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Ist die produzierte mRNA über die Zeit konstant?

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Ich mache eine statistische Datenanalyse eines Datensatzes von P. Furiosus-Zellen, die Gammastrahlung ausgesetzt waren.

Für die Proben, die der Gammastrahlung ausgesetzt waren, habe ich die Werte der mRNA, die im Laufe der Zeit produziert wurde. Bei den Proben ohne Gammastrahlung (Referenzproben) fehlt mir der Zeitpunkt, zu dem die mRNA extrahiert wurde.

Daher habe ich mich gefragt: Ist die produzierte mRNA unter normalen Bedingungen im Allgemeinen zeitlich konstant? Ich dachte, dass vielleicht die Tatsache, dass es konstant ist, der Grund dafür sein könnte, dass es die Werte der Zeit nicht gibt.


Ist die produzierte mRNA über die Zeit konstant? - Biologie

DNA wird in einem Prozess namens genetische Transkription in RNA kopiert. Zu transkribieren bedeutet „etwas schriftlich niederzuschreiben“. Die Informationen in der DNA werden in eine kleinere Version (RNA) transkribiert – oder umgeschrieben –, die von der Zelle verwendet werden kann.

Lernziele

  • Verstehen Sie die grundlegenden Schritte bei der Transkription von DNA in RNA
  • Beschreiben Sie die Rolle der RNA-Polymerase
  • Den Unterschied zwischen Prä-RNA und mRNA verstehen
  • Beschreiben Sie die posttranslationale Modifikation der RNA und ihren Zweck

Die Transkription erfolgt im Zellkern. Es verwendet DNA als Vorlage, um ein RNA-Molekül (mRNA) herzustellen. Während der Transkription wird ein mRNA-Strang hergestellt, der zu einem DNA-Strang komplementär ist. Abbildung 1 zeigt, wie dies geschieht.

Abbildung 1. Übersicht über die Transkription. Die Transkription verwendet die Basensequenz in einem DNA-Strang, um einen komplementären mRNA-Strang herzustellen. Tripletts sind Gruppen von drei aufeinanderfolgenden Nukleotidbasen in der DNA. Codons sind komplementäre Basengruppen in der mRNA.


Einführung

Trotz der verrauschten Natur der Genexpression 1,2,3,4,5,6 , sind verschiedene Aspekte der Einzelzelldynamik, wie das Volumenwachstum, effektiv deterministisch. Neuere Einzelzellmessungen zeigen, dass das Wachstum des Zellvolumens oft exponentiell ist. Dazu gehören Bakterien 7,8,9,10, Archaea 11, knospende Hefe 10,12,13,14,15 und Säugerzellen 10,16. Darüber hinaus sind die mRNA- und Proteinzahlen während des gesamten Zellzyklus häufig proportional zum Zellvolumen: Die Homöostase von mRNA-Konzentration und Proteinkonzentration wird in einem exponentiell wachsenden Zellvolumen mit variabler Genomkopienzahl 17,18,19,20,21 aufrechterhalten, 22. Das exponentielle Wachstum von mRNA und Proteinzahl zeigt dynamische Transkriptions- und Translationsraten proportional zum Zellvolumen und nicht zur Genomkopienzahl. Aktuelle Genexpressionsmodelle gehen jedoch oft von einer konstanten Transkriptionsrate pro Gen und einer konstanten Translationsrate pro mRNA aus (Modell mit konstanter Rate) 1,5,23,24,25 . Unter der Annahme einer endlichen Abbaurate von mRNAs und nicht abbaubaren Proteinen führen diese Modelle zu einer konstanten mRNA-Zahl proportional zur Genkopienzahl und zu einem linearen Wachstum der Proteinzahl 26,27,28 , was nicht mit der Proportionalität von mRNA und Proteinzahl zur exponentiell wachsendes Zellvolumen.

