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Was ist die kostengünstigste Methode, um sequenzielle Aminosäuredeletionen zu erzeugen?

Was ist die kostengünstigste Methode, um sequenzielle Aminosäuredeletionen zu erzeugen?


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Ich suche nach sequentiellen Deletionen aus einem interessierenden Gen. Die Gesamtgröße dieser Region beträgt 8 Aminosäuren. Ich versuche herauszufinden, welcher Teil dieser Region innerhalb des Gens notwendig ist.

Wenn dies zum Beispiel meine Sequenz ist:
A B C D E F G H

Ich möchte generieren:
BCDEFGH, CDEFGH, DEFGH und so weiter.

Was ist der kostengünstigste Weg, dies zu tun (durch Minimierung des Primereinsatzes, des Enzymeinsatzes usw.). Ich habe dieses Gen bereits in einen Expressionsvektor subkloniert.

Vielen Dank!


Es ist zwar nicht das billigste, aber sicherlich das schnellste und einfachste. Ich würde die Aminosäure schnell austauschen. Dies erfordert kein Subklonen und erfordert nur

  • zwei ~25 nt Primer ($10)
  • 1 Schuss Pfu (~0,25 $)
  • 1 Schuss DPNI ($0,05)
  • kompetente Zellen (~$5)
  • Sequenzierung zur Bestätigung (~ $ 4-6)

Insgesamt wahrscheinlich > 20 $ pro Mutant in 2-3 Tagen Wartezeit.

(Bearbeiten) Ich gehe eher mit quikchange als mit OE-PCR, einfach weil es die Klonschritte entfernt. Sie müssen möglicherweise mehr Kolonien mit konventionellem Klonen im Vergleich zu Quickchange screenen.


Deletionen können sinnvoll sein, wenn Sie den N-Terminus oder C-Terminus eines Proteins analysieren. Wenn Sie jedoch eine interne Region betrachten, denken Sie daran, dass je mehr AAs Sie löschen, desto wahrscheinlicher ist es, dass Sie die gesamte Proteinstruktur stören. Wenn Sie eine zufällige Auswahl von 8 AAs in einem Protein löschen, besteht die Möglichkeit, dass Sie die Aktivität ausschalten, indem Sie die Proteinfaltung oder -stabilität ändern. Das sind keine nützlichen Informationen.

Diese Frage wird normalerweise zuerst durch Alanin-Scanning beantwortet - sequentielle oder additive Umwandlung von Aminosäuren in Alanin. Dies ist viel informativer als Löschungen. Noch besser ist, Sie können Wildtyp-AAs durch andere AAs ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Ladung oder Hydrophobie ersetzen. Dann ändern Sie höchstwahrscheinlich die Funktion einer Region, ohne die Struktur zu ändern.

Das Schnellwechsel-Kit funktioniert super, aber wenn Kosten sind ein Thema Sie können ganze Plasmid-Mutagenese-PCR mit Ihren eigenen Reagenzien durchführen. Und stellen Sie Ihre eigenen kompetenten Zellen her.

Meiner Erfahrung nach kann die PCR für ganze Plasmide jedoch schwierig sein - wenn sie beim ersten Mal nicht funktioniert, kann die Fehlersuche schwierig sein. Wenn Zeit ist ein Thema, würde ich empfehlen, eine überlappende Extensions-PCR mit den gleichen mutagenen Primern durchzuführen, plus einem Satz Amplifikationsprimer am 5'- und 3'-Ende Ihres Gens. Stellen Sie eine große Charge des verdauten Vektors her, testen Sie ihn als Negativkontrolle und verwenden Sie ihn für die Ligation all Ihrer verschiedenen Inserts.


Eine allgemeine Methode zur Suche nach Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz zweier Proteine ​​☆

Ein computeradaptierbares Verfahren zum Auffinden von Ähnlichkeiten in den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinen wurde entwickelt. Aus diesen Befunden ist es möglich zu bestimmen, ob zwischen den Proteinen eine signifikante Homologie besteht. Diese Informationen werden verwendet, um ihre mögliche evolutionäre Entwicklung zu verfolgen.

Die maximale Übereinstimmung ist eine Zahl, die von der Ähnlichkeit der Sequenzen abhängt. Eine seiner Definitionen ist die größte Anzahl von Aminosäuren eines Proteins, die mit denen eines zweiten Proteins abgeglichen werden kann, wobei alle möglichen Unterbrechungen in einer der Sequenzen berücksichtigt werden. Während die Unterbrechungen zu einer sehr großen Anzahl von Vergleichen führen, schließt das Verfahren effizient diejenigen Vergleiche aus, die nicht zur maximalen Übereinstimmung beitragen können.

Vergleiche werden anhand der kleinsten Signifikanzeinheit, einem Aminosäurepaar, angestellt, eine von jedem Protein. Alle möglichen Paare werden durch ein zweidimensionales Array repräsentiert, und alle möglichen Vergleiche werden durch Pfade durch das Array repräsentiert. Für diese maximale Übereinstimmung müssen nur bestimmte der möglichen Pfade bewertet werden. Jeder Zelle im Array, die ähnliche Aminosäuren repräsentiert, wird ein numerischer Wert zugewiesen, in diesem Fall einer. Die maximale Übereinstimmung ist die größte Zahl, die sich aus der Summierung der Zellwerte jedes Pfads ergeben würde.


Resultate und Diskussionen

COBARDE wurde ursprünglich mit interessanten Ergebnissen an TEM-1-β-Lactamase getestet [14]. Es gab klare Hinweise, dass dieses Enzym auch lange interne Deletionen tolerieren konnte [15] und dies wurde durch die systematische Einführung von Deletionen bestätigt. GFP ist jedoch völlig anders, da noch keine aktiven internen Deletionen gemeldet wurden. Wir dachten, ein ausgezeichnetes Testfeld für COBARDE wäre der Versuch, dieses bereits ziemlich starre und strukturell beeinträchtigte Protein zu verkürzen.

Wir haben die Region zwischen den Resten 129–142 als Ziel der Mutagenese aus drei Gründen ausgewählt: 1) Es ist die längste Schleife des Proteins 2) zwei frühere Versuche von Deletionen in diesem Bereich führten nicht zu fluoreszierenden Proteinen [10, 11] 3 ) Veröffentlichte Sequenzvergleiche von GFP gegenüber GFP-ähnlichen Proteinen von Anthozoen legen nahe, dass GFP die Deletion von entweder G138 [16] oder H139 [17] (G139 bzw. H140 in sgGFP) tolerieren kann.

Die experimentellen Arbeiten begannen mit der Synthese der Oligonukleotid-Bibliothek. Eine aktuelle Einschränkung der Fmoc-basierten Mutagenesemethoden ist die Depurination von benzoylierten Desoxyadenosinen (dA bz s), was zu einem hohen Anteil an Rückgratspaltung führt (unsere eigenen unveröffentlichten Ergebnisse). Dieses Depurinationsproblem wird verstärkt, wenn die Zielsequenz am 3'-Ende mit dA angereichert ist, da die Synthese von 3' in Richtung 5' abläuft. Die Schwere des Problems verhinderte eine erfolgreiche Synthese des kodierenden Strangs für die Zielregion. Daher haben wir auf die Synthese einer komplementären Sequenz zurückgegriffen, die weiter modifiziert wurde, um den Gehalt von dA bz s in der Nähe des 3'-Endes (fettgedruckt) noch weiter zu reduzieren: 3' ctc g einC ttt cca TAg CTG AAG TTC CTT CTg CCG TTG TAg GAC CCT GTG TTT g AC ctt atg ttg ata ttg 5'. Diese Sequenz enthält 17 dA bz s weniger als die Originalsequenz und wurde von COBARDE erfolgreich zusammengestellt. Das Oligonukleotid wurde als PCR-Template von zwei teilweise komplementären Primern verwendet, um ein 148 bp doppelsträngiges Fragment zu erzeugen, das die Mlu Ich und Acc I-Restriktionsschnittstellen wie in Fig. 2 gezeigt. Das Produkt wurde verdaut und mit dem Kanamycin-tragenden Klonierungsvektor pT4GFP Mlu (siehe M&M zur Herstellung dieses Empfängerplasmids) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in XL1-Blue-Zellen transformiert, um eine Bibliothek von 2 × 10 6 Varianten zu ergeben. Die Analyse von Kolonien, die 24 h bei 37 °C auf Platten gezüchtet wurden, zeigte, dass mehr als 99 % der Transformanten für das bloße Auge nicht fluoreszierend waren, was darauf hindeutet, dass die meisten Deletionen die Proteinstruktur und/oder -funktion störten. Plasmid-DNA von 40 zufällig ausgewählten fluoreszierenden Klonen wurde erhalten und sequenziert, was enthüllte, dass 14 der Proben aufgrund unvollständiger dem religierten Vektor entsprachen Mlu ICH/Acc Der I-Verdau 22 entsprach Wildtyp-sgGFP, das mit dem in der Bibliothek erzeugten Wildtyp-Oligonukleotid erzeugt wurde, und nur 4 der Klone waren Mutanten, die Fluoreszenz beibehielten. Diese Mutanten entsprachen einzelnen Aminosäuredeletionen von Isoleucin 129 (sgGFP-Δ I129) und Aspartat 130 (sgGFP-Δ D130). Jede Mutante wurde zweimal gefunden.

Oligonukleotide, die zur Herstellung von sgGFP-Mutanten verwendet werden, wie in M&M . beschrieben. Zur klaren Visualisierung sind Codons, die einer kombinatorischen Deletion unterzogen wurden, alternativ fett und unterstrichen markiert. Sternchen repräsentieren Nukleotiddeletionen. N stellt eine äquimolare Mischung der vier Nukleotide dar und S eine Mischung von G und C. Restriktionsstellen sind doppelt unterstrichen.

Andererseits gab die DNA-Sequenzanalyse von 33 nicht fluoreszierenden Kolonien (Tabelle 1) eine Einschätzung der Qualität der Bibliothek und lieferte Einblicke in die Art von Mutationen, die die Fluoreszenz zerstören. Aus den in Tabelle 1 dargestellten Daten ziehen wir folgende Schlussfolgerungen:

1) In der Zielregion wurde eine erfolgreiche Mutagenese (mit einer durchschnittlichen Mutageneserate von 50%) erreicht. Aus Tabelle 1 ist klar, dass Aminosäuredeletionen gut verteilt und entlang des Ziels vertreten waren, mit Ausnahme des ersten Codons (kodierend für I129), das nur mit einer Rate von 2% mutiert war, weil die Fmoc-Cl-liefernde Linie nicht richtig geprimt war. Dieser Fehler wurde jedoch ab dem zweiten Codon korrigiert.

2) 6 von 33 Klonen (Klone 28–33) enthielten entweder einzelne Nukleotiddeletionen oder Insertionen, die den offenen Leserahmen der Gene verändern. Obwohl dieser Anteil an unerwünschten Varianten anscheinend hoch ist (18%), liegt er innerhalb des Fehlerbereichs, der bei konventionellen Oligonukleotiden gefunden wird, wie er beim Zusammenbau synthetischer Gene beobachtet wurde [18–20]. Deletionen einzelner Nukleotide treten normalerweise aufgrund eines unvollständigen Capping-Schritts während jedes Synthesezyklus auf. Diese chemische Unvollkommenheit kann durch die Verwendung von UNICAP [21], einem kürzlich im Handel erhältlichen potenten Capping-Reagenz, deutlich reduziert werden. Die verbleibenden 1,68 × 10 6 nützlichen Varianten (82%) reichen jedoch aus, um den vollständigen Satz von 16384 (2 14 ) möglichen Deletionsvarianten darzustellen. Bei einer durchschnittlichen Mutageneserate von 0,5 pro Codon sollte jede der Mutanten mit der gleichen Häufigkeit vertreten sein und wir brauchen nur eine Bibliothek von 75492 Klonen, um die am wenigsten vertretene Variante mit 99%iger Sicherheit zu finden [22]. Da der Wildtyp-Klon beim Fluoreszenz-Screening mehrmals gefunden wurde, kann außerdem gefolgert werden, dass alle Mutanten in der experimentellen Bibliothek gut vertreten waren.

3) Die Bibliothek folgt einer grob binomialen Verteilung. Mutanten mit 6, 7, 8 und 9 Deletionen waren am häufigsten.

4) Die meisten Deletionen in der untersuchten Schleife zerstören die GFP-Fluoreszenz. Dieses Ergebnis stimmt mit denen von Li . überein et al [10] und Kitamura et al [11]. Li entfernte die Region, die die Aminosäuren 132–139 von GFP umfasst, durch ortsgerichtete Mutagenese, während Kitamura zufällig Tripeptidblöcke in der Region 125–142 entfernte. In beiden Studien wurde festgestellt, dass die Deletionen einen vollständigen Verlust der Fluoreszenz verursachen.

Unsere Probe von 33 sequenzierten nicht fluoreszierenden Mutanten enthielt nur eine einzelne Deletionsmutante, sgGFP-Δ K141, aber zwei einzelne Deletionen, sgGFP-Δ I129 und sgGFP-Δ D130, konservierten Fluoreszenz. Um sicherzustellen, dass unser Fluoreszenz-Screening alle aktiven robusten Mutanten erfasst, haben wir uns entschieden, die verbleibenden 11 Mutanten mit einfacher Deletion und die Doppelmutante, die Δ I129 und Δ D130 durch ortsgerichtete Mutagenese kombiniert, unter Verwendung der spezifischen Oligonukleotide, die auf Figur 2.

Zur Bestätigung der Gültigkeit des Bibliotheksscreenings wird keine der E coli die Expression dieser Mutanten zeigte auf den Platten nach Inkubation bei 37 °C für 24 h einen grün fluoreszierenden Phänotyp. Fluoreszenzscannen von Kulturen, die jede der vierzehn Einzeldeletionsmutanten und die Doppelmutante enthielten, die 12 h bei 37 °C gezüchtet wurden, bestätigten die in Platten beobachteten Ergebnisse. Diese Experimente verwarfen auch die Hypothese, dass sgGFP- ΔG139 und sgGFP- ΔH140 kann funktionell sein, wie die Ausrichtung von GFP gegenüber GFP-ähnlichen Proteinen nahelegt.

Andere Alignments, die auf dreidimensionalen Strukturen von GFP im Vergleich zu GFP-ähnlichen Proteinen basieren, legen nahe, dass die Region 128–141 keine Deletionen toleriert und dass GFP eine Deletion von Y143 tolerieren muss [23, 24]. Um die Zuverlässigkeit dieser 3D-Aligmente für das Protein-Engineering zu testen, entfernten wir den äquivalenten Rest (Y144) in sgGFP durch ortsgerichtete Mutagenese und die Fluoreszenz ging vollständig verloren. Die Schlussfolgerung dieser Verknüpfungen ist offensichtlich, es kann keine Vorhersage gemacht werden, wenn die Sequenzidentität zwischen den verglichenen Proteinen so gering ist. Die Sequenzidentität zwischen GFPs und GFP-ähnlichen Proteinen beträgt etwa 25 %.

Eine zusätzliche Charakterisierung ganzer Zellen mit den Mutanten sgGFP-Δ I129 und sgGFP-Δ D130 ergab, dass beide Proteine ​​eine Blauverschiebung von zwei Nanometern in ihrer maximalen Emission aufwiesen und ihre Fluoreszenzintensität auf 21 % bzw wt sgGFP. Das letzte Ergebnis korrelierte nicht mit dem in Platten beobachteten Phänotyp, wo die grüne Farbe der Mutanten nur geringfügig weniger intensiv war als die des Wildtyp-Proteins. Wir entschieden uns dann, die Quantenausbeute der mutierten Proteine ​​zu messen, die sich als 31% bzw. 21% kleiner als das Elternprotein herausstellten. Da die Abnahme der Quantenausbeute der Mutanten den Fluoreszenzverlust nicht vollständig erklärt, haben wir uns der Proteinkonzentration in den Zellen zugewandt, einem weiteren Faktor, der die Fluoreszenzintensität beeinflusst. Die Menge an löslichem und unlöslichem Protein für jede Mutante wurde durch Western-Blotting analysiert, wie in Fig. 3 gezeigt, unter Verwendung von Anti-GFP zum Nachweis. Dieses Experiment zeigte deutlich, dass der Hauptgrund für die Reduktion bzw. den Verlust der Fluoreszenz der Mutanten deren niedrige Konzentration war, die wiederum auch auf eine geringe Stabilität oder falsche Faltung zurückzuführen sein könnte [25]. Es überrascht nicht, dass sgGFP-Δ I129 und sgGFP-Δ D130 die am besten exprimierten Mutanten waren. Um zu beurteilen, ob die Proteine ​​durch unsachgemäße Faltung inaktiviert wurden, züchteten wir die Mutanten bei 30°C. Bei dieser niedrigeren Temperatur erhöhte sich die Fluoreszenz von sgGFP-Δ I129 von 21% auf 46%, wohingegen sgGFP-Δ D130 von 17% auf 116% im Vergleich zu Gew.-sgGFP anstieg. Diese Ergebnisse zeigten, dass beide Deletionsmutanten wärmeempfindlich sind und dass sgGFP-Δ D130 bei niedrigeren Temperaturen noch stärker fluoresziert als das Wildtyp-Protein. Niedrigere Temperaturen begünstigen häufig eine geeignete Faltung von Mutanten [13]. Western-Blotting der Mutanten, die bei 30°C gezüchtet wurden, gezeigt in Fig. 3b, bestätigte, dass die Proteinkonzentration erhöht war.

Western-Blotting-Analyse von deletierten Mutanten, die bei zwei verschiedenen Temperaturen gezüchtet wurden. (A) Deletionen einzelner Aminosäuren, die in der Region 129–142 von sgGFP und der bei 37 °C gewachsenen Doppelmutante sgGFP-ΔI129/ΔD130 enthalten sind. (B) Einige sgGFP-Mutanten, die bei 30 °C gezüchtet wurden. S und P repräsentieren die lösliche bzw. unlösliche Fraktion der Zellen. Die Fraktionen S und P wurden auf verschiedenen Gelen laufen gelassen. Spur 1: sgGFP wt, Spur 2: sgGFP-ΔI129, Spur 3: sgGFP-ΔD130, Spur 4: sgGFP-ΔF131, Spur 5: sgGFP-ΔK132, Spur 6: sgGFP-ΔE133, Spur 7: sgGFP-ΔD134, Spur 8 : sgGFP-ΔG135, Spur 9: sgGFP-ΔN136, Spur 10: sgGFP-ΔI137, Spur 11: sgGFP-ΔL138, Spur 12: sgGFP-ΔG139, Spur 13: sgGFP-ΔH140, Spur 14: sgGFP-ΔK141, Spur 15: sgGFP-ΔL142 und Spur 16: sgGFP-ΔI129/ΔD130.

Es ist erwähnenswert, dass plattierte Kolonien, die die anderen Einzeldeletionsmutanten exprimierten, während 15 Tagen des Wachstums weder bei 30 °C noch bei 22 °C nicht fluoreszierend blieben.

Temperatur-Denaturierungskurven (siehe Abbildung 4) für die aktiven gereinigten Mutanten sgGFP-Δ I129 und sgGFP-Δ D130 zeigten, dass diese Proteine ​​weniger hitzestabil sind als das Elternprotein, aber nicht genug, um die signifikante Proteinreduktion bei 37° . zu erklären C. Daher sind diese Aminosäuren essentiell für eine gute Faltung, insbesondere D130.

"Temperaturdenaturierungskurven der gereinigten Proteine ​​sgGFP wt, sgGFP-ΔI129 und sgGFP-ΔD130. Aliquots in dreifacher Ausführung jeder Probe wurden verschiedenen Temperaturen ausgesetzt (25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C). , 75 °C und 80 °C) während 5 Minuten und die anfängliche (FÖ) und Endfluoreszenz (FF) wurde gemessen. Das Verhältnis FF/FÖ gegen die Temperatur wurde aufgetragen."

Bei einigen nicht-funktionellen Mutanten wie sgGFP-Δ L138 und sgGFP- ΔI129/ΔD130, niedrige Proteinkonzentration war nicht die einzige Erklärung für ihren Fluoreszenzverlust. Diese beiden Mutanten führten zu signifikanten Einschlusskörperchen, aber es blieb immer noch eine beträchtliche Menge Protein in Lösung, von der man erwarten würde, dass sie ein Signal liefert, wenn die Proteine ​​fluoreszierend wären an sich. Wir glauben, dass diese Mutanten korrekt gefaltet sind, aber die Reifung des Chromophors ist beeinträchtigt, ähnlich dem farblosen GFP, das aus isoliert wurde Aequorea corulescens (acGFP) oder die verstärkte Mutante aceGFP-G222E [26]. Es werden mehr biophysikalische und biochemische Assays benötigt, um aufzuklären, welche Prozesse betroffen sind – Cyclisierung, Oxidation oder Dehydratisierung.

Die wichtigste Schlussfolgerung aus den hier vorgestellten Deletionsstudien ist die Schlüsselrolle der Reste 131–142 (130–141 in GFP) für eine angemessene Faltung des Proteins. Dieses Ergebnis stimmt mit den von Baird . gemeldeten Ergebnissen überein et al [13] Arbeiten mit Permutationen. Sie fanden heraus, dass GFP nur nach dem Rest N144 an verschiedenen Stellen geöffnet werden kann, erklärten jedoch nicht das Fehlen von Öffnungen in der ersten Hälfte des Proteins. Daher scheint die Region 131–142 als Brücke zu fungieren, die zwei unabhängig gefaltete Teile des Proteins verbindet.

Um weiter zu untersuchen, wie wichtig die Sequenz in der Unterregion 131–142 ist, haben wir uns entschieden, jede der zwölf Positionen einer Single-Site-Saturation-Mutagenese (siehe M&M für Details) unter Verwendung der degenerierten Oligonukleotide aus Abbildung 2 zu unterziehen. die meisten Varianten (55%), die in den Substitutionsbibliotheken gefunden wurden, zeigten in den Platten nach 24 h Wachstum bei 37 °C einen grün fluoreszierenden Phänotyp, was zeigt, dass Substitutionen toleriert werden, wo Deletionen nicht sind. Die DNA-Sequenzdaten mehrerer zufällig ausgewählter fluoreszierender und nicht fluoreszierender Kolonien (wie im Plattentest erschienen) sind in Tabelle 2 konzentriert. Die Daten zeigen, dass G135 die am wenigsten tolerante Aminosäure ist, wobei erlaubte Ersetzungen dieses Rests nur blassgrüne- fluoreszierende Kolonien (aufgrund des verminderten löslichen Proteins in den Zelldaten nicht gezeigt). Diese vergrabene Aminosäure bildet einen Teil einer kurzen α-Helix, die sich in der Mitte der Schleife befindet. Anscheinend besteht die Hauptfunktion dieser α-Helix darin, I137 zum Kern des Laufs zu positionieren, um einen Teil der Schlaufe zu fixieren.

