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Wird eine von einer Proteinsequenz abgeleitete Nukleinsäuresequenz von einem Plasmid exprimiert?

Wird eine von einer Proteinsequenz abgeleitete Nukleinsäuresequenz von einem Plasmid exprimiert?


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Ich habe eine Fasta-Datei mit der Aminosäuresequenz von Glykogenin-1: https://www.rcsb.org/fasta/entry/6EQJ

Ich möchte ein Plasmid erstellen, das Glykogenin-1 produziert.

Ist es möglich, die Glycogenin-1-Aminosäuresequenz zur Herstellung dieses Plasmids zu verwenden? Oder bräuchte man dazu die Nukleinsäuresequenz?


Mir fehlt das Wissen, um Ihre Frage vollständig zu beantworten, aber ich kann einige potenziell nützliche Informationen geben:

  • Theoretisch können Sie eine Peptidsequenz einfach in silico in eine eindeutige Nukleotidsequenz übersetzen, indem Sie die für GMOs optimierte Codon-Nutzung verwenden. Dafür kann ich ein Python-Skript freigeben.

  • Sie könnten auch leicht in Datenbanken nach der „echten“ Nukleotidsequenz suchen. Verwenden Sie zum Beispiel 'Blast', um das Gen Ihrer Peptidsequenz zu finden.

  • Aber Achtung! Es gibt bekannte Fälle von Codon-optimierten Sequenzen, die eine schlechte Proteinfaltung oder sogar (paradoxerweise) schlechtere Expressionsniveaus als die native Sequenz verursachen.

  • Es gibt Software, die beim Design von Plasmiden hilft, auch im Hinblick auf die Verwendung einzigartiger Restriktions-Visiere, um zu entscheiden, welches Ihrer Restriktionsenzyme anwendbar ist.


Vollständige Sequenz des für Protein A kodierenden Staphylokokken-Gens. Ein Gen entwickelte sich durch mehrfache Duplikationen.

Das Gen, das für Protein A aus Staphylococcus aureus kodiert, wurde durch molekulares Klonen isoliert, und es wurde gefunden, dass ein Subklon, der ein 1,8-Kilobase-Insert enthält, ein funktionelles Protein A in Escherichia coli ergibt. Die vollständige Nukleotidsequenz des Inserts, einschließlich des Strukturgens und der 5‘- und 3‘-flankierenden Sequenzen, wurde bestimmt. Ausgehend von einem TTG-Initiatorcodon ergibt ein offenes Leseraster mit 1527 Nukleotiden ein Präprotein von 509 Aminosäuren und einem vorhergesagten Mr = 58.703. Das Strukturgen wird auf beiden Seiten von palindromischen Strukturen flankiert, gefolgt von einem Abschnitt von T-Resten, was auf Transkriptionsterminationssignale schließen lässt. Somit scheint es, dass Protein A von einer monocistronischen mRNA translatiert wird. Die Sequenz zeigt umfangreiche interne Homologien, die eine 58-Aminosäureeinheit, die für die IgG-Bindung verantwortlich ist, 5-mal wiederholt werden und eine 8-Aminosäureeinheit, die möglicherweise für die Bindung an die Zellwand von S. aureus verantwortlich ist, 12-mal wiederholen. Vergleiche zwischen den wiederholten Regionen zeigen eine deutliche Präferenz für stille Mutationen, was auf einen evolutionären Druck hindeutet, die Aminosäuresequenz zu bewahren. Die Struktur des Gens weist auch darauf hin, wie sich das Gen entwickelt hat.


Bibliotheken

Eine "Bibliothek" ist ein bequemer Speichermechanismus für genetische Information.

  • Sie sind typischerweise entweder "genomische" oder "cDNA" (d. h. mRNA in DNA-Form) genetische Information.
  • Abgeleitete genetische Sequenzen aus entsprechenden Polypeptidinformationen können verwendet werden, um spezifische genetische Informationen innerhalb einer Bibliothek zu identifizieren.

Aufbau einer cDNA-Bibliothek

Das dafür verantwortliche Enzym ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase namens umgekehrte Transkriptase.

  • Reverse Transkriptasen wurden traditionell aus isoliert Viren dessen Genom tatsächlich in einer RNA-Form vorliegt und in Duplex-DNA umgewandelt werden muss.
  • Diese Viren tragen typischerweise eine funktionelle reverse Transkriptase zusammen mit ihrer genetischen mRNA-Komponente, wenn sie Zellen infizieren.
  • Eine der gängigsten kommerziell erhältlichen reversen Transkriptasen ist das Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (MMLV).
  • Dies RNA-abhängige DNA-Polymerase (wie alle Polymerasen) fügen Nukleotide zu einem neuen Polynukleotid in der 5'-zu-3'-Richtung hinzu, wobei RNA als Vorlage . Es enthält keine 3'->5'-Exonuklease-(Korrektur-)Aktivität.

MMLV verwendet mRNA als Matrize, erfordert aber a Grundierung (es kann einen DNA-Primer verlängern, aber keinen synthetisieren).

  • Eines der wirklich netten Dinge an eukaryotischen mRNAs ist das Vorhandensein von 3' Poly-A-Tracks.

Beachten Sie, dass wir produziert haben komplementäre DNA (oder cDNA) zum ursprünglichen mRNA-Strang.

Wenn wir "Nicks" in die RNA-Hälfte dieses DNA/RNA-Duplexes einführen können, dann wäre die Situation derjenigen sehr ähnlich, die bei der "Lagging-Strang"-Synthese von prokaryontischer genomischer DNA beobachtet wird.

  • Durch die Wirkung des Enzyms RNAse H können Nicks in die RNA-Hälfte des Moleküls eingebracht werden.
  • Dieses Enzym zeigt eine endonukleolytische Spaltung der RNA-Einheit von RNA/DNA-Hybriden sowie 5'->3'- und 3'->5'-Exoribonuklease-Aktivität.
  • Mit anderen Worten, es wird die RNA einschneiden und dann in beide Richtungen wieder verdauen:
  • Diese RNA-Fragmente können nun als Primer für die DNA-Synthese dienen, indem E coli Pol I. Dieses Enzym übersetzt auch die "Nicks", um die RNA-Primer effektiv zu entfernen:

Abbildung 3.6.3:DNA-Synthese

Beachten Sie, dass wir möglicherweise entweder eine restliche 5'-RNA-Cap-Region oder eine Lücke am 5'-Ende des ursprünglichen mRNA-Strangs haben werden.

Insertion von cDNA in Plasmid.

Um unseren Aufbau einer nützlichen cDNA-Bibliothek abzuschließen, brauchen wir einen Weg, um pflegen und verbreiten unsere cDNA.

  • Wir können dies erreichen, indem wir die cDNA in eine geeignete Plasmid.
  • Es gibt zwei klassische Möglichkeiten, dieses Kunststück zu vollbringen:
  1. Homopolymeres Tailing
  2. Linker-Addition

Homopolymeres Tailing

Terminale Transferase ist eine ungewöhnliche DNA-Polymerase, die nur in einer eukaryotischen Zelle namens a . vorkommt Prälymphozyten.

  • In Anwesenheit von a zweiwertiges Kation das Enzym katalysiert die Addition von dNTPs an die 3'-Hydroxyltermini der DNA.
  • Wenn das hinzuzufügende Nukleotid ein Purin ist, ist Mg 2+ das verwendete Kation.
  • Wenn das hinzuzufügende Nukleotid ein Pyrimidin ist, wird Co 2+ verwendet.
  • Je nach Reaktionsbedingungen werden drei bis mehrere Tausend Basen zugegeben.

Abbildung 3.6.4:Terminale Transferase-Aktivität

  • Schneiden wir unser Plasmid und behandeln es zusätzlich mit terminaler Transferase, außer jetzt fügen wir die ergänzende Basis zu der, die wir unserer cDNA hinzugefügt haben, können wir die cDNA anlagern und in das Plasmid ligieren.

