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Y = Fx Dimerbildung vs. Mo (Grafik 2) - Biologie

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Y = Fx-Dimerbildung vs. Mo (Grafik 2)

Interaktionsenergie

Die Wechselwirkungsenergie zwischen den Molekülen A und B (ΔE AB ) wird als Differenz zwischen der Energie des Dimers (E A,B ) und der Summe der Monomerenergien (E A + E B ) bestimmt.

Die Wechselwirkungsenergie, ΔE ABC , eines Trimeren ABC kann auf zwei Arten ausgedrückt werden [ 42b ]: als Differenz der elektronischen Energie des Komplexes und der Monomere

oder als Summe von drei paarweisen additiven Beiträgen und dem Dreikörperterm ΔE 3

Der Dreikörperterm kann wie folgt ausgedrückt werden:

Für Tetramere und größere Komplexe wird die Methodik entsprechend erweitert. Die Analyse ausgedehnter Systeme kann vereinfacht werden, indem eine ausgewählte Gruppe von Molekülen als ein Subsystem behandelt wird. Zum Beispiel könnte ein hydratisiertes Kation (Kation plus Wassermoleküle) als ein Subsystem behandelt werden, wenn die Nichtadditivität von Wechselwirkungen in Komplexen zwischen hydratisierten Kationen und Basenpaaren und Trimeren bewertet wird [ 13c ].

Die Stabilität eines Dimers wird außerdem durch die Deformation der Monomere bei der Komplexbildung beeinflusst. Dies kann durch Subtrahieren der Energie der optimierten isolierten Monomere (E Ai , E Ai ) von den Energien der Monomere in der Dimergeometrie (E A , E B ) bewertet werden. Die entsprechende Deformations-(Relaxations-)Energie ΔE DEF ist positiv (abstoßend).

Die Gesamtkomplexierungsenergie ΔE T ist somit definiert als

und die Gleichungen (5) und (6) können auf einfache Weise auch auf Trimere und größere Cluster erweitert werden.

Werden die Rechnungen unter Einbeziehung von Elektronenkorrelationseffekten durchgeführt, dann bestehen die Wechselwirkungsenergien ΔE und ihre Komponenten aus HF- und Elektronenkorrelationskomponenten

Der erstere Begriff umfasst im Wesentlichen die elektrostatischen, Induktions-, Ladungstransfer- und Elektronenaustauschbeiträge. Die Dispersionsenergie stammt aus der Elektronenkorrelation, die auch die anderen Beiträge beeinflusst.


Y = Fx Dimerbildung vs. Mo (Grafik 2) - Biologie

Um Gerinnungs-(thrombotische) Episoden auszuschließen und Erkrankungen im Zusammenhang mit Thrombose zu diagnostizieren

Wenn Sie Symptome eines Blutgerinnsels oder einer Erkrankung haben, die zu unangemessenen Blutgerinnseln führt, wie z. B. tiefe Venenthrombose (TVT), Lungenembolie (LE) oder disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC), und um die Behandlung von DIC und übermäßigen Gerinnungszuständen zu überwachen

Eine Blutprobe, die aus einer Vene in Ihrem Arm entnommen wird

Möglicherweise finden Sie Ihre Testergebnisse auf der Website Ihres Labors oder im Patientenportal. Sie befinden sich jedoch derzeit bei Lab Tests Online. Möglicherweise wurden Sie von der Website Ihres Labors hierher geleitet, um Ihnen Hintergrundinformationen zu den von Ihnen durchgeführten Tests zur Verfügung zu stellen. Sie müssen zur Website oder zum Portal Ihres Labors zurückkehren oder sich an Ihren Arzt wenden, um Ihre Testergebnisse zu erhalten.

Lab Tests Online ist eine preisgekrönte Website zur Patientenaufklärung, die Informationen zu Labortests bietet. Der Inhalt der Website, der von Laborwissenschaftlern und anderen medizinischen Fachkräften überprüft wurde, bietet allgemeine Erklärungen dazu, was die Ergebnisse für jeden auf der Website aufgeführten Test bedeuten können, z gesundheitlicher oder medizinischer Zustand.

Die Referenzbereiche für Ihre Tests finden Sie in Ihrem Laborbericht. Sie befinden sich normalerweise rechts neben Ihren Ergebnissen.

Wenn Sie keinen Laborbericht haben, wenden Sie sich an Ihren Arzt oder das Labor, das die Tests durchgeführt hat, um den Referenzbereich zu erhalten.