Die Positionen 131, 137, 138 und 142 tolerierten nur konservative Ersetzungen durch hydrophobe Reste. Da auch F131, L138 und L142 im Kern des Proteins vergraben sind, sind diese Aminosäuren wahrscheinlich für die Fixierung der Schleife wichtig. Die nicht fluoreszierende Mutante F130A zeigte auch, dass die Größe der hydrophoben Seitenkette für eine geeignete Verpackung des Proteins wichtig ist. Andererseits wurden die Reste H140 und K141 nur durch hydrophile Aminosäuren ersetzt, was auf Ionen- oder H-Brücken-Wechselwirkungen mit benachbarten Aminosäuren schließen lässt. Schließlich tolerierten die Reste K132, E133, D134, N136 und G139, deren Seitenketten dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, jegliche Aminosäuresubstitution.

Unsere Ergebnisse mit Substitutionen bestätigten den Anwendungsbereich des Scanning-Mutagenese-Ansatzes, um vergrabene und exponierte Aminosäuren in Proteinen unbekannter Struktur zu identifizieren, wie von Bajaj . vorgeschlagen et al [27]. Zum Beispiel zerstörte die Substitution verborgener Aminosäuren durch geladene Reste, wie in den Mutanten F131D, F131K, I137D, I137E, I137R und L142D, die Fluoreszenz, anscheinend aufgrund von Proteininstabilität. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass einige Mutanten (in Tabelle 2 mit einem Sternchen markiert), die im Plattentest anfänglich nicht fluoreszierend waren, nach 3–5 zusätzlichen Tagen Wachstum bei Raumtemperatur blassgrün-fluoreszierend wurden, was auf eine langsame Reifung der Chromophor wie bei acGFP [26].


BAUMBAU

Viele moderne Softwarepakete zum Konstruieren phylogenetischer Bäume enthalten eine verwirrende Reihe unterschiedlicher Verfahren: Neighbor Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood und Bayes'sche Algorithmen sind nur einige der am weitesten verbreiteten Techniken. Wir haben jedoch festgestellt, dass zwei ältere Methoden—UPGMA und Fitch–Margoliash— die phylogenetischen Kernprinzipien so einführen, dass die Lernenden komplexere Verfahren anwenden können. Während der Workshops der Fakultät beginnen wir mit einer einfachen Matrix von paarweisen Abständen zwischen Nukleotidsequenzen ( Abbildung 2 A) und bitten die Teilnehmergruppen, diese Daten zu verwenden, um einen phylogenetischen Baum abzuleiten ( Abbildung 2 B). Einzelne Gruppen experimentieren typischerweise mit einer Vielzahl intuitiver Ansätze: Verbinden von Sequenzen mit dem Baum in der Reihenfolge zunehmender oder abnehmender Ähnlichkeit, Darstellung von Ästen als gerade, schräge oder gekrümmte Linien und Lösen der Baumtopologie und der Astlängen gleichzeitig oder sequentiell. Während die Teilnehmer über ihre Bäume diskutieren, packen sie ihre evolutionären Annahmen und mathematischen Methoden aus und untersuchen sie gemeinsam.

(EIN) Genetische Distanzmatrix für Nukleinsäuresequenzen generiert von EvolSeq (B) Entsprechender phylogenetischer Baum, der den ultrametrischen Zustand veranschaulicht.

An dieser Stelle eruieren und formalisieren wir die intuitiven Vorstellungen der Teilnehmer in Bezug auf die genetische Distanz. Insbesondere ist zu beachten, dass jede Entfernungsmessung nicht negativ und symmetrisch sein muss (d. h. die Entfernung von A nach B ist gleich der Entfernung von B nach A) und die Dreiecksungleichung erfüllen muss DACDAB + DBC für jeden Satz von drei Sequenzen. Wenn sich die Sequenzen über eine strenge molekulare Uhr entwickeln, erfüllt die Distanzmatrix außerdem auch die Drei-Punkte-Bedingung [19]: Für drei beliebige Sequenzen sind die beiden größten paarweisen Abstände gleich. Bäume, die diese Bedingung erfüllen, werden als ultrametrisch bezeichnet. Bei solchen Bäumen kann der Abstand zwischen zwei beliebigen Schwestertaxa gleichmäßig auf ihre beiden Äste aufgeteilt werden, was den Baumbau viel einfacher macht.

In der Praxis weicht die Sequenzevolution oft von einer strengen molekularen Uhr ab: Die Substitutionsraten können im Laufe der Zeit oder zwischen den Sequenzen variieren (vielleicht aufgrund von Änderungen des Selektionsdrucks oder der effektiven Populationsgröße). Phylogenetische Bäume solcher Sequenzen werden nicht mehr ultrametrisch sein, sondern können stattdessen die schwächere Bedingung der Additivität erfüllen. In einem additiven Baum kann der genetische Abstand zwischen zwei beliebigen Punkten ermittelt werden, indem die Längen aller Zweige seit den letzten gemeinsamen Vorfahren dieser Sequenzen addiert werden [ Abbildung 3 ]. Die Rekonstruktion additiver Bäume wird dadurch erschwert, dass Schwestertaxa im Gegensatz zu einem ultrametrischen Baum nicht gleich weit von ihrem letzten gemeinsamen Vorfahren entfernt sein müssen. Stattdessen müssen Zweiglängen durch Lösen eines Systems simultaner linearer Gleichungen abgeleitet werden. Für einen Drei-Taxa-Baum haben diese Gleichungen eine einzige exakte Lösung [20]: wenn DAB, DAC und DBC sind die drei paarweisen Abstände zwischen Folgen, die Abstände von ihrem zentralen Scheitelpunkt V werden gegeben von DEIN V = ½(DAB + DACDBC), DBV = ½(DAB + DBCDAC) und DLebenslauf = ½(DBC + DACDAB). Größere Bäume können gehandhabt werden, indem nach drei Sequenzen gleichzeitig aufgelöst wird, die beiden nächsten Sequenzen in ihren gemeinsamen Scheitelpunkt kollabiert werden, der durchschnittliche Abstand von diesem Scheitelpunkt zu jeder verbleibenden Folge in der Distanzmatrix berechnet wird, die nächste Folge zu den verbleibenden zwei hinzugefügt und gelöst wird wieder.

(EIN) Genetische Distanzmatrix für Aminosäuresequenzen generiert von EvolSeq (B) Entsprechender phylogenetischer Baum zur Veranschaulichung des additiven Kriteriums.

Bisher haben wir die genetische Distanz als die Anzahl der Nukleotid- oder Aminosäureunterschiede zwischen Sequenzen gemessen. Diese einfache Metrik berücksichtigt jedoch nicht, dass möglicherweise mehrere Substitutionen an derselben Position aufgetreten sind, und neigt daher dazu, das tatsächliche Ausmaß der Divergenz zu unterschätzen. Daher ist die nächste logische Verfeinerung die Jukes�ntor-Distanzmetrik, die eine Korrektur für dieses Phänomen enthält. Anschließend führen wir ausgefeiltere Distanzmetriken ein, die den Transition–Transversion Bias (Kimura 2-Parameter-Modell), die ungleiche Basisfrequenz (HKY85) und die Variation der Substitutionsrate zwischen den Positionen (HKY + Γ + I) berücksichtigen. Wir diskutieren auch Distanzmetriken, die verwendet werden, um Aminosäuresequenzen zu analysieren, wie die BLOSUM80-Matrix für eng verwandte Sequenzen und die PAM250-Matrix für weiter entfernte Beziehungen.

Um Distanzmatrizen für ultrametrische und additive Bäume zu erstellen, verwenden wir das ESTEEM-Paket EvolSeq, ein Excel-Arbeitsbuch, das die molekulare Evolution von DNA-Sequenzen simuliert. Das Arbeitsbuch beginnt mit einer einzelnen zufälligen Sequenz und folgt dann dieser Sequenz im Laufe der Zeit, während sie sich reproduziert und mutiert. Schließlich werden bis zu 20 verwandte Sequenzen generiert. EvolSeq berechnet dann die (ultrametrischen) genetischen Distanzen zwischen jedem Paar von DNA-Sequenzen und auch die (additiven) Distanzen zwischen den zugehörigen Aminosäuresequenzen. Obwohl das Evolutionsmodell von EvolSeq’ extrem einfach ist, ist es als Werkzeug zum schnellen Generieren von Bäumen für Bleistift-und-Papier-Übungen im Klassenzimmer nützlich. Die zentrale Lektion für die Schüler ist, dass einfache algebraische Methoden wesentliche Einblicke in phylogenetische Methoden geben können und dass zusätzliche Verfeinerungen basierend auf den für ein bestimmtes biologisches System geeigneten evolutionären Modellen diese Methoden noch weiter verbessern können.


Hintergrund

Seit einigen Jahren wird die phylogenetische Konstruktion als ein Problem statistischer Inferenz betrachtet. Eine der beliebtesten Methoden, um phylogenetische Beziehungen abzuleiten, ist die Maximum Likelihood (ML). Es wurde oft angenommen, dass einer der Vorteile von ML gegenüber sparsamen Methoden darin besteht, dass sie die Verwendung verschiedener Evolutionsmodelle je nach untersuchtem Datensatz ermöglicht. Daher ist die Kenntnis des Evolutionsprozesses und die Fähigkeit, realistische Evolutionsmodelle zu konstruieren, die Grundlage, um genaue phylogenetische Beziehungen zwischen den Arten ableiten zu können. Derzeit besteht eine der größten Herausforderungen in der Phylogenetik darin, den Prozess der Nukleotid- oder Aminosäuresubstitution genau zu modellieren und aus unseren Modellen auszuwählen, um genaue Phylogenien abzuleiten. Felsenstein [1] hat in Simulationen erstmals gezeigt, dass zu vereinfachende Modelle, die Mehrfachsubstitutionen unterschätzen, in bestimmten Situationen zu Inkonsistenzen bei der Phylogenieschätzung führen können (sogenannte „Felsensteinzone“). Weitere Simulationsstudien haben gezeigt, dass selbst bei Verwendung der ML-Analyse eine Unterschätzung von Nukleotidsubstitutionen (wie von einfacheren Modellen angenommen) zu einer langen Verzweigung und Inkonsistenz in der Felsensteinzone führt [2, 3]. Diese Ergebnisse wurden auch in realen Datensätzen dupliziert, bei denen die Verwendung unzureichender Modelle zu einer Anziehungskraft für lange Zweige führen kann [4, 5]. In Simulationen wurde jedoch auch gezeigt, dass Modellverletzungen in bestimmten Situationen auch den wahren Baum begünstigen können (oft als „Farris-Zone“ oder „Inverse-Felsenstein-Zone“ bezeichnet) [6, 7]. In Simulationen und realen Daten wurde später gezeigt, dass dies nur in sehr begrenzten Fällen passieren kann und generell die Verwendung zu vereinfachender Modelle vermieden werden sollte [3, 7, 8]. Eine Tatsache, die mit Sicherheit richtig ist, ist, dass die genaue Schätzung der Knotenunterstützung stark durch die Verwendung von vereinfachenden Modellen in simulierten und realen Datensätzen beeinflusst wird [9, 10]. Es ist klar, dass die Verwendung von zu vereinfachenden (oder falschen) Substitutionsmodellen unsere Phylogenien negativ beeinflussen kann, es sei denn, wir können völlig sicher sein, dass ein Datensatz in eine der oben genannten Kategorien passt.

Fast alle Modelle des Aminosäureersatzes gehen davon aus, dass sich alle Aminosäurestellen unabhängig nach demselben Markov-Prozess entwickeln. Es wird angenommen, dass der Markov-Prozess stationär und homogen ist, sodass alle Substitutionsraten über die Zeit konstant sind. Jedes der Proteinsubstitutionsmodelle besteht aus einer 20 × 20-Momentanratenmatrix, die den Satz der ursprünglichen Aminosäurefrequenzen enthält (π ich) aus dem Datensatz, der zum Generieren des Modells verwendet wurde. Die (π ich)-Werte stellen die Gleichgewichts- oder stationären Frequenzen der 20 Aminosäuren dar und die Matrizen werden oft modifiziert, um den Satz beobachteter Frequenzen in den untersuchten Datensatz aufzunehmen. Modelle, die die beobachteten Aminosäurehäufigkeiten berücksichtigen, werden oft mit dem Suffix „+F“ bezeichnet [11]. Wenn wir davon ausgehen, dass der Substitutionsprozess reversibel ist, reduziert sich die Anzahl der freien Parameter von 399 auf 189. Aufgrund des Rechenaufwands durch die Optimierung aller 189 freien Parameter der Momentanratenmatrix mit großen Datensätzen und dem Risiko einer Überanpassung der Matrix Parameter bei der Analyse kleiner Datensätze hat dazu geführt, dass sich die meisten Phylogenie-Programme auf empirische Modelle der Proteinevolution stützen. Dayhoffet al. [12] waren die ersten, die ein allgemeines Modell der Aminosäuresubstitution unter Verwendung der damals begrenzten Menge an verfügbaren Sequenzdaten entwickelten. Seitdem wurden mehrere zusätzliche Modelle aus anderen Datensätzen und mit unterschiedlichen Techniken entwickelt, wie z. B. maximale Sparsamkeit und maximale Wahrscheinlichkeit [13–22].

Es wurde viel über verschiedene Techniken geforscht, um eine Modellauswahl an Nukleotiddaten durchzuführen [23]. In der Vergangenheit wurden drei Maßnahmen verwendet, um das am besten geeignete Substitutionsmodell auszuwählen. Der hierarchische Likelihood-Quotienten-Test (hLRT) besteht aus einer Baumhierarchie, bei der das am besten geeignete Modell ausgewählt wird, indem eine Reihe von paarweisen Likelihood-Quotienten-Tests durchgeführt und durch den Baum navigiert wird, um zum endgültigen Modell zu gelangen [24]. Die hLRT ist jedoch nur für Modelle geeignet, die als Untermengen voneinander definiert werden können, und wird daher im Allgemeinen nur auf die Auswahl von Nukleotidmodellen angewendet. Zum Beispiel ist das F81-Modell [25] eine Teilmenge des HKY-Modells [26], wobei die Übergangs- und Transversionsraten gleich eingestellt sind. Da die verschiedenen Aminosäurematrizen keine freien Parameter besitzen, ist es nicht möglich, eine ähnliche Baumhierarchie wie bei Nukleotidmodellen zu definieren. Das Akaike-Informationskriterium (AIC) [27] und das Bayessche Informationskriterium (BIC) [28] gehören zu einer anderen Klasse von Modellauswahlmaßen, die alle Modelle gleichzeitig nach einem Fitnessmaß vergleichen. Obwohl diese Maßnahmen seit vielen Jahren bei der Auswahl von Nukleotidmodellen verwendet werden, wurden erst kürzlich Programme wie MODELGENERATOR [29] und Prottest [30] speziell entwickelt, um statistische Analysen des vollständigen Satzes verfügbarer Aminosäuresubstitutionsmodelle durchzuführen.

Bisher gingen viele phylogenetische Analysen mehrerer Datensätze aus einem festen Satz von Taxa von einem einzigen Substitutionsmodell für alle Sätze von Homologen aus (z. B. [31–33]). Wir argumentieren, dass, wenn angenommen wird, dass eine einzelne Aminosäurematrix die am besten geeignete Matrix für alle Gene in einem Datensatz ist, die Möglichkeit besteht, dass die Methode auf Situationen wie die zuvor erwähnte stößt und suboptimale Phylogenien produziert. Wir haben Experimente mit realen Datensätzen durchgeführt, um festzustellen, ob es richtig ist, Phylogenien aus verschiedenen Genen unter Verwendung derselben Aminosäurematrix aufzubauen. Dieses Thema wurde noch nie zuvor untersucht und unsere Ergebnisse zeigen große Unterschiede in den besten Proteinmodellen innerhalb aller analysierten Datensätze. Die in diesem Papier präsentierten Ergebnisse werfen die Frage auf, ob wir vor einer Schätzung der Aminosäure-Phylogenie vollständige Proteinmodell-Selektionsanalysen durchführen sollten.


Biophysikalische und biochemische Eigenschaften von fluoreszierenden Proteinen

Derzeit stehen beim Design eines Experiments Dutzende von FP-Optionen zur Verfügung. Welches soll ausgewählt werden? Die Antwort kann sich alle paar Monate ändern, da in der Literatur über verbesserte FPs berichtet wird, obwohl neuere nicht immer gleich besser sind. Welche FPs man auch in Betracht zieht, es gibt einige Schlüsselfunktionen, die für jedes FP-Experiment grundlegend sind. Spektrale und biochemische Eigenschaften sind für FPs wichtig und werden normalerweise entweder im Originalpapier mit der Beschreibung des FP oder im Datenblatt eines Unternehmens angegeben (siehe Kasten 1). Mit wenigen Ausnahmen benötigen Forscher die hellsten, photostabilsten, am wenigsten phototoxischen und am schnellsten faltenden FP, um robuste Fluoreszenzsignale zu erhalten. Für FP-Fusionsproteine ​​verwendet unser Labor hauptsächlich die im ersten Teil von Tabelle 1 aufgeführten FPs. Superfolder GFP ist vielversprechend für Fusionsproteinkonstrukte, die vergleichsweise schwach erscheinen, höchstwahrscheinlich, weil die Fusionsproteine ​​die FP-Faltung stören (siehe Lit. [14], insbesondere Abbildung 4). Das heißt, genauso wie FPs die Funktionalität eines Fusionsproteins beeinflussen können (siehe folgende Abschnitte), kann ein interessierendes Protein die FP-Faltung unterbrechen und das FP-Fluoreszenzsignal beeinflussen.

Tabelle 1

Beliebte FPs und erfolgreiche Beispiele für FP-Fusionsproteine

ProteinReferenzAnmerkungen
FPs
    TagBFP[37]Neue helle fotostabile blaue FP
   ꃎrulean[38]Verbesserte Form des Cyan FP (CFP)
    Monomeres EGFP[1, 15, 20, 21]Das ursprünglich optimierte grüne FP und am besten charakterisierte FP für das Design von FP-Fusionsproteinen.
    Venus oder Citrin[39, 40]Verbesserte Formen der gelben FP (YFP).
    mCherry oder mKate2[3, 22]Beliebte rote FPs.
    PA-GFP und PA-mCherry[41, 42]Photoaktivierbare FPs.
    FP-Fusionsproteine
    GRP94-GFP[43]Luminal ER Chaperon
    GFP-NMDAR1[44]Ionenkanal.
    GFP-Wanne1[45]Hefe α-Tubulin
    GFP-Clathrin [46] Hüllprotein des sekretorischen Weges

Fluoreszierende Protein-Codon-Optimierung und Sequenzeignung

Die meisten FPs wurden aus Quallen- und Korallenproteinen entwickelt. Ein wesentlicher Unterschied zwischen diesen Tieren und Säugetieren ist die Wahl der Aminosäurecodons. 1996 verbesserten Brian Seed und Kollegen [15] die Expression und das Fluoreszenzsignal von GFP in Säugerzellen um das 40- bis 120-fache, indem sie die GFP-Codonsequenz stark modifizierten, um die Präferenzen von Säugerzellen widerzuspiegeln. Die meisten kommerziell erhältlichen Plasmide wurden für Säugerzellen codonoptimiert. Einige der älteren FP-Plasmide, die in Laborgefriergeräten lauern, wurden jedoch möglicherweise nicht optimiert und ein GFP ist möglicherweise nicht mit einem anderen gleichwertig. Codon-optimierte FPs für Säugetiere sind nicht unbedingt für andere Modellorganismen optimiert, wie z Drosophila oder Hefe. Forscher, die in Nicht-Säugetiersystemen arbeiten, sollten erwägen, für ihren Modellorganismus codon-optimierte Varianten von FPs zu synthetisieren (derzeit etwa 350 US-Dollar für den durchschnittlichen FP).

Selbst wenn ein FP Codon-optimiert ist, ist es möglicherweise nicht unbedingt für einige zelluläre Umgebungen geeignet. TagRFP und mKO enthalten beispielsweise mehrere Cysteine ​​und Konsensus-N-Glykosylierungsstellen (NXS/T, X ist eine beliebige Aminosäure außer Prolin), die die Faltung, Größe und Oligomerisierung dieser FPs verändern könnten, wenn sie auf den sekretorischen Weg eukaryotischer abzielen Zellen [16]. Auch EGFP und seine Varianten enthalten zwei Cysteine, die im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zu disulfidgebundenen Oligomeren führen können [17]. Unter extremeren Bedingungen kann sich EGFP in der stark oxidierenden Umgebung des periplasmatischen Raums gramnegativer Bakterien nicht richtig falten oder fluoreszieren [18]. Im Gegensatz dazu faltet sich das Cystein-lose mCherry leicht in der gleichen Umgebung [19]. Untersuchen Sie daher die FP-Aminosäuresequenzen immer sorgfältig auf potenziell umweltempfindliche Sequenzen.

Fluoreszierender Protein-Oligomer-Zustand

Viele FPs neigen zur Oligomerisierung entweder als Teil der inhärenten Struktur (d. h. DsRed ist ein obligates Tetramer) oder wenn sie in hohen Konzentrationen auf Membranen oder in oligomeren Proteinen (d. h. EGFP) vorhanden sind. Daher ist es wichtig zu bestimmen, ob ein FP monomer ist und ob dies für Ihr Experiment von Bedeutung ist. Während über FP-Oligomerisierung häufiger berichtet wird, ist die Neigung eines FP zur Oligomerisierung oft unbekannt, da Oligomerisierungsassays nicht immer robust oder quantitativ sind. Viele Veröffentlichungen beschreiben ein FP als monomer, ohne die Monomerisierung direkt zu demonstrieren oder ohne ein K . zu berichtenD Wert. Dieser Punkt ist nicht nur akademisch. Es kann schwierig oder teuer sein (bis zu 500 USD pro Plasmid), ein FP-Plasmid zu erhalten, und Sie werden wahrscheinlich nicht in guter Stimmung sein, wenn diese 500 USD FP mit Ihrem FRET-Biosensor oder integralen Membranfusionsprotein oligomerisieren. Derzeit gibt es keine akzeptierten Standards dafür, wie monomer ein FP für Zellanwendungen sein muss. Einige Forscher fusionieren neue FPs mit Tubulin oder Aktin, um festzustellen, ob sich Zytoskelettstrukturen richtig bilden. Jedoch verfehlten solche Assays die Wirkungen der EGFP-Dimerisierung unter anderen physiologischen Bedingungen (siehe unten). Daher müssen die Forscher bestätigen, dass sich ein FP-markiertes Protein in Assays und Umgebungen, die für das interessierende Protein relevant sind, ähnlich verhält wie nicht-markierte Proteine.