Abbildung 3.6.5:cDNA in das Plasmid ligieren

  • Der Nutzen der Insertion des C-Schwanz-cDNA-Inserts in eine G-Schwanz-Pst I-Stelle im Vektor ist wie folgt:
  1. Die Pst I-Erkennungssequenz und -Schnittstelle ist
    5' C T G C A G 3'
    3' G A C G T C 5'
  2. Die Spaltung dieser Stelle durch Pst I, gefolgt von G-Tailing wird produzieren
    5' C T G C A (G)n G 3'
    3' G (G)n A C G T C 5'

Linker

Ein alternatives Verfahren zum Einfügen von cDNA-Fragmenten in einen Bibliotheksvektor besteht in der Zugabe von "Linkern".

    Linker sind kurze Oligonukleotide (

Die Schritte bei der Linker-Addition sind wie folgt:

  1. Behandlung von cDNA mit S1-Nuklease (um mögliche 5'-Cap-mRNA-Fragmente zu entfernen, die im cDNA-Duplex verbleiben
  2. Konvertieren Sie potenzielle "ragged" -Enden durch Behandlung mit Pol I in stumpfe (füllt 5'-Überhänge auf und kaut 3'-Überhänge zurück)
  3. cDNA an potenziellen internen Eco RI-Stellen durch Behandlung mit Eco RI-Methylase (plus S-Adenosylmethionin) methylieren
  4. Ligieren Sie Linker mit stumpfer, methylierter cDNA mit T4-DNA-Ligase
  5. Linker mit Eco RI Restriktionsendonuklease schneiden
  6. Entfernen Sie Linkerfragmente von cDNA-Fragmenten durch Agarosegelelektrophorese
  7. cDNA an Vektor-DNA-Fragment ligieren (geöffnet durch Eco RI-Restriktionsendonuklease

Dieses Lehrbuch wurde 1998 veröffentlicht. Das Human Genome Project wurde 2003 abgeschlossen.


Rekombinante DNA-Technologie: Top 8 Techniken

Die folgenden Punkte heben die acht wichtigsten Techniken der rekombinanten DNA-Technologie hervor. Einige der Techniken sind: 1. Aufbau der Genbibliothek 2. Spezifisches Genscreening aus Bibliotheken 3. Chromosomenwandern und Genklonen 4. Untersuchung des DNA-Polymorphismus durch Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Technik 5. Southern-Blotting-Verfahren und andere.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik Nr. 1.

Aufbau der Genbibliothek:

Es ist sehr schwierig, ein bestimmtes Gen aus der enormen Anzahl von Genen im Pflanzengenom zu isolieren. Es ist sehr vorteilhaft, diese Gene in Form einer Genbibliothek zur Verfügung zu stellen, die aus zwei verschiedenen Arten besteht – der genomischen DNA-Bibliothek und der cDNA-Bibliothek.

Eine genomische DNA-Bibliothek repräsentiert das gesamte Spendergenom. Durch Spaltung des Gesamtgenoms des Organismus mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen kann eine genomische Bibliothek hergestellt werden. Die resultierenden Fragmente können etwa 15 bis mehrere hundert kbp groß sein, die häufig nur Teile von Genen enthalten.

Jedes Fragment wird dann in ein geeignetes Plasmid oder einen geeigneten Bakteriophagenvektor inseriert und dann wird jedes Fragment durch Klonieren, üblicherweise in Bakterien, Viren oder Hefen, amplifiziert. Eine Ziel-DNA-Sequenz wird identifiziert, subkultiviert und als Zelllinien gehalten, die als Genbank oder Klonbank bekannt sind.

Eine cDNA-Bibliothek stellt nur transkribierte Gene dar, was für eukaryontische Strukturgene gut geeignet ist. Es wird auf folgende Weise zubereitet.

Aus einem bestimmten Gewebe werden die mRNA-Moleküle isoliert und dann durch reverse Transkriptase in entsprechende cDNAs transkribiert. Die cDNAs werden dann in einen geeigneten Vektor inseriert und durch Klonierung amplifiziert. Die cDNA enthält keine Introns. Nach der Transformation werden die cDNAs in Prokaryonten exprimiert.

Zur Expression muss der cDNA ein prokaryontischer Promotor hinzugefügt werden, da dieser keinen Promotor enthält. Die eukaryotische mRNA enthält am 3′ -Ende einen Poly(A)-Schwanz, der es ermöglicht, die mRNA durch Affinitätschromatographie von den anderen RNAs zu trennen. Das Säulenmaterial besteht aus Polydesoxythymidin-Oligonukleotid (poly dT)-verknüpften festen Partikeln aus Cellulose oder anderen Materialien.

Wenn die aus einem Gewebe extrahierte Gesamt-RNA-Fraktion auf die Säule geladen wird, binden die mRNA-Moleküle an die Säule durch Hybridisierung ihres Poly(A)-Schwanzes an das Poly(dT) des Säulenmaterials, und die anderen RNAs werden ausgewaschen. Mit einem geeigneten Puffer wird dann die gebundene mRNA von der Säule eluiert.

Auf der isolierten mRNA-Matrize werden cDNA-Stränge durch reverse Transkriptase hergestellt. Das an den Poly(A)-Schwanz gebundene Poly(dT)-Fragment wird als Primer für das Enzym verwendet. Die mRNA wird dann durch RNase H teilweise abgebaut, um mRNA-Fragmente zu bilden, die als Primer für die Synthese des zweiten cDNA-Strangs durch DNA-Polymerase dienen können.

Mittels DNA-Polymerase I werden diese mRNA-Fragmente sukzessive durch DNA-Fragmente ersetzt und diese dann durch DNA-Ligase miteinander verknüpft.

An seinem 5′-Ende verbleibt ein kurzes RNA-Fragment, was von untergeordneter Bedeutung ist, da die meisten mRNAs an seinem 5′-Ende nicht-kodierende Bereiche enthalten. Die so aus mRNA-Molekülen gebildeten doppelsträngigen cDNA-Moleküle werden dann durch Klonieren unter Verwendung von Plasmiden oder Bakteriophagen als Klonierungsvektoren amplifiziert.

In Phagen kann eine Genbank konserviert werden. Die Phagen-DNA besitzt eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease EcoRI. Die cDNA-Doppelhelix wird zuerst durch eine EcoRI-Methylase an EcoRI-Restriktionsstellen methyliert, um die Restriktionsstelle innerhalb der cDNA zu schützen. Chemisch synthetisierte doppelsträngige Oligonukleotide (so genannte Linker) werden dann an beiden Enden des cDNA-Doppelstrangs durch T4 DNA-Ligase.

Die Restriktionsendonuklease EcoRI verursacht versetzte Schnitte der beiden DNA-Stränge, wobei an jedem resultierenden Ende vier Nukleotide eines Strangs ungepaart bleiben. Diese ungepaarten Enden werden als klebrige Enden bezeichnet, da sie miteinander oder mit komplementären klebrigen Enden anderer DNA-Fragmente ein Basenpaar bilden können.

EcoRI spaltet also den Linker sowie die k-Phagen-DNA, um klebrige Enden zu bilden, was zur Paarung der komplementären Basen der cDNA- und Phagen-DNA-Enden führt. Schließlich erfolgt die Ligation der DNA-Stränge durch T4 DNA-Ligase. Somit wird cDNA in den Vektor eingefügt.

Eine Genbank kann auch in Plasmiden konserviert werden. Zu diesem Zweck wird eine cDNA in Plasmide ähnlich wie bei der Insertion in Phagen-DNA inseriert. Die rekombinanten Plasmide werden dann in E. coli-Zellen übertragen, indem die Zellen mit CaCl&sub2; behandelt werden2 ihre Membran für das Plasmid durchlässiger zu machen und mit einem kurzen Hitzeschock.

Die Plasmidvektoren enthalten ein Antibiotikaresistenzgen, das die Bakterien gegen Ampicillin oder Tetracyclin resistent macht. Wenn ein solches Antibiotikum dem Kulturmedium zugesetzt wird, überleben nur die transformierten Zellen, nach dem Ausplattieren auf Agarkulturmedium entwickeln sich Bakterienkolonienflecken.

Es werden Plasmidvektoren konstruiert, bei denen die Restriktionsschnittstelle innerhalb des β-gaIactosidase-Gens verbleibt. Das Galactosidase-Enzym hydrolysiert das farblose X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) zu einem unlöslichen blauen Produkt.

Die rekombinanten Plasmide mit DNA-Inserts besitzen kein intaktes β-Galactosidasegen und können das funktionelle Enzym nicht produzieren. Auf dem Kulturmedium der Agarplatte, das X-Gal enthält, werden blaue und weiße Kolonien erzeugt. Die farblosen Kolonien werden als Zellen ausgewählt, die Plasmide mit DNA-Inserts enthalten.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik # 2.

Spezifisches Genscreening aus Bibliotheken:

Zum Screenen von Bakterienkolonien von Phagenplaques, die das gewünschte Gen enthalten, werden spezifische Sonden verwendet. Auf die auf der Agaroberfläche wachsenden Bakterienkolonien oder Phagenplaques wird eine Nylon- oder Nitrozellulosemembran aufgebracht. Einige der Bakterien oder Phagen binden an die Blotting-Membran.

Um die an die Blotting-Membran gebundenen Bakterien- oder Phagenklone zu screenen, werden zwei Arten von Sonden verwendet, wie:

(1) Spezifische Antikörper zur Identifizierung des als Genprodukt des gewünschten Klons produzierten Proteins

(2) Spezifische radioaktive DNA-Sonden zur Markierung der cDNA des gewünschten Klons durch Hybridisierung.

(a) Antikörper-Screening-Technik:

Bei dieser Technik wird eine ausreichende Menge an Protein, das durch das interessierende Gen kodiert wird, vorher gereinigt, so dass polyklonale Antikörper gegen das Protein durch Immunisierung in einem geeigneten Tier hergestellt werden können.

Zum Antikörper-Screening:

1. Die cDNA-Bibliothek muss neben einem Promotor eingefügt werden, der die Initiation der Transkription des eingefügten Gens kontrolliert. Dies wird als Expressionsvektor bezeichnet. Eine Kolonie von Wirtszellen wird auf festes Medium ausplattiert, das Antibiotika enthält.

2. Die resultierende mRNA wird dann in das entsprechende Protein translatiert, das vom Antikörper erkannt wird. Wenn sich auf der Platte eine diskrete Kolonie gebildet hat, wird sie dann auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die genaue Position der Zellkolonie auf der Platte wird auf der Matrix beibehalten.

Die Ausrichtung der Blotting-Membran ist so markiert, dass die sichtbaren Flecken auf der Membran den Orten spezifischer Bakterienkolonien von Phagenplaques entsprechen, die DNA-Insert enthalten, die später von der Platte abgenommen werden können.

3. Die an den Filter gebundenen Bakterien werden aufgebrochen und die freigesetzten Bakterienproteine ​​werden an der Membran fixiert, während die Phagen selbst lysieren und so die Zellproteine ​​freisetzen, die dann am Filter fixiert werden. Das Protein wird dann auf der Membran unter Verwendung des Western-Blotting-Verfahrens sichtbar gemacht.

4. Bei diesem Verfahren werden Antikörper zur spezifischen Bindung mit dem entsprechenden Protein zugegeben, aber von allen anderen Teilen der Membran abgewaschen.

5. Ein zweiter Antikörper, entweder radioaktiv markiert oder fluoreszenzmarkiert oder enzymkonjugiert, wird verwendet, um den ersten gebundenen Antikörper nachzuweisen. Die Blotting-Membran wird dann gewaschen, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.

6. Eine positive Kolonie ist im Autoradiogramm als dunkler Fleck zu erkennen (Abb. 17.14). Die positive Kolonie wird verdünnt aufgenommen und auf eine andere Agarplatte ausplattiert und der Vorgang wird durch Screening wiederholt, um einen einzelnen reinen Klon zu erhalten. Positive Phagenplaques werden auch in Bakterien erneut gezüchtet und erneut ausplattiert, um reine Klone zu erhalten.

(b) Screening durch spezifische DNA-Sonde:

Grundsätzlich beinhaltet diese Screening-Technik die Hybridisierung zwischen einer markierten DNA-Sonde und einer Ziel-DNA-Sequenz. Bei dem Verfahren werden auf der Membran vorhandene Bakterien oder Phagen lysiert und die Proteine ​​entfernt.

Die fest gebundene DNA wird dann in Einzelstränge aufgelöst. Als Sonden werden dann 32P-markierte Desoxynukleotidsequenzen verwendet, die zu dem membrangebundenen DNA-Strang komplementär sind. Diese binden durch Hybridisierung an die gewünschte cDNA, die auf der Blotting-Membran vorhanden ist. Die Identifizierung der positiven Klone erfolgt durch Autoradiographie.

Abhängig von den Techniken ist das Screening durch DNA-Sonden von den folgenden Typen:

ich. Oligonukleotid-Screening:

Bei dieser Screening-Technik wird eine chemisch synthetisierte Oligonukleotidsonde verwendet, um cDNA-Klone zu isolieren. Eine Oligonukleotidsonde ist ein kurzes DNA-Segment, das normalerweise 10 bis 50 Nukleotide lang ist und am 5′-Ende mit 32P-Phosphat radioaktiv markiert ist. Die Technik wird nur angewendet, wenn das Genprodukt in sehr geringer Menge verfügbar ist, die nicht ausreicht, um Antikörper zu erzeugen.

Durch Mikrosequenzierung wird die N-terminale Aminosäuresequenz dieses Proteins bestimmt. Aus diesen Informationen wird die entsprechende DNA-Sequenz abgeleitet, um Oligonukleotidsonden durch chemische Synthese unter Verwendung eines automatischen Synthesizers herzustellen.

Es werden degenerierte Oligonukleotide hergestellt, die alle möglichen Sequenzen zum Codieren der gegebenen Aminosäuresequenz enthalten. Diese radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden hybridisieren mit der gewünschten cDNA, die auf der Blotting-Membran vorhanden ist. Positive Klone werden durch Autoradiographie identifiziert.

ii. Heterologes Sonden-Screening:

Heterologe Sonden sind cDNA-Klone, die zuvor von einer anderen Spezies erhalten wurden. Diese werden verwendet, um eine spezifische cDNA-Bibliothek zu screenen, die aus der mRNA einer anderen Spezies hergestellt wurde. Sie wird erfolgreich, wenn eine ausreichende Sequenzhomologie der Gene zwischen den beiden Arten besteht.

iii. Transposon-Tagging:

Transposons sind diskrete DNA-Sequenzen, die innerhalb des Genoms einer Pflanze springen können, was manchmal zur Fehlfunktion eines funktionellen Gens aufgrund einer Störung seiner korrekten Sequenz führt. Die Transposons werden mit Hilfe eines Enzyms transponiert aus einer Position im Genom herausgeschnitten und an einer anderen Position im Genom wieder zusammengefügt.

Die Markierung eines Gens mit einem inserierten Transposon wird als Transposon-Gen-Tagging bezeichnet. Eine radioaktiv markierte DNA-Sonde basierend auf der bekannten Transposonsequenz wird verwendet, um durch DNA-Hybridisierung die Region des Genoms zu identifizieren, in der das Transposon markiert wurde. Ein solcher identifizierter Bakterienklon wird das interessierende Gen enthalten.

NS. Differenzielles Screening:

Ein differentielles oder (±)-Screening-Verfahren wird verwendet, um einen interessierenden physiologischen Prozess zu verfolgen. Bei diesem Verfahren wird die differentielle Expression von Genen vor und nach der Induktion verwendet. Zum Beispiel werden viele Auxin-induzierte Gene dereprimiert, um nach der Auxin-Behandlung mRNA zu produzieren. Aus der nach der Auxin-Behandlung produzierten mRNA kann eine cDNA-Bibliothek hergestellt werden.