Da das Zellvolumen, die Proteinkopienzahl und die mRNA-Kopienzahl während des Zellzyklus exponentiell wachsen, kann man erwarten, dass eine ausreichende Bedingung zum Erreichen einer konstanten Konzentration darin besteht, sie mit der gleichen exponentiellen Wachstumsrate wachsen zu lassen. Die mathematische Analyse legt jedoch nahe, dass dies unzureichend ist. Betrachten wir den Logarithmus der Proteinkonzentration C, was geschrieben werden kann als ln(C) = ln(P) − ln(V). Hier P ist die Proteinzahl und V ist das Zellvolumen. Geht man davon aus, dass die Proteinzahl und das Zellvolumen exponentiell aber unabhängig wachsen, mit zeitabhängigen exponentiellen Wachstumsraten λP(T) und λv(T) bzw. die zeitliche Ableitung des Konzentrationslogarithmus gehorcht dann D ln(C)/dt

λP(T) − λv(T). Auch wenn die zeitgemittelten Wachstumsraten von Proteinanzahl und Zellvolumen gleich sind, (langle angle = langle angle) , jegliche Schwankungen in die Differenz zwischen ihnen wird sich akkumulieren und zu einem zufälligen Laufverhalten des Logarithmus der Konzentration führen. Die Homöostase von Protein- und mRNA-Konzentrationen impliziert, dass ein Regulierungsmechanismus vorhanden sein muss, um die Akkumulation von Rauschen im Laufe der Zeit zu verhindern.

Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, einen solchen Mechanismus zu identifizieren, indem ein grobkörniges Modell entwickelt wird, das das Zellvolumenwachstum explizit berücksichtigt. Insbesondere betrachten wir nur kontinuierlich proliferierende Zellen und nicht wachsende Zellen, z. B. Bakterienzellen in der stationären Phase 29 . Die Allgegenwart der Homöostase legt nahe, dass die globale Maschinerie der Genexpression, RNA-Polymerasen (RNAPs) und Ribosomen, eine zentrale Rolle innerhalb des Modells spielen sollten. Basierend auf der Annahme, dass die Anzahl der Ribosomen der limitierende Faktor bei der Translation ist, finden wir, dass das exponentielle Wachstum des Zellvolumens und der Proteinanzahl auf die autokatalytische Natur der Ribosomen zurückzuführen ist 30,31,32,33 . Die Tatsache, dass Ribosomen alle Proteine ​​herstellen, sorgt dafür, dass die Proteinkonzentrationen nicht divergieren. Ausgehend von der Annahme, dass die Anzahl der RNAP der limitierende Faktor bei der Transkription ist, stellen wir fest, dass auch die mRNA-Zahl exponentiell wächst und die mRNA-Konzentration aufgrund der Konkurrenz zwischen den Genen um diese globale Ressource unabhängig von der Genomkopienzahl ist 18,19, 20. Wir untersuchen auch die Auswirkungen der Genomreplikation. Aufgrund des heterogenen Timings der Genreplikation ist die Transkriptionsrate eines Gens vom Zellzyklus abhängig. In unserem Modell verdoppelt sie sich unmittelbar nach der Replikation des Gens und nimmt allmählich ab, wenn andere Gene repliziert werden. Dennoch stellen wir fest, dass dies zu einem geringen Effekt auf den Proteinspiegel führt. Schließlich erweitern wir unser Modell auf allgemeinere Situationen, in denen ein Überschuss an RNAP (Ribosom) zur Sättigung von DNA (mRNA) führt. Wir schlagen ein Phasendiagramm der Genexpression und des Zellwachstums vor, das durch das Protein-zu-DNA-Verhältnis kontrolliert wird. Wir sagen einen Übergang von exponentiellem Wachstum zu linearem Wachstum des Zellvolumens voraus, wenn das Protein-zu-DNA-Verhältnis einen Schwellenwert überschreitet.


Sie alle müssen wirklich verstehen, wie mRNA-“-Impfstoffe” entworfen und ausgeführt werden: Sie werden es nicht mögen

Aber können wir uns zunächst auf die Definition von „Impfstoff“ einigen? Nehmen wir an, wir sprechen von einem völlig legitimen traditionellen Impfstoff, der seit Jahren auf dem Markt ist und sicher und wirksam ist. Was ist das grundsätzlich? Können wir uns darauf einigen, dass ein Impfstoff eine Substanz ist, die aus einer abgeschwächten oder toten Version des Krankheitserregers hergestellt wird, die in den Blutkreislauf eingebracht wird, um eine Immunantwort auszulösen?