Die FP-Oligomerisierung ist von Bedeutung, da sich FPs, die als monomer angesehen werden, als Dimere bei ausreichend hohen Konzentrationen in Zellen erwiesen haben. Beispielsweise bildet EGFP Dimere, wenn es an integrale Membranproteine ​​fusioniert oder in oligomere Proteine ​​eingebaut wird [20]. Infolgedessen können Fusions-FPs unangemessene Wechselwirkungen eingehen, die zu falsch positiven FRET-Signalen [20] oder einer Verzerrung von Zellorganellen [21] führen. Für Fusionsproteine ​​muss das FP wirklich monomer sein. Glücklicherweise können EGFP und Varianten (CFP und YFP) mit einer einzigen Punktmutation (A206K) monomerisiert werden [20, 21].

Fluoreszierende Proteinanwendungen in Zellen

Kostenlose FPs zum Markieren von Zellen

FPs können als freie Proteine ​​entweder konstitutiv oder unter der Kontrolle eines interessierenden Promotors exprimiert werden. Es gibt nur wenige Einschränkungen bei der Wahl des FP für diese Experimente außer der Identifizierung eines ausreichend hellen FP. Tandem-Dimer-FPs, d. h. tdKatushka2 und tdTomato, sind eine ausgezeichnete Wahl, da sie zwei Kopien eines FPs haben, was sie außergewöhnlich hell macht [22]. Wenn FPs als Reporter der Promotoraktivität verwendet werden, kann die Chromophor-Bildungszeit eine Überlegung sein. Schnelle Ordner-FPs wie mCherry und Venus melden schnell die Promotoraktivität. Beachten Sie, dass solche FP-Reporter wenig Einblick in die Nachrichtenstabilität bieten und im Allgemeinen sowohl die kumulative Promotoraktivität als auch die Stabilität des fluoreszierenden Proteins widerspiegeln, da fluoreszierende Proteine ​​typischerweise eine Halbwertszeit von 24 Stunden haben [23]. Um den FP-Umsatz zu steigern, haben mehrere Gruppen Proteasom-Degrons an FPs angehängt und erreichen Protein-Halbwertszeiten von

2h [23]. Alternativ kann eine andere Klasse von FPs, fluoreszierende “timer”, die Farbe mit dem Alter ändern und relative Maße der Verhältnisse von kürzlich synthetisierten und alten FPs liefern [24, 25].

Fluoreszierende Proteinfusionsproteine

Die Visualisierung der Verteilung und Dynamik eines Proteins in einem subzellulären Kompartiment hat neue Möglichkeiten in der Zellbiologie eröffnet [26-28]. Korrektes Design und Charakterisierung von FP-Fusionsproteinen sind für die Interpretation von FP-Fusionsprotein-Studien unerlässlich.

Einige Forscher nehmen Abkürzungen und “llonieren per Telefon.” Während es verlockend ist, sich auf andere zu verlassen, um FP-Fusionsproteine ​​von Interesse zu erzeugen, gibt es wichtige Gründe, eigene Konstrukte herzustellen. Bei Konstrukten, die von anderen Labors oder Firmen erhalten werden, muss man skeptisch sein. Nicht alle Konstrukte werden unter Berücksichtigung von Protein-Targeting-Domänen hergestellt (siehe unten). Außerdem sind viele FPs nicht immer richtig beschriftet. Zum Beispiel könnte ein DsRed-Konstrukt die monomere oder tetramere Form sein. Ein anderes Beispiel ist mir passiert. Ich führe oft Photobleaching-Experimente durch, um die Proteindynamik von GFP-Fusionsproteinen zu untersuchen, und eine grundlegende Voraussetzung für diese Experimente ist, dass das FP irreversibel photobleichet. Einmal produzierten GFP-Fusionsproteine ​​von einem Kollaborateur unerwartet schnelle Proteinmobilitäten in Zellen. Die Sequenzierung ergab, dass das GFP die drei EGFP-Mutationen und zwei zusätzliche Mutationen enthielt, von denen berichtet wurde, dass sie die Helligkeit erhöhen. Kontrollexperimente zeigten, dass dieses GFP im Gegensatz zu Standard-EGFP fast 80% reversibles Photobleichen (auch Photoswitching genannt) durchmachte (unsere unveröffentlichten Ergebnisse und Studien von [16, 29, 30]). Nicht alle 𠇎GFPs” sind gleich! Wenn Sie ein FP-Konstrukt von einem anderen Labor erhalten, fordern Sie höflich eine Plasmidkarte und eine Sequenzdatei an. Wenn keine Sequenzdatei verfügbar ist, sequenzieren Sie das FP-Konstrukt selbst, bevor Sie Experimente durchführen. Arbeiten Sie nicht mit mysteriösen Reagenzien! Diese Anekdote veranschaulicht auch, wie wichtig es ist, stabile Basislinienwerte für zeitaufgelöste Fluoreszenzexperimente zu sammeln, um Phänomene wie Photoswitching zu identifizieren. Schließlich sind ungewöhnliche photophysikalische Eigenschaften von FPs nicht immer problematisch. Sie können genutzt werden, um neue bildgebende Verfahren zu entwickeln. Photoswitching spielt beispielsweise eine wichtige Rolle in der Super-Resolution-Technik von PALM ([31] und siehe den Artikel von Jennifer Lippincott-Schwartz in dieser Ausgabe).

Warum GFP Antikörper nicht obsolet gemacht hat

Immer wenn ein Epitop-Tag (ANY Epitop-Tag, EGFP, myc, His, HA usw.) zu einem Protein hinzugefügt wird, kann das Tag die Proteinfunktion entweder durch sterische Blockierung von Proteininteraktionen mit Substraten oder durch Zerstörung von Targeting-Sequenzen modifizieren (siehe nächster Abschnitt). Die Kenntnis Ihres Proteins und die Entwicklung des Epitop-Tags, um eine Störung der Proteinfunktion oder des Targetings zu vermeiden, können solche Probleme umgehen.

Ein Antikörper gegen Ihr natives Protein ist ein Schlüsselreagenz für alle Epitop-Tagging-Experimente. Ein Antikörper kann bestätigen, dass das eigene markierte Protein: 1) korrekt durch Immunfluoreszenz lokalisiert wird, 2) die richtige Größe hat und in ähnlichen Konzentrationen wie das nicht markierte Protein in einem Immunoblot exprimiert wird und 3) mit bekannten Substraten in einer Co-Immunpräzipitation interagiert. Das einfache Markieren eines Proteins mit einem FP, um die Herstellung eines Antikörpers zu vermeiden, wird nicht alle diese wichtigen Punkte ansprechen. Jede Lokalisierung der FP-Fusion oder zugehörige Informationen müssen unabhängig mit einem Antikörper verifiziert werden, um zu bestätigen, dass das FP das Proteinverhalten oder die Lokalisierung nicht gestört hat.

Neben einem Antikörper erfordern Fusionsproteinstudien die Verfügbarkeit oder Entwicklung eines funktionellen Assays. Die Bedeutung eines funktionellen Assays kann nicht genug betont werden. Selbst wenn sich Ihr markiertes Protein in einer Zelle korrekt lokalisiert, ist es wichtig zu bestätigen, dass sich Ihr markiertes Protein wie das native Protein verhält. Der Zweck der Zugabe eines FP zu einem Protein besteht darin, die Lokalisierung und Dynamik des interessierenden Proteins in Zellen zu überwachen. Ein nicht-funktionelles FP-markiertes Protein ist bestenfalls informativ und höchstwahrscheinlich irreführend. Einige Beispiele von FP-markierten Proteinen mit nachgewiesener Funktionalität sind im zweiten Teil von Tabelle 1 aufgeführt.

Targeting-Sequenzen und wo das fluoreszierende Protein eingefügt wird

Nachdem Sie ein helles monomeres FP ausgewählt, einen funktionellen Assay für Ihr interessierendes Protein erstellt und einen guten Antikörper gegen Ihr natives Protein erhalten haben, können Sie entscheiden, wo Sie das FP platzieren möchten. Signifikante Kenntnisse des interessierenden Proteins sind für ein erfolgreiches FP-Fusionsdesign unerlässlich, und es sollte darauf geachtet werden, dass die FP-Fusion nicht die normale Lokalisierung und Funktionalität des interessierenden Proteins blockiert. Ein kritischer Faktor bei der FP-Platzierung beinhaltet die Kenntnis der verschiedenen Arten von Proteinmotiven für das Targeting, das Abrufen und die Retention sowie die kontextuellen und positionellen Anforderungen der Motive.

Viele zelluläre Proteine ​​befinden sich in Organellen oder Unterkompartimenten. Die Proteinlokalisierung hängt entscheidend von der Information ab, die in der Primärsequenz des Proteins kodiert ist [32]. Protein-Targeting-Sequenzen hängen häufig vom Kontext und der Position der Sequenz innerhalb des Proteins ab. Viele Protein-Targeting-Sequenzen müssen sich am extremen NH . befinden2 oder COOH-Terminus des Proteins (siehe Tabelle 2). Beispielsweise dringen die meisten sekretorischen Proteine ​​nicht in das ER ein, es sei denn, die Signalsequenz befindet sich am NH .2 Ende des Proteins. In ähnlicher Weise erfordert ein residentes ER-Protein, dass das ER-Wiedergewinnungsmotiv (-KDEL oder -KKXX) sich am absoluten COOH-Terminus des Proteins befinden muss, um mit der Wiedergewinnungsmaschinerie zu interagieren. So wird beispielsweise die Platzierung eines FP vor der Signalsequenz oder nach dem ER-Wiedergewinnungsmotiv die korrekte Lokalisierung des FP-Fusionsproteins stören. Die Positionserfordernisse der Lokalisierungssequenzen eines interessierenden Proteins werden bestimmen, welche Stellen für die Fusion eines FP geeignet sind.

Tabelle 2

Eukaryotische Protein-Targeting-Domänen mit Positionsanforderungen

SequenzpositionLokalisierungAnmerkungen
NH2-terminale Domänen
    Signalsequenz-ERNormalerweise posttranslational gespalten
    Presequence-MitochondrienAmphipathische Helix, die normalerweise posttranslational gespalten wird
    MyristoylierungssequenzZytoplasmatisches Gesicht von ZellmembranenInitiierendes Methionin wird gespalten
    COOH-terminale Domänen
    -KDELER-Retrieval-Motiv für LuminalproteineDie Domäne muss sich im ER-Lumen befinden.
    -KKXX (X ist eine beliebige Aminosäure)ER-Retrieval-Motiv für integrale MembranproteineDie Domäne muss im Zytoplasma exponiert sein
    -SKLPeroxisomlumen
    -GPI-AnkersequenzBindet luminale und extrazelluläre Blättchen von ZellmembranenFragment des COOH-Terminus des Proteins wird zur Fusion mit GPI . gespalten
    -SchwanzankerER oder mitochondriale Membran
    -CAAX (X ist eine beliebige Aminosäure) Palmitoylierung

6.000 Gene) des menschlichen Genoms kodieren sekretorische Proteine ​​[33]. Weitere 1500 Proteine ​​befinden sich in Mitochondrien, bis zu 8400 im Zellkern und 60 in Peroxisomen. Zytoplasmatische Proteine ​​können auch positionsabhängige posttranslationale Modifikationen enthalten, wie Myristoylierung und Palmitoylierung. Zusammen kodieren mindestens ein Drittel der Gene im menschlichen Genom Proteine ​​mit positionsabhängiger Information. Somit erfordert die Markierung jedes Proteins mit einem FP (oder JEDEM Epitop-Tag) eine spezifische Bewertung geeigneter und ungeeigneter Positionen für das FP relativ zu dem interessierenden Protein. Die große Anzahl von Proteinen mit Targeting-Informationen legt nahe, dass alle potentiellen Fusionsproteine ​​auf Targeting-Sequenzen analysiert werden sollten.

Es ist merkwürdig, dass zahlreiche Veröffentlichungen, oft in Top-Journalen, einheitliche FP-Tagging-Strategien verwenden, um die Lokalisierung und das Verhalten großer Proteinarrays in Zellen zu verfolgen. Während es eindeutig attraktiv ist, Ansätze mit hohem Durchsatz zu entwickeln, um das neueste “-ome zu beschreiben,” kann eine sorgfältige Lektüre der FP-Tagging-Strategie schwerwiegende Probleme mit dem Ansatz und den zugehörigen Daten aufdecken. Viele Protein-Targeting-Sequenzen haben strenge Positionsanforderungen. Das Platzieren eines FP vor oder nach einer Targeting-Sequenz könnte die Targeting-Sequenz maskieren, das korrekte Targeting eines Proteins stören und somit das wahllose GFP-Tagging von Proteinen zu einer zweifelhaften Praxis machen (Kasten 2). Zum Beispiel haben einige Studien ein FP vor dem Start oder am Ende aller offenen Leserahmen konstruiert. Der erstere Ansatz verhindert, dass die meisten sekretorischen Proteine ​​in das ER eintreten und mitochondriale Proteine ​​in die mitochondrialen oder die Addition von Myristoylgruppen translozieren. Der letztere Ansatz verhindert die Retention von Proteinen im ER und den Eintritt von Proteinen in Peroxisomen. Somit werden ganze Klassen von Proteinen falsch angesteuert und falsch verarbeitet. Die resultierenden Daten sind von fragwürdigem Wert. Trotz dieser Bedenken bieten einige Unternehmen jetzt Tausende von cDNAs an, die entweder am NH . mit EGFP fusioniert sind2 oder COOH-Terminus. Die Untersuchung einer Probe sekretorischer Proteinkonstrukte, wie des luminalen ER-Chaperons Calreticulin, zeigte, dass offene Leserahmen mit einer Signalsequenz und einem –KDEL-Abrufmotiv beide EGFP-Fusionsoptionen aufwiesen, von denen keine physiologisch funktionsfähig wäre. Kaum 800€ wert! Wenn Sie daran interessiert sind, ein vorkonstruiertes FP-Fusionsprotein-Plasmid zu erhalten, ist addgene.org eine ausgezeichnete Quelle. Veröffentlichte FP-Fusionskonstrukte sind in einer durchsuchbaren Datenbank verfügbar, wurden gut kommentiert und sind für eine geringe Gebühr von $65 pro Plasmid erhältlich.

Ich möchte nicht den Eindruck erwecken, dass jedes Protein ein “mines Feld” von kritischen Zieldomänen ist. Vielmehr finden sich die meisten positionsabhängigen Targeting-Domänen überwiegend an den NH2- und COOH-Enden des Proteins. Dies vereinfacht die Analyse und macht die Erzeugung von FP-Fusionsproteinen relativ einfach. Unter Berücksichtigung der Bedeutung der FP-Position haben zahlreiche Studien erfolgreich FP-markierte Proteine ​​mit der Funktionalität des unmarkierten Wildtyp-Proteins erzeugt (Tabelle 1). Während das Design von FP-Fusionsproteinen (Kasten 2) erhebliche Kenntnisse des interessierenden Proteins erfordert, sind Targeting-Sequenzen nicht immer in der Primärsequenz des Proteins ersichtlich. Beachten Sie, dass viele der Sequenzen in Tabelle 1 nicht als absolute Konsensussequenzen definiert sind. Dies liegt daran, dass viele Targeting-Sequenzen biochemisch definierte Eigenschaften aufweisen, aber keine gemeinsame Primärsequenz haben. Zum Beispiel hat jedes sekretorische Protein im menschlichen Genom seine eigene einzigartige Signalsequenz, deren Größe von 14 bis 70 Aminosäuren reicht [34]. Webbasierte Ressourcen wie GenBank, ExPASy und SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) können beispielsweise bei der Identifizierung von Signalsequenzen helfen. Angesichts dieser Komplexität ist das FP-Tagging kein empfohlener Ansatz zur Charakterisierung neuer oder schlecht untersuchter Proteine.

Da die meisten FP-Plasmide in Form des Clontech N-Vektors vorliegen, gibt es eine zusätzliche Überlegung für das FP-Fusionsdesign. Das N-Konstrukt enthält eine starke Säugetier-Kozak-Sequenz und ein initiierendes Methionin für das FP. Das Design eignet sich hervorragend zum Exprimieren eines FP selbst, kann jedoch für Fusionsproteine ​​suboptimal sein, da das FP möglicherweise unabhängig von der angehängten Fusionsproteinsequenz translatiert werden könnte, möglicherweise aufgrund eines undichten ribosomalen Scannens (unsere unveröffentlichten Daten und [35]). Um das Potenzial für solche Phänomene zu reduzieren, amplifiziert die PCR die FP-Sequenz ohne eine Methionin- oder Kozak-Sequenz und fusioniert sie im Leseraster mit der cDNA für das interessierende Protein. Bestätigen Sie nach der Konstruktion die FP-Fusionsproteinsequenz, -funktionalität, -lokalisation relativ zum ungetaggten Elternprotein durch Immunfluoreszenz und die Fusionsproteingröße mit einem Immunoblot. Jetzt sind Sie bereit, das volle Potenzial von FP-Fusionsproteinen in lebenden Zellen oder sogar ganzen Organismen zu erschließen.


Inhalt

Frühe Mutageneseversuche unter Verwendung von Strahlung oder chemischen Mutagenen waren nicht ortsspezifisch und erzeugten zufällige Mutationen. [2] Analoga von Nukleotiden und anderen Chemikalien wurden später verwendet, um lokalisierte Punktmutationen zu erzeugen, [3] Beispiele für solche Chemikalien sind Aminopurin, [4] Nitrosoguanidin, [5] und Bisulfit. [6] Die ortsgerichtete Mutagenese wurde 1974 im Labor von Charles Weissmann unter Verwendung eines Nukleotidanalogons N 4 -Hydroxycytidin erreicht, das den Übergang von GC zu AT induziert. [7] [8] Diese Mutagenesemethoden sind jedoch durch die Art der Mutation, die sie erreichen können, begrenzt und sie sind nicht so spezifisch wie spätere ortsgerichtete Mutagenesemethoden.

1971 zeigten Clyde Hutchison und Marshall Edgell, dass es möglich ist, Mutanten mit kleinen Fragmenten des Phagen ϕX174 und Restriktionsnukleasen herzustellen. [9] [10] Hutchison entwickelte 1978 mit seinem Mitarbeiter Michael Smith einen flexibleren Ansatz zur ortsgerichteten Mutagenese, indem er Oligonukleotide in einer Primer-Extension-Methode mit DNA-Polymerase einsetzte. [11] Für seinen Anteil an der Entwicklung dieses Verfahrens teilte sich Michael Smith später im Oktober 1993 mit Kary B. Mullis, dem Erfinder der Polymerase-Kettenreaktion, den Nobelpreis für Chemie.

Das grundlegende Verfahren erfordert die Synthese eines kurzen DNA-Primers. Dieser synthetische Primer enthält die gewünschte Mutation und ist komplementär zur Matrizen-DNA um die Mutationsstelle herum, so dass er mit der DNA im interessierenden Gen hybridisieren kann. Die Mutation kann eine einzelne Basenänderung (eine Punktmutation), mehrere Basenänderungen, Deletion oder Insertion sein. Der einzelsträngige Primer wird dann mit einer DNA-Polymerase verlängert, die den Rest des Gens kopiert. Das so kopierte Gen enthält die mutierte Stelle und wird dann in einem Vektor in eine Wirtszelle eingeführt und kloniert. Schließlich werden Mutanten durch DNA-Sequenzierung ausgewählt, um zu überprüfen, ob sie die gewünschte Mutation enthalten.

Das ursprüngliche Verfahren mit Einzelprimer-Extension war aufgrund einer geringen Mutantenausbeute ineffizient. Diese resultierende Mischung enthält sowohl die ursprüngliche unmutierte Matrize als auch den mutierten Strang, wodurch eine gemischte Population von mutanten und nicht mutierten Nachkommen entsteht. Darüber hinaus ist die verwendete Matrize methyliert, während der Mutantenstrang unmethyliert ist, und die Mutanten können aufgrund des Vorhandenseins eines Fehlpaarungsreparatursystems, das die methylierte Matrizen-DNA begünstigt, gegenselektiert werden, was zu weniger Mutanten führt. Viele Ansätze wurden seitdem entwickelt, um die Effizienz der Mutagenese zu verbessern.

Es steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung, um ortsspezifische Mutagenese zu bewirken, [12] obwohl die meisten von ihnen seit den frühen 2000er Jahren selten in Laboratorien verwendet wurden, da neuere Techniken immer einfachere Wege ermöglichen, ortsspezifische Mutationen in Gene einzuführen.

Kunkels Methode Bearbeiten

1985 führte Thomas Kunkel eine Technik ein, die die Notwendigkeit der Mutantenselektion reduziert. [13] Das zu mutierende DNA-Fragment wird in ein Phagemid wie M13mp18/19 eingefügt und dann in ein E coli Stamm mit einem Mangel an zwei Enzymen, dUTPase (dut) und Uracil-Deglycosidase (udg). Beide Enzyme sind Teil eines DNA-Reparaturwegs, der das bakterielle Chromosom vor Mutationen durch die spontane Desaminierung von dCTP zu dUTP schützt. Der dUTPase-Mangel verhindert den Abbau von dUTP, was zu einem hohen dUTP-Spiegel in der Zelle führt. Der Uracil-Deglycosidase-Mangel verhindert die Entfernung von Uracil aus neu synthetisierter DNA. Als Doppelmutante E coli die Phagen-DNA repliziert, kann ihre enzymatische Maschinerie daher dUTP anstelle von dTTP falsch einbauen, was zu einzelsträngiger DNA führt, die einige Uracile (ssUDNA) enthält. Die ssUDNA wird aus dem Bakteriophagen extrahiert, der in das Medium freigesetzt wird, und dann als Matrize für die Mutagenese verwendet. Zur Primerverlängerung wird ein Oligonukleotid verwendet, das die gewünschte Mutation enthält. Die sich bildende Heteroduplex-DNA besteht aus einem nicht mutierten Elternstrang, der dUTP enthält, und einem mutierten Strang, der dTTP enthält. Die DNA wird dann in einen E. coli-Stamm transformiert, der den Wildtyp trägt dut und udg Gene. Dabei wird der Uracil-haltige Eltern-DNA-Strang abgebaut, so dass fast die gesamte resultierende DNA aus dem mutierten Strang besteht.