Radioaktiv markierte cDNA-Sonden werden aus der mRNA von sowohl induzierten als auch nicht-induzierten Geweben hergestellt. Das Screening-Verfahren ist das gleiche wie für die Verwendung von Oligonukleotiden beschrieben. Jede Bakterienkolonie mit dem Insert, das ein induziertes Gen darstellt, hybridisiert nur mit den cDNA-Sonden, die aus induzierter mRNA hergestellt wurden. Es wird in Northern Blots bestätigt.

v. Isolierung von Genen durch Komplementierung:

Gene, die für unbekannte Proteine ​​kodieren, können durch Komplementierung von Mangelmutanten von Bakterien oder Hefe nach Transformation mit Plasmiden aus einer cDNA-Bibliothek isoliert werden. Das Protein ist nur durch seine Funktion bekannt. Die Gene für Saccharose-Translokatorproteine, die an der Beladung des Phloems beteiligt sind, wurden durch Komplementation identifiziert. Zu diesem Zweck wurde eine Hefemangelmutante verwendet.

Die Mutante hatte aufgrund eines defekten Saccharose-Translokator-Gens die Fähigkeit verloren, Saccharose aufzunehmen, und konnte daher Saccharose nicht mehr als Kohlenstoffquelle verwenden. Diese Mutante wurde mit Plasmiden aus einer Pflanzen-cDNA-Bibliothek transformiert, die unter der Kontrolle des Hefe-Promotors exprimiert wurden.

Nach dem Plattieren wurde gefunden, dass ein Hefeklon auf dem Saccharose enthaltenden Medium wuchs, was die Erzeugung von Pflanzensaccharose-Translokatorprotein innerhalb der transformierten Hefezellen anzeigte. Dabei wurden positive Hefeklone amplifiziert, die Plasmid-cDNA isoliert und sequenziert. Aus der cDNA-Sequenzierung wurde die Aminosäuresequenz des Saccharose-Trans-Locator-Proteins bestimmt.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik # 3.

Chromosomenwandern und Genklonen:

Die Eigenschaften eines Organismus hängen von den DNA-Basensequenzen seines Genoms ab. Diese Basensequenz unterscheidet sich nicht nur zwischen verschiedenen Arten, sondern auch zwischen Individuen derselben Art. Genetische Karten werden auf der Grundlage der Rekombinationsfrequenzen der phänotypischen Merkmale eines Organismus erstellt.

Die Karte zeigt den relativen Abstand zwischen zwei Genen auf einem Chromosom. Der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) von DNA kann verwendet werden, um Unterschiede in den Genen innerhalb einer Spezies ohne einen detaillierten Sequenzvergleich nachzuweisen. RFLP von DNA kann als genetische Marker verwendet werden.

Dies basiert auf der Verwendung bakterieller Restriktionsendonukleasen, die eine DNA an einer spezifischen palindromischen Erkennungssequenz, bekannt als Restriktionsstelle, spalten, was zu einem Polymorphismus der Restriktionsfragmentlänge führt.

Für den Zweck des Chromosomen-Walkings wird zuerst eine genomische Bibliothek der interessierenden Pflanze erstellt. Die DNA wird mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme in überschaubare Fragmente geschnitten. Die Fragmente werden unter Verwendung geeigneter Vektoren zur Vermehrung in Bakterien eingeführt, um eine Population chimärer Vektoren zu erzeugen.

Um Fragmente bestimmter Abschnitte des Genoms zu selektieren, werden markierte DNA-Sonden hergestellt. Dazu wird ein bestimmter DNA-Abschnitt des Chromosoms gefunden, der sich in der Nähe des interessierenden Gens befindet.

Dieser DNA-Abschnitt wird durch einen Plasmidvektor in E. coli eingeführt und dann vermehrt. Anschließend werden die Plasmide isoliert und die vervielfältigten DNA-Abschnitte wieder ausgeschnitten, isoliert und radioaktiv markiert. Diese Sonden werden RFLP-Marker genannt.

DNA-Restriktionsfragmente werden mit den markierten Sonden durch das Southern-Blot-Verfahren analysiert. Da es möglich ist, Tausende von Restriktionsfragmenten aus einem Genom eines bestimmten Organismus zu klonen und zu identifizieren, können mit RFLPs genetische Marker erhalten werden, die ein gesamtes Genom abdecken. Somit können genetische Karten auf der Grundlage von RFLP-Markern verwendet werden, um Gene zu klonen, die mit einem bestimmten RFLP verknüpft werden können.

Dies geschieht, indem man von der Stelle des bekannten RFLP zu dem genauen Ort des interessierenden Gens geht. Die genomische Bibliothek wird mit einem klonierten Restriktionsfragment, das mit dem interessierenden Gen rekombiniert ist, sondiert. DNA-Inserts von diesen Klonen werden mit Restriktionsenzymen verdaut und eine Karte der Reihenfolge der DNA-Segmente wird erstellt.

DNA-Fragmente, die die Enden der Inserts darstellen, werden isoliert und als hybridisierende Sonden verwendet, um zusätzliche Klone aus der Bibliothek zu screenen.

Jeder neue Klon enthält DNA-Inserts, bei denen es sich um Sequenzen handelt, die vom vorherigen Insert fortgesetzt wurden. Dieser Gehzyklus wird mehrmals wiederholt, bis die gewünschte Position erreicht ist. Das Chromosomen-Walking ist ein mühsamer und zeitaufwendiger Prozess.

RFLP-Marker werden nach Mendelschen Prinzipien vererbt. Diese werden verwendet, um eine bestimmte Sorte zu charakterisieren. Mehrere Sonden werden in parallelen Messungen und in der Pflanzensystematik verwendet, um phylogenetische Bäume zu etablieren. Als markierte Sonden können definierte Restriktionsfragmente verwendet werden, um bestimmte Gene auf dem Chromosom zu lokalisieren.

Mit dieser Technik wurden Chromosomenkarten für Arabidopsis, Kartoffel, Tomate und Mais erstellt.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik Nr. 4.

Untersuchung des DNA-Polymorphismus durch Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Technik:

Durch die Amplifikation zufällig gewonnener DNA-Fragmente ist es möglich, die Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen von Individuen oder Varietäten einer Art zu analysieren. Diese zufällige amplifizierte polymorphe DNA (RAPD)-Technik ist viel einfacher zu handhaben und wird in sehr kurzer Zeit breit angewendet.

Das Prinzip der Technik ist die 1984 von Kary Mullis erfundene Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Ausgewählte DNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 2-3 kb können bei dieser Methode durch DNA-Polymerase amplifiziert werden. Für diese Amplifikation sind Oligonukleotidprimer erforderlich. Zwei Oligonukleotide, die jeweils zu einer kurzen Sequenz in einem Strang des gewünschten DNA-Segments komplementär sind, werden synthetisiert.

Die Primer sind direkt hinter dem Ende der zu amplifizierenden Sequenz positioniert. Im ersten Schritt wird die isolierte DNA, die das zu klonierende Segment enthält, kurz auf etwa 95 °C erhitzt, um sie in Gegenwart eines Überschusses der gekühlten synthetischen Oligonukleotid-Primer zu denaturieren.

Im nächsten Schritt wird eine hitzestabile DNA-Polymerase namens Taq I aus Thermus aquaticus, die in heißen Brunnen lebt, isoliert und die Vorstufe Desoxynukleosidtriphosphate hinzugefügt.

Das geprimte DNA-Segment wird dann selektiv repliziert. Die Schritte werden dann innerhalb weniger Stunden durch 25 oder 30 solcher Zyklen wiederholt. Die amplifizierten DNA-Segmente können leicht isoliert und kloniert werden. Da bei der Polymerase-Kettenreaktion die Anzahl der gebildeten DNA-Moleküle exponentiell mit der Anzahl der Zyklen multipliziert wird, können sehr kleine DNA-Proben vervielfacht werden.

Im ersten Schritt wird die neu gebildete DNA-Länge an einem Ende nicht eingeschränkt. Immer wenn der Primer an die komplementäre Basensequenz des neu gebildeten DNA-Strangs bindet, entsteht im nächsten Zyklus ein Produkt, dessen Länge durch beide Primer eingeschränkt wird.

Die großen Mengen amplifizierter Produkte einzelner DNA-Fragmente können durch Gelelektrophorese getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt werden. Die Fragmente sind als fluoreszierende Banden unter UV-Chromatolicht nachweisbar. Eine Änderung der Primersequenz kann unterschiedliche DNA-Fragmente erzeugen. Eine Vielzahl von synthetischen Oligonukleotidprimern ist im Handel erhältlich.

Die RAPD-Technik ist empfindlich genug, um in fast jeder Art von Probe nur ein DNA-Molekül nachzuweisen. Die Technik ist sehr schnell und erfordert weder die Herstellung von Sonden noch das zeitaufwendige Verfahren eines Southern-Blots.

Es wurde verwendet, um DNA-Fragmente von Mumien und Überresten ausgestorbener Tiere zu klonen. Es ist auch ein wirksames neues Werkzeug in der Gerichtsmedizin. Es wird auch in der pränatalen Diagnostik genetischer Erkrankungen eingesetzt. Da die RAPD-Technik die Unterscheidung zwischen den Sorten einer Art ermöglicht, ist sie zu einem wichtigen Werkzeug in der Züchtung geworden.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik Nr. 5.

Southern-Blotting-Verfahren:

Southern-Blotting ist eine Technik der DNA-Hybridisierung, bei der ein oder mehrere spezifische DNA-Fragmente in einer großen Population mittels Hybridisierung an eine markierte komplementäre Nukleinsäuresonde nachgewiesen werden. Die Methode wurde 1975 von Edward Southern entwickelt. Die Restriktionsfragmente werden zunächst durch Elektrophorese in einem Agarosegel der Länge nach fraktioniert. Die Beweglichkeit des kleinsten Fragments ist am größten.

Nach dem Denaturieren werden die segregierten Fragmente im Gel durch Auflegen der Membran auf das Gel auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran übertragen. Ein Fluss eines geeigneten Puffers durch das Gel eluiert DNA-Fragmente und blot sie auf die Membran. Die Membran ist mit einem Stapel Seidenpapier bedeckt.

Die gebundenen DNA-Fragmente werden durch den Puffer in Einzelstränge dissoziiert. Nach dem Blotting wird die Membran 1-2 Stunden auf 80 °C erhitzt oder UV-Licht ausgesetzt, um DNA-Moleküle an der Membran zu fixieren. Eine markierte DNA-Sonde, die bei Zugabe eine spezifische Sequenz eines interessierenden Gens darstellt, wird an einen DNA-Strang hybridisiert, der an die Membran gebunden ist.

Nach Entfernen der ungebundenen Sonden durch Waschen werden die hybridisierten DNAs durch Autoradiographie identifiziert. Die Position der Bande auf dem Blot hängt dann mit ihrer Wanderung und damit ihrer Größe zusammen (Abb. 17.19).

Rekombinante DNA-Technologie: Technik # 6.

Western-Blotting-Verfahren:

Western Blotting ist eine immunologische Methode, die verwendet wird, um die Expression eines Gens auf Proteinebene zu quantifizieren. Unter Verwendung der Nukleotidsequenzinformation kann ein Peptid synthetisiert werden, indem die Aminosäuren in einer spezifischen Sequenz chemisch verbunden werden. Ein solches synthetisches Peptid kann verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen.

Der Antikörper kann verwendet werden, um die von dem Gen kodierten Proteine ​​nachzuweisen. Die empfindliche Quantifizierung eines spezifischen Proteins erfolgt durch Western-Blotting. Aus den Geweben werden Gesamtproteine ​​in einem geeigneten Puffer extrahiert und durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen aufgetrennt.

Die aufgetrennten Proteine ​​werden dann elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, die dann entweder mit radioaktiv markierten oder enzymgebundenen Antikörpern sondiert wird. Die Radioaktivität wird auf dem fotografischen Film nachgewiesen und die enzymgebundenen Antikörper erzeugen eine Farbe auf der Membran, die durch Densitometrie-Scanning quantifiziert werden kann. Die Methode wurde 1981 von Burnette entwickelt.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik # 7.

Northern-Blotting:

Durch Northern-Blotting-Verfahren erfolgt die Quantifizierung der Expression eines Gens auf RNA-Ebene durch RNA-DNA-Hybridisierung. Die Technik wurde 1980 von Thomas entwickelt. Bei dieser Methode werden entweder Gesamt-RNAs oder Poly(A)-mRNAs aus den Geweben isoliert. Die größenbasierte Trennung der RNAs erfolgt durch Agarosegelelektrophorese in Gegenwart von Formaldehyd oder Methylquecksilber als Denaturierungsmittel.

Wie beim Southern-Blotting wird eine Nitrozellulosemembran auf das Gel gelegt und die RNA-Moleküle werden aus dem Gel eluiert und auf die Membran geblottet, während ein geeigneter Puffer durch das Gel fließen kann. Die aufgetrennten RNAs können auch durch Elektrophorese auf die Membran übertragen werden.

Die übertragenen RNAs werden auf der Membran entweder durch 1 – 2 Stunden langes Backen bei 60 °C oder durch Bestrahlung mit UV-Licht fixiert. Eine zu dem interessierenden Gen komplementäre radiomarkierte DNA-Sonde wird dann mit der RNA auf dem Filter hybridisieren gelassen, um die komplementären mRNA-Spezies zu screenen, die dann durch ein beliebiges geeignetes Standardverfahren quantifiziert werden.

Rekombinante DNA-Technologie: Technik # 8.

Slot-Blot-Analyse:

Die Slot-Blot-Analyse ist eine Modifikation des Northern-Blotting-Verfahrens. Dies wird zur schnellen Bestimmung der Spiegel ausgewählter mRNA-Spezies verwendet. Bei diesem Verfahren werden Gesamt-RNAs oder Poly(A)-RNAs, anstatt sie auf einem Agarosegel aufzutrennen, direkt auf einen Nitrozellulosefilter mittels einer Slot-Blot-Vorrichtung geblottet. Die anschließende Verarbeitung ist dieselbe wie oben beschrieben.


CDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz eines Maus-DNA-Reparaturenzyms (APEX-Nuklease) mit signifikanter Homologie zu Escherichia coli-Exonuklease III

Wir haben ein Maus-DNA-Reparaturenzym mit Apurin/Apyrimidin-Endonuklease-, DNA-3'-Phosphatase-, 3'-5'-Exonuklease- und DNA-3'-Reparaturdiesterase-Aktivitäten gereinigt und das Enzym als APEX-Nuklease bezeichnet. Ein cDNA-Klon für das Enzym wurde aus einer Maus-Milz-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Sonden von degenerierten Oligonukleotiden isoliert, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz des Enzyms abgeleitet wurden. Die vollständige Nukleotidsequenz der cDNA (1,3 Kilobasen) wurde bestimmt. Die Northern-Hybridisierung unter Verwendung dieser cDNA zeigte, dass die Größe ihrer mRNA etwa 1,5 Kilobasen beträgt. Die vollständige Aminosäuresequenz für das Enzym, die aus der Nukleotidsequenz der cDNA (APEX-Nuklease-cDNA) vorhergesagt wurde, zeigt an, dass das Enzym aus 316 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 35.400 besteht. Die vorhergesagte Sequenz enthält die partiellen Aminosäuresequenzen, die von einem Proteinsequenzierer aus dem gereinigten Enzym bestimmt wurden. Die kodierende Sequenz der APEX-Nuklease wurde in pUC18 SmaI- und HindIII-Stellen im Kontrollrahmen des lacZ-Promotors kloniert. Das Konstrukt wurde in Zellen des Stammes BW2001 (xth-11, nfo-2) von Escherichia coli eingeführt. Die transformierten Zellen exprimierten ein 36,4-kDa-Polypeptid (die 316-Aminosäure-Sequenz der APEX-Nuklease, an deren Spitze das N-terminale Decapeptid der Beta-Galactosidase steht) und waren gegenüber Methylmethansulfonat weniger empfindlich als die Elternzellen. Das Fusionsprodukt zeigte eine Priming-Aktivität für DNA-Polymerase auf Bleomycin-geschädigter DNA und säuredepurinierter DNA. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Maus-APEX-Nuklease zeigt eine signifikante Homologie zu denen der Exonuklease III von E. coli und dem ExoA-Protein von Streptococcus pneumoniae und eine intensive Homologie mit der der Rinder-AP-Endonuklease 1.


Danksagung

Wir danken Herrn Witoon Tirasophon und Dr. Betty Jo Brown für wertvolle Anregungen während des Genklonierungsprozesses. Wir danken Frau Mariliz Ortiz-Maldonado für die Bereitstellung von PHBH für einen Standard zur Proteinbestimmung und Dr. Brian Guenther für Vorschläge zur Proteindatenbanksuche. Diese Arbeit wurde vom U.S. Public Health Service, Grants GM 20877 (D.P.B.) und GM 11106 (V.M.) und dem Development and Promotion of Science and Technology Talent Project, Thailand (P.C.) unterstützt.


Wird eine von einer Proteinsequenz abgeleitete Nukleinsäuresequenz von einem Plasmid exprimiert? - Biologie

Die „klassischen“ Nitroreduktasen enterischer Bakterien sind Flavoproteine, die die Reduktion verschiedener Nitroaromaten zu hochtoxischen, mutagenen oder kanzerogenen Metaboliten katalysieren. The gene for the nitroreductase Enterobacter cloacae has now been cloned using an antibody specific to this protein. The nucleotide sequence of the structural gene and flanking regions are reported. Sequence analysis indicates that this gene belongs to a gene family of flavoproteins which have not been previously described. Analysis of the 5'-untranslated region reveals the presence of putative regulatory elements which may be involved in the modulation of the expression of this enzyme. The cloned gene was placed under the control of a T7 promoter for overexpression of the protein in Escherichia coli. The expressed recombinant protein was purified to homogeneity and exhibited physical, spectral, and catalytic properties identical to the protein isolated from E. cloacae.

This paper is dedicated to the memory of Marlene A. DeLuca who passed away November 18,1987. Her presence in our lives as teacher, scientist, mentor, and friend will be deeply missed.

The nucleotide sequence(s) reported in this paper has been submitted to the GenBank TM /EMBL Data Bank with accession number(s) M37085.


Transformation and plasmid isolation

Once cloning is completed, plasmids are taken up into competent cells (chemically competent or electrocompetent E coli) for propagation and storage, by a process called transformation. Chemically competent cells are cells treated with salts to open up the pores in the membrane and cell wall. Plasmid DNA is then added to the cells and a mild heat shock opens pores in the E coli cells, allowing for entry of the plasmid. In contrast, DNA is introduced into electrocompetent cells through transient pores that are formed in the E coli membrane and cell wall when short electrical pulses are delivered to the cell and plasmid DNA mixture. When choosing a competent cell strain to work with, it is important to consider the following factors:

  • Genotyp—the list of genetic mutations (deletions, changes, or insertions) in the strain that distinguish it from wild-type E coli
  • Transformation efficiency—measurement of amount of supercoiled plasmid (such as pUC19) successfully transformed into a volume of cells defined as colony forming units per microgram of DNA delivered (cfu/μg) we manufacture competent cells that have efficiencies ranging from >1 x 10 6 to >3 x 10 10 cfu/μg
  • Anwendung—experiment type for which the competent cells are well suited applications include routine cloning, protein expression, library production, cloning unstable DNA, ssDNA propagation, bacmid creation, and Cre-Lox recombination
  • Kit format—formats include high-throughput (96 well), single-use Invitrogen One Shot vials, standard kits, or bulk format

After taking advantage of the E coli’s molecular machinery to replicate the plasmid DNA, a plasmid purification kit can be used to purify the plasmid.

DNA (containing your gene of interest). We offer two main technologies for plasmid purification:

For purification of a cloned plasmid that will be used to transfect into a cell line for protein expression, we recommend anion exchange purification for its higher purity and lower endotoxin levels. Silica-based purification is appropriate for cloning related workflows, but not optimal for plasmids used for transfection as there are higher levels of endotoxins and impurities. Anion exchange columns also produce better results with large plasmids. The Invitrogen PureLink HiPure Expi Plasmid Kits have been developed to give higher yields from large-scale plasmid isolation, in less than half the time of typical plasmid DNA isolation methods.


Inhalt

Prior to the 1970s, the understanding of genetics and molecular biology was severely hampered by an inability to isolate and study individual genes from complex organisms. This changed dramatically with the advent of molecular cloning methods. Microbiologists, seeking to understand the molecular mechanisms through which bacteria restricted the growth of bacteriophage, isolated restriction endonucleases, enzymes that could cleave DNA molecules only when specific DNA sequences were encountered. [6] They showed that restriction enzymes cleaved chromosome-length DNA molecules at specific locations, and that specific sections of the larger molecule could be purified by size fractionation. Using a second enzyme, DNA ligase, fragments generated by restriction enzymes could be joined in new combinations, termed recombinant DNA. By recombining DNA segments of interest with vector DNA, such as bacteriophage or plasmids, which naturally replicate inside bacteria, large quantities of purified recombinant DNA molecules could be produced in bacterial cultures. The first recombinant DNA molecules were generated and studied in 1972. [7] [8]

Molecular cloning takes advantage of the fact that the chemical structure of DNA is fundamentally the same in all living organisms. Therefore, if any segment of DNA from any organism is inserted into a DNA segment containing the molecular sequences required for DNA replication, and the resulting recombinant DNA is introduced into the organism from which the replication sequences were obtained, then the foreign DNA will be replicated along with the host cell's DNA in the transgenic organism.

Molecular cloning is similar to polymerase chain reaction (PCR) in that it permits the replication of DNA sequence. The fundamental difference between the two methods is that molecular cloning involves replication of the DNA in a living microorganism, while PCR replicates DNA in an in vitro solution, free of living cells.

In standard molecular cloning experiments, the cloning of any DNA fragment essentially involves seven steps: (1) Choice of host organism and cloning vector, (2) Preparation of vector DNA, (3) Preparation of DNA to be cloned, (4) Creation of recombinant DNA, (5) Introduction of recombinant DNA into host organism, (6) Selection of organisms containing recombinant DNA, (7) Screening for clones with desired DNA inserts and biological properties.

Although the detailed planning of the cloning can be done in any text editor, together with online utilities for e.g. PCR primer design, dedicated software exist for the purpose. Software for the purpose include for example ApE [1] (open source), DNAStrider [2] (open source), Serial Cloner [3] (gratis) and Collagene [4] (open source).

Notably, the growing capacity and fidelity of DNA synthesis platforms allows for increasingly intricate designs in molecular engineering. These projects may include very long strands of novel DNA sequence and/or test entire libraries simultaneously, as opposed to of individual sequences. These shifts introduce complexity that require design to move away from the flat nucleotide-based representation and towards a higher level of abstraction. Examples of such tools are GenoCAD, Teselagen [5] (free for academia) or GeneticConstructor [6] (free for academics).

Choice of host organism and cloning vector Edit

Although a very large number of host organisms and molecular cloning vectors are in use, the great majority of molecular cloning experiments begin with a laboratory strain of the bacterium E coli (Escherichia coli) and a plasmid cloning vector. E coli and plasmid vectors are in common use because they are technically sophisticated, versatile, widely available, and offer rapid growth of recombinant organisms with minimal equipment. [3] If the DNA to be cloned is exceptionally large (hundreds of thousands to millions of base pairs), then a bacterial artificial chromosome [10] or yeast artificial chromosome vector is often chosen.

Specialized applications may call for specialized host-vector systems. For example, if the experimentalists wish to harvest a particular protein from the recombinant organism, then an expression vector is chosen that contains appropriate signals for transcription and translation in the desired host organism. Alternatively, if replication of the DNA in different species is desired (for example, transfer of DNA from bacteria to plants), then a multiple host range vector (also termed shuttle vector) may be selected. In practice, however, specialized molecular cloning experiments usually begin with cloning into a bacterial plasmid, followed by subcloning into a specialized vector.

Whatever combination of host and vector are used, the vector almost always contains four DNA segments that are critically important to its function and experimental utility: [3]

  • DNA replication origin is necessary for the vector (and its linked recombinant sequences) to replicate inside the host organism
  • one or more unique restriction endonuclease recognition sites to serves as sites where foreign DNA may be introduced
  • ein selectable genetic marker gene that can be used to enable the survival of cells that have taken up vector sequences
  • ein tag gene that can be used to screen for cells containing the foreign DNA

Preparation of vector DNA Edit

The cloning vector is treated with a restriction endonuclease to cleave the DNA at the site where foreign DNA will be inserted. The restriction enzyme is chosen to generate a configuration at the cleavage site that is compatible with the ends of the foreign DNA (see DNA end). Typically, this is done by cleaving the vector DNA and foreign DNA with the same restriction enzyme, for example EcoRI. Most modern vectors contain a variety of convenient cleavage sites that are unique within the vector molecule (so that the vector can only be cleaved at a single site) and are located within a gene (frequently beta-galactosidase) whose inactivation can be used to distinguish recombinant from non-recombinant organisms at a later step in the process. To improve the ratio of recombinant to non-recombinant organisms, the cleaved vector may be treated with an enzyme (alkaline phosphatase) that dephosphorylates the vector ends. Vector molecules with dephosphorylated ends are unable to replicate, and replication can only be restored if foreign DNA is integrated into the cleavage site. [11]

Preparation of DNA to be cloned Edit

For cloning of genomic DNA, the DNA to be cloned is extracted from the organism of interest. Virtually any tissue source can be used (even tissues from extinct animals), [12] as long as the DNA is not extensively degraded. The DNA is then purified using simple methods to remove contaminating proteins (extraction with phenol), RNA (ribonuclease) and smaller molecules (precipitation and/or chromatography). Polymerase chain reaction (PCR) methods are often used for amplification of specific DNA or RNA (RT-PCR) sequences prior to molecular cloning.

DNA for cloning experiments may also be obtained from RNA using reverse transcriptase (complementary DNA or cDNA cloning), or in the form of synthetic DNA (artificial gene synthesis). cDNA cloning is usually used to obtain clones representative of the mRNA population of the cells of interest, while synthetic DNA is used to obtain any precise sequence defined by the designer. Such a designed sequence may be required when moving genes across genetic codes (for example, from the mitochrondria to the nucleus) [13] or simply for increasing expression via codon optimization. [14]

The purified DNA is then treated with a restriction enzyme to generate fragments with ends capable of being linked to those of the vector. If necessary, short double-stranded segments of DNA (linkers) containing desired restriction sites may be added to create end structures that are compatible with the vector. [3] [11]

Creation of recombinant DNA with DNA ligase Edit

The creation of recombinant DNA is in many ways the simplest step of the molecular cloning process. DNA prepared from the vector and foreign source are simply mixed together at appropriate concentrations and exposed to an enzyme (DNA ligase) that covalently links the ends together. This joining reaction is often termed ligation. The resulting DNA mixture containing randomly joined ends is then ready for introduction into the host organism.

DNA ligase only recognizes and acts on the ends of linear DNA molecules, usually resulting in a complex mixture of DNA molecules with randomly joined ends. The desired products (vector DNA covalently linked to foreign DNA) will be present, but other sequences (e.g. foreign DNA linked to itself, vector DNA linked to itself and higher-order combinations of vector and foreign DNA) are also usually present. This complex mixture is sorted out in subsequent steps of the cloning process, after the DNA mixture is introduced into cells. [3] [11]

Introduction of recombinant DNA into host organism Edit

The DNA mixture, previously manipulated in vitro, is moved back into a living cell, referred to as the host organism. The methods used to get DNA into cells are varied, and the name applied to this step in the molecular cloning process will often depend upon the experimental method that is chosen (e.g. transformation, transduction, transfection, electroporation). [3] [11]

When microorganisms are able to take up and replicate DNA from their local environment, the process is termed transformation, and cells that are in a physiological state such that they can take up DNA are said to be competent. [15] In mammalian cell culture, the analogous process of introducing DNA into cells is commonly termed transfection. Both transformation and transfection usually require preparation of the cells through a special growth regime and chemical treatment process that will vary with the specific species and cell types that are used.

Electroporation uses high voltage electrical pulses to translocate DNA across the cell membrane (and cell wall, if present). [16] In contrast, transduction involves the packaging of DNA into virus-derived particles, and using these virus-like particles to introduce the encapsulated DNA into the cell through a process resembling viral infection. Although electroporation and transduction are highly specialized methods, they may be the most efficient methods to move DNA into cells.

Selection of organisms containing vector sequences Edit

Whichever method is used, the introduction of recombinant DNA into the chosen host organism is usually a low efficiency process that is, only a small fraction of the cells will actually take up DNA. Experimental scientists deal with this issue through a step of artificial genetic selection, in which cells that have not taken up DNA are selectively killed, and only those cells that can actively replicate DNA containing the selectable marker gene encoded by the vector are able to survive. [3] [11]

When bacterial cells are used as host organisms, the selectable marker is usually a gene that confers resistance to an antibiotic that would otherwise kill the cells, typically ampicillin. Cells harboring the plasmid will survive when exposed to the antibiotic, while those that have failed to take up plasmid sequences will die. When mammalian cells (e.g. human or mouse cells) are used, a similar strategy is used, except that the marker gene (in this case typically encoded as part of the kanMX cassette) confers resistance to the antibiotic Geneticin.

Screening for clones with desired DNA inserts and biological properties Edit

Modern bacterial cloning vectors (e.g. pUC19 and later derivatives including the pGEM vectors) use the blue-white screening system to distinguish colonies (clones) of transgenic cells from those that contain the parental vector (i.e. vector DNA with no recombinant sequence inserted). In these vectors, foreign DNA is inserted into a sequence that encodes an essential part of beta-galactosidase, an enzyme whose activity results in formation of a blue-colored colony on the culture medium that is used for this work. Insertion of the foreign DNA into the beta-galactosidase coding sequence disables the function of the enzyme so that colonies containing transformed DNA remain colorless (white). Therefore, experimentalists are easily able to identify and conduct further studies on transgenic bacterial clones, while ignoring those that do not contain recombinant DNA.

The total population of individual clones obtained in a molecular cloning experiment is often termed a DNA library. Libraries may be highly complex (as when cloning complete genomic DNA from an organism) or relatively simple (as when moving a previously cloned DNA fragment into a different plasmid), but it is almost always necessary to examine a number of different clones to be sure that the desired DNA construct is obtained. This may be accomplished through a very wide range of experimental methods, including the use of nucleic acid hybridizations, antibody probes, polymerase chain reaction, restriction fragment analysis and/or DNA sequencing. [3] [11]

Molecular cloning provides scientists with an essentially unlimited quantity of any individual DNA segments derived from any genome. This material can be used for a wide range of purposes, including those in both basic and applied biological science. A few of the more important applications are summarized here.

Genome organization and gene expression Edit

Molecular cloning has led directly to the elucidation of the complete DNA sequence of the genomes of a very large number of species and to an exploration of genetic diversity within individual species, work that has been done mostly by determining the DNA sequence of large numbers of randomly cloned fragments of the genome, and assembling the overlapping sequences.

At the level of individual genes, molecular clones are used to generate probes that are used for examining how genes are expressed, and how that expression is related to other processes in biology, including the metabolic environment, extracellular signals, development, learning, senescence and cell death. Cloned genes can also provide tools to examine the biological function and importance of individual genes, by allowing investigators to inactivate the genes, or make more subtle mutations using regional mutagenesis or site-directed mutagenesis. Genes cloned into expression vectors for functional cloning provide a means to screen for genes on the basis of the expressed protein's function.

Production of recombinant proteins Edit

Obtaining the molecular clone of a gene can lead to the development of organisms that produce the protein product of the cloned genes, termed a recombinant protein. In practice, it is frequently more difficult to develop an organism that produces an active form of the recombinant protein in desirable quantities than it is to clone the gene. This is because the molecular signals for gene expression are complex and variable, and because protein folding, stability and transport can be very challenging.

Many useful proteins are currently available as recombinant products. These include--(1) medically useful proteins whose administration can correct a defective or poorly expressed gene (e.g. recombinant factor VIII, a blood-clotting factor deficient in some forms of hemophilia, [17] and recombinant insulin, used to treat some forms of diabetes [18] ), (2) proteins that can be administered to assist in a life-threatening emergency (e.g. tissue plasminogen activator, used to treat strokes [19] ), (3) recombinant subunit vaccines, in which a purified protein can be used to immunize patients against infectious diseases, without exposing them to the infectious agent itself (e.g. hepatitis B vaccine [20] ), and (4) recombinant proteins as standard material for diagnostic laboratory tests.

Transgenic organisms Edit

Once characterized and manipulated to provide signals for appropriate expression, cloned genes may be inserted into organisms, generating transgenic organisms, also termed genetically modified organisms (GMOs). Although most GMOs are generated for purposes of basic biological research (see for example, transgenic mouse), a number of GMOs have been developed for commercial use, ranging from animals and plants that produce pharmaceuticals or other compounds (pharming), herbicide-resistant crop plants, and fluorescent tropical fish (GloFish) for home entertainment. [1]

Gene therapy Edit

Gene therapy involves supplying a functional gene to cells lacking that function, with the aim of correcting a genetic disorder or acquired disease. Gene therapy can be broadly divided into two categories. The first is alteration of germ cells, that is, sperm or eggs, which results in a permanent genetic change for the whole organism and subsequent generations. This “germ line gene therapy” is considered by many to be unethical in human beings. [21] The second type of gene therapy, “somatic cell gene therapy”, is analogous to an organ transplant. In this case, one or more specific tissues are targeted by direct treatment or by removal of the tissue, addition of the therapeutic gene or genes in the laboratory, and return of the treated cells to the patient. Clinical trials of somatic cell gene therapy began in the late 1990s, mostly for the treatment of cancers and blood, liver, and lung disorders. [22]

Despite a great deal of publicity and promises, the history of human gene therapy has been characterized by relatively limited success. [22] The effect of introducing a gene into cells often promotes only partial and/or transient relief from the symptoms of the disease being treated. Some gene therapy trial patients have suffered adverse consequences of the treatment itself, including deaths. In some cases, the adverse effects result from disruption of essential genes within the patient's genome by insertional inactivation. In others, viral vectors used for gene therapy have been contaminated with infectious virus. Nevertheless, gene therapy is still held to be a promising future area of medicine, and is an area where there is a significant level of research and development activity.


Inhalt

RNA serves as a template for cDNA synthesis. [2] In cellular life, cDNA is generated by viruses and retrotransposons for integration of RNA into target genomic DNA. In molecular biology, RNA is purified from source material after genomic DNA, proteins and other cellular components are removed. cDNA is then synthesized through in vitro reverse transcription. [3]

RNA Purification Edit

RNA is transcribed from genomic DNA in host cells and is extracted by first lysing cells then purifying RNA utilizing widely-used methods such as phenol-chloroform, silica column, and bead-based RNA extraction methods. [4] Extraction methods vary depending on the source material. For example, extracting RNA from plant tissue requires additional reagents, such as polyvinylpyrrolidone (PVP), to remove phenolic compounds, carbohydrates, and other compounds that will otherwise render RNA unusable. [5] To remove DNA and proteins, enzymes such as DNase and Proteinase K are used for degradation. [6] Importantly, RNA integrity is maintained by inactivating RNases with chaotropic agents such as guanidinium isothiocyanate, sodium dodecyl sulphate (SDS), phenol or chloroform. Total RNA is then separated from other cellular components and precipitated with alcohol. Various commercial kits exist for simple and rapid RNA extractions for specific applications. [7] Additional bead-based methods can be used to isolate specific sub-types of RNA (e.g. mRNA and microRNA) based on size or unique RNA regions. [8] [9]

Reverse Transcription Edit

First-strand synthesis Edit

Using a reverse transcriptase enzyme and purified RNA templates, one strand of cDNA is produced (first-strand cDNA synthesis). The M-MLV reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus is commonly used due to its reduced RNase H activity suited for transcription of longer RNAs. [10] The AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus may also be used for RNA templates with strong secondary structures (i.e. high melting temperature). [11] cDNA is commonly generated from mRNA for gene expression analyses such as RT-qPCR and RNA-seq. [12] mRNA is selectively reverse transcribed using oligo-dT primers that are the reverse complement of the poly-adenylated tail on the 3' end of all mRNA. An optimized mixture of oligo-dT and random hexamer primers increases the chance of obtaining full-length cDNA while reducing 5' or 3' bias. [13] Ribosomal RNA may also be depleted to enrich both mRNA and non-poly-adenylated transcripts such as some non-coding RNA. [14]

Second-strand synthesis Edit

The result of first-strand syntheses, RNA-DNA hybrids, can be processed through multiple second-strand synthesis methods or processed directly in downstream assays. [15] [16] An early method known as hairpin-primed synthesis relied on hairpin formation on the 3' end of the first-strand cDNA to prime second-strand synthesis. However, priming is random and hairpin hydrolysis leads to loss of information. The Gubler and Hoffman Procedure uses E. Coli RNase H to nick mRNA that is replaced with E. Coli DNA Polymerase I and sealed with E. Coli DNA Ligase. An optimization of this procedure relies on low RNase H activity of M-MLV to nick mRNA with remaining RNA later removed by adding RNase H after DNA Polymerase translation of the second-strand cDNA. This prevents lost sequence information at the 5' end of the mRNA.

Complementary DNA is often used in gene cloning or as gene probes or in the creation of a cDNA library. When scientists transfer a gene from one cell into another cell in order to express the new genetic material as a protein in the recipient cell, the cDNA will be added to the recipient (rather than the entire gene), because the DNA for an entire gene may include DNA that does not code for the protein or that interrupts the coding sequence of the protein (e.g., introns). Partial sequences of cDNAs are often obtained as expressed sequence tags.

With amplification of DNA sequences via polymerase chain reaction (PCR) now commonplace, one will typically conduct reverse transcription as an initial step, followed by PCR to obtain an exact sequence of cDNA for intra-cellular expression. This is achieved by designing sequence-specific DNA primers that hybridize to the 5' and 3' ends of a cDNA region coding for a protein. Once amplified, the sequence can be cut at each end with nucleases and inserted into one of many small circular DNA sequences known as expression vectors. Such vectors allow for self-replication, inside the cells, and potentially integration in the host DNA. They typically also contain a strong promoter to drive transcription of the target cDNA into mRNA, which is then translated into protein.

On 13 June 2013, the United States Supreme Court ruled in the case of Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics that while naturally occurring human genes cannot be patented, cDNA is patent eligible because it does not occur naturally. [17]

cDNA is also used to study gene expression via methods such as RNA-seq or RT-qPCR. [18] [19] [20] For sequencing, RNA must be fragmented due to sequencing platform size limitations. Additionally, second-strand synthesized cDNA must be ligated with adapters that allow cDNA fragments to be PCR amplified and bind to sequencing flow cells. Gene-specific analysis methods commonly use microarrays and RT-qPCR to quantify cDNA levels via fluorometric and other methods.

Some viruses also use cDNA to turn their viral RNA into mRNA (viral RNA → cDNA → mRNA). The mRNA is used to make viral proteins to take over the host cell.

An example of this first step from viral DNA to cDNA can be seen in the HIV cycle of infection. Here, the host cell membrane becomes attached to the virus’ lipid envelope which allows the viral capsid with two copies of viral genome RNA to enter the host. The cDNA copy is then made through reverse transcription of the viral RNA, a process facilitated by the chaperone CypA and a viral capsid associated reverse transcriptase. [21]

cDNA is also generated by retrotransposons in eukaryotic genomes. Retrotransposons are mobile genetic elements that move themselves within, and sometimes between, genomes via RNA intermediates. This mechanism is shared with viruses with the exclusion of the generation of infectious particles. [22] [23]

Mark D. Adams et al. “Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project.” Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Netz.

Philip M. Murphy, and H. Lee Tiffany. “Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor.” Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. Netz.


Schau das Video: Construction of a Plasmid Vector HD Animation (Juni 2022).


Bemerkungen:

  1. Yao

    Unvergleichlicher Satz;)

  2. Audel

    Der Autor geht auf den Grund, es gibt Fragen!

  3. Hrothgar

    Ich mag es nicht, wieder



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