Verstehen Sie jetzt Folgendes: mRNA “Impfstoffe” sind keine Impfstoffe… Nein. Wir haben es hier mit Biotechnologie und Bioengineering zu tun. Kurz gesagt, es ist eine genetische Veränderung. Stellen Sie sich den Überschwang der von Luziferian Gates finanzierten Pharmaunternehmen vor, ganz zu schweigen von Gates selbst, in ihrem Streben, Gott zu sein.

Wie funktioniert es also? Wenn sich Zellen teilen, werden die DNA-Stränge repliziert, und die Messenger-RNA (mRNA) spielt eine wichtige Rolle bei Prozessen, die als Transkription und Translation bekannt sind. Informieren Sie sich HIER. Das Ding, das Moderna/Pfizer/Gates entwickelt haben, ist ein synthetischer mRNA-Strang, der die Membran gesunder menschlicher Zellen durchdringt und den normalen Replikationsprozess kapert. Die zuvor gesunde menschliche Zelle wird nun zu einem Fragment des eigentlichen Virus, dem sogenannten „Spike-Protein“, umgewandelt. Dieses Molekül wird als Krankheitserreger erkannt und löst eine Immunantwort aus.

Die zuvor gesunde menschliche Zelle wird nun zu einem Fragment des eigentlichen Virus transformiert. Das hast du richtig gelesen. Folgendes ist aus dem ersten Absatz des Wiki-Eintrags zu dieser Technologie:

Ein RNA-Impfstoff oder mRNA (Messenger-RNA)-Impfstoff ist ein neuartiger Impfstoff, der Moleküle synthetischer RNA in menschliche Zellen transfiziert. Sobald sie sich in den Zellen befindet, fungiert die RNA als mRNA und reprogrammiert die Zellen, um das fremde Protein herzustellen, das normalerweise vom Krankheitserreger (z jedes Pathogen… Das mRNA-Molekül wird mit einem Wirkstofftransportvehikel, normalerweise PEGylierten Lipid-Nanopartikeln, [2] beschichtet, um die zerbrechlichen mRNA-Stränge zu schützen und ihre Aufnahme in die menschlichen Zellen zu unterstützen. [3] [4]

… über die mittel- und längerfristigen Nebenwirkungen ist wenig bekannt [8]

Wenn Sie HIER zum Wiki gehen und oben auf der Seite auf Verlauf anzeigen klicken, dann scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf Älteste, dass dieser Artikel erstmals am 17. Februar 2020 erstellt wurde. Wie frisch. Sie werden auch feststellen, dass diese Technologie noch im Januar 2020 noch nicht einmal als experimentell galt. Es galt als theoretisch. Beeindruckend.

So viele Fragen. Wird die Bio-Vegan-Non-GVO-Menge diese Biotechnologie boykottieren, die praktisch jeden Menschen, der sie annimmt, in einen wandelnden GVO verwandelt? Ich hasse es, wenn die Logik den Entscheidungen im Gesundheitswesen im Weg steht. Was passiert, wenn der Ansturm der Warp-Geschwindigkeit, die Biotechnologie zu vernichten, dazu führt, dass ein Teil der mRNA-Sequenzierung nur geringfügig ausfällt? Ich denke immer an den armen Jeff Goldblum in Die Fliege.

Ich denke auch immer an all die vergeblichen Jahrzehnte des Versuchs, einen Coronavirus-Impfstoff zu entwickeln, mit unzähligen Mäusen, Katzen und Kindern, die in den Studien gestorben sind. Das wussten Sie nicht? Ja, das Problem ist, dass diese “Impfstoffe” die Tendenz haben, die Aufnahme des Erregers zu erhöhen. Dieser Effekt heißt antikörperabhängige Verstärkung (ADE), und ich habe HIER eine lange kommentierte Erklärung dieses Problems gepostet. Unterm Strich ist dies der Grund, warum es noch nie einen Coronavirus-Impfstoff gegeben hat. Aber irgendwie haben sie in zehn Monaten einen gefunden?