Kassettenmutagenese Bearbeiten

Im Gegensatz zu anderen Verfahren muss die Kassettenmutagenese keine Primerverlängerung unter Verwendung von DNA-Polymerase beinhalten. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment synthetisiert und dann in ein Plasmid eingefügt. [14] Es beinhaltet die Spaltung durch ein Restriktionsenzym an einer Stelle im Plasmid und die anschließende Ligation eines Paares komplementärer Oligonukleotide, die die Mutation im interessierenden Gen enthalten, an das Plasmid. Üblicherweise sind die Restriktionsenzyme, die das Plasmid und das Oligonukleotid schneiden, die gleichen, was es den klebrigen Enden des Plasmids und des Inserts ermöglicht, miteinander zu ligieren. Dieses Verfahren kann Mutanten mit einer Effizienz von nahezu 100 % erzeugen, ist jedoch durch die Verfügbarkeit geeigneter Restriktionsstellen begrenzt, die die zu mutierende Stelle flankieren.

PCR ortsgerichtete Mutagenese Bearbeiten

Die Beschränkung der Restriktionsstellen bei der Kassettenmutagenese kann unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion mit Oligonukleotid-"Primern" überwunden werden, so dass ein größeres Fragment erzeugt werden kann, das zwei geeignete Restriktionsstellen abdeckt. Die exponentielle Amplifikation bei der PCR erzeugt ein Fragment, das die gewünschte Mutation in ausreichender Menge enthält, um durch Gelelektrophorese vom ursprünglichen, nicht mutierten Plasmid getrennt zu werden, das dann unter Verwendung von rekombinanten molekularbiologischen Standardtechniken in den ursprünglichen Kontext eingefügt werden kann. Es gibt viele Variationen derselben Technik. Das einfachste Verfahren platziert die Mutationsstelle an einem der Enden des Fragments, wobei eines von zwei Oligonukleotiden, die zur Erzeugung des Fragments verwendet werden, die Mutation enthält. Dies beinhaltet einen einzigen PCR-Schritt, hat aber immer noch das inhärente Problem, dass eine geeignete Restriktionsstelle in der Nähe der Mutationsstelle benötigt wird, es sei denn, ein sehr langer Primer wird verwendet. Andere Variationen verwenden daher drei oder vier Oligonukleotide, von denen zwei nicht mutagene Oligonukleotide sein können, die zwei geeignete Restriktionsstellen abdecken und ein Fragment erzeugen, das verdaut und in ein Plasmid ligiert werden kann, während das mutagene Oligonukleotid zu einer Stelle komplementär sein kann innerhalb dieses Fragments weit von jeder geeigneten Restriktionsstelle entfernt. Diese Verfahren erfordern mehrere PCR-Schritte, damit das letzte zu ligierende Fragment die gewünschte Mutation enthalten kann. Der Entwurfsprozess zur Erzeugung eines Fragments mit der gewünschten Mutation und relevanten Restriktionsstellen kann mühsam sein. Softwaretools wie SDM-Assist [15] können den Prozess vereinfachen.

Gesamtplasmid-Mutagenese Bearbeiten

Für Plasmidmanipulationen wurden andere ortsgerichtete Mutagenesetechniken weitgehend durch Techniken ersetzt, die hocheffizient, aber relativ einfach, leicht zu verwenden und im Handel als Kit erhältlich sind. Ein Beispiel für diese Techniken ist die Quikchange-Methode [16], bei der ein Paar komplementärer mutagener Primer verwendet wird, um das gesamte Plasmid in einer Thermocycling-Reaktion unter Verwendung einer nicht-strangverdrängenden High-Fidelity-DNA-Polymerase wie z pfu Polymerase. Die Reaktion erzeugt eine gekerbte, zirkuläre DNA. Die Matrizen-DNA muss durch enzymatischen Verdau mit einem Restriktionsenzym wie z DpnI, das spezifisch für methylierte DNA ist. Alle DNA aus den meisten hergestellt Escherichia coli Stämme würden das Template-Plasmid methyliert, das in biosynthetisiert wird E coli wird daher verdaut, während das mutierte Plasmid, das erzeugt wird in vitro und daher unmethyliert ist, unverdaut bleiben würde. Man beachte, dass bei diesen Doppelstrang-Plasmid-Mutagenese-Verfahren, während die Thermocycling-Reaktion verwendet werden kann, die DNA nicht wie bei einer PCR exponentiell amplifiziert werden muss. Stattdessen ist die Amplifikation linear, und es ist daher ungenau, sie als PCR zu bezeichnen, da keine Kettenreaktion stattfindet.

Beachten Sie, dass pfu Polymerase kann bei höheren Extensionstemperaturen (≥70 °C) strangverdrängend werden, was zum Scheitern des Experiments führen kann, daher sollte die Extensionsreaktion bei der empfohlenen Temperatur von 68 °C durchgeführt werden. Bei einigen Anwendungen wurde beobachtet, dass dieses Verfahren zur Insertion mehrerer Kopien von Primern führt. [17] Eine Variation dieser Methode, SPRINP genannt, verhindert dieses Artefakt und wurde bei verschiedenen Arten der ortsgerichteten Mutagenese verwendet. [17]

Andere Techniken wie die Scanning-Mutagenese von Oligo-gerichteten Zielen (SMOOT) können halbzufällig mutagene Oligonukleotide bei der Plasmid-Mutagenese kombinieren. [18] Diese Technik kann Plasmid-Mutagenese-Bibliotheken erstellen, die von einzelnen Mutationen bis hin zu umfassender Codon-Mutagenese über ein ganzes Gen reichen.

In vivo ortsgerichtete Mutagenesemethoden Bearbeiten

  • Delitto perfetto[19]
  • Transplacement "Pop-In-Pop-Out"
  • Direkte Gendeletion und ortsspezifische Mutagenese mit PCR und einem recycelbaren Marker
  • Direkte Gendeletion und ortsspezifische Mutagenese mit PCR und einem recycelbaren Marker unter Verwendung langer homologe Regionen
  • In vivo ortsgerichtete Mutagenese mit synthetischen Oligonukleotiden [20]

CRISPR Bearbeiten

Seit 2013 ermöglicht die Entwicklung der CRISPR-Cas9-Technologie die effiziente Einführung verschiedener Mutationen in das Genom einer Vielzahl von Organismen. Das Verfahren erfordert keine Transposon-Insertionsstelle, hinterlässt keinen Marker und seine Effizienz und Einfachheit hat es zum bevorzugten Verfahren für die Genom-Editierung gemacht. [21] [22]

Ortsgerichtete Mutagenese wird verwendet, um Mutationen zu erzeugen, die ein rational entworfenes Protein mit verbesserten oder speziellen Eigenschaften (d. h. Protein-Engineering) produzieren können.

Ermittlungstools – spezifische Mutationen in der DNA erlauben eine rationale Untersuchung der Funktion und Eigenschaften einer DNA-Sequenz oder eines Proteins. Darüber hinaus können einzelne Aminosäureveränderungen durch ortsgerichtete Mutagenese in Proteinen helfen, die Bedeutung posttranslationaler Modifikationen zu verstehen. Beispielsweise blockiert die Umwandlung eines bestimmten Serins (Phosphoakzeptor) in ein Alanin (Phospho-Nicht-Akzeptor) in einem Substratprotein die Anlagerung einer Phosphatgruppe, wodurch die Phosphorylierung untersucht werden kann. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Phosphorylierung des Proteins CBP durch die Kinase HIPK2 aufzudecken. [24]

Kommerzielle Anwendungen – Proteine ​​können so konstruiert werden, dass sie mutierte Formen erzeugen, die auf eine bestimmte Anwendung zugeschnitten sind. Üblicherweise verwendete Waschmittel können beispielsweise Subtilisin enthalten, dessen Wildtyp-Form ein Methionin enthält, das durch Bleichmittel oxidiert werden kann, wodurch die Aktivität des Proteins in diesem Prozess erheblich reduziert wird. [25] Dieses Methionin kann durch Alanin oder andere Reste ersetzt werden, wodurch es oxidationsbeständig wird und das Protein in Gegenwart von Bleichmitteln aktiv bleibt. [26]

Da die Kosten für die Synthese von DNA-Oligonukleotiden sinken, ist die künstliche Synthese eines vollständigen Gens jetzt ein praktikables Verfahren zur Einführung von Mutationen in das Gen. Dieses Verfahren ermöglicht eine umfassende Mutagenese über mehrere Stellen hinweg, einschließlich der vollständigen Neugestaltung der Codon-Nutzung des Gens, um es für einen bestimmten Organismus zu optimieren. [27]


Inhalt

Rationales Design Bearbeiten

Beim rationalen Proteindesign nutzt ein Wissenschaftler detaillierte Kenntnisse über die Struktur und Funktion eines Proteins, um gewünschte Veränderungen vorzunehmen. Dies hat im Allgemeinen den Vorteil, kostengünstig und technisch einfach zu sein, da ortsgerichtete Mutageneseverfahren gut entwickelt sind. Ihr größter Nachteil besteht jedoch darin, dass häufig keine detaillierten strukturellen Kenntnisse eines Proteins verfügbar sind, und selbst wenn vorhanden, kann es sehr schwierig sein, die Auswirkungen verschiedener Mutationen vorherzusagen, da Strukturinformationen meistens ein statisches Bild einer Proteinstruktur liefern. Programme wie [email protected] und Foldit nutzen jedoch Crowdsourcing-Techniken, um Einblicke in die Faltungsmotive von Proteinen zu gewinnen. [2]

Computergestützte Proteindesignalgorithmen zielen darauf ab, neue Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die energiearm sind, wenn sie an die vordefinierte Zielstruktur gefaltet werden. Obwohl der zu durchsuchende Sequenz-Konformationsraum groß ist, ist die größte Herausforderung für das computergestützte Proteindesign eine schnelle, aber genaue Energiefunktion, die optimale Sequenzen von ähnlichen suboptimalen unterscheiden kann.

Ausrichtung mehrerer Sequenzen Bearbeiten

Ohne strukturelle Informationen über ein Protein ist die Sequenzanalyse oft nützlich, um Informationen über das Protein aufzuklären. Diese Techniken beinhalten das Alignment von Zielproteinsequenzen mit anderen verwandten Proteinsequenzen. Dieses Alignment kann zeigen, welche Aminosäuren zwischen Spezies konserviert sind und für die Funktion des Proteins wichtig sind. Diese Analysen können helfen, Hotspot-Aminosäuren zu identifizieren, die als Zielstellen für Mutationen dienen können. Das multiple Sequenz-Alignment verwendet Datenbanken wie PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE und BALIBASE, um Zielproteinsequenzen mit bekannten Sequenzen zu kreuzen. Mehrere Sequenz-Alignment-Techniken sind unten aufgeführt. [3] [ Seite benötigt ]

Dieses Verfahren beginnt mit der paarweisen Ausrichtung von Sequenzen unter Verwendung von k-Tupel- oder Needleman-Wunsch-Verfahren. Diese Verfahren berechnen eine Matrix, die die paarweise Ähnlichkeit zwischen den Sequenzpaaren darstellt. Ähnlichkeitsbewertungen werden dann in Entfernungsbewertungen umgewandelt, die verwendet werden, um einen Leitbaum unter Verwendung des Nachbarverbindungsverfahrens zu erzeugen. Dieser Leitbaum wird dann verwendet, um ein multiples Sequenz-Alignment zu erhalten. [3] [ Seite benötigt ]

Clustal Omega Bearbeiten

Dieses Verfahren ist in der Lage, bis zu 190.000 Sequenzen unter Verwendung des k-Tupel-Verfahrens auszurichten. Die nächsten Sequenzen werden mit dem mBed geclustert und k-bedeutet Methoden. Ein Leitbaum wird dann unter Verwendung des UPGMA-Verfahrens konstruiert, das vom HH-Ausrichtungspaket verwendet wird. Dieser Führungsbaum wird verwendet, um mehrere Sequenz-Alignments zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

MAFFT Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet eine schnelle Fourier-Transformation (FFT), die Aminosäuresequenzen in eine Sequenz umwandelt, die aus Volumen- und Polaritätswerten für jeden Aminosäurerest besteht. Diese neue Sequenz wird verwendet, um homologe Regionen zu finden. [3] [ Seite benötigt ]

K-Ausrichtung Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet den angenäherten String-Matching-Algorithmus von Wu-Manber, um mehrere Sequenz-Alignments zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

Mehrfachsequenzvergleich durch Log-Erwartung (MUSCLE) Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet Kmer- und Kimura-Abstände, um mehrere Sequenz-Alignments zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

T-Kaffee Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet baumbasierte Konsistenzzielfunktionen für die Ausrichtungsentwicklung. Es hat sich gezeigt, dass diese Methode 5-10% genauer ist als Clustal W. [3] [ Seite benötigt ]

Koevolutionäre Analyse Bearbeiten

Die koevolutionäre Analyse wird auch als korrelierte Mutation, Kovariation oder Kosubstitution bezeichnet. Diese Art von rationalem Design beinhaltet wechselseitige evolutionäre Veränderungen an evolutionär interagierenden Loci. Im Allgemeinen beginnt dieses Verfahren mit der Erzeugung eines kuratierten multiplen Sequenz-Alignments für die Zielsequenz. Dieses Alignment wird dann einer manuellen Verfeinerung unterzogen, die das Entfernen von Sequenzen mit hohen Lücken sowie von Sequenzen mit geringer Sequenzidentität beinhaltet. Dieser Schritt erhöht die Qualität der Ausrichtung. Als nächstes wird das manuell verarbeitete Alignment für weitere koevolutionäre Messungen unter Verwendung verschiedener korrelierter Mutationsalgorithmen verwendet. Diese Algorithmen führen zu einer Koevolutionsbewertungsmatrix. Diese Matrix wird durch Anwenden verschiedener Signifikanztests gefiltert, um signifikante Koevolutionswerte zu extrahieren und Hintergrundrauschen auszulöschen. Koevolutionäre Messungen werden weiter ausgewertet, um ihre Leistung und Stringenz zu beurteilen. Schließlich werden die Ergebnisse dieser koevolutionären Analyse experimentell validiert. [3] [ Seite benötigt ]

Strukturvorhersage Bearbeiten

De novo Die Proteinsynthese profitiert von der Kenntnis vorhandener Proteinstrukturen. Diese Kenntnis der bestehenden Proteinstruktur hilft bei der Vorhersage neuer Proteinstrukturen. Methoden zur Vorhersage der Proteinstruktur fallen in eine der vier folgenden Klassen: von Anfang an, fragmentbasierte Methoden, Homologiemodellierung und Protein-Threading. [3] [ Seite benötigt ]

Von Anfang an Bearbeiten

Diese Methoden beinhalten eine freie Modellierung, ohne strukturelle Informationen über die Vorlage zu verwenden. Von Anfang an Methoden zielen darauf ab, die nativen Strukturen von Proteinen entsprechend dem globalen Minimum seiner freien Energie vorherzusagen. einige Beispiele für von Anfang an Methoden sind AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS und ENCEPP12. Allgemeine Schritte für von Anfang an Methoden beginnen mit der geometrischen Darstellung des interessierenden Proteins. Als nächstes wird ein potentielles Energiefunktionsmodell für das Protein entwickelt. Dieses Modell kann entweder unter Verwendung von molekularmechanischen Potentialen oder von der Proteinstruktur abgeleiteten Potentialfunktionen erstellt werden. Nach der Entwicklung eines Potenzialmodells werden Energiesuchtechniken einschließlich molekulardynamischer Simulationen, Monte-Carlo-Simulationen und genetischer Algorithmen auf das Protein angewendet. [3] [ Seite benötigt ]

Fragmentbasiertes Bearbeiten

Diese Verfahren verwenden Datenbankinformationen bezüglich Strukturen, um homologe Strukturen mit den erzeugten Proteinsequenzen abzugleichen. Diese homologen Strukturen werden unter Verwendung von Bewertungs- und Optimierungsverfahren zu kompakten Strukturen zusammengesetzt, mit dem Ziel, die niedrigste potenzielle Energiebewertung zu erreichen. Webserver für Fragmentinformationen sind I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM und ANGLOR. [3] : 72

Homologiemodellierung Bearbeiten

Diese Verfahren basieren auf der Homologie von Proteinen. Diese Methoden werden auch als vergleichende Modellierung bezeichnet. Der erste Schritt bei der Homologiemodellierung ist im Allgemeinen die Identifizierung von Matrizensequenzen bekannter Struktur, die zu der Abfragesequenz homolog sind. Als nächstes wird die Abfragesequenz an der Vorlagensequenz ausgerichtet. Nach dem Alignment werden die strukturell konservierten Regionen unter Verwendung der Template-Struktur modelliert. Darauf folgt die Modellierung von Seitenketten und Schleifen, die sich von der Vorlage unterscheiden. Schließlich wird die modellierte Struktur einer Verfeinerung und Qualitätsbewertung unterzogen. Server, die für Homologiemodellierungsdaten verfügbar sind, sind hier aufgelistet: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA und I-TASSER. [3] [ Seite benötigt ]

Protein-Threading Bearbeiten

Protein-Threading kann verwendet werden, wenn kein zuverlässiges Homolog für die Abfragesequenz gefunden werden kann. Diese Methode beginnt mit dem Abrufen einer Abfragesequenz und einer Bibliothek von Vorlagenstrukturen. Als nächstes wird die Abfragesequenz über bekannte Vorlagenstrukturen gefädelt. Diese Kandidatenmodelle werden unter Verwendung von Bewertungsfunktionen bewertet. Diese werden basierend auf potentiellen Energiemodellen sowohl der Abfrage- als auch der Vorlagensequenz bewertet. Die Übereinstimmung mit dem Modell mit der niedrigsten potentiellen Energie wird dann ausgewählt. Methoden und Server zum Abrufen von Threading-Daten und zum Durchführen von Berechnungen sind hier aufgeführt: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP-Server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPREDITS ., LI , RAPTOR, COTH, MUSTER. [3] [ Seite benötigt ]

Weitere Informationen zum rationalen Design finden Sie unter ortsgerichtete Mutagenese.

Gezielte Evolution Bearbeiten

In der gerichteten Evolution wird zufällige Mutagenese, z.B. B. durch fehleranfällige PCR oder Sequenzsättigungsmutagenese, auf ein Protein angewendet, und ein Selektionsregime wird verwendet, um Varianten mit gewünschten Merkmalen zu selektieren. Weitere Mutations- und Selektionsrunden werden dann angewendet. Diese Methode ahmt die natürliche Evolution nach und liefert im Allgemeinen bessere Ergebnisse als rationales Design. Ein zusätzlicher Prozess, der als DNA-Shuffling bezeichnet wird, mischt und vergleicht Teile erfolgreicher Varianten, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Solche Prozesse ahmen die Rekombination nach, die während der sexuellen Fortpflanzung natürlich auftritt. Der Vorteil der gerichteten Evolution besteht darin, dass weder strukturelle Vorkenntnisse eines Proteins erforderlich sind, noch vorhergesagt werden muss, welche Auswirkungen eine bestimmte Mutation haben wird. Tatsächlich sind die Ergebnisse von Experimenten zur gerichteten Evolution oft insofern überraschend, als erwünschte Veränderungen oft durch Mutationen verursacht werden, von denen erwartet wurde, dass sie keine Wirkung haben. Der Nachteil besteht darin, dass sie ein Hochdurchsatz-Screening erfordern, das nicht für alle Proteine ​​durchführbar ist. Große Mengen rekombinanter DNA müssen mutiert und die Produkte auf gewünschte Merkmale gescreent werden. Die große Variantenvielfalt erfordert oft eine teure Roboterausrüstung, um den Prozess zu automatisieren. Darüber hinaus können nicht alle gewünschten Aktivitäten einfach überprüft werden.

Die natürliche Darwinsche Evolution kann im Labor effektiv nachgeahmt werden, um Proteineigenschaften für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Katalyse, zuzuschneiden. Es gibt viele experimentelle Technologien, um große und vielfältige Proteinbibliotheken herzustellen und um gefaltete, funktionelle Varianten zu screenen oder auszuwählen. Gefaltete Proteine ​​treten überraschend häufig im Zufallssequenzraum auf, ein Vorkommen, das bei der Entwicklung selektiver Binder und Katalysatoren ausgenutzt werden kann. Obwohl sie konservativer als die direkte Selektion aus dem tiefen Sequenzraum ist, ist die Neugestaltung bestehender Proteine ​​durch zufällige Mutagenese und Selektion/Screening eine besonders robuste Methode zur Optimierung oder Veränderung vorhandener Eigenschaften. Es stellt auch einen hervorragenden Ausgangspunkt dar, um ehrgeizigere Engineering-Ziele zu erreichen. Die Verbindung experimenteller Evolution mit modernen Computermethoden ist wahrscheinlich die umfassendste und fruchtbarste Strategie zur Erzeugung funktioneller Makromoleküle, die der Natur unbekannt sind. [4]

Die Hauptherausforderungen beim Design hochwertiger Mutantenbibliotheken haben in der jüngsten Vergangenheit erhebliche Fortschritte gezeigt. Dieser Fortschritt erfolgte in Form besserer Beschreibungen der Auswirkungen von Mutationsladungen auf Proteinmerkmale. Auch computergestützte Ansätze haben große Fortschritte im unzählig großen Sequenzraum zu handhabbareren Screening-Größen gezeigt und so intelligente Mutantenbibliotheken geschaffen. Die Bibliotheksgröße wurde auch durch die Identifizierung von nützlichen Schlüsselresten unter Verwendung von Algorithmen für die systematische Rekombination auf besser durchsuchbare Größen reduziert. Schließlich wurde mit der Entwicklung genauerer statistischer Modelle und Algorithmen zur Quantifizierung und Vorhersage gekoppelter Mutationseffekte auf Proteinfunktionen ein bedeutender Schritt vorwärts in Richtung eines effizienten Reengineerings von Enzymen gemacht. [5]

Im Allgemeinen kann die gerichtete Evolution als ein iterativer zweistufiger Prozess zusammengefasst werden, der die Erzeugung von Proteinmutantenbibliotheken und Hochdurchsatz-Screening-Prozesse umfasst, um nach Varianten mit verbesserten Merkmalen zu selektieren. Diese Technik erfordert keine Vorkenntnisse über die Proteinstruktur und die Funktionsbeziehung. Die gerichtete Evolution verwendet zufällige oder fokussierte Mutagenese, um Bibliotheken mutierter Proteine ​​zu erzeugen. Zufällige Mutationen können entweder durch fehleranfällige PCR oder durch Ortssättigungsmutagenese eingeführt werden. Mutanten können auch unter Verwendung der Rekombination mehrerer homologer Gene erzeugt werden. Die Natur hat eine begrenzte Anzahl von nützlichen Sequenzen entwickelt. Die gerichtete Evolution ermöglicht es, unentdeckte Proteinsequenzen mit neuartigen Funktionen zu identifizieren. Diese Fähigkeit hängt von der Fähigkeit des Proteins ab, Substitutionen von Aminosäureresten zu tolerieren, ohne die Faltung oder Stabilität zu beeinträchtigen. [3] [ Seite benötigt ]

Methoden der gerichteten Evolution können grob in zwei Strategien eingeteilt werden, asexuelle und sexuelle Methoden.

Asexuelle Methoden Bearbeiten

Asexuelle Methoden erzeugen keine Querverbindungen zwischen elterlichen Genen. Einzelne Gene werden verwendet, um Mutantenbibliotheken unter Verwendung verschiedener mutagener Techniken zu erstellen. Diese asexuellen Methoden können entweder eine zufällige oder eine fokussierte Mutagenese erzeugen.

Zufällige Mutagenese Bearbeiten

Zufällige mutagene Verfahren erzeugen zufällige Mutationen im gesamten interessierenden Gen. Zufällige Mutagenese kann die folgenden Arten von Mutationen einführen: Transitionen, Transversionen, Insertionen, Deletionen, Inversion, Missense und Nonsense. Beispiele für Verfahren zur Herstellung von Zufallsmutagenese sind unten.

Fehleranfällige PCR Bearbeiten

Die fehleranfällige PCR nutzt die Tatsache, dass der Taq-DNA-Polymerase die 3'- bis 5'-Exonuklease-Aktivität fehlt. Dies führt zu einer Fehlerrate von 0,001-0,002 % pro Nukleotid pro Replikation. Diese Methode beginnt mit der Auswahl des Gens oder des Bereichs innerhalb eines Gens, das mutiert werden soll. Als nächstes wird das erforderliche Fehlerausmaß basierend auf der Art und dem Ausmaß der Aktivität berechnet, die man erzeugen möchte. Dieses Fehlerausmaß bestimmt die anzuwendende fehleranfällige PCR-Strategie. Nach der PCR werden die Gene in ein Plasmid kloniert und in kompetente Zellsysteme eingeführt. Diese Zellen werden dann auf gewünschte Merkmale gescreent. Plasmide werden dann für Kolonien isoliert, die verbesserte Merkmale aufweisen, und werden dann als Matrizen in der nächsten Mutageneserunde verwendet. Die fehleranfällige PCR zeigt Verzerrungen für bestimmte Mutationen im Vergleich zu anderen. Wie zum Beispiel Verzerrungen für Übergänge über Transversionen. [3] [ Seite benötigt ]

Die Fehlerraten bei der PCR können auf folgende Weise erhöht werden: [3] [ Seite benötigt ]

  1. Erhöhen Sie die Konzentration von Magnesiumchlorid, das die nicht komplementäre Basenpaarung stabilisiert.
  2. Fügen Sie Manganchlorid hinzu, um die Basenpaarspezifität zu reduzieren.
  3. Erhöhte und unausgewogene Zugabe von dNTPs.
  4. Zugabe von Basenanaloga wie dITP, 8 oxo-dGTP und dPTP.
  5. Erhöhen Sie die Konzentration der Taq-Polymerase.
  6. Verlängerungszeit verlängern.
  7. Zykluszeit erhöhen.
  8. Verwenden Sie weniger genaue Taq-Polymerase.

Siehe auch Polymerase-Kettenreaktion für weitere Informationen.

Rolling Circle fehleranfällige PCR Bearbeiten

Diese PCR-Methode basiert auf der Rolling-Circle-Amplifikation, die der Methode nachempfunden ist, die Bakterien verwenden, um zirkuläre DNA zu amplifizieren. Dieses Verfahren führt zu linearen DNA-Duplexen. Diese Fragmente enthalten Tandem-Wiederholungen zirkulärer DNA, die als Konkatamere bezeichnet werden und in Bakterienstämme umgewandelt werden können. Mutationen werden eingeführt, indem zuerst die Zielsequenz in ein geeignetes Plasmid kloniert wird. Als nächstes beginnt der Amplifikationsprozess unter Verwendung von Zufalls-Hexamer-Primern und 29-DNA-Polymerase unter fehleranfälligen Rolling-Circle-Amplifikationsbedingungen. Zusätzliche Bedingungen zur Erzeugung einer fehleranfälligen Rolling-Circle-Amplifikation sind 1,5 pM Matrizen-DNA, 1,5 mM MnCl&sub2;2 und eine Reaktionszeit von 24 Stunden. MnCl2 wird in die Reaktionsmischung gegeben, um zufällige Punktmutationen in den DNA-Strängen zu fördern. Mutationsraten können durch Erhöhung der MnCl .-Konzentration erhöht werden2, oder durch Verringern der Konzentration der Matrizen-DNA. Die fehleranfällige Rolling-Circle-Amplifikation ist im Vergleich zur fehleranfälligen PCR aufgrund ihrer Verwendung von universellen Zufalls-Hexamer-Primern anstelle von spezifischen Primern vorteilhaft.Auch die Reaktionsprodukte dieser Amplifikation müssen nicht mit Ligasen oder Endonukleasen behandelt werden. Diese Reaktion ist isotherm. [3] [ Seite benötigt ]

Chemische Mutagenese Bearbeiten

Chemische Mutagenese beinhaltet die Verwendung chemischer Mittel, um Mutationen in genetische Sequenzen einzuführen. Beispiele für chemische Mutagene folgen.

Natriumbisulfat ist wirksam bei der Mutation von G/C-reichen Genomsequenzen. Dies liegt daran, dass Natriumbisulfat die Desaminierung von unmethyliertem Cytosin zu Uracil katalysiert. [3] [ Seite benötigt ]

Ethylmethansulfonat alkyliert Guanidinreste. Diese Änderung verursacht Fehler bei der DNA-Replikation. [3] [ Seite benötigt ]

Salpetrige Säure bewirkt eine Transversion durch Desaminierung von Adenin und Cytosin. [3] [ Seite benötigt ]

Der duale Ansatz zur zufälligen chemischen Mutagenese ist ein iterativer zweistufiger Prozess. Zuerst geht es um die in vivo chemische Mutagenese des interessierenden Gens über EMS. Als nächstes wird das behandelte Gen isoliert und in einen unbehandelten Expressionsvektor kloniert, um Mutationen im Plasmidrückgrat zu verhindern. [3] [ Seite benötigt ] Diese Technik bewahrt die genetischen Eigenschaften des Plasmids. [3] [ Seite benötigt ]

Targeting von Glykosylasen auf eingebettete Arrays für die Mutagenese (TaGTEAM) Bearbeiten

Diese Methode wurde verwendet, um gezielte in vivo Mutagenese in Hefe. Dieses Verfahren beinhaltet die Fusion einer 3-Methyladenin-DNA-Glycosylase an die tetR-DNA-Bindungsdomäne. Es hat sich gezeigt, dass dies die Mutationsraten in Regionen des Genoms, die tetO-Stellen enthalten, um das 800-fache erhöht. [3] [ Seite benötigt ]

Mutagenese durch zufällige Insertion und Deletion Bearbeiten

Dieses Verfahren beinhaltet eine Längenänderung der Sequenz durch gleichzeitige Deletion und Insertion von Basenstücken beliebiger Länge. Es hat sich gezeigt, dass dieses Verfahren Proteine ​​mit neuen Funktionalitäten durch Einführung neuer Restriktionsschnittstellen, spezifischer Codons und vier Basencodons für nicht-natürliche Aminosäuren produziert. [3] [ Seite benötigt ]

Transposon-basierte Zufallsmutagenese Bearbeiten

Kürzlich wurde über viele Verfahren zur auf Transposonen basierenden Zufallsmutagenese berichtet. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: PERMUTE – zufällige zirkuläre Permutation, zufällige Proteinverkürzung, zufällige Nukleotidtriplett-Substitution, zufällige Domäne/Tag/mehrere Aminosäureinsertion, Codon-Scanning-Mutagenese und Multicodon-Scanning-Mutagenese. Diese oben genannten Techniken erfordern alle das Design von Mini-Mu-Transposons. Thermo Scientific stellt Kits für das Design dieser Transposons her. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige Mutagenesemethoden, die die Länge der Ziel-DNA verändern Bearbeiten

Diese Verfahren beinhalten die Veränderung der Genlänge durch Insertions- und Deletionsmutationen. Ein Beispiel ist das Tandem Repeat Insertion (TRINS)-Verfahren. Diese Technik führt zur Erzeugung von Tandem-Wiederholungen zufälliger Fragmente des Zielgens durch Rolling-Circle-Amplifikation und gleichzeitigen Einbau dieser Wiederholungen in das Zielgen. [3] [ Seite benötigt ]

Mutator-Stämme Bearbeiten

Mutatorstämme sind bakterielle Zelllinien, denen ein oder mehrere DNA-Reparaturmechanismen fehlen. Ein Beispiel für einen Mutatorstrang ist E. coli XL1-RED. [3] [ Seite benötigt ] Dieser untergeordnete Stamm von E. coli ist in den MutS-, MutD-, MutT-DNA-Reparaturwegen defizient. Die Verwendung von Mutatorstämmen ist bei der Einführung vieler Mutationstypen nützlich, jedoch zeigen diese Stämme aufgrund der Anhäufung von Mutationen im eigenen Genom der Stämme eine fortschreitende Kulturkrankheit. [3] [ Seite benötigt ]

Fokussierte Mutagenese Bearbeiten

Fokussierte mutagene Verfahren erzeugen Mutationen an vorbestimmten Aminosäureresten. Diese Techniken erfordern ein Verständnis der Sequenz-Funktions-Beziehung für das interessierende Protein. Das Verständnis dieser Beziehung ermöglicht die Identifizierung von Resten, die für Stabilität, Stereoselektivität und katalytische Effizienz wichtig sind. [3] [ Seite benötigt ] Beispiele für Methoden, die eine fokussierte Mutagenese erzeugen, sind unten aufgeführt.

Site-Sättigungsmutagenese Bearbeiten

Die Site-Sättigungsmutagenese ist eine auf PCR basierende Methode, die verwendet wird, um Aminosäuren mit signifikanten Rollen in der Proteinfunktion anzusteuern. Die zwei gebräuchlichsten Techniken, um dies durchzuführen, sind die Einzel-PCR des ganzen Plasmids und die Überlappungsverlängerungs-PCR.

Die Einzel-PCR des gesamten Plasmids wird auch als ortsgerichtete Mutagenese (SDM) bezeichnet. SDM-Produkte werden einem Dpn-Endonuklease-Verdau unterzogen. Dieser Verdau führt zur Spaltung nur des Elternstrangs, da der Elternstrang ein GmATC enthält, das an N6 von Adenin methyliert ist. SDM funktioniert nicht gut für große Plasmide von über zehn Kilobasen. Außerdem ist dieses Verfahren nur in der Lage, zwei Nukleotide gleichzeitig zu ersetzen. [3] [ Seite benötigt ]

Die Überlappungsverlängerungs-PCR erfordert die Verwendung von zwei Primerpaaren. Ein Primer in jedem Set enthält eine Mutation. Eine erste PCR-Runde unter Verwendung dieser Primersätze wird durchgeführt und zwei doppelsträngige DNA-Duplexe werden gebildet. Dann wird eine zweite PCR-Runde durchgeführt, in der diese Duplexe denaturiert und wieder mit den Primersets verbunden werden, um Heteroduplexe zu erzeugen, in denen jeder Strang eine Mutation aufweist. Alle Lücken in diesen neu gebildeten Heteroduplexen werden mit DNA-Polymerasen gefüllt und weiter amplifiziert. [3] [ Seite benötigt ]

Sequenzsättigungsmutagenese (SeSaM) Bearbeiten

Sequenzsättigungsmutagenese führt zur Randomisierung der Zielsequenz an jeder Nukleotidposition. Dieses Verfahren beginnt mit der Erzeugung von DNA-Fragmenten variabler Länge, die mit universellen Basen versehen sind, über die Verwendung von Template-Transferasen an den 3'-Termini. Als nächstes werden diese Fragmente unter Verwendung einer einzelsträngigen Matrize auf die volle Länge verlängert. Die universellen Basen werden durch eine zufällige Standardbase ersetzt, was Mutationen verursacht. Es gibt mehrere modifizierte Versionen dieser Methode wie SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+ und SeSAM-III. [3] [ Seite benötigt ]

Einzelprimerreaktionen parallel (SPRINP) Bearbeiten

Dieses Verfahren der Ortssättigungsmutagenese beinhaltet zwei separate PCR-Reaktionen. Die erste davon verwendet nur Vorwärtsprimer, während die zweite Reaktion nur Rückwärtsprimer verwendet. Dies vermeidet die Bildung einer Primer-Dimer-Bildung. [3] [ Seite benötigt ]

Mega-primerte und Ligase-freie fokussierte Mutagenese Bearbeiten

Diese mutagene Technik der Sättigungssättigung beginnt mit einem mutagenen Oligonukleotid und einem universellen flankierenden Primer. Diese beiden Reaktanten werden für einen anfänglichen PCR-Zyklus verwendet. Produkte aus diesem ersten PCR-Zyklus werden als Megaprimer für die nächste PCR verwendet. [3] [ Seite benötigt ]

Ω-PCR-Bearbeitung

Dieses mutagene Verfahren zur Ortssättigung basiert auf einer Überlappungsverlängerungs-PCR. Es wird verwendet, um Mutationen an einer beliebigen Stelle in einem zirkulären Plasmid einzuführen. [3] [ Seite benötigt ]

PFunkel-ominchange-OSCARR Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet eine benutzerdefinierte ortsgerichtete Mutagenese an einer oder mehreren Stellen gleichzeitig. OSCARR ist ein Akronym für einfache Eintopf-Methodik für Kassettenrandomisierung und Rekombination. Diese Randomisierung und Rekombination führt zur Randomisierung der gewünschten Fragmente eines Proteins. Omnichange ist eine sequenzunabhängige Multisite-Sättigungsmutagenese, die bis zu fünf unabhängige Codons auf einem Gen sättigen kann.

Trimer-Dimer-Mutagenese Bearbeiten

Dieses Verfahren entfernt redundante Codons und Stoppcodons.

Kassettenmutagenese Bearbeiten

Dies ist eine PCR-basierte Methode. Die Kassettenmutagenese beginnt mit der Synthese einer DNA-Kassette, die das interessierende Gen enthält, das auf beiden Seiten von Restriktionsstellen flankiert wird. Die Endonuklease, die diese Restriktionsstellen spaltet, spaltet auch Stellen im Zielplasmid. Die DNA-Kassette und das Zielplasmid werden beide mit Endonukleasen behandelt, um diese Restriktionsstellen zu spalten und klebrige Enden zu erzeugen. Als nächstes werden die Produkte dieser Spaltung miteinander ligiert, was zur Insertion des Gens in das Zielplasmid führt. Eine alternative Form der Kassettenmutagenese, die als kombinatorische Kassettenmutagenese bezeichnet wird, wird verwendet, um die Funktionen einzelner Aminosäurereste im interessierenden Protein zu identifizieren. Die rekursive Ensemble-Mutagenese verwendet dann Informationen aus der vorherigen kombinatorischen Kassetten-Mutagenese. Codon-Kassetten-Mutagenese ermöglicht es Ihnen, ein einzelnes Codon an einer bestimmten Stelle in doppelsträngiger DNA einzufügen oder zu ersetzen. [3] [ Seite benötigt ]

Sexuelle Methoden Bearbeiten

Sexuelle Methoden der gerichteten Evolution beinhalten in vitro Rekombination, die natürliche nachahmen in vivo Rekombination. Im Allgemeinen erfordern diese Techniken eine hohe Sequenzhomologie zwischen den Elternsequenzen. Diese Techniken werden oft verwendet, um zwei verschiedene Elterngene zu rekombinieren, und diese Methoden erzeugen Kreuzungen zwischen diesen Genen. [3] [ Seite benötigt ]

In vitro homologe Rekombination Bearbeiten

Homologe Rekombination kann als entweder kategorisiert werden in vivo oder in vitro. In vitro homologe Rekombination imitiert natürliche in vivo Rekombination. Diese in vitro Rekombinationsverfahren erfordern eine hohe Sequenzhomologie zwischen den Elternsequenzen. Diese Techniken nutzen die natürliche Diversität der Elterngene, indem sie sie rekombinieren, um chimäre Gene zu erhalten. Die resultierende Chimäre zeigt eine Mischung aus elterlichen Eigenschaften. [3] [ Seite benötigt ]

DNA-Shuffling Bearbeiten

Dies in vitro Technik war eine der ersten Techniken im Zeitalter der Rekombination. Es beginnt mit der Verdauung homologer Elterngene in kleine Fragmente durch DNase1. Diese kleinen Fragmente werden dann von unverdauten Elterngenen gereinigt. Gereinigte Fragmente werden dann unter Verwendung einer Primer-losen PCR wieder zusammengesetzt. Diese PCR beinhaltet homologe Fragmente von verschiedenen Elterngenen, die aufeinander primern, was zu chimärer DNA führt. Die chimäre DNA von Elterngröße wird dann unter Verwendung von endterminalen Primern in einer regulären PCR amplifiziert. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige Grundierung in vitro Rekombination (RPR) Bearbeiten

Dies in vitro Das homologe Rekombinationsverfahren beginnt mit der Synthese vieler kurzer Genfragmente, die Punktmutationen aufweisen, unter Verwendung von Zufallssequenz-Primern. Diese Fragmente werden unter Verwendung einer Primer-losen PCR zu Elterngenen voller Länge wieder zusammengesetzt. Diese reassemblierten Sequenzen werden dann mittels PCR amplifiziert und weiteren Selektionsprozessen unterzogen. Dieses Verfahren ist im Vergleich zum DNA-Shuffling vorteilhaft, da keine DNase 1 verwendet wird und somit keine Voreingenommenheit für die Rekombination neben einem Pyrimidinnukleotid besteht. Dieses Verfahren ist auch aufgrund seiner Verwendung von synthetischen Zufallsprimern vorteilhaft, die eine einheitliche Länge aufweisen und keine Verzerrungen aufweisen. Schließlich ist dieses Verfahren unabhängig von der Länge der DNA-Matrizensequenz und erfordert eine kleine Menge an Eltern-DNA. [3] [ Seite benötigt ]

Verkürzte metagenomische Gen-spezifische PCR Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt chimäre Gene direkt aus metagenomischen Proben. Es beginnt mit der Isolierung des gewünschten Gens durch funktionelles Screening aus einer metagenomischen DNA-Probe. Als nächstes werden spezifische Primer entworfen und verwendet, um die homologen Gene aus verschiedenen Umweltproben zu amplifizieren. Schließlich werden chimäre Bibliotheken erzeugt, um die gewünschten funktionellen Klone zu gewinnen, indem diese amplifizierten homologen Gene gemischt werden. [3] [ Seite benötigt ]

Gestaffelter Erweiterungsprozess (StEP) Bearbeiten

Dies in vitro Das Verfahren basiert auf dem Template-Switching, um chimäre Gene zu erzeugen. Dieses auf PCR basierende Verfahren beginnt mit einer anfänglichen Denaturierung der Matrize, gefolgt von einem Annealing der Primer und einer kurzen Verlängerungszeit. Alle nachfolgenden Zyklen erzeugen ein Annealing zwischen den kurzen Fragmenten, die in vorherigen Zyklen erzeugt wurden, und verschiedenen Teilen der Matrize. Diese kurzen Fragmente und die Matrizen lagern sich basierend auf der Sequenzkomplementarität zusammen. Dieser Prozess des Annealings von Fragmenten an Template-DNA ist als Template-Switching bekannt. Diese angelagerten Fragmente dienen dann als Primer für die weitere Verlängerung. Dieses Verfahren wird durchgeführt, bis die chimäre Gensequenz der parentalen Länge erhalten wird. Die Ausführung dieses Verfahrens erfordert nur flankierende Primer, um zu beginnen. Es ist auch kein Dnase1-Enzym erforderlich. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige Chimeragenese auf transienten Templaten (RACHITT) Bearbeiten

Es wurde gezeigt, dass dieses Verfahren chimäre Genbibliotheken mit durchschnittlich 14 Crossovers pro chimärem Gen erzeugt. Es beginnt mit dem Alignment von Fragmenten von einem elterlichen oberen Strang auf den unteren Strang einer Uracil enthaltenden Matrize eines homologen Gens. 5'- und 3'-Überhanglappen werden gespalten und Lücken werden durch die Exonuklease- und Endonuklease-Aktivitäten von Pfu- und taq-DNA-Polymerasen gefüllt. Die Uracil enthaltende Matrize wird dann durch Behandlung mit einer Uracil-DNA-Glcosylase aus dem Heteroduplex entfernt, gefolgt von einer weiteren Amplifikation unter Verwendung von PCR. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, da es Chimären mit relativ hoher Übergangsfrequenz erzeugt. Sie ist jedoch aufgrund der Komplexität und der Notwendigkeit der Erzeugung von einzelsträngiger DNA und Uracil, die einzelsträngige Matrizen-DNA enthalten, etwas eingeschränkt. [3] [ Seite benötigt ]

Synthetisches Mischen Bearbeiten

Das Mischen von synthetischen degenerierten Oligonukleotiden fügt den Mischverfahren Flexibilität hinzu, da Oligonukleotide mit optimalen Codons und nützlichen Mutationen eingeschlossen werden können. [3] [ Seite benötigt ]

In vivo Homologe Rekombination Bearbeiten

Die in Hefe durchgeführte Klonierung beinhaltet den PCR-abhängigen Wiederzusammenbau von fragmentierten Expressionsvektoren. Diese wieder zusammengesetzten Vektoren werden dann in Hefe eingeführt und kloniert. Die Verwendung von Hefe zur Klonierung des Vektors vermeidet Toxizität und Gegenselektion, die durch Ligation und Vermehrung in E. coli eingeführt würde. [3] [ Seite benötigt ]

Mutagenes organisiertes Rekombinationsverfahren durch homologe in vivo Gruppierung (MORPHIEREN) Bearbeiten

Dieses Verfahren führt Mutationen in spezifische Regionen von Genen ein, während andere Teile intakt bleiben, indem die hohe Häufigkeit der homologen Rekombination in Hefe genutzt wird. [3] [ Seite benötigt ]

Phagen-unterstützte kontinuierliche Evolution (PACE) Bearbeiten

Dieses Verfahren verwendet einen Bakteriophagen mit einem modifizierten Lebenszyklus, um sich entwickelnde Gene von Wirt zu Wirt zu übertragen. Der Lebenszyklus des Phagen ist so gestaltet, dass der Transfer mit der interessierenden Aktivität des Enzyms korreliert. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, da es für die kontinuierliche Evolution des Gens nur minimale menschliche Eingriffe erfordert. [3]

In vitro nicht-homologe Rekombinationsmethoden Bearbeiten

Diese Verfahren basieren auf der Tatsache, dass Proteine ​​eine ähnliche strukturelle Identität aufweisen können, während ihnen eine Sequenzhomologie fehlt.

Exon schlurfen Bearbeiten

Exon-Shuffling ist die Kombination von Exons verschiedener Proteine ​​durch Rekombinationsereignisse, die an Introns auftreten. Beim orthologen Exon-Shuffling werden Exons aus orthologen Genen verschiedener Spezies kombiniert. Beim orthologen Domänen-Shuffling werden ganze Proteindomänen aus orthologen Genen verschiedener Spezies gemischt. Beim paralogen Exon-Shuffling werden Exons aus verschiedenen Genen derselben Spezies gemischt. Beim paralogen Domänen-Shuffling werden ganze Proteindomänen von paralogen Proteinen derselben Spezies gemischt. Funktionelles Homolog-Shuffling beinhaltet das Shuffling von nicht-homologen Domänen, die funktionell verwandt sind. Alle diese Prozesse erfolgen mit der Amplifikation der gewünschten Exons aus verschiedenen Genen unter Verwendung chimärer synthetischer Oligonukleotide. Diese Amplifikationsprodukte werden dann unter Verwendung einer Primer-losen PCR wieder zu Genen voller Länge zusammengesetzt. Während dieser PCR-Zyklen fungieren die Fragmente als Matrizen und Primer. Dies führt zu chimären Genen voller Länge, die dann einem Screening unterzogen werden. [3] [ Seite benötigt ]

Inkrementelle Verkürzung zur Erzeugung von Hybridenzymen (ITCHY) Bearbeiten

Fragmente von Elterngenen werden durch kontrollierte Verdauung durch Exonuklease III erzeugt. Diese Fragmente werden unter Verwendung von Endonuklease abgestumpft und werden ligiert, um Hybridgene zu erzeugen. THIOITCHY ist eine modifizierte ITCHY-Technik, die Nukleotidtriphosphat-Analoga wie &agr;-Phosphothioat-dNTPs verwendet. Der Einbau dieser Nukleotide blockiert die Verdauung durch Exonuklease III. Diese Hemmung der Verdauung durch Exonuklease III wird als Spiking bezeichnet. Spiking kann erreicht werden, indem zuerst Gene mit Exonuklease verkürzt werden, um Fragmente mit kurzen einzelsträngigen Überhängen zu erzeugen. Diese Fragmente dienen dann als Matrizen für die Amplifikation durch DNA-Polymerase in Gegenwart kleiner Mengen von Phosphothioat-dNTPs. Diese resultierenden Fragmente werden dann zusammenligiert, um Gene voller Länge zu bilden. Alternativ können die intakten Elterngene durch PCR in Gegenwart von normalen dNTPs und Phosphothioat-dNTPs amplifiziert werden. Diese Amplifikationsprodukte voller Länge werden dann einem Verdau durch eine Exonuklease unterzogen. Die Verdauung wird fortgesetzt, bis die Exonuklease auf ein α-pdNTP trifft, was zu Fragmenten unterschiedlicher Länge führt. Diese Fragmente werden dann zusammenligiert, um chimäre Gene zu erzeugen. [3] [ Seite benötigt ]

SCRATCHY Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt Bibliotheken von Hybridgenen, die multiples Crossover hemmen, indem DNA-Shuffling und ITCHY kombiniert werden. Diese Methode beginnt mit der Konstruktion zweier unabhängiger ITCHY-Bibliotheken. Die erste mit Gen A am N-Terminus. Und das andere mit Gen B am N-Terminus. Diese Hybridgenfragmente werden entweder unter Verwendung von Restriktionsenzymverdau oder PCR mit Terminusprimern über Agarosegelelektrophorese getrennt. Diese isolierten Fragmente werden dann zusammengemischt und unter Verwendung von DNase1 weiter verdaut. Verdaute Fragmente werden dann durch Primerlose PCR mit Template-Switching wieder zusammengesetzt. [3] [ Seite benötigt ]

Rekombinierte Erweiterung auf abgeschnittenen Vorlagen (RETT) Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt Bibliotheken von Hybridgenen durch Matrizenwechsel von unidirektional wachsenden Polynukleotiden in Gegenwart von einzelsträngigen DNA-Fragmenten als Matrizen für Chimären. Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung von einzelsträngigen DNA-Fragmenten durch reverse Transkription von Ziel-mRNA. Genspezifische Primer werden dann an die einzelsträngige DNA angelagert. Diese Gene werden dann während eines PCR-Zyklus verlängert. Auf diesen Zyklus folgt ein Template-Switching und ein Annealing der kurzen Fragmente, die aus der früheren Primer-Extension erhalten wurden, an andere einzelsträngige DNA-Fragmente. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis einzelsträngige DNA voller Länge erhalten wird. [3] [ Seite benötigt ]

Sequenzhomologie-unabhängige Proteinrekombination (SHIPREC) Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt eine Rekombination zwischen Genen mit geringer bis keiner Sequenzhomologie. Diese Chimären werden über eine Linkersequenz fusioniert, die mehrere Restriktionsstellen enthält. Dieses Konstrukt wird dann unter Verwendung von DNase1 verdaut. Die Fragmente werden unter Verwendung von S1-Nuklease stumpfendig gemacht. Diese Fragmente mit glatten Enden werden durch Ligation zu einer zirkulären Sequenz zusammengefügt. Dieses zirkuläre Konstrukt wird dann unter Verwendung von Restriktionsenzymen linearisiert, für die die Restriktionsschnittstellen in der Linkerregion vorhanden sind. Dies führt zu einer Bibliothek chimärer Gene, in der der Beitrag der Gene zum 5'- und 3'-Ende im Vergleich zum Ausgangskonstrukt umgekehrt wird. [3] [ Seite benötigt ]

Sequenzunabhängige ortsgerichtete Chimeragenese (SISDC) Bearbeiten

Dieses Verfahren führt zu einer Genbibliothek mit mehreren Kreuzungen von mehreren Elterngenen. Dieses Verfahren erfordert keine Sequenzidentität zwischen den Elterngenen. Dies erfordert eine oder zwei konservierte Aminosäuren an jeder Crossover-Position. Es beginnt mit dem Alignment von Elternsequenzen und der Identifizierung von Konsensusregionen, die als Crossover-Stellen dienen.Darauf folgt der Einbau spezifischer Tags, die Restriktionsstellen enthalten, gefolgt von der Entfernung der Tags durch Verdau mit Bac1, was zu Genen mit kohäsiven Enden führt. Diese Genfragmente werden gemischt und in einer geeigneten Reihenfolge ligiert, um chimäre Bibliotheken zu bilden. [3] [ Seite benötigt ]

Degenerierte Homo-Duplex-Rekombination (DHR) Bearbeiten

Dieses Verfahren beginnt mit dem Alignment homologer Gene, gefolgt von der Identifizierung von Polymorphismusregionen. Als nächstes wird der oberste Strang des Gens in kleine degenerierte Oligonukleotide aufgeteilt. Der untere Strang wird ebenfalls in Oligonukleotide verdaut, um als Gerüst zu dienen. Diese Fragmente werden in Lösung kombiniert, und die Oligonukleotide des oberen Strangs werden auf Oligonukleotide des unteren Strangs montiert. Lücken zwischen diesen Fragmenten werden mit Polymerase gefüllt und ligiert. [3] [ Seite benötigt ]

Zufällige multirekombinante PCR (RM-PCR) Bearbeiten

Dieses Verfahren beinhaltet das Mischen mehrerer DNA-Fragmente ohne Homologie in einer einzigen PCR. Dies führt zur Rekonstruktion vollständiger Proteine ​​durch den Zusammenbau von Modulen, die für verschiedene Struktureinheiten kodieren. [3] [ Seite benötigt ]

Benutzerfreundliche DNA-Rekombination (USERec) Bearbeiten

Dieses Verfahren beginnt mit der Amplifikation von Genfragmenten, die rekombiniert werden müssen, unter Verwendung von Uracil-dNTPs. Diese Amplifikationslösung enthält auch Primer, PfuTurbo und Cx Hotstart DNA-Polymerase. Amplifizierte Produkte werden als nächstes mit USER-Enzym inkubiert. Dieses Enzym katalysiert die Entfernung von Uracilresten aus der DNA, wodurch einzelne Basenpaarlücken entstehen. Die mit USER-Enzym behandelten Fragmente werden gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert und einem Dpn1-Verdau unterzogen, um die Matrizen-DNA zu entfernen. Diese resultierenden Dingle-strängigen Fragmente werden einer Amplifikation unter Verwendung von PCR unterzogen und werden in E. coli transformiert. [3] [ Seite benötigt ]

Golden Gate Shuffling (GGS) Rekombination Bearbeiten

Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, mindestens 9 verschiedene Fragmente in einem Akzeptorvektor zu rekombinieren, indem Sie ein Restriktionsenzym vom Typ 2 verwenden, das außerhalb der Restriktionsschnittstellen schneidet. Es beginnt mit der Subklonierung von Fragmenten in getrennten Vektoren, um auf beiden Seiten Bsa1-flankierende Sequenzen zu erzeugen. Diese Vektoren werden dann unter Verwendung des Typ-II-Restriktionsenzyms Bsa1 gespalten, das vier Nukleotid-Einzelstrangüberhänge erzeugt. Fragmente mit komplementären Überhängen werden hybridisiert und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Schließlich werden diese Konstrukte dann in E. coli-Zellen transformiert, die auf Expressionsniveaus gescreent werden. [3] [ Seite benötigt ]

Phosphorthioat-basierte DNA-Rekombinationsmethode (PRTec) Bearbeiten

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Strukturelemente oder ganze Proteindomänen zu rekombinieren. Dieses Verfahren basiert auf der Phosphorothioat-Chemie, die die spezifische Spaltung von Phosphorothiodiester-Bindungen ermöglicht. Der erste Schritt im Prozess beginnt mit der Amplifikation von Fragmenten, die zusammen mit dem Vektorrückgrat rekombiniert werden müssen. Diese Amplifikation wird unter Verwendung von Primern mit phosphorthiolierten Nukleotiden an den 5'-Enden erreicht. Amplifizierte PCR-Produkte werden in einer Ethanol-Jod-Lösung bei hohen Temperaturen gespalten. Als nächstes werden diese Fragmente bei Raumtemperatur hybridisiert und in E. coli transformiert, die alle Kerben reparieren. [3] [ Seite benötigt ]

Integron Bearbeiten

Dieses System basiert auf einem natürlichen ortsspezifischen Rekombinationssystem in E. coli. Dieses System wird Integron-System genannt und erzeugt ein natürliches Gen-Shuffling. Dieses Verfahren wurde verwendet, um ein funktionelles Tryptophan-Biosynthese-Operon in trp-defizienten E. coli zu konstruieren und zu optimieren, indem einzelne Rekombinationskassetten oder trpA-E-Gene zusammen mit regulatorischen Elementen mit dem Integron-System geliefert wurden. [3] [ Seite benötigt ]

Y-Ligation-basiertes Mischen (YLBS) Bearbeiten

Dieses Verfahren erzeugt einzelsträngige DNA-Stränge, die eine einzelne Blocksequenz entweder am 5'- oder 3'-Ende, komplementäre Sequenzen in einer Stammschleifenregion und eine D-Verzweigungsregion umfassen, die als Primer-Bindungsstelle für die PCR dient. Äquivalente Mengen von sowohl 5'- als auch 3'-Halbsträngen werden gemischt und aufgrund der Komplementarität in der Stammregion ein Hybrid gebildet. Hybride mit freien phosphorylierten 5'-Enden in 3'-Halbsträngen werden dann mit freien 3'-Enden in 5'-Halbsträngen unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in Gegenwart von 0,1 mM ATP ligiert. Die ligierten Produkte werden dann durch zwei Arten von PCR amplifiziert, um Prä-5'-Halb- und Prä-3'-Halb-PCR-Produkte zu erzeugen. Diese PCR-Produkte werden über Avidin-Biotin-Bindung an das 5'-Ende der Prims, die biotinmarkierte Stammsequenzen enthalten, in Einzelstränge umgewandelt. Als nächstes werden biotinylierte 5'-Halbstränge und nicht-biotinylierte 3'-Halbstränge als 5'- und 3'-Halbstränge für den nächsten Y-Ligationszyklus verwendet. [3] [ Seite benötigt ]

Semi-rationales Design verwendet Informationen über die Sequenz, Struktur und Funktion eines Proteins in Verbindung mit prädiktiven Algorithmen. Zusammen werden diese verwendet, um Zielaminosäurereste zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten die Proteinfunktion beeinflussen. Mutationen dieser Schlüsselaminosäurereste erzeugen Bibliotheken mutierter Proteine, die mit größerer Wahrscheinlichkeit verbesserte Eigenschaften aufweisen. [6]

Fortschritte im semi-rationalen Enzym-Engineering und de novo-Enzymdesign bieten Forschern leistungsstarke und effektive neue Strategien zur Manipulation von Biokatalysatoren. Die Integration von sequenz- und strukturbasierten Ansätzen in das Bibliotheksdesign hat sich als guter Leitfaden für das Enzym-Redesign erwiesen. Im Allgemeinen sind aktuelle rechnerische De-novo- und Redesign-Methoden nicht mit weiterentwickelten Varianten in der katalytischen Leistung vergleichbar. Obwohl eine experimentelle Optimierung durch gerichtete Evolution möglich ist, werden weitere Verbesserungen der Genauigkeit von Strukturvorhersagen und eine größere katalytische Fähigkeit durch Verbesserungen der Designalgorithmen erreicht. Weitere funktionelle Erweiterungen können durch die Integration der Proteindynamik in zukünftige Simulationen einbezogen werden. [6]

Biochemische und biophysikalische Studien werden zusammen mit der Feinabstimmung prädiktiver Rahmenbedingungen nützlich sein, um die funktionelle Bedeutung einzelner Designmerkmale experimentell zu bewerten. Ein besseres Verständnis dieser funktionalen Beiträge wird dann Feedback für die Verbesserung zukünftiger Designs geben. [6]

Die gerichtete Evolution wird wahrscheinlich nicht als Methode der Wahl für das Protein-Engineering abgelöst werden, obwohl das computergestützte Proteindesign die Art und Weise, wie Protein-Engineering Bio-Makromoleküle manipulieren kann, grundlegend verändert hat. Kleinere, fokussiertere und funktionsreichere Bibliotheken können durch die Verwendung von Verfahren erzeugt werden, die prädiktive Rahmen für hypothesengesteuertes Protein-Engineering beinhalten. Neue Designstrategien und technische Fortschritte haben eine Abkehr von traditionellen Protokollen wie der gerichteten Evolution eingeleitet, die die effektivste Strategie zur Identifizierung leistungsstärkster Kandidaten in fokussierten Bibliotheken darstellt. Die Synthese ganzer Genbibliotheken ersetzt Shuffling- und Mutageneseprotokolle für die Bibliotheksvorbereitung. Auch hochspezifische Screening-Assays mit niedrigem Durchsatz werden zunehmend anstelle monumentaler Screening- und Selektionsbemühungen von Millionen von Kandidaten eingesetzt. Zusammen sind diese Entwicklungen bereit, das Protein-Engineering über die gerichtete Evolution hinaus hin zu praktischen, effizienteren Strategien für die maßgeschneiderte Biokatalysatoren zu führen. [6]

Nachdem ein Protein eine gerichtete Evolution, ein Rationsdesign oder ein Semirationsdesign durchlaufen hat, müssen die Bibliotheken mutierter Proteine ​​gescreent werden, um zu bestimmen, welche Mutanten verbesserte Eigenschaften aufweisen. Phagen-Display-Methoden sind eine Option zum Screenen von Proteinen. Dieses Verfahren beinhaltet die Fusion von Genen, die die varianten Polypeptide kodieren, mit Phagen-Hüllprotein-Genen. Auf Phagenoberflächen exprimierte Proteinvarianten werden durch Bindung mit immobilisierten Zielen in vitro selektiert. Phagen mit ausgewählten Proteinvarianten werden dann in Bakterien amplifiziert, gefolgt von der Identifizierung positiver Klone durch einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest. Diese ausgewählten Phagen werden dann einer DNA-Sequenzierung unterzogen. [3] [ Seite benötigt ]

Zelloberflächen-Display-Systeme können auch verwendet werden, um mutierte Polypeptidbibliotheken zu screenen. Die mutierten Gene der Bibliothek werden in Expressionsvektoren eingebaut, die dann in geeignete Wirtszellen transformiert werden. Diese Wirtszellen werden weiteren Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz unterzogen, um die Zellen mit den gewünschten Phänotypen zu identifizieren. [3] [ Seite benötigt ]

Zellfreie Anzeigesysteme wurden entwickelt, um die in vitro Proteintranslation oder zellfreie Translation. Diese Methoden umfassen mRNA-Display, Ribosomen-Display, kovalente und nicht-kovalente DNA-Displays und in vitro Kompartimentierung. [3] : 53

Enzym-Engineering Bearbeiten

Enzym-Engineering ist die Anwendung der Modifizierung der Struktur eines Enzyms (und damit seiner Funktion) oder des Modifizierens der katalytischen Aktivität isolierter Enzyme, um neue Metaboliten zu produzieren, neue (katalysierte) Reaktionswege zu ermöglichen [7] oder von einige bestimmte Verbindungen in andere (Biotransformation). Diese Produkte sind nützlich als Chemikalien, Pharmazeutika, Kraftstoffe, Nahrungsmittel oder landwirtschaftliche Zusatzstoffe.

Ein Enzymreaktor [8] besteht aus einem Gefäß, das ein Reaktionsmedium enthält, das verwendet wird, um eine gewünschte Umsetzung auf enzymatischem Wege durchzuführen. In diesem Verfahren verwendete Enzyme sind in der Lösung frei.

Computermethoden wurden verwendet, um ein Protein mit einer neuartigen Faltung namens Top7 [9] und Sensoren für nichtnatürliche Moleküle zu entwerfen. [10] Die Entwicklung von Fusionsproteinen hat Rilonacept hervorgebracht, ein Arzneimittel, das die Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung des Cryopyrin-assoziierten periodischen Syndroms erhalten hat.

Eine andere Computermethode, IPRO, führte erfolgreich zum Umschalten der Cofaktor-Spezifität der Candida boidinii-Xylose-Reduktase. [11] Iterative Protein Redesign and Optimization (IPRO) entwickelt Proteine ​​neu, um native oder neuartige Substrate und Cofaktoren zu erhöhen oder ihnen Spezifität zu verleihen. Dies geschieht durch wiederholtes zufälliges Stören der Struktur der Proteine ​​um bestimmte Designpositionen herum, Identifizieren der energieärmsten Kombination von Rotameren und Bestimmen, ob das neue Design eine niedrigere Bindungsenergie als die vorherigen hat. [12]

Computergestütztes Design wurde auch verwendet, um komplexe Eigenschaften einer hochgeordneten Nanoproteinanordnung zu entwickeln. [13] Ein Proteinkäfig, E. coli Bacterioferritin (EcBfr), der natürlicherweise strukturelle Instabilität und ein unvollständiges Selbstorganisationsverhalten zeigt, indem er zwei Oligomerisierungszustände besetzt, ist das Modellprotein in dieser Studie. Durch computergestützte Analyse und Vergleich mit seinen Homologen wurde festgestellt, dass dieses Protein eine überdurchschnittliche dimere Grenzfläche auf seiner zweizähligen Symmetrieachse aufweist, hauptsächlich aufgrund der Existenz einer Grenzflächen-Wassertasche, die auf zwei wasserverbrückten Asparaginresten zentriert ist . Um die Möglichkeit zu untersuchen, EcBfr für eine modifizierte strukturelle Stabilität zu entwickeln, wird eine semiempirische Berechnungsmethode verwendet, um die Energieunterschiede der 480 möglichen Mutanten an der dimeren Grenzfläche relativ zum Wildtyp-EcBfr virtuell zu untersuchen. Diese Computerstudie konvergiert auch bei den wasserverbrückten Asparaginen. Das Ersetzen dieser beiden Asparagine durch hydrophobe Aminosäuren führt zu Proteinen, die sich zu alpha-helikalen Monomeren falten und sich zu Käfigen zusammenfügen, wie durch Circulardichroismus und Transmissionselektronenmikroskopie nachgewiesen wird. Sowohl die thermische als auch die chemische Denaturierung bestätigen, dass alle neu gestalteten Proteine ​​in Übereinstimmung mit den Berechnungen eine erhöhte Stabilität aufweisen. Eine der drei Mutationen verschiebt die Population zugunsten des Oligomerisierungszustands höherer Ordnung in Lösung, wie sowohl durch Größenausschlusschromatographie als auch durch native Gelelektrophorese gezeigt wird. [13]

EIN in silico Methode, PoreDesigner, [14] wurde erfolgreich entwickelt, um das bakterielle Kanalprotein (OmpF) umzugestalten, um seine Porengröße von 1 nm auf jede gewünschte Sub-nm-Dimension zu reduzieren. Transportexperimente an den engsten gestalteten Poren zeigten eine vollständige Salzabweisung beim Zusammenbau in biomimetischen Blockpolymer-Matrizen.


MATERIALEN UND METHODEN

HIV-1-Sequenzdatensätze:

Die Analysen wurden an insgesamt 71 Sequenzen voller Länge der Subtypen B (n = 27) und C (n = 27) und Gruppe M (n = 27) Viren, die die Subtypen A–K darstellen. Diese repräsentativen Sequenzen, die aus der HIV-Datenbank von Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov) heruntergeladen wurden, werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben ( de O liveira et al. 2003a). Um die Möglichkeit einer Intersubtyp-Rekombination auszuschließen, wurden nur als nicht rekombinant klassifizierte Sequenzen in die Analysen eingeschlossen (A nisimova et al. 2003 et al. 2003). Um die Einführung von Insertionen und Deletionen zu vermeiden, müssen Nukleotidsequenzen, die mehrfach gespleißte frühe regulatorische (tat, Rev, nef), einfach gespleißt (env, vif, vpr, vpu) und ungespleißte strukturelle (Gag, pol) Gene wurden unter Verwendung eines in DAMBE implementierten CLUSTAL-Algorithmus (X ia und X ie 2001) gegen ihre vorhergesagte Aminosäuresequenz ausgerichtet. Ähnliche Alignments wurden für die translatierten Aminosäuresequenzen konstruiert. Die Alignments wurden manuell mit der Genetic Data Environment für Linux-Schnittstelle bearbeitet ( de O liveira et al. 2003b).

Phylogenetische Analyse und Baumbildung:

Für jedes einzelne Gen wurden separate Analysen durchgeführt, die sowohl Distanz- als auch Maximum-Likelihood-(ML)-Methoden umfassten. Das am besten passende Nukleotid-Substitutionsmodell wurde unter Verwendung eines hierarchischen Likelihood-Ratio-Tests (LRT) bewertet, der in MODELTEST 3.0 implementiert wurde (Posada und Crandall 1998). Die ML-Bäume für komplette Genome und einzelne Gene wurden durch Implementierung einer heuristischen Suche mit Tree Bisection Reconnection Branch Swapping erhalten. Nachbarbäume wurden unter Verwendung des Felsentein 84-Modells konstruiert und in der Codon-Selektionsanalyse verwendet. Phylogenetische Analysen wurden mit dem Programm PAUP* 4.0b10 durchgeführt (Swofford 2002).

Analyse des Selektionsdrucks:

Die positive Selektion wurde unter Verwendung von vier verschiedenen Codon-basierten ML-Substitutionsmodellen (Y ang et al. 2000): M0 (ein Verhältnis), M1 (neutral), M2 (Auswahl) und M3 (diskret). Alle Modelle wurden im Codeml-Programm des PAML-Softwarepakets (Yang 1997) implementiert. Die Analysen wurden mit dem diskreten Modell (M3) mit drei Dn/DS (ω) Klassen. Solche Modelle ermöglichen es , zwischen Standorten zu variieren, indem eine bestimmte Anzahl von diskreten Standortkategorien definiert wird, jede mit ihrem eigenen ω-Wert. Durch Maximum-Likelihood-Optimierung ist es möglich, den Wert für ω und für . zu schätzen P, der Anteil der Websites im ausgerichteten Datensatz, der in eine bestimmte Kategorie fällt. Schließlich berechnet der Algorithmus die A posteriori Wahrscheinlichkeit, dass jedes Codon zu einer bestimmten Site-Kategorie gehört. Im M3-Modell wurden Lokalisationen mit einer Posterior-Wahrscheinlichkeit von über 90 % und einem ω-Wert >1,0 als „positive Selektionsstellen“ (Y ang et al. 2000). Da diese Modelle verschachtelt sind, wobei M3 das komplexeste und M0 das am wenigsten komplexe ist, ist es möglich, das am besten passende Modell für die Daten mit Hilfe des LRT (A nisimova et al. 2001). Der Vergleich von M0 mit M3 ist ein Test der Standortratenvariation Der Vergleich von M1 mit M2 ist ein Test für eine positive Selektion.

Rekonstruktion gemeinsamer Vorfahren:

Ein verwurzelter Baum von n Taxa enthält n − 1 interner Knoten. Ancestrale Sequenzen an den internen Knoten von jedem der neun Proteine ​​in den B- und C-Datensätzen wurden nach maximaler Wahrscheinlichkeit unter Verwendung von Codon-Modellen rekonstruiert, die mit der LRT-Methode ausgewählt wurden. Rekonstruierte Vorfahrensequenzen wurden gespeichert und in ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen übersetzt. Das gp160-Hüllglykoprotein war aufgrund des Vorhandenseins von hypervariablen Regionen mit mehreren Insertionen und Deletionen (Indels) am schwierigsten zu analysieren. Um die Analyse von gp160 zu erleichtern, wurden Sequenzen unter Verwendung von Glykosylierung, Myristylierung und Proteinkinasestellen als Anker ausgerichtet. Um die Möglichkeit alternativer Koaleszenzereignisse zu untersuchen, die von den in PAML konstruierten ML-Bäumen abweichen, wurden auch suboptimale ML-Bäume mit dem in MRBayes-Software implementierten Bayes-Algorithmus rekonstruiert (Huelsenbeck und R onquist 2001). Ahnensequenzen der Bäume wurden auch rekonstruiert und für die Vorhersage von Fluchtepitopen gespeichert.

Identifizierung von Fluchtepitopen:

Um nach potentiellen Escape-Epitopen zu suchen, wurden genomische Regionen mit einer großen Anzahl von positiv selektierten Stellen zusammen mit Vorfahrensequenzen analysiert. Die Sequenzen wurden ausgerichtet, translatiert und auf Unterschiede zwischen beprobten Stämmen und ihren rekonstruierten Vorfahrensequenzen analysiert. Um neue Peptidsequenzen zu identifizieren, die in den Probenstämmen nicht vorhanden waren, wurden Vorfahrensequenzen unter Verwendung eines 10-Aminosäuren-Gleitfensters analysiert, das jeweils um ein Codon erhöht wurde. Immer wenn ein rekonstruiertes 10-Aminosäuren-Vorfahrenpeptid in den äußeren Zweigen des Baums nicht vorhanden war, wurde die Probensequenz als mögliches neues Epitop gespeichert. Neue Aminosäurepeptide wurden mit zwei prädiktiven Softwareprogrammen, SYFPEITHI (R ammensee et al. 1999) und Epimap aus der Los Alamos HIV Seq.Db (B rander und Goulder 1999) für Aminosäurezusammensetzung und Bindungseigenschaften.


Was ist die kostengünstigste Methode, um sequenzielle Aminosäuredeletionen zu erzeugen? - Biologie

PrimerX ist ein webbasiertes Programm, das entwickelt wurde, um das Design mutagener PCR-Primer für die ortsgerichtete Mutagenese zu automatisieren.

Ortsgerichtete Mutagenese, manchmal auch als ortsspezifische Mutagenese bezeichnet, ist eine PCR-basierte Technik, bei der spezifische Mutationen in eine DNA-Sequenz eingeführt werden. Dies wird durch PCR-Amplifikation unter Verwendung mutagener Oligonukleotid-Primer erreicht, die bereits die gewünschte Mutation enthalten. Da die mutagenen Primer während der PCR in jede neue Kopie der Matrizen-DNA eingebaut werden, ist das Ergebnis die Amplifikation einer neuen, mutierten DNA-Sequenz. Da jedoch im Gegensatz zu Primern in der gewöhnlichen PCR mutagene Primer nicht perfekt an die Matrizen-DNA anlagern, müssen hinsichtlich ihres Designs besondere Überlegungen angestellt werden. PrimerX wurde entwickelt, um Ihnen bei dieser Aufgabe zu helfen.

Damit PrimerX mutagene Primer erzeugen kann, sind zwei Sequenzen erforderlich. Die erste ist ein Teil der unmutierten DNA-Matrizensequenz, die die Zielstelle für die Mutation enthält. Die zweite ist die entsprechende DNA- oder Proteinsequenz, die Sie generieren möchten, die bereits die gewünschte Mutation enthält. Basierend auf diesen Sequenzen erstellt PrimerX eine Liste aller möglichen Primerpaare, die Ihre gewünschte Mutation kodieren, und befolgt eine Reihe von Einschränkungen, die Sie angeben.

PrimerX kann Primer basierend auf zwei Arten von Sequenzdaten generieren. Sie können die mutierte DNA-Sequenz direkt eingeben und die gewünschten Basenpaar-Insertionen, -Deletionen oder -Substitutionen einbauen. Dies wird empfohlen, um kleine Basensubstitutionen, -insertionen und -deletionen zu erzeugen. Aber die wahre Stärke von PrimerX liegt in seiner Fähigkeit, Primer basierend auf einer mutierten Proteinsequenz zu generieren. Mit dieser Option können Sie Änderungen in der Proteinsequenz eingeben, die von Ihrem eingegebenen DNA-Template kodiert wird. PrimerX generiert dann Primer basierend auf allen möglichen DNA-Sequenzen, die die gewünschte Änderung unter Berücksichtigung der Codon-Degeneration kodieren können.Dies wird empfohlen, um Mutationen in Genen zu erzeugen, insbesondere wenn beabsichtigt ist, eine Aminosäure in eine andere zu ändern oder ein Stoppcodon einzufügen.

PrimerX ermöglicht es Ihnen auch, Spezifikationen für die Vorwärts- und Rückwärtsprimer separat festzulegen, sodass Sie Primerpaare für eine Vielzahl von Protokollen einfach entwerfen können. Sie haben auch die Kontrolle über Variablen wie den GC-Gehalt, die Schmelztemperatur, die Länge der die Mutation flankierenden Regionen und die Gesamtlänge des Primers. Darüber hinaus kann es automatisch Primer für drei kommerziell erhältliche Mutageneseprotokolle generieren: die QuikChange&trade und ExSite&trade Site-Directed Mutagenesis Kits von Stratagene® und das GeneTailor&trade Site-Directed Mutagenesis System von Invitrogen&trade.

Schließlich enthält PrimerX eine einfache Anwendung, die von Ihnen entworfene mutagene Primer charakterisieren kann. Mit diesem Tool müssen Sie nur die Sequenz eines mutagenen Primers und die Anzahl der fehlgepaarten Basen eingeben, und PrimerX meldet dessen Länge, Schmelztemperatur, GC-Gehalt usw.

A. Primer-Design basierend auf DNA-Sequenz

In diesem Schritt sollen Sie einfach einen Teil Ihrer DNA-Vorlagensequenz eingeben. PrimerX erfordert nur, dass diese Sequenz die Zielstelle für die Mutation enthält, flankiert von einer ausreichend langen Matrizensequenz. In den meisten Fällen sind 50 bp mit der Zielstelle im Zentrum mehr als ausreichend.

Sie haben zwei Möglichkeiten, Ihre DNA-Vorlagensequenz einzugeben. Zuerst können Sie eine Datei hochladen, indem Sie auf "Browse" klicken, um ein Datei-Upload-Menü zu öffnen. Auf diese Weise können Sie nach einer Textdatei suchen und diese auswählen, die Ihre DNA-Vorlagensequenz enthält. Und zweitens können Sie die Vorlagensequenz direkt in den Textbereich unter dem Datei-Upload-Bereich eingeben oder einfügen. In beiden Fällen können Sie eine DNA-Rohsequenz oder eine im Fasta-Format eingeben.

Bei PrimerX wird die Groß-/Kleinschreibung nicht beachtet, die Eingabe von "GCATGAG" ist dasselbe wie die Eingabe von "gcatgag". Auch wenn PrimerX Fasta-formatierte DNA-Sequenzen akzeptieren kann und automatisch den einzeiligen Header entfernt, der mit ">" beginnt, entfernt es auch die DNA-Sequenz von allen Zeichen, die nicht dazu gehören. Mit anderen Worten, jeder Buchstabe, der nicht C, G, A oder T in Ihrer DNA-Vorlagensequenz ist, wird automatisch entfernt, ebenso wie alle Zahlen, Leerzeichen oder Sonderzeichen. Das bedeutet, dass Sie Sequenzen in anderen Formaten einfügen können, z. B. im Sequenzteil einer GenBank-Datei (nach der Zeile ORIGIN), und PrimerX entfernt automatisch die Zahlen und Leerzeichen für Sie.

Hier werden Sie aufgefordert, einen einfachen Code einzugeben, der Ihre gewünschte Mutation identifiziert. Dieser Schritt ist optional, wenn Sie diesen Schritt überspringen, können Sie Ihre gewünschte Mutation später manuell in die Matrizensequenz eingeben. Dies kann jedoch mühsam sein, insbesondere wenn Sie eine lange Sequenz eingegeben haben. Die Eingabe eines einfachen Mutationscodes an dieser Stelle kann Ihnen ein wenig Ärger ersparen.

Der Mutationscode, den Sie eingeben müssen, ist eine vereinfachte Variation der Nomenklatur, die von den Dunnen und Antonarakis zur Beschreibung von Sequenzvariationen auf Proteinebene vorgeschlagen wurde (Hum Genet 109(1): 121-124, 2001). Wir haben diese Variante zum Teil entwickelt, weil sie für jeden, der neu bei PrimerX ist, leicht zu erlernen ist.

Der Mutationscode besteht aus einer Folge von einem oder mehreren Buchstaben, einer Zahl und schließlich einem oder mehreren zusätzlichen Buchstaben. Der erste Teil bezeichnet die Base(n), die Sie ändern möchten, entweder durch Substitution mit einer anderen Base, Deletion oder Einfügen einer anderen Base an dieser Position, so dass sie an eine spätere Position verschoben wird. Die Zahl bezeichnet die numerische Position dieser Base innerhalb der von Ihnen bereitgestellten Template-Sequenz. Die letzte Buchstabenfolge kennzeichnet die gewünschte Änderung. Wenn Sie einen Ersatz wünschen, sollte dieser aus der/den Basis(n) bestehen, die Sie ersetzen möchten. Wenn Sie eine Löschung generieren möchten, sollten dies die Buchstaben "del" sein. Wenn eine Einfügung gewünscht wird, sollte diese aus den Buchstaben "ins" gefolgt von den gewünschten Basen bestehen. Beispiele sind unten gezeigt.

Mutationstyp Mutationscode Beschreibung
Auswechslung C15G Ersetzt ein "C" an Position 15 durch ein "G".
CG15AT Ersetzt "CG" an den Positionen 15-16 durch "AT".
Streichung C15del Löscht ein "C" an Position 15.
CG15del Löscht "CG" an den Positionen 15-16.
Einfügen C15insG Fügt ein "G" an Position 15 ein und schiebt das "C" auf Position 16.
CG15insAT Fügt "AT" an den Positionen 15-16 ein und schiebt den "CG" auf die Positionen 17-18.

Beim Mutationscode wird die Groß-/Kleinschreibung nicht beachtet, es wäre egal, ob entweder die Basen oder die Affixe "del" oder "ins" in Groß- oder Kleinschreibung eingegeben werden. Wir empfehlen jedoch, das im obigen Beispiel gezeigte Format zur einfachen Interpretation zu befolgen. Wenn Sie bei der Eingabe des Mutationscodes einen Fehler machen und dieser vom Programm nicht interpretiert werden kann, erscheint später beim Erkennen des Fehlers eine Fehlermeldung.

In diesem Schritt werden Sie aufgefordert, das Mutageneseprotokoll einzugeben, für das Sie mutagene Primer entwerfen möchten. In allen Fällen werden Standardparameter bereitgestellt, die Sie jedoch nach Belieben ändern können. Die Auswahlmöglichkeiten sind wie folgt:

Benutzerspezifisch (einfach) Wenn Sie diese Option auswählen, können Sie manuell einfache Spezifikationen eingeben, die die Art der gewünschten Primer beschreiben. Die Parameter, die Sie eingeben müssen, sind leicht verständlich, Sie können jedoch Vorwärts- und Rückwärtsprimer nicht getrennt definieren. Jedes auf diese Weise erzeugte Primerpaar ist entweder komplementär oder überlappend und symmetrisch. Benutzerdefiniert (Erweitert) Mit dieser Option können Sie auch Ihr gewünschtes Primerpaar entwerfen. Sie können die Parameter für Ihre Vorwärts- und Rückwärtsprimer separat einstellen. Außerdem können Sie den Abstand des Reverse-Primers von der Mutation einstellen, der Reverse-Primer enthält nicht unbedingt die Mutation. QuikChange&trade Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene® Die Standardparameter, die diesem Protokoll entsprechen, werden für Sie eingegeben. Primer sind komplementär, mit der Mutation in der Mitte. ExSite&trade Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene® Die Standardparameter, die diesem Protokoll entsprechen, werden für Sie eingegeben. Primer werden nicht überlappen, die Mutation befindet sich am 5'-Ende des Vorwärtsprimers. GeneTailor&trade Site-Directed Mutagenesis System von Invitrogen&trade Die Standardparameter, die diesem Protokoll entsprechen, werden für Sie eingegeben. Die Primer überlappen sich, wobei die Mutation nur im Vorwärtsprimer vorhanden ist.

Ihre Aufgabe in diesem Schritt hängt davon ab, ob Sie sich für die Eingabe eines Mutationscodes in Schritt 2 entschieden haben Sie wünschen. Wenn es sich tatsächlich um Ihre gewünschte Sequenz handelt, müssen Sie nur mit Schritt 5 fortfahren. Wenn die vom Programm generierte Sequenz jedoch falsch ist, drücken Sie die Schaltfläche "Zurück" in Ihrem Browser und geben Sie Ihren Mutationscode erneut ein.

Wenn Sie jedoch Schritt 2 übersprungen haben, ändern Sie einfach die Vorlagensequenz im Textbereich in diejenige, die Sie generieren möchten. Wenn Sie beispielsweise "..GCGTGCG.." in "..GCGAGCG.." ändern möchten, löschen Sie einfach das T und geben stattdessen ein A ein. Es gibt jedoch einige Dinge, die Sie bei der Eingabe einer Mutation beachten sollten:

  • Sie sollten nur die gewünschte Mutation eingeben. Ändern Sie nichts anderes, sonst wird PrimerX denken, dass es ein Teil der gewünschten Mutation ist, und es könnte zu Rechenfehlern kommen.
  • Geben Sie nur Einfügungen, Löschungen oder Ersetzungen ein. Geben Sie keine Kombinationen der drei ein. Fügen Sie beispielsweise kein G ein und ersetzen Sie dann ein benachbartes C durch ein anderes G. (z. B. "..CCC.." -> "..CGGC..") Da eine Base hinzugefügt wurde, interpretiert PrimerX dies als eine Einfügung von nur einer Basis und machen ihre Berechnungen entsprechend.
  • Geben Sie keine Mutation an mehr als einer Stelle in der Sequenz ein. Nehmen Sie beispielsweise keine Substitution an einer Stelle vor und dann eine weitere Substitution fünf Basenpaare stromabwärts. PrimerX interpretiert die gesamte Sequenz dazwischen als Teil der Mutation.

In einigen Fällen kann für diesen Schritt anstelle einer DNA-Sequenz eine Meldung im Textbereich angezeigt werden. Die Meldung weist auf einen Fehler hin, den Sie möglicherweise in einem vorherigen Schritt gemacht haben. Sie müssen dann nur noch den "Zurück"-Button Ihres Browsers drücken und Ihren Fehler korrigieren.

In diesem letzten Schritt werden Sie aufgefordert, eine Reihe von Parametern einzugeben, die Ihr gewünschtes Primerpaar beschreiben. Die Liste der angezeigten Parameter hängt von dem Protokoll ab, das Sie in Schritt 3 ausgewählt haben. Wenn Sie beispielsweise "Benutzerspezifisch (Basic)" gewählt haben, sehen Sie hier eine Liste von Parametern, mit der Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer gemeinsam definieren können . Wenn Sie jedoch "Benutzerspezifisch (Erweitert)" auswählen, werden hier zwei separate Listen angezeigt: eine zum Konfigurieren des Vorwärtsprimers und die andere zum Konfigurieren des Rückwärtsprimers. Wenn Sie sich für eines der drei kommerziellen Protokolle entschieden haben, werden hier die Standardwerte angezeigt, die für Ihr gewünschtes Protokoll empfohlen werden.

Bei den meisten dieser Parameter müssen Sie einen Bereich zulässiger Werte definieren, indem Sie ein Minimum und ein Maximum zuweisen. Im Folgenden finden Sie eine Liste von Parametern:

    Schmelztemperatur (°.C) – Dies bezieht sich auf die in Ihrer PCR-Reaktion zulässige Schmelztemperatur (Tm). Die Schmelztemperatur wird nach folgender Formel berechnet:

Tm = 81,5 + 0,41 (%GC) – 675/N – % Fehlanpassung
wobei N = Primerlänge in Basenpaaren,
und Werte für %GC und %mismatch sind ganze Zahlen.

Oder für Einfügungen und Löschungen:

Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675/N
wobei N die eingefügten/gelöschten Basen nicht einschließt.

Es gibt bestimmte Dinge, die Sie beim Festlegen dieser Einschränkungen beachten sollten. Insbesondere sollten Sie darauf achten, keine Widersprüche in Ihren Werten aufzubauen. Beispielsweise sollte ein Mindestwert nicht größer sein als sein entsprechender Höchstwert. Wenn Sie "Mutationsstelle in der Mitte des Primers" auswählen, sollten sich die Bereiche, die Sie für die 5'- und 3'-flankierenden Regionen einstellen, überlappen (oder besser noch identisch sein). Andernfalls wäre es unmöglich, Primer zu erzeugen. Die Eingabe dieser Widersprüche führt zu einer Fehlermeldung, die das Problem identifiziert.

Sie sollten auch bedenken, dass, wenn "Mutationsstelle in der Mitte des Primers" nicht ausgewählt ist, die Bereiche, die Sie für die Längen der 5'- und 3'-flankierenden Regionen definieren, schmaler als die Standardwerte gemacht werden sollten. Dies liegt daran, dass die Längen der flankierenden Bereiche nicht mehr darauf beschränkt sind, ungefähr gleich zu sein. Das Festlegen großer Bereiche für beide führt dazu, dass PrimerX möglicherweise Hunderte potenzieller Primer berechnet, was den Server verlangsamt und wahrscheinlich zu viele Ergebnisse ausgibt, um nützlich zu sein. Ein maximaler Bereich von jeweils 5 bp sollte ausreichend sein.

B. Primer-Design basierend auf Proteinsequenz

In diesem Schritt sollen Sie einen Teil Ihrer Template-DNA-Sequenz eingeben, der die zu mutierende(n) Zielaminosäure(n) codiert. Die Zielstelle sollte auf beiden Seiten von ausreichender Länge der Matrizensequenz flankiert werden. Darüber hinaus sollte die von Ihnen eingegebene DNA-Sequenz aus dem Sense-Strang stammen und im richtigen Leseraster beginnen, damit sie vom Programm richtig übersetzt werden kann. Die Eingabe von etwa 50 bp ist normalerweise ausreichend.

Wie bereits erwähnt, haben Sie zwei Möglichkeiten, Ihre DNA-Vorlagensequenz einzugeben. Zuerst können Sie eine Datei hochladen, indem Sie auf "Browse" klicken, um ein Datei-Upload-Menü zu öffnen. Auf diese Weise können Sie nach einer Textdatei suchen und diese auswählen, die Ihre DNA-Vorlagensequenz enthält. Und zweitens können Sie die Vorlagensequenz direkt in den Textbereich unter dem Datei-Upload-Bereich eingeben oder einfügen. In beiden Fällen können Sie eine DNA-Rohsequenz oder eine im Fasta-Format eingeben.

Bei PrimerX wird die Groß-/Kleinschreibung nicht beachtet, die Eingabe von "GCATGAG" ist dasselbe wie die Eingabe von "gcatgag". Auch wenn PrimerX Fasta-formatierte DNA-Sequenzen akzeptieren kann und automatisch den einzeiligen Header entfernt, der mit ">" beginnt, entfernt es auch die DNA-Sequenz von allen Zeichen, die nicht dazu gehören. Mit anderen Worten, jeder Buchstabe, der nicht C, G, A oder T in Ihrer DNA-Vorlagensequenz ist, wird automatisch entfernt, ebenso wie alle Zahlen, Leerzeichen oder Sonderzeichen. Das bedeutet, dass Sie Sequenzen in anderen Formaten einfügen können, z. B. im Sequenzteil einer GenBank-Datei (nach der Zeile ORIGIN), und PrimerX entfernt automatisch die Zahlen und Leerzeichen für Sie.

Ein Klick auf „Übersetzen“ sollte dazu führen, dass in Schritt 2 die entsprechende Proteinsequenz im Textbereich angezeigt wird.

In diesem Schritt müssen Sie lediglich überprüfen, ob PrimerX die zuvor eingegebene DNA-Sequenz richtig in die entsprechende Proteinsequenz übersetzen konnte. Die resultierende Proteinsequenz sollte auch die zu mutierende(n) Zielaminosäure(n) enthalten.

Hier ist eine Liste der Buchstabensymbole für die verschiedenen Aminosäuren.

"A" = Alanin
"C" = Cystein
"D" = Asparaginsäure
"E" = Glutaminsäure
"F" = Phenylalanin
"G" = Glycin
"H" = Histidin
"Ich" = Isoleucin
"K" = Lysin
"L" = Leucin
"M" = Methionin / Start
"N" = Asparagin
"P" = Prolin
"Q" = Glutamin
"R" = Arginin
"S" = Serin
"T" = Threonin
"V" = Valin
"W" = Tryptophan
"Y" = Tyrosin
"_" = Stopp-Codon

Hier werden Sie aufgefordert, einen einfachen Code einzugeben, der Ihre gewünschte Mutation identifiziert. Dieser Schritt ist optional, wenn Sie diesen Schritt überspringen, können Sie Ihre gewünschte Mutation später manuell in die Proteinsequenz eingeben. Dies kann jedoch mühsam sein, insbesondere wenn Sie eine lange Sequenz eingegeben haben. Die Eingabe eines einfachen Mutationscodes an dieser Stelle kann Ihnen ein wenig Ärger ersparen.

Der Mutationscode, den Sie eingeben müssen, ist eine vereinfachte Variation der Nomenklatur, die von den Dunnen und Antonarakis zur Beschreibung von Sequenzvariationen auf Proteinebene vorgeschlagen wurde (Hum Genet 109(1): 121-124, 2001). Wir haben diese Variante zum Teil entwickelt, weil sie für jeden, der neu bei PrimerX ist, leicht zu erlernen ist.

Der Mutationscode besteht aus einer Folge von einem oder mehreren Buchstaben, einer Zahl und schließlich einem oder mehreren zusätzlichen Buchstaben. Der erste Teil bezeichnet die Aminosäure(n), die Sie ändern möchten, entweder durch Substitution mit einer anderen Aminosäure, Deletion oder Insertion einer anderen Aminosäure an dieser Position, sodass sie an eine spätere Position verschoben wird. Die Zahl bezeichnet die numerische Position dieser Aminosäure innerhalb der Proteinsequenz. Die letzte Buchstabenfolge kennzeichnet die gewünschte Änderung. Wenn Sie eine Substitution wünschen, sollte diese aus der oder den Aminosäuren bestehen, die Sie durch die ursprüngliche(n) ersetzen möchten. Wenn Sie eine Löschung generieren möchten, sollten dies die Buchstaben "del" sein. Wenn eine Insertion gewünscht wird, sollte diese aus den Buchstaben "ins" gefolgt von der Aminosäure(n) bestehen, die eingefügt werden soll. Beispiele sind unten gezeigt.

Mutationstyp Mutationscode Beschreibung
Auswechslung E15P Ersetzt ein "E" an Position 15 durch ein "P".
EF15PQ Ersetzt "EF" an den Positionen 15-16 durch "PQ".
Streichung E15del Löscht ein "E" an Position 15.
EF15del Löscht "EF" an den Positionen 15-16.
Einfügen E15insP Fügt ein "P" an Position 15 ein und schiebt das "E" auf Position 16.
EF15insPQ Fügt "PQ" an den Positionen 15-16 ein und schiebt das "EF" auf die Positionen 17-18.

Beim Mutationscode wird die Groß-/Kleinschreibung nicht beachtet, es wäre egal, ob entweder die Basen oder die Affixe "del" oder "ins" in Groß- oder Kleinschreibung eingegeben werden. Wir empfehlen jedoch, das im obigen Beispiel gezeigte Format zur einfachen Interpretation zu befolgen. Wenn Sie bei der Eingabe des Mutationscodes einen Fehler machen und dieser vom Programm nicht interpretiert werden kann, erscheint später beim Erkennen des Fehlers eine Fehlermeldung.

In diesem Schritt werden Sie aufgefordert, das Mutageneseprotokoll einzugeben, für das Sie mutagene Primer entwerfen möchten. In allen Fällen werden Standardparameter bereitgestellt, die Sie jedoch nach Belieben ändern können. Die Auswahlmöglichkeiten sind wie folgt:

Benutzerdefiniert (Basis) Wenn Sie diese Option auswählen, können Sie manuell einfache Spezifikationen eingeben, die die Art der gewünschten Primer beschreiben. Die Parameter, die Sie eingeben müssen, sind leicht verständlich, Sie können jedoch Vorwärts- und Rückwärtsprimer nicht getrennt definieren. Jedes auf diese Weise erzeugte Primerpaar ist entweder komplementär oder überlappend und symmetrisch. Benutzerdefiniert (Erweitert) Mit dieser Option können Sie auch Ihr gewünschtes Primerpaar entwerfen. Sie können die Parameter für Ihre Vorwärts- und Rückwärtsprimer separat einstellen. Außerdem können Sie den Abstand des Reverse-Primers von der Mutation einstellen, der Reverse-Primer enthält nicht unbedingt die Mutation. QuikChange&trade Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene® Die Standardparameter, die diesem Protokoll entsprechen, werden für Sie eingegeben. Primer sind komplementär, mit der Mutation in der Mitte. ExSite&trade Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene® Die Standardparameter, die diesem Protokoll entsprechen, werden für Sie eingegeben. Primer werden nicht überlappen, die Mutation befindet sich am 5'-Ende des Vorwärtsprimers. GeneTailor&trade Site-Directed Mutagenesis System von Invitrogen&trade Die Standardparameter, die diesem Protokoll entsprechen, werden für Sie eingegeben. Die Primer überlappen sich, wobei die Mutation nur im Vorwärtsprimer vorhanden ist.

Ihre Aufgabe in diesem Schritt hängt davon ab, ob Sie sich in Schritt 3 für die Eingabe eines Mutationscodes entschieden haben Sie wünschen. Wenn es sich tatsächlich um Ihre gewünschte Sequenz handelt, müssen Sie nur mit Schritt 6 fortfahren. Wenn die vom Programm generierte Sequenz jedoch falsch ist, drücken Sie die Schaltfläche "Zurück" in Ihrem Browser und geben Sie Ihren Mutationscode erneut ein.

Wenn Sie jedoch Schritt 3 übersprungen haben, ändern Sie einfach die Vorlagensequenz im Textbereich in diejenige, die Sie generieren möchten. Wenn Sie beispielsweise "..EFLQLMN.." in "..EFLRLMN.." ändern möchten, löschen Sie einfach das Q und geben stattdessen ein R ein. Es gibt jedoch einige Dinge, die Sie bei der Eingabe einer Mutation beachten sollten:

  • Sie sollten nur die gewünschte Mutation eingeben. Ändern Sie nichts anderes, sonst wird PrimerX denken, dass es ein Teil der gewünschten Mutation ist, und es könnte zu Rechenfehlern kommen.
  • Geben Sie nur Einfügungen, Löschungen oder Ersetzungen ein. Geben Sie keine Kombinationen der drei ein. Füge zum Beispiel kein Q ein und ersetze dann ein benachbartes I durch ein anderes Q. (z. B. "..LIL.." -> "..LQQL..") Da eine Aminosäure hinzugefügt wurde, interpretiert PrimerX dies als Einfügung von nur einer Basis und machen ihre Berechnungen entsprechend.
  • Geben Sie keine Mutation an mehr als einer Stelle in der Sequenz ein. Nehmen Sie beispielsweise keine Substitution an einer Stelle vor und dann eine weitere Substitution fünf Aminosäuren entfernt. PrimerX interpretiert die gesamte Sequenz dazwischen als Teil der Mutation.

In einigen Fällen kann im Textbereich für diesen Schritt anstelle einer Proteinsequenz eine Meldung erscheinen. Die Meldung weist auf einen Fehler hin, den Sie möglicherweise in einem vorherigen Schritt gemacht haben. Sie müssen dann nur noch den "Zurück"-Button Ihres Browsers drücken und Ihren Fehler korrigieren.

In diesem letzten Schritt werden Sie aufgefordert, eine Reihe von Parametern einzugeben, die Ihr gewünschtes Primerpaar beschreiben. Die Liste der angezeigten Parameter hängt von dem Protokoll ab, das Sie in Schritt 3 ausgewählt haben. Wenn Sie beispielsweise "Benutzerspezifisch (Basic)" gewählt haben, sehen Sie hier eine Liste von Parametern, mit der Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer gemeinsam definieren können . Wenn Sie jedoch "Benutzerspezifisch (Erweitert)" auswählen, werden hier zwei separate Listen angezeigt: eine zum Konfigurieren des Vorwärtsprimers und die andere zum Konfigurieren des Rückwärtsprimers. Wenn Sie sich für eines der drei kommerziellen Protokolle entschieden haben, werden hier die Standardwerte angezeigt, die für Ihr gewünschtes Protokoll empfohlen werden.

Bei den meisten dieser Parameter müssen Sie einen Bereich zulässiger Werte definieren, indem Sie ein Minimum und ein Maximum zuweisen. Im Folgenden finden Sie eine Liste von Parametern:

  • Expressionssystem - Hier können Sie aus einer Liste häufig verwendeter Modellorganismen auswählen, die in der Molekular- und Zellbiologie verwendet werden. Wenn Sie sich für eine davon entscheiden, generiert PrimerX Primer basierend auf der optimalen Codon-Nutzung dieses Organismus. Wenn Sie beispielsweise einen Glycinrest einfügen und diesen im Bakterium E. coli exprimieren möchten, erzeugt PrimerX Primer, bei denen der Glycinrest vom Codon GGC kodiert wird, das von E. coli am häufigsten verwendet wird, um Glycin zu kodieren . Dies erhöht die Chancen, dass Ihre gewünschte Mutation von dem Organismus, mit dem Sie arbeiten, korrekt exprimiert wird.
    Wenn der Organismus, mit dem Sie arbeiten, nicht in der Liste enthalten ist, können Sie den Codon Usage Analyzer verwenden, um das richtige zu verwendende Codon zu bestimmen.
  • Schmelztemperatur (°.C) – Dies bezieht sich auf die in Ihrer PCR-Reaktion zulässige Schmelztemperatur (Tm). Die Schmelztemperatur wird nach folgender Formel berechnet:

Tm = 81,5 + 0,41 (%GC) – 675/N – % Fehlanpassung
wobei N = Primerlänge in Basenpaaren,
und Werte für %GC und %mismatch sind ganze Zahlen.

Oder für Einfügungen und Löschungen:

Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675/N
wobei N die eingefügten/gelöschten Basen nicht einschließt.

Es gibt bestimmte Dinge, die Sie beim Festlegen dieser Einschränkungen beachten sollten. Insbesondere sollten Sie darauf achten, keine Widersprüche in Ihren Werten aufzubauen. Beispielsweise sollte ein Mindestwert nicht größer sein als sein entsprechender Höchstwert. Wenn Sie "Mutationsstelle in der Mitte des Primers" auswählen, sollten sich die Bereiche, die Sie für die 5'- und 3'-flankierenden Regionen einstellen, überlappen (oder besser noch identisch sein). Andernfalls wäre es unmöglich, Primer zu erzeugen. Die Eingabe dieser Widersprüche führt zu einer Fehlermeldung, die das Problem identifiziert.

Sie sollten auch bedenken, dass, wenn "Mutationsstelle in der Mitte des Primers" nicht ausgewählt ist, die Bereiche, die Sie für die Längen der 5'- und 3'-flankierenden Regionen definieren, schmaler als die Standardwerte gemacht werden sollten. Dies liegt daran, dass die Längen der flankierenden Bereiche nicht mehr darauf beschränkt sind, ungefähr gleich zu sein. Das Festlegen großer Bereiche für beide führt dazu, dass PrimerX möglicherweise Hunderte potenzieller Primer berechnet, was den Server verlangsamt und wahrscheinlich zu viele Ergebnisse ausgibt, um nützlich zu sein. Ein maximaler Bereich von jeweils 5 bp sollte ausreichend sein.

Wenn Sie auf "Primer generieren" klicken, zeigt PrimerX die berechneten Ergebnisse auf dem Bildschirm an. Die Ergebnisseite besteht aus zwei Teilen: einer Anzeige der von Ihnen übermittelten DNA-Sequenz(en) und einer Liste der vom Programm generierten Primer.

Jede DNA-Sequenz wird in Zeilen von 50 bp angezeigt. Oberhalb der oberen Zeile sollten Sie 4 gleichmäßig verteilte Punkte (".") sehen. Diese richten sich nach dem 10., 20., 30. und 40. Basenpaar in jeder Zeile aus, sodass Sie Positionen in der Sequenz leichter finden können.

Es folgt eine Liste der von Ihnen eingegebenen Parameter. Auf diese Weise können Sie mehrere Ergebnissätze verfolgen.

Darunter sehen Sie eine Zählung der Gesamtzahl der generierten Primerpaare, gefolgt von einer Liste dieser Primerpaare. Wenn "Komplementäre Primer" ausgewählt ist, wird jedes Paar als Vorwärtssequenz und sein Rückwärtskomplement angezeigt. Wenn "Überlappende Primer" ausgewählt ist oder wenn Sie ein Protokoll ausgewählt haben, das die getrennte Entwicklung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern erfordert, werden die Primer in antiparalleler Weise angezeigt, wobei ihre komplementären Regionen ausgerichtet sind.

Über und unter jedem Primerpaar befinden sich ein oder mehrere Symbole. Wenn Sie einen oder mehrere Sternchen (" * ") sehen, handelt es sich bei der von Ihnen eingegebenen Mutation um eine Substitution oder eine Insertion, und die Sternchen befinden sich direkt über und unter den substituierten oder eingefügten Basen. Die Symbole "/" und "/" zeigen an, dass Sie eine Löschung vorgenommen haben, diese zeigen an die Stelle, an der ein Teil der Vorlagensequenz entfernt wurde.

Unter jedem Primerpaar werden einige grundlegende Informationen angezeigt. Dazu gehören die folgenden:

  • GC-Gehalt – Dies gibt den Prozentsatz der G- und C-Basen in der Primersequenz an.
  • Schmelztemperatur - Dies gibt die geschätzte Schmelztemperatur an, basierend auf der oben angegebenen Formel. Dies ist nur ein geschätzter Wert und kann in der tatsächlichen PCR-Reaktion nicht genau sein.
  • Länge – Dies gibt die Länge jedes Primers in Basenpaaren an.
  • Position – Dies gibt die Start- und Endpositionen innerhalb der ursprünglichen (unmutierten) Matrizensequenz an, die der Primersequenz entsprechen.
  • 5'- und 3'-flankierende Regionen – Diese geben die Längen der Regionen an, die die mutierte Stelle innerhalb der Vorwärtsprimersequenz flankieren.
  • Vorwärts- und Rückwärtsprimer MW - Diese geben die Molekulargewichte der entsprechenden einzelsträngigen Oligonukleotidprimer in Dalton an, die nach folgender Formel berechnet werden:

MW = (313,21 x nA) + (304,20 x nT) + (329,21 x nG) +
(289,19 x nC) + 18,02 - 80,00
wobei: nA = Anzahl der Adeninbasen, nT = Anzahl der
Thyminbasen usw.

Wenn PrimerX keine Primer generieren kann, wird eine Fehlermeldung mit Ratschlägen zur Behebung des Problems angezeigt. Wenn dieses oder ein anderes Problem weiterhin besteht, senden Sie mir bitte eine E-Mail.

NS. Primer-Charakterisierung

Diese Funktion von PrimerX ist eigentlich ziemlich selbsterklärend. Geben Sie in das Textfeld "Primer-Sequenz" die Vorwärtssequenz eines von Ihnen entworfenen Primers ein. Geben Sie in das Textfeld "Nicht übereinstimmende Basen" die Anzahl der Basen ein, die gegenüber der ursprünglichen Sequenz geändert wurden. Wählen Sie anschließend aus, ob Ihre gewünschte Mutation eine Substitution, Insertion oder Deletion ist. Wenn Sie auf "Submit" klicken, berechnet und meldet PrimerX das umgekehrte Komplement, die Länge, die Schmelztemperatur, den GC-Gehalt, das Molekulargewicht und die prozentuale Fehlanpassung der Sequenz sowie ob die Sequenz mit einem G oder C endet oder nicht.

Diese Funktion wurde entwickelt, um Sie beim Entwerfen Ihrer eigenen mutagenen Primer zu unterstützen, anstatt ein Primerpaar aus den Ergebnissen auszuwählen, die in den Primer-Designfunktionen erhalten wurden. Als wir diese Funktion hinzufügten, hatten wir das QuikChange&trade Site-Directed Mutagenesis-Protokoll von Stratagene®. Für diejenigen, die dieses Protokoll verwenden, sind hier die von Stratagene empfohlenen Richtlinien:

  • Primer sollten zwischen 25 und 45 Basen lang sein.
  • Die Schmelztemperatur sollte höher oder gleich 78 °C sein, wobei die zuvor angegebene Formel verwendet wird.
  • Die gewünschte Mutation sollte in der Mitte des Primers mit

Carlo Lapid ist derzeit Doktorand am National Institute of Molecular Biology and Biotechnology (NIMBB) der Universität der Philippinen, Diliman. Im April 2003 schloss er seinen Bachelor in Molekularbiologie und Biotechnologie ab und strebt nun einen Master in diesem Bereich an. Außerdem ist er wissenschaftlicher Mitarbeiter am Marine Science Institute, ebenfalls an der Universität der Philippinen. Er kann per E-Mail an [email protected] gesendet werden.

Er begann mit dem Schreiben von PrimerX als Pflichtprojekt für einen Einführungskurs in die Bioinformatik. Die Arbeit an dem Projekt hat ihm jedoch so viel Spaß gemacht, dass er beschloss, es weiter zu aktualisieren und zu verbessern.

Yimin Gao ist Doktorand im dritten Jahr am Department of Computer Science der University of the Philippines, Diliman. Er schloss sein Studium der Informatik an der Universität der Philippinen in Los Banos im April 2002 mit einem Diplom ab und macht nun seinen Master in Informatik mit Schwerpunkt Bioinformatik. Er kann per E-Mail an [email protected] gesendet werden.

Bioinformatics.Org ist eine internationale Organisation, die sich für Freiheit und Offenheit im Bereich der Bioinformatik einsetzt. Dies geschieht durch die Bereitstellung kostenloser und offener Ressourcen für Forschung, Entwicklung und Bildung, damit diese Ressourcen weiterentwickelt werden können. Die Organisation ist gemeinnützig und unterhält eine gleichnamige Internet-Site, über die auf diese Ressourcen zugegriffen werden kann. Bioinformatics.Org hofft, die Barriere für den Einstieg in und die Teilnahme an der Bioinformatik zu senken, da der Zugang zu modernsten Ressourcen für Einzelpersonen, kleine Gruppen, an schlecht finanzierten Institutionen oder in Entwicklungsländern unerschwinglich teuer sein kann.

VII. Urheberrechtsinformation

PrimerX – Automatisiertes Design mutagener Primer für die ortsgerichtete Mutagenese
Copyright & Kopie 2003 von Carlo Lapid

Obwohl wir, die Entwickler von PrimerX, unser Bestes getan haben, um PrimerX so nützlich und leistungsfähig wie möglich zu machen, können wir keine Garantie hinsichtlich der Effektivität oder Genauigkeit dieses Programms/dieser Website geben. Es wird nicht garantiert, dass Primer, die mit PrimerX entworfen wurden, in einer tatsächlichen PCR-Reaktion oder einem anderen Verfahren funktionieren. Wir können nicht für Probleme verantwortlich gemacht werden, die infolge der Verwendung dieses Programms auftreten.

PrimerX ist in keiner Weise mit Stratagene®, Invitrogen&trade oder einem anderen privaten Unternehmen verbunden. Wir unterstützen nicht offiziell die QuikChange&trade-, ExSite&trade- oder GeneTailor&trade Site-Directed Mutagenesis-Kits oder andere Produkte, die von diesen oder anderen Unternehmen verkauft werden.



Bemerkungen:

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