Laborergebnisse allein sind nicht aussagekräftig. Ihre Bedeutung ergibt sich aus dem Vergleich mit Referenzbereichen. Referenzbereiche sind die Werte, die für eine gesunde Person erwartet werden. Sie werden manchmal als "normale" Werte bezeichnet. Durch den Vergleich Ihrer Testergebnisse mit Referenzwerten können Sie und Ihr Arzt feststellen, ob eines Ihrer Testergebnisse außerhalb des erwarteten Wertebereichs liegt. Werte, die außerhalb der erwarteten Bereiche liegen, können Hinweise liefern, um mögliche Zustände oder Krankheiten zu identifizieren.

Während sich die Genauigkeit von Labortests in den letzten Jahrzehnten erheblich weiterentwickelt hat, kann es aufgrund von Unterschieden in Testgeräten, chemischen Reagenzien und Techniken zu Abweichungen von Labor zu Labor kommen. Aus diesem Grund werden auf dieser Seite so wenige Referenzbereiche bereitgestellt. Es ist wichtig zu wissen, dass Sie den Bereich des Labors verwenden müssen, das Ihren Test durchgeführt hat, um zu beurteilen, ob Ihre Ergebnisse "innerhalb der normalen Grenzen" liegen.

Weitere Informationen finden Sie im Artikel Referenzbereiche und ihre Bedeutung.

D-Dimer ist eines der Proteinfragmente, die produziert werden, wenn ein Blutgerinnsel im Körper aufgelöst wird. Es ist normalerweise nicht oder nur in sehr geringen Mengen nachweisbar, es sei denn, der Körper bildet und baut Blutgerinnsel ab. Dann kann sein Blutspiegel deutlich ansteigen. Dieser Test weist D-Dimer im Blut nach.

Wenn ein Blutgefäß oder Gewebe verletzt ist und zu bluten beginnt, wird vom Körper ein Prozess namens Hämostase eingeleitet, um ein Blutgerinnsel zu bilden, um die Blutung zu begrenzen und schließlich zu stoppen. Dieser Prozess produziert Fäden eines Proteins namens Fibrin, die miteinander vernetzen, um ein Fibrinnetz zu bilden. Dieses Netz trägt zusammen mit den Blutplättchen dazu bei, das sich bildende Blutgerinnsel an der Stelle der Verletzung zu halten, bis es verheilt ist.

Sobald der Bereich geheilt ist und das Gerinnsel nicht mehr benötigt wird, verwendet der Körper ein Enzym namens Plasmin, um das Gerinnsel (Thrombus) in kleine Stücke aufzubrechen, damit es entfernt werden kann. Die Fragmente des zerfallenden Fibrins im Gerinnsel werden als Fibrinabbauprodukte (FDP) bezeichnet und bestehen aus verschieden großen Stücken vernetzten Fibrins. Eines der Endprodukte des Fibrinabbaus ist D-Dimer, das in einer Blutprobe gemessen werden kann, wenn es vorhanden ist. Der D-Dimer-Spiegel im Blut kann signifikant ansteigen, wenn im Körper eine signifikante Bildung und ein Abbau von Fibringerinnseln stattfindet.

Für eine Person mit einem geringen oder mittleren Risiko für Blutgerinnung (Thrombose) und/oder thrombotische Embolie besteht die Stärke des D-Dimer-Tests darin, dass er in der Notaufnahme eines Krankenhauses verwendet werden kann, um die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins eines Blutgerinnsels zu bestimmen . Ein negativer D-Dimer-Test (D-Dimer-Spiegel liegt unter einem vorgegebenen Cut-Off-Schwellenwert) zeigt an, dass es sehr unwahrscheinlich ist, dass ein Thrombus vorliegt. Ein positiver D-Dimer-Test kann jedoch nicht vorhersagen, ob ein Gerinnsel vorhanden ist oder nicht. Es zeigt an, dass weitere diagnostische Verfahren erforderlich sind (z. B. Ultraschall, CT-Angiographie).

Es gibt mehrere Faktoren und Bedingungen, die mit einer unangemessenen Bildung von Blutgerinnseln verbunden sind. Eine der häufigsten ist die tiefe Venenthrombose (DVT), bei der sich Blutgerinnsel in Venen tief im Körper, am häufigsten in den Unterschenkeln, bilden. Diese Gerinnsel können sehr groß werden und den Blutfluss in den Beinen blockieren, was zu Schwellungen, Schmerzen und Gewebeschäden führt. Es ist möglich, dass ein Teil des Gerinnsels abbricht und in andere Körperteile wandert. Diese "Embolie" kann sich in der Lunge festsetzen und eine Lungenembolie oder Embolie (LE) verursachen. Lungenembolien durch TVT betreffen jedes Jahr mehr als 300.000 Menschen in den USA.