Was ist mit Schwangerschaft, Stillzeit und der langfristigen Fruchtbarkeit von gentechnisch veränderten Müttern? Ohhh… die wollen nicht dorthin. Sie möchten wissen, wie mRNA-Biotechnologie ein sich entwickelndes Baby, ein stillendes Baby oder die Chancen einer Mutter, jemals wieder schwanger zu werden, beeinträchtigen könnte? Schade, denn auf solche Versuche wurde absichtlich verzichtet, nicht einmal bei Mäusen. Die Beweise müssen nicht verschwinden, wenn keine Beweise vorgelegt wurden. Als Pfizer dann die britische Zulassung erhielt, gaben sie ZEHN SEITEN mit Splaining, Warnungen, Haftungsausschlüssen usw. heraus. HIER

Bill Gates ist auf Video und erklärt, dass er die Weltbevölkerung um 90% reduzieren will, aber ich bin der Spinner für die Behauptung, dass ein Impfstoff, der über synthetische Genetik funktioniert, Fruchtbarkeitsrisiken darstellen könnte. Jep.


Ergebnisse

Nachweis einzelner mRNA-Moleküle

Um zufällige Ereignisse der Genaktivierung und -inaktivierung direkt zu beobachten, haben wir die Variationen von Zelle zu Zelle in der Anzahl der Moleküle einer bestimmten mRNA gemessen. Wir erreichten dies durch die Integration eines Reportergens mit einem Tandem-Array von Sondenbindungsstellen in Säugerzellen und verwendeten fluoreszenzmarkierte Sonden, um mRNA sichtbar zu machen, die von dem Gen durch FISH transkribiert wurde. Um Einzelmolekülsensitivität zu erhalten, führten wir 32 Tandemkopien einer 43 Basenpaar langen Sondenbindungssequenz am 3′-Ende einer kodierenden Sequenz für ein fluoreszierendes Protein ein (in dieser Arbeit bezeichnen wir dieses Sequenzarray als M1). Das Konstrukt wurde durch Elektroporation in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) inseriert und eine stabile Zelllinie isoliert, bei der eine einzelne Kopie des Gens in das Genom der Zellen integriert wurde. Diese Zellen wurden dann fixiert und einer Hybridisierung mit einer einzelsträngigen Oligodesoxyribonukleotidsonde unterzogen, die sowohl komplementär zu den tandemartig wiederholten Sequenzen war als auch mit fünf gut dispergierten Fluorophor-Einheiten markiert war ( 1A ). Die Bindung so vieler Fluorophore an jedes einzelne mRNA-Molekül führte zu so hellen Signalen, dass jedes Molekül als beugungsbegrenzter Fleck in einem herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop nachweisbar war (Abbildung 1B). Um die Gesamtzahl der mRNA-Moleküle in jeder Zelle zu zählen, wurden optische Schnitte über das gesamte dreidimensionale Zellvolumen aufgenommen (Video S1). Die Anzahl der mRNA-Moleküle in jeder Zelle wurde dann mit benutzerdefinierter Software gemessen, um einzelne fluoreszierende Flecken in drei Dimensionen aus den Bildstapeln zu identifizieren (Abbildung 1C). Wir haben zuvor gezeigt, dass jeder Spot einem einzelnen mRNA-Molekül entspricht und dass es während des FISH-Verfahrens keinen signifikanten Verlust an mRNA-Molekülen gibt [25], wodurch gezeigt wurde, dass die Methode eine gültige Methode ist, um die Anzahl der mRNA-Moleküle in einzelnen Zellen zu zählen .

(A) Schematische Darstellung der mRNA-Nachweismethode. Mehrere fluoreszierende Sonden binden an jedes mRNA-Molekül und liefern ein helles, lokalisiertes Signal.

(B) Zusammengeführtes Bild eines dreidimensionalen Stapels von Bildern aus einer CHO-Zelle, die das in (A) dargestellte 7x-tetO-Gen exprimiert, wobei jede mRNA an FISH-Sonden hybridisiert ist, die an die multimere Sondenbindungssequenz in ihrer 3′ binden -UTR (Sonde P1-TMR, die an das M1-Multimer bindet). Jeder Spot entspricht einem einzelnen mRNA-Molekül.

