianten und neue Gene identifizieren und kann auch verwendet werden, um die Expression in Organismen zu profilieren, für die nur wenige oder keine Sequenzinformationen verfügbar sind .

RNA-Profile in Wikipedia Bearbeiten

Profile wie diese finden sich für fast alle in Wikipedia aufgelisteten Proteine. Sie werden von Organisationen wie dem Genomics Institute der Novartis Research Foundation und dem European Bioinformatics Institute erstellt. Weitere Informationen finden Sie in deren Datenbanken (Beispiel für den hier abgebildeten GLUT4-Transporter siehe Zitat).[75] Diese Profile geben den Grad der DNA-Expression (und damit die produzierte RNA) eines bestimmten Proteins in einem bestimmten Gewebe an und sind entsprechend in den Bildern in der Proteinbox auf der rechten Seite jeder Wikipedia-Seite farbcodiert.

Proteinquantifizierung Bearbeiten

Für Proteine ​​codierende Gene kann das Expressionsniveau direkt durch eine Reihe von Verfahren mit einigen klaren Analogien zu den Techniken zur mRNA-Quantifizierung bestimmt werden.

Eine der am häufigsten verwendeten Methoden ist die Durchführung eines Western Blots gegen das interessierende Protein. [76] Dies liefert neben seiner Identität auch Informationen über die Größe des Proteins. Eine Probe (oft zelluläres Lysat) wird auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine Membran übertragen und dann mit einem Antikörper gegen das interessierende Protein sondiert. Der Antikörper kann entweder an ein Fluorophor oder an Meerrettichperoxidase zur Abbildung und/oder Quantifizierung konjugiert werden. Die Gel-basierte Natur dieses Assays macht die Quantifizierung weniger genau, hat aber den Vorteil, dass spätere Modifikationen des Proteins, beispielsweise Proteolyse oder Ubiquitinierung, aus Größenänderungen identifiziert werden können.

MRNA-Protein-Korrelation Bearbeiten

Die Quantifizierung von Protein und mRNA erlaubt eine Korrelation der beiden Niveaus. Die Frage, wie gut die Proteinspiegel mit ihren entsprechenden Transkriptspiegeln korrelieren, wird stark diskutiert und hängt von mehreren Faktoren ab. Die Regulation bei jedem Schritt der Genexpression kann die Korrelation beeinflussen, wie für die Regulation der Translation [19] oder der Proteinstabilität gezeigt. [77] Auch posttranslationale Faktoren, wie der Proteintransport in hochpolaren Zellen, [78] können die gemessene mRNA-Protein-Korrelation beeinflussen.

Lokalisierung Bearbeiten

Die Expressionsanalyse ist nicht auf die Quantifizierung beschränkt. Es kann auch eine Lokalisierung bestimmt werden. mRNA kann mit einem geeignet markierten komplementären mRNA-Strang nachgewiesen werden und Protein kann über markierte Antikörper nachgewiesen werden. Die sondierte Probe wird dann durch Mikroskopie beobachtet, um zu identifizieren, wo sich die mRNA oder das Protein befindet.

Durch Ersetzen des Gens durch eine neue Version, die mit einem grün fluoreszierenden Protein (oder einem ähnlichen) Marker fusioniert ist, kann die Expression in lebenden Zellen direkt quantifiziert werden. Dies geschieht durch Abbildung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Es ist sehr schwierig, ein GFP-fusioniertes Protein an seinen nativen Ort im Genom zu klonen, ohne die Expressionsniveaus zu beeinflussen, daher kann diese Methode oft nicht verwendet werden, um die endogene Genexpression zu messen. Es wird jedoch häufig verwendet, um die Expression eines künstlich in die Zelle eingeführten Gens zu messen, beispielsweise über einen Expressionsvektor. Es ist wichtig anzumerken, dass durch die Fusion eines Zielproteins mit einem fluoreszierenden Reporter das Verhalten des Proteins, einschließlich seiner zellulären Lokalisation und seines Expressionsniveaus, signifikant verändert werden kann.

Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay arbeitet mit Antikörpern, die auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert sind, um interessierende Proteine ​​aus Proben einzufangen, die dem Well hinzugefügt wurden. Unter Verwendung eines an ein Enzym oder Fluorophor konjugierten Nachweisantikörpers kann die Menge des gebundenen Proteins durch fluorometrischen oder kolorimetrischen Nachweis genau gemessen werden. Der Nachweisprozess ist dem eines Western Blots sehr ähnlich, aber durch die Vermeidung der Gelschritte kann eine genauere Quantifizierung erreicht werden.

Ein Expressionssystem ist ein System, das speziell für die Produktion eines Genprodukts der Wahl entwickelt wurde. Dies ist normalerweise ein Protein, kann aber auch RNA sein, wie beispielsweise tRNA oder ein Ribozym. Ein Expressionssystem besteht aus einem Gen, das normalerweise von DNA kodiert wird, und der molekularen Maschinerie, die erforderlich ist, um die DNA in mRNA zu transkribieren und die mRNA unter Verwendung der bereitgestellten Reagenzien in Protein zu übersetzen. Im weitesten Sinne umfasst dies jede lebende Zelle, aber der Begriff wird normalerweise verwendet, um sich auf die Expression als Laborwerkzeug zu beziehen. Ein Expressionssystem ist daher oft in irgendeiner Weise künstlich. Expressionssysteme sind jedoch ein grundsätzlich natürlicher Prozess. Viren sind ein hervorragendes Beispiel für ihre Replikation, indem sie die Wirtszelle als Expressionssystem für die viralen Proteine ​​und das Genom verwenden.

Induzierbarer Ausdruck Bearbeiten

In der Natur Bearbeiten

Zusätzlich zu diesen biologischen Werkzeugen werden bestimmte natürlich beobachtete Konfigurationen der DNA (Gene, Promotoren, Enhancer, Repressoren) und die zugehörige Maschinerie selbst als Expressionssystem bezeichnet. Dieser Begriff wird normalerweise in dem Fall verwendet, in dem ein Gen oder ein Satz von Genen unter wohldefinierten Bedingungen eingeschaltet wird, zum Beispiel das einfache Repressor-Switch-Expressionssystem in Lambda-Phagen und das lac-Operatorsystem in Bakterien. Mehrere natürliche Expressionssysteme werden direkt verwendet oder modifiziert und für künstliche Expressionssysteme wie das Tet-on- und Tet-off-Expressionssystem verwendet.

Gene wurden manchmal als Knoten in einem Netzwerk betrachtet, wobei Inputs Proteine ​​wie Transkriptionsfaktoren sind und Outputs das Niveau der Genexpression sind. Der Knoten selbst führt eine Funktion aus, und der Betrieb dieser Funktionen wurde so interpretiert, dass er eine Art Informationsverarbeitung innerhalb von Zellen durchführt und das Zellverhalten bestimmt.

Gennetzwerke können auch konstruiert werden, ohne ein explizites Kausalmodell zu formulieren. Dies ist häufig der Fall, wenn Netzwerke aus großen Expressionsdatensätzen zusammengesetzt werden. [79] Die Kovariation und Korrelation der Expression wird über eine große Stichprobe von Fällen und Messungen (oft Transkriptom- oder Proteomdaten) berechnet. Die Quelle der Variation kann entweder experimentell oder natürlich (beobachtet) sein. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Genexpressionsnetzwerke zu konstruieren, aber ein gängiger Ansatz besteht darin, eine Matrix aller paarweisen Korrelationen der Expression über Bedingungen, Zeitpunkte oder Individuen hinweg zu berechnen und die Matrix (nach Schwellenwertbildung bei einem bestimmten Grenzwert) in . umzuwandeln eine grafische Darstellung, in der Knoten Gene, Transkripte oder Proteine ​​darstellen und Kanten, die diese Knoten verbinden, die Stärke der Assoziation darstellen (siehe [1]). [80]

Die folgenden experimentellen Techniken werden verwendet, um die Genexpression zu messen und sind in grober chronologischer Reihenfolge aufgeführt, beginnend mit den älteren, etablierteren Technologien. Sie werden nach ihrem Multiplexitätsgrad in zwei Gruppen eingeteilt.


Schau das Video: GENOM (Juni 2022).


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