Während sich Gerinnsel am häufigsten in den Venen der Beine bilden, können sie sich auch in anderen Bereichen bilden. Messungen von D-Dimer können verwendet werden, um Gerinnsel an einer dieser Stellen nachzuweisen. Zum Beispiel sind Blutgerinnsel in Koronararterien die Ursache von Myokardinfarkten (Herzinfarkten). Gerinnsel können sich an der Auskleidung des Herzens oder seiner Klappen bilden, insbesondere wenn das Herz unregelmäßig schlägt (Vorhofflimmern) oder wenn die Klappen beschädigt sind. Gerinnsel können sich auch in großen Arterien als Folge von Verengungen und Schäden durch Arteriosklerose bilden. Teile solcher Gerinnsel können abbrechen und eine Embolie verursachen, die eine Arterie in einem anderen Organ, wie dem Gehirn (was einen Schlaganfall verursacht) oder den Nieren verstopft.

Messungen von D-Dimer können zusammen mit anderen Tests auch angeordnet werden, um die Diagnose der disseminierten intravaskulären Gerinnung (DIC) zu unterstützen. DIC ist ein Zustand, bei dem Gerinnungsfaktoren aktiviert und dann im ganzen Körper verbraucht werden. Dadurch entstehen zahlreiche winzige Blutgerinnsel und gleichzeitig wird der Betroffene anfällig für übermäßige Blutungen. Es ist ein komplexer, manchmal lebensbedrohlicher Zustand, der aus einer Vielzahl von Situationen entstehen kann, einschließlich einiger chirurgischer Eingriffe, Sepsis, giftiger Schlangenbisse, Lebererkrankungen und nach der Geburt. Es werden Schritte unternommen, um die betroffene Person zu unterstützen, während die zugrunde liegende Erkrankung abklingt. Der D-Dimer-Spiegel wird bei DIC typischerweise sehr erhöht sein.


Martinize2 (für das das Manuskript in Vorbereitung ist) und Martinate-Codes, die in dieser Arbeit verwendet werden, sind öffentlich unter https://github.com/marrink-lab/ verfügbar. Ausführlichere Informationen finden Sie unter Zusatzcodes.

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Danksagung

Diese Arbeit wurde vom NIH (HL114453, AI156924, AI156923, CA165065, CA243142, AI145406, NS076511, NS061817, P41GM103712, R21NS094854, PA30DA035778 und P01DK096990), der Natural Science Foundation of China (81873209, 819381622050, Zentrum, Polen (Stipendium 2019/35/D/ST4/02203), 111 Project of Chinese MoE (B13038), the Local Innovative and Research Teams Project of Guangdong Pearl River Talents Program (2017BT01Y036), GDUPS (2019) und March of Dimes Prematurity Research Center an der University of Pennsylvania. Wir danken J. Guererro-Santoro für die technische Unterstützung bei der PNPLA9 KO BeWo-Zellen.


MATERIALEN UND METHODEN

DNA-Konstrukte

Capu-NT (aa 1�) und Verkürzungen von Capu-NT wurden durch PCR-Amplifikation aus einer Capu-Matrize voller Länge (CG3399, Capu-PA) erzeugt. Capu-NT-Verkürzungen wurden in pGEX-6P-2 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) zwischen den BamHallo und NichtIch Seiten. Punktmutationen wurden in Capu-CT unter Verwendung von QuikChange Site Directed Mutagenesis (Stratagene, Santa Clara, CA) eingeführt.

Proteinexpression und -reinigung

Acanthamoeba castellani Aktin-, Capu-Schwanz- und Capu-CT-Konstrukte wurden gemäß veröffentlichten Protokollen gereinigt (MacLean-Fletcher und Pollard, 1980 Vizcarra undਊl., 2011). Kurz gesagt, der Capu-Schwanz wurde als GST-Fusion exprimiert und dann vom Tag abgespalten (sofern nicht anders angegeben). Capu-CT wurde als Histidin-markiertes Konstrukt exprimiert. Wir exprimierten Capu-NT::pGEX-6P-2 in Rosetta (DE3) pLysS-kompetenten Zellen. Die Zellen wurden in Terrific Broth bei 37ଌ gezüchtet, bis sie bei 600 nm eine optische Dichte von 0,6𠄰,8 erreichten, woraufhin die Temperatur 1 h lang auf 20ଌ gesenkt wurde. Dann wurden die Zellen mit 0,25 mM Isopropyl-β-d-thiogalactosid induziert und nach 13� h geerntet. Zellpellets wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei �ଌ gelagert.

Aufgetaute Zellpellets wurden in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 7, 150 mM NaCl, 0,2 % Triton X-100, 1 mM Dithiothreitol [DTT]), ergänzt mit 1,7 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 1 μg/ml . resuspendiert DNaseI. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4ଌ oder auf Eis durchgeführt. Die Zellen wurden durch zwei Passagen durch einen Mikrofluidizer (Microfluidics, Newton, MA) lysiert. Das Lysat wurde bei 20.000 × . zentrifugiert g für 20 min und der Überstand wurde mit 1,5 ml Glutathion–Sepharose 4b Beads (GE Healthcare) für 1 h nutiert. Capu-NT wurde von der gebundenen GST durch Inkubation mit PreScission Protease (GE Healthcare) über Nacht bei 4ଌ abgespalten. Das Eluat wurde in einer Amicon 10-kDa–-Zentrifugalfiltereinheit mit Molekulargewichts-Cutoff konzentriert und dann unter Verwendung einer Superdex 200 10/300 GL-Säule (GE Healthcare Säulenpuffer: 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 0,5 M l .) gelfiltriert -Arginin, 1 mM DTT). Die Fraktionen wurden basierend auf der SDS–PAGE-Analyse gepoolt, in Lagerpuffer (10 mM Tris, pH 7, 1 mM DTT) dialysiert und dann über Nacht in 1:1 Glycerin:Lagerungspuffer gegeben. Proteinaliquote wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei �ଌ gelagert. Die resultierenden Capu-NT-Proben waren zu 98% rein (Abbildung 1B).

Bei der Reinigung von Capu-NT traten zwei Probleme auf: 1) Proteinabbau, was zu einem Dublett auf den Gelen führte, und 2) DnaK-Chaperon-Kontamination. Ersteres wurde durch Verwendung des zuvor beschriebenen Lysepuffers im Gegensatz zu der für Glutathionharz empfohlenen phosphatgepufferten Standard-Kochsalzlösung behoben. Vor der Proteasespaltung ein zusätzlicher Waschschritt unter Verwendung von Lysepuffer, ergänzt mit 5 mM ATP und 10 mM MgCl2 den größten Teil des DnaK entfernt (Pastorino undਊl., 2008). Verkürzungen von Capu-NT wurden nach dem gleichen Verfahren gereinigt.

Die Konzentrationen aller Proteine ​​werden als Konzentrationen ihrer Monomere (Untereinheiten) angegeben, um die Analyse der Wechselwirkungen zu vereinfachen. Somit entsprechen 20 nM Capu-CT 10 nM einer funktionellen Keimbildungseinheit. In ähnlicher Weise beziehen sich die hier berichteten neuen Extinktionskoeffizienten auf Monomerkonzentrationen. Um den Extinktionskoeffizienten von Capu-NT (204.855 cm 𢄡 M 𢄡) zu bestimmen, haben wir die Konzentration einer gereinigten Probe durch Aminosäureanalyse (AAA) an der University of California im Los Angeles Biopolymer Laboratory gemessen. Der Extinktionskoeffizient wurde nach dem Beerschen Gesetz berechnet (Abs = C*ε*B), wo C die Konzentration des Proteins, gemessen mit AAA, Abs ist die Absorption bei 280 nm, gemessen für die von AAA analysierte Probe, und B ist die Pfadlänge (1 cm). Der Extinktionskoeffizient von Capu(50�) (41.758 cm 𢄡 M 𢄡) wurde ähnlich bestimmt. Zur Bestimmung des Extinktionskoeffizienten von Capu(1�) (99.582 cm 𢄡 M 𢄡) haben wir Banden aus fünf verschiedenen Konzentrationen von Capu(1�) auf einem mit SyproRed (Invitrogen) gefärbten SDS–PAGE-Gel quantifiziert. . Die Gele wurden auf einem Pharos FX (Bio-Rad, Hercules, CA) abgebildet. Die Capu(1�)-Konzentration wurde mit Capu(50�) als Standard gemessen. Da Capu(1�) Tryptophan- und Tyrosinreste fehlen, haben wir seine Konzentration mit quantitativer SyproRed-Färbung mit Capu(1�) als Standard bestimmt.