(C) Identifizierung der Flecken im dreidimensionalen Bildstapel in (C). Jedes vom Bildanalysealgorithmus gefundene Partikel ist anders gefärbt, was zeigt, dass der Algorithmus genau ist und einzelne Moleküle eindeutig identifiziert werden. Die Maßstabsbalken sind 5 µm lang.

Messung von Zell-zu-Zell-Variationen in klonalen Zellen

Um Variationen der mRNA-Zahlen in klonalen Zelllinien von Zelle zu Zelle zu messen, erzeugten wir stabile CHO-Zelllinien, die unser Konstrukt exprimieren. Das Gen wurde unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, dessen Expression in Säugerzellen kontrolliert werden konnte (Abbildung 2A), und es wurde durch Elektroporation stabil in das Genom integriert, was zur Einführung einer einzigen Kopie des Gens führte (wie von Southern . bestätigt). Blotting unveröffentlichter Daten). Die Beobachtung der in diesen Zellen synthetisierten mRNA zeigte, dass es deutliche Variationen in der Anzahl der mRNA-Moleküle von Zelle zu Zelle gab ( 2B ). Die gelegentlich beobachteten größeren hellen Bereiche sind kürzlich aktivierte Transkriptionsstellen [25,26], die durch eine Ansammlung naszierender mRNA verursacht wurden, die noch nicht wegdiffundiert war. Die Beobachtung, dass diese Stellen selten vorkommen, weist darauf hin, dass die mRNA nicht kontinuierlich synthetisiert wird, sondern eher während kurzer Zeiträume, in denen das Gen transkriptionell aktiv ist. Wir bezeichnen diese Perioden als transkriptionale Bursts. Die restliche Zeit befindet sich das Gen in einem transkriptionell inaktiven Zustand, in dem keine mRNA-Moleküle synthetisiert werden und die früher synthetisierten abgebaut werden.

(A) Schematische Darstellung der Doxycyclin-kontrollierbaren Promotoren und der Reportergene, die sie kontrollieren. Doxycyclin bindet an das tTA-Protein und verhindert so dessen Bindung an das tet Operator.

(B, C) Repräsentative Felder von Zellen der Zelllinien E-YFP-M1-1x und E-YFP-M1-7x, die die 1x-tetO- bzw. 7x-tetO-Promotoren enthalten, wobei jede mRNA an die FISH-Sonde P1 . hybridisiert ist -TMR und das Bild wurde durch Zusammenführen eines dreidimensionalen Bildstapels erhalten.

(D) Zwei Schwesterzellen aus der Zelllinie E-YFP-M1-7x mit mRNA, hybridisiert an die FISH-Sonde P1-TMR (rot) und mit DAPI (blau) costainiert. Das Bild repräsentiert eine Fokusebene. Die Maßstabsbalken sind 5 µm lang.