Meise (Drosophila Profilin) ​​wurde ohne Affinitäts-Tag im pET17b-Plasmid in BL21 (DE3) pLysS-kompetenten Zellen exprimiert (über Nacht bei 18°C). Zellpellets wurden in Extraktionspuffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendiert und mit einem Mikrofluidizer lysiert. Das Lysat wurde bei 20.000 × . zentrifugiert g für 20 min, und der Überstand wurde mit DE52-Harz für 30 min bei 4°C inkubiert. Sowohl der Durchfluss als auch eine Extraktionspufferwäsche wurden gesammelt. Ammoniumsulfat wurde unter Rühren bei 4 °C für 15 Minuten bis zu einer Sättigung von 35 % zugegeben. Die Probe wurde bei 30.000 × . zentrifugiert g für 30min. Der Überstand wurde auf 61 % Ammoniumsulfat-Sättigung gebracht und erneut zentrifugiert und das Pellet über Nacht mit 5 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, 1 mM DTT dialysiert. Die Probe wurde durch eine Hydroxyapatit-Säule (Bio-Rad) filtriert und dann durch Gelfiltration auf einer HiLoad 26/60 Superdex 75-Säule (GE Healthcare) in 150 mM NaCl, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7 und 0,5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP). Das gereinigte Protein wurde in 50 % Glycerin, 50 % 10 mM HEPES, pH 7 und 0,5 mM TCEP schockgefroren und bei �ଌ gelagert. Die Chic-Konzentration wurde durch quantitative SyproRed-Färbung unter Verwendung von . berechnet Schizosaccharomyces pombe Profilin (1,63 OD/mg/ml) als Standard (Lu und Pollard, 2001).

Gereinigt Acanthamoeba castellani Aktin wurde mit Oregon Green 488 Iodacetamid (Life Technologies, Carlsbad, CA) auf Cystein 374 markiert. Filamentöses Aktin wurde 3𠄴 h mit 100 mM KCl, 2 mM MgCl . dialysiert2, 25 mM Imidazol, pH 7,5 und 0,2 mM ATP, um reduzierende Reagenzien zu entfernen. Das Aktin wurde über Nacht bei 4ଌ mit einem 5- bis 10-fachen molaren Überschuss an Farbstoff geschüttelt. Die Reaktion wurde mit 10 mM DTT gequencht und bei 195.000 × . zentrifugiert g. Das Pellet wurde in Actin-G-Puffer (2 mM Tris, 0,1 mM CaCl&sub2;) resuspendiert2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % Natriumazid) und dialysiert für 3𠄴 d vor der Gelfiltration auf einer Superdex 200 10/300 GL-Säule. Aktinkonzentration und Farbstoffmarkierungsprozentsatz wurden nach Kovar . berechnet undਊl. (2003) .

Pyren-Aktin-Polymerisationsassays

Pyren-Aktin-Assays wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt ( Zalevsky undਊl., 2001). Kurz gesagt, 4 μM A. castellani Actin (5% Pyren-markiert) wurde 2 min bei 25°C mit ME-Puffer (Endkonzentration, 200 μM Ethylenglycoltetraessigsäure [EGTA] und 50 μM MgCl .) inkubiert2), um Ca-G-Aktin in Mg-G-Aktin umzuwandeln. Die Polymerisation wurde durch Zugabe von KMEH-Polymerisationspuffer (Endkonzentration, 10 mM Na-HEPES, pH 7,0, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1 mM MgCl&sub2;2) zum Mg-G-Aktin. Zusätzliche Komponenten wie Capu-CT, Capu-tail und Capu-NT wurden vor der Zugabe zu Mg-G-Actin im Polymerisationspuffer kombiniert. Die Fluoreszenz wurde in einem Spektrofluorometer (Photon Technology, Birmingham, NJ) oder einem TECAN F200 mit λ . überwachtErregung = 365 nm und λEmission = 407 nm.

Widerhakenkonzentrationen bei T1/2 wurden für die Bulk-Pyren-Assays mit der folgenden Gleichung berechnet: [Stacheldraht] = Dehnungsrate/(k+ × [Aktinmonomere] − k), wo k+ = 11,6 μM 𢄡 s 𢄡 und k = 1,4 s 𢄡 (Pollard, 1986). Die Dehnungsrate wurde durch die Steigung einer Best-Fit-Linie zu den Rohdaten bei halbmaximaler Polymerisation bestimmt. Wir nahmen an, dass die Aktinmonomerkonzentration 2 μM betrug, als wir die Daten in der Nähe von . analysierten T1/2. Die Berechnung der Keimbildungsraten von Capu-CT in Gegenwart von Capu-NT erfolgte wie zuvor beschrieben (Quinlan undਊl., 2007). Kurz gesagt, mit einem benutzerdefinierten Wavelet-Analyse-basierten Algorithmus haben wir die Fluoreszenzintensitätsdaten geglättet. Die Daten der ersten 30 s wurden gegen die Zeit aufgetragen, und die Steigungen dieser Linien wurden als Geschwindigkeit der Bildung von Widerhakenenden (d. h. Keimbildungsgeschwindigkeit) genommen.

Experimente zur kompetitiven Pyrenpolymerisation wurden unter Verwendung eines kompetitiven Bindungsmodells analysiert, wie in Vinson . beschrieben undਊl. (1998) . Berechnen KD für die Capu-Schwanz/Capu-NT-Wechselwirkung haben wir die folgende Gleichung verwendet:

wo L = [Capu-Schwanz], R0 = [Capu-NT], KD ist die Affinität von Capu-CT für Capu-NT, und Kd2 ist die Affinität von Capu-tail zu Capu-NT. Bei EC50 = 3 μM, F = 0,5 und L = 3 μM. Unter diesen Bedingungen und wann KD wird mit 10 nM angenommen (Kich von Capu-CT/Capu-NT), Kd2 beträgt 333 nM.

Proteolyse

Capu-NT wurde gegen 10 mM Tris, 50 mM KCl und 1 mM DTT dialysiert und auf eine Endkonzentration von 3 &mgr;m verdünnt. Zum Zeitpunkt 0 min wurden dem Capu-NT 6 nM Trypsin zugesetzt. Zu den Zeitpunkten 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 90 und 120 min wurden Proben aus der Reaktion entnommen und zu 4 mM PMSF zugegeben, um die Proteolyse zu stoppen. Die Proben wurden gekocht und zur Visualisierung auf einem SDS–PAGE-Gel laufen gelassen. In der zweiten Bedingung wurden 50 μM Capu-Schwanz zu Capu-NT hinzugefügt, bevor Trypsin hinzugefügt wurde.

Um die Grenzen stabiler Banden nach tryptischem Verdau zu bestimmen, wurde proteolysiertes Capu-NT auf einem SDS–PAGE-Gel laufen gelassen und auf eine Immobilon-P-Membran (Millipore, Billerica, MA) übertragen. Die Banden wurden durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht und aus der Membran ausgeschnitten. Das Nevada Proteomics Center (Reno, NV) führte eine Edman-Proteinsequenzierung durch, um den N-Terminus zu identifizieren. Um die Molekulargewichte der verdauten Banden zu bestimmen, wurden sowohl unbehandelte als auch verdaute (5 min) Capu-NT durch MALDI-Massenspektrometrie analysiert (ergänzende Abbildung S3B). Capu-NT (0,5 μl von 3,2 μM) wurde mit 0,5 μl gesättigter Sinapinsäure gemischt und auf einem Voyager-DE STR MALDI-TOF-Massenspektrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA) analysiert.

Fluoreszenzanisotropie

Die Fluoreszenzpolarisationsanisotropie von 20 nM Capu-Schwanz𠄺lexa Fluor 488 (40% markiert) mit steigenden Mengen an Capu-NT, Capu(1�) oder Capu(1�) wurde mit einem Spektrofluorometer gemessen. Alle Assays wurden bei 25ଌ in 10 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EGTA, 1 mM TCEP, 0,5 mM Thesit, 50 mM KCl und 1 mM MgCl . durchgeführt2. Der Fluorophor wurde durch planpolarisiertes Licht bei 488 nm angeregt, und die Emission wurde bei 520 nm bei Winkeln parallel und senkrecht zum Einfallswinkel gemessen. Im Emissionspfad wurde ein Bandpassfilter bei 520 କ nm platziert. Die Daten wurden wie zuvor beschrieben analysiert ( Vizcarra undਊl., 2011 ).

TIRF-Mikroskopie-Assays

Deckgläser für TIRF-Elongationsassays wurden im Wesentlichen wie beschrieben hergestellt (Hansen undਊl., 2010). Kurz gesagt wurden Deckgläser durch Beschallung mit Ethanol, 1 M Kaliumhydroxid und Ethanol gewaschen, wobei nach jedem Schritt mit Milli-Q-Wasser gewaschen wurde. The coverslips were then sonicated with isopropanol (15 min), followed by 5% 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in isopropanol (30 min). Silanized coverslips were baked at 90ଌ and stored in 100% ethanol for up to 1 mo. Before PEGylation, coverslips were washed with Milli-Q water. A drop of 30 mg/ml n-hydroxylsuccinimide𠄿unctionalized polyethylene glycol (PEG-NHS 97% methoxy-PEG-NHS and 3% biotin-PEG-NHS JenKem Technology, Allen, TX) in n,n-dimethyl formamide was placed on half of the silanized coverslips. Another coverslip was placed over each drop to create a sandwich. The PEGylation reaction was carried out by incubating the sandwiches at 75ଌ for at least 2 h, followed by multiple washes with Milli-Q water. PEGylated coverslips were stored in a sealed container at 4ଌ for up to 1 mo before use.

Heavy meromyosin (HMM a gift of the Reisler lab, University of California at Los Angeles) was biotinylated using maleimide-PEG11-biotin (Thermo Scientific, Waltham, MA). HMM (0.5 mg/ml) was incubated with 0.5 mM TCEP for 30 min at room temperature. TCEP was removed using a PD10 column (GE Healthcare), and HMM was eluted in 50 mM sodium phosphate, pH 7, and 100 mM sodium chloride. A 40-fold molar excess of maleimide-PEG11-biotin was incubated with the HMM for 2 h at room temperature, followed by dialysis with 25 mM Tris, pH 8, 30 mM KCl, and 1 mM DTT, and then the same buffer was mixed with equal volume of glycerol. The biotinylated-HMM was flash frozen and stored at �ଌ. Streptavidin (VWR, Radnor, PA) was diluted to 30 μM tetramer in Milli-Q water, flash frozen, and stored at �ଌ.

Flow cells with volumes of �� μl were assembled using double-stick tape. Immediately before imaging, 25 μl of 40 nM streptavidin was applied to the flow cell for 30 s, followed by a wash with 25 μl of 1× TIRF buffer (50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7, 0.2 mM ATP, 50 mM DTT, 0.2% methylcellulose), 30 s of incubation with 25 μl of 20 nM biotinylated-HMM, and a wash with 25 μl of 1× TIRF buffer. Profilin/actin (final concentration, 1 μM actin, 16% Oregon green labeled, and 5 μM Drosophila profilin) was incubated with ME buffer for 2 min at room temperature. A solution containing 2× TIRF buffer, glucose oxidase (final concentration 0.25 mg/ml), catalase (final concentration 0.05 mg/ml), and any additional proteins (1 nM Capu-CT and/or 100 nM Capu(1�) final concentrations) was mixed with the Mg-G-actin solution. Filament elongation was visualized on a DMI6000 TIRF microscope (Leica, Wetzlar, Germany) for at least 10 min, capturing images at 10-s intervals. Filament lengths and elongation rates were analyzed with JFilament incorporated in FIJI ( Smith etਊl., 2010 ).

Bulk elongation assay

Actin (5 μM) was polymerized in 1× KMEH buffer at 25ଌ for 1 h and aliquoted into 5-μl volumes of 5 μM 1 d before an experiment. To initiate polymerization at the barbed end, we added 20% labeled 0.5 μM Mg-G-actin to the seeds. Filament assembly was tracked for 700 s. Elongation rates were calculated from the slopes between 200 and 700 s. Final concentrations of proteins were 0.25 μM actin seeds, 0.5 μM Mg-G-actin, 100 nM Capu-CT, 500 nM Capu(1�), and 0.375 nM recombinant mouse capping protein 㬑㬢. Capu-CT was mixed with buffer or Capu(1�) and incubated for 60 s at 25ଌ. Subsequently, this mix was added to the seeds and incubated for another 30 s. At this time, Mg-G-actin was added to the ME buffer (see earlier description) and incubated for 2 min at 25ଌ. After 2 min, seeds, Mg-G-actin, and 1× KMEH buffer containing either buffer blank or CP were combined and analyzed in the fluorometer. To minimize filament shearing, cut pipette tips were used to transfer the polymerization reaction to the cuvette. For the “mid-assay” addition of protein, instead of adding Capu(1�) or Spir-KIND in the beginning of the assay, we added one or the other after recording elongation for 200 s. Each condition was repeated three times.

Circular dichroism

Proteins were dialyzed into 50 mM potassium phosphate, 1 mM DTT (pH 7). Circular dichroism spectra were measured on a J-715 spectropolarimeter (Jasco, Tokyo, Japan) by averaging three wavelength scans from 195 to 280 nm. The data were analyzed using a previously described method within the Jasco and Sofsec1 software packages ( Sreerama and Woody, 1993 ). The latter compares the input data with a database of spectra from proteins with known secondary structure.

Analytical ultracentrifugation

Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation was performed on Capu-NT and Capu(1�) essentially as described ( Chen etਊl., 2012 ). Both proteins were dialyzed into 10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.5 mM TCEP (pH 7.5) and diluted to a final concentration of 2.4 μM Capu-NT or 5.0 μM Capu(1�). Proteins were spun at 50,000 rpm at 4ଌ for 3 h in an Optima XL-A Analytical Ultracentrifugation system (Beckman Coulter, Brea, CA). Data were acquired every 3 min for 50 scans. Data were analyzed with Beckman Origin-based software, version 3.01. Capu(1�) was unstable over the course of an experiment at 20ଌ. This breakdown is apparent in the analysis (Supplemental Figure S6A), where we see a clear peak at 2.7S and then trailing shoulders from that peak. Data acquired at 4ଌ were corrected for the viscosity change.

Sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation was performed at two speeds (11,000 and 13,000 rpm) with three different concentrations of Capu-NT (0.6, 1.8, and 2.8 μM). Scans collected between 24 and 28 h after speed was attained were analyzed. The same buffer conditions, centrifuge, and analysis software were used as in the velocity sedimentation experiments.

Size-exclusion column with multiangle light scattering

To analyze Capu(1�), Capu(1�), and Capu-NT with SEC-MALS, the proteins were dialyzed into 10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.5 mM TCEP overnight and spin concentrated using an Amicon 10-kDa–molecular weight cutoff centrifugal filter unit. An analytical size-exclusion column (5 μm, 300 Å, 7.8 × 300 mm Wyatt Technology, Goleta, CA) was equilibrated with phosphate-buffered saline (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2Bestellung4). In each case a 100-μl sample was loaded: 43.5 μM Capu(1�), 18.3 μM Capu(1�), or 5.8 μM Capu-NT. The smaller the size of the protein, the more protein was needed to detect light scattering signals. During elution, light scattering was measured with a miniDAWN TREOS and the refractive index (n) was measured with an Optilab T-rEX system (Wyatt Technology). The data were analyzed by ASTRA 6 software to obtain average molecular weights ( Table 1 ). Die dn/dc (wo C is concentration) for the calculation was set to 0.185 ml/g, a typical value for proteins.


Prominent Changes in Hematology and Coagulation

Since a hyperinflammatory profile consistent with cytokine storm has been robustly associated with COVID-19 severity and suggested as the predominant cause of patient mortality, most initial literature has focused on the dysregulation of immune response in COVID-19 patients and the potential value of immune modulating treatments. However, evidence of alarming coagulation abnormalities and high incidence of thrombotic events in COVID-19 patients is prevalent (70). Early reports from Wuhan, China demonstrated prolonged activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time, and elevated D-dimer as well as thrombocytopenia (20, 139, 155). In a more in-depth study of 183 patients by Tang et al., 71.4% of non-survivors and 0.6% of recovered cases met the criteria for disseminated intravascular coagulation during hospitalization (128). In addition to prolonged prothrombin time, studies in other cohorts have reported high prevalence of lupus anticoagulant in the circulation (13). Recent autopsy data from Italy also observed fibrin thrombi in pulmonary small arterial vessels in 87% of fatal cases examined, suggesting the contribution of coagulation in diffuse alveolar and endothelial damage (15). These data clearly suggest a state of hypercoagulability in severe COVID-19.

Although prominent changes in blood coagulation may be a contributing mechanism to COVID-19 mortality, its pathogenesis is estimated to be tightly linked to inflammation and cytokine release. Specifically, immunothrombosis is a phenomenon known to occur as a result of host defense against various pathogens, including viral infection (30). For example, the activation of complement pathways can lead to initiation of the coagulation cascade (30, 127). Complement-mediated pulmonary tissue damage and microvascular injury have been observed in small cohorts with severe COVID-19 (85). Procoagulant response is also associated with the inflammatory effects of cytokines in the vascular endothelium, including increased vascular permeability and damage as a result of immune-cell infiltration (62). Given the correlation of IL-6 levels with increased fibrinogen and D-dimer in severe COVID-19 patients, it is likely that cytokine-mediated procoagulant changes are partially responsible for the specific thrombosis profile observed in critically ill patients (41, 110). Presence of neutrophil extracellular traps (NETs) are also possibly linked to COVID-19 thrombosis via activation of intrinsic coagulation (8, 50, 162). Overall, the predominant mechanism seems that encompassing SARS-CoV-2-induced endothelial damage fosters monocyte recruitment and activation, along with tissue factor exposure, which then activates blood coagulation. Recruitment of neutrophils by activated endothelial cells can also synthesize and release multiple cytokines into the circulation, further accelerating this process (93). In addition to the coagulopathy observed in COVID-19, severe bleeding in patients is rare in comparison to other RNA-type viruses with hemorrhagic manifestations (30). However, a recent report in Blut characterized bleeding as a significant cause of morbidity in COVID-19 patients, emphasizing the need for randomized trials on the benefit of escalated prophylaxis (1). By taking these data into consideration, a close connection between the inflammatory and coagulation response of COVID-19 patients appears to exist, wherein treatment options for both contributing factors should be explored.


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Konkurrierende Interessen

No competing interests declared.

Autorenbeiträge

Conceptualization, Resources, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft, Writing - review and editing.

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Conceptualization, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft.



Bemerkungen:

  1. Daisar

    Ich denke, Fehler werden gemacht. Wir müssen diskutieren.

  2. Eustatius

    Igor zhzhot))))) und nicht Sie, der das Haus dort versehentlich in Brand gesteckt hat?

  3. Jaymes

    Mach etwas Ernstes

  4. Martainn

    Es ist konform, es ist die bewundernswerte Phrase



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