Ein quantitativer Beweis für die Burst-ähnliche Natur der Transkription ergibt sich aus dem Vergleich der Anzahl von mRNA in Zellen, die aktive Transkriptionsstellen enthalten, mit denen ohne aktive Transkriptionsstellen. Wir fanden, dass von 97 zufällig ausgewählten Zellen der Zelllinie E-YFP-M1-7x (Details des Konstrukts unten diskutiert) die 23 enthaltenden Transkriptionsherde durchschnittlich 244 mRNA pro Zelle aufwiesen, verglichen mit 33 mRNA pro Zelle in den 74 ohne aktive Transkriptionsstelle (P < 10 –4 ). Da die FISH-Methode auch die räumliche Position der mRNA liefert, konnten wir auch die relative Anzahl der mRNA im Zellkern und im Zytoplasma vergleichen, um das Verhalten der Transkriptionsausbrüche weiter zu untersuchen. Wenn die Transkription schubweise erfolgt, würde man erwarten, dass bei aktivem Gen mehr mRNA im Zellkern als im Zytoplasma vorkommt, da die nukleäre mRNA nicht exportiert wurde. Wenn sich das Gen jedoch im inaktiven Zustand befindet, wird die nukleäre mRNA ohne Ergänzung exportiert, was dazu führt, dass ein geringerer Anteil der gesamten zellulären mRNA im Zellkern gefunden wird. Um ein solches Verhalten zu untersuchen, haben wir die Zellen nach der Hybridisierung mit DAPI costainiert und festgestellt, ob sich jede mRNA im Zytoplasma oder im Zellkern befindet. Oft fanden wir, dass Zellen ohne Transkriptionsfokus nur zytoplasmatische mRNA aufwiesen, während Zellen mit einer Transkriptionsstelle normalerweise eine große Anzahl nukleärer mRNA aufwiesen (Abbildung 2D). Statistisch gesehen hatten Zellen mit aktiven Transkriptionsstellen einen höheren Prozentsatz an Reporter-mRNA im Zellkern (35%, 17 analysierte Zellen) als Zellen ohne aktive Transkriptionsstellen (25%, 22 analysierte Zellen) (P = 0,0093). Interessanterweise stammen die beiden in Abbildung 2D dargestellten Zellen eindeutig von derselben Elternzelle ab, scheinen jedoch ein unterschiedliches Transkriptionsverhalten zu zeigen. Dieses Verhalten ist typisch und weist darauf hin, dass Variationen globaler extrinsischer Faktoren wie der Position im Zellzyklus nicht die primäre Quelle für Variationen in der Aktivität des Transgens sind. Dies wird in „Relative Contributions of Intrinsic and Extrinsic Factors to Variations in mRNA“ systematischer analysiert Level“ der Ergebnisse.

Ein weiterer Beweis für Transkriptionsausbrüche kommt aus einer Analyse der Statistik der Verteilung von mRNA-Molekülen pro Zelle über die gesamte Zellpopulation. Wenn mRNA mit einer konstanten Rate produziert würde, würde man eine Poisson-Verteilung der mRNA pro Zelle erwarten, wobei in diesem Fall die mittlere Anzahl von mRNA-Molekülen pro Zelle und die Varianz (das Quadrat der Standardabweichung) gleich wären. Wir fanden jedoch, dass der Mittelwert ungefähr 40 mRNA-Moleküle pro Zelle betrug, während die Varianz ungefähr 1.600 Moleküle im Quadrat betrug, was darauf hindeutet, dass die mRNA nicht mit konstanter Geschwindigkeit synthetisiert wird, was mit dem Auftreten von Transkriptionsausbrüchen übereinstimmt.

Mechanismen zur Kontrolle von transkriptionellen Bursts

Um die Mechanismen zu untersuchen, die transkriptionale Bursts kontrollieren, veränderten wir das Gesamtniveau der Transkription, indem wir sowohl die Menge des in den Zellen vorhandenen Transkriptionsaktivators als auch die Anzahl der Bindungsstellen für diesen Aktivator im Promotor veränderten. Um dies zu erreichen, wurde das Gen stromabwärts von einem minimalen Cytomegalovirus-Promotor eingefügt und entweder eine oder sieben Kopien des Tetracyclin-sensitiven tet -Operatorsequenz stromaufwärts vom Promotor vorhanden waren (Fig. 2A). Die Transkription vom Promotor ist nur möglich, wenn ein Protein, das als tet-Transaktivator (tTA) bekannt ist, an die Operatorsequenz bindet. tTA ist ein Protein, das aus zwei Domänen besteht: einer, die an die tet Operator (abgeleitet vom TetR-Protein) und einer, der die Transkription benachbarter Gene fördert (die saure Aktivierungsdomäne von VP16). Das Tetracyclin-ähnliche Antibiotikum Doxycyclin bindet an die DNA-bindende Domäne von tTA und verhindert so die Bindung an DNA. Durch Variation des Doxycyclinspiegels im Wachstumsmedium konnten wir den Spiegel an freiem tTA in den Zellen kontrollieren [27].

Zwei Konstrukte (1x-tetO und 7x-tetO) wurden stabil in CHO-Zellen integriert, die zuvor zur Expression von tTA modifiziert worden waren, was zu den Zelllinien E-YFP-M1-1x und E-YFP-M1-7x führte, die jeweils a Einzelkopie des jeweiligen Reportergens. Repräsentative Schnappschüsse von klonalen Zellfeldern sind in den Abbildungen 2B und 2C gezeigt. Wir beobachteten, dass die Größe der Bursts bei der E-YFP-M1-7x-Zelllinie größer war als bei der E-YFP-M1-1x-Zelllinie. Anschließend variierten wir die Menge an Doxycyclin im Wachstumsmedium und maßen die Verteilung der Anzahl von mRNA-Molekülen pro Zelle über mehrere Felder von Zellen, die bei jeder Doxycyclin-Konzentration gezüchtet wurden (Abbildung 3A mRNA-Zählungen in Tabelle S1). Wie erwartet führte eine Erhöhung des Doxycyclinspiegels zu einer Abnahme der mittleren Anzahl von mRNA-Molekülen pro Zelle (Abbildung 3B, oben). Wir fanden jedoch auch heraus, dass die Variabilität in der Population (quantitativ gemessen durch das „Rauschen“, das wir als Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert definieren) über alle Doxycyclinkonzentrationen für das 1x-tetO-Konstrukt konstant blieb, aber für das 7x .-Konstrukt nicht monoton variierte -tetO-Konstrukt (Abbildung 3B, unten). Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass sich die Rauscheigenschaften nicht ändern, wenn man die mRNA-Konzentration und nicht die absolute Zahl betrachtet (Abbildung S2, vergleiche mit Abbildung 3B, unten). Dies liegt höchstwahrscheinlich daran, dass die primäre Variationsquelle der Aktivierungszustand des Gens selbst ist, der nicht mit dem Volumen der Zelle variiert.

(A) Histogramme, die die Verteilung von mRNA-Molekülen pro Zelle für drei Doxycyclin-Konzentrationen für beide Zelllinien E-YFP-M1-1x (links) und E-YFP-M1-7x (rechts) zeigen.

(B) Diagramme, die den Bevölkerungsdurchschnitt (oben) und das Rauschen (definiert als Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert [unten]) als Funktion der Doxycyclinkonzentration zeigen. Statistiken wurden aus den in (A) verwendeten mRNA-Zählungen entnommen und Fehlerbalken wurden durch Bootstrapping erhalten.

(C) Aktivierungsrate (λ/δ) und durchschnittliche Anzahl der pro Burst produzierten mRNA-Moleküle (μ/γ) für 1x-tetO (blau) und 7x-tetO (rot), erhalten durch Anpassen der mRNA-Zähldaten an das Genmodell Aktivierung und Inaktivierung nach der Maximum-Likelihood-Methode. Fehlerbalken spiegeln 95 % Konfidenzintervalle wider.

Beide Ergebnisse stimmen nicht mit konventionellen stochastischen Modellen der Genexpression [3,5,15,28] überein, die vorhersagen, dass das Rauschen stetig zunehmen sollte, wenn das mittlere Transkriptionsniveau abnimmt. Um dieses Verhalten zu erklären, haben wir ein Modell der Genaktivierung und -inaktivierung [29] herangezogen, bei dem das Gen selten übergeht zwischen einem transkriptionell aktiven Zustand, in dem viele mRNA-Moleküle produziert werden, und einem transkriptionell inaktiven Zustand, in dem keine mRNA-Moleküle vorhanden sind produziert (das Modell wird in Protokoll S1 genauer analysiert, wo eine vollständige Formel für die mRNA-Verteilung präsentiert wird). Mit einer schnellen numerischen Auswertung der theoretischen Verteilungen, die sich aus diesem Modell ergeben, konnten wir die experimentell erhaltenen Daten anpassen, um Ausdrücke für die Genaktivierungsrate λ (bis auf einen Faktor der mRNA-Abbaurate, ) und den Durchschnitt zu finden Anzahl der während jedes Bursts produzierten mRNA, μ/γ (im Folgenden als durchschnittliche Burst-Größe bezeichnet) (Abbildung 3C). Die mRNA-Halbwertszeit wurde durch quantitative RT-PCR zu ungefähr 4 ± 1 h bestimmt (Abbildung S1 siehe Materialien und Methoden für weitere Diskussionen). Die Ergebnisse des Anpassungsverfahrens zeigen, dass entweder eine Erhöhung der Anzahl von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen oder eine Erhöhung der Menge an intrazellulären Transkriptionsfaktoren die durchschnittliche Burst-Größe erhöht. Ob dies auf eine Abnahme der Geninaktivierungsrate oder eine Erhöhung der Transkriptionsrate des aktivierten Gens zurückzuführen ist, lässt sich aufgrund unserer Analyse nicht sagen. Diese Tatsache weist jedoch auf einen wichtigen Unterschied zum bakteriellen Fall hin, bei dem die Genaktivierung und -inaktivierung typischerweise mit der Assoziation und Dissoziation von Transkriptionsfaktoren in Verbindung gebracht wurden [4]. In diesem Fall würde eine Verringerung der Menge an Transkriptionsfaktoren dazu dienen, die Aktivierungsrate zu verringern, während die Inaktivierungs- und Transkriptionsraten gleich bleiben. In unseren Daten scheint die Rate der Genaktivierung ziemlich konstant zu sein, bis die Doxycyclinkonzentration ein relativ hohes Niveau erreicht, an welchem ​​Punkt sie ansteigt, was gegen die Anwendung des Bakterienmodells auf unser System spricht. Es ist unklar, warum die Genaktivierungsrate bei höheren Doxycyclinkonzentrationen zunimmt, da eine Verringerung der Transkriptionsfaktoren nur die Genaktivierungsrate verringern sollte. Dies könnte auf Faktoren zurückzuführen sein, die in unserem Modell nicht enthalten sind, oder auf ein physikalisches Verhalten der Zelle, das bei höheren Doxycyclinkonzentrationen induziert wird. Unsere Daten weisen jedoch im Allgemeinen darauf hin, dass die Modulierung der Konzentration von Transkriptionsaktivatoren das Gesamtniveau der Transkription beeinflusst, indem eher die durchschnittliche Burst-Größe als ihre Frequenz verändert wird.

Relative Beiträge intrinsischer und extrinsischer Faktoren zu Variationen des mRNA-Spiegels

Wenn die Variation der Expressionsniveaus von einer Zelle zur anderen wirklich auf zufällige Genaktivierungsereignisse zurückzuführen wäre, würde das Vorhandensein mehrerer unabhängig voneinander aktivierender Kopien des Gens zu einer geringeren Variabilität der mRNA-Zahlen von Zelle zu Zelle führen (dh das Rauschen sollte verringern). Intuitiv kann man dies erkennen, wenn man simultane Münzwürfe betrachtet: Wenn nur eine Münze geworfen wird, ist es entweder Kopf oder Zahl, aber wenn mehrere Münzen gleichzeitig geworfen werden, liegt die Wahrscheinlichkeit, dass der Satz von ihnen fast 50% Kopf und 50 beträgt % Zahl steigt mit der Anzahl der verwendeten Münzen. Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir mehrere Kopien unseres Reportergens in eine Region des Genoms über kationische Lipid-basierte Transfektion (Lipofektion) integriert, die gleichzeitig Dutzende bis Hunderte von Genkopien integriert, oft hintereinander und am selben Ort, und isoliert Zelllinie L-GFP-M1-7x. Im Allgemeinen war die Anzahl der in dieser Zelllinie produzierten mRNA viel größer als in E-YFP-M1-7x (mit nur einer Kopie des Reportergens), aber die Zelllinie zeigte immer noch massive Variationen von Zelle zu Zelle (Abbildung 4A .). ) mit einer deutlich schiefen Verteilung (Abbildung 4B). Statistisch wird dies durch die Tatsache belegt, dass die Rauscheigenschaften dieser beiden Zelllinien ähnlich waren, da die mittlere Anzahl an mRNA-Molekülen pro Zelle gegenüber der E-YFP-M1-7x-Zelllinie ungefähr um das 10-Fache (ohne Doxycyclin) zugenommen hat , würde man erwarten, dass das Rauschen um einen Faktor von 10 ≈ 3 abnimmt, wenn die Gene unabhängig exprimiert werden, aber es wurde keine solche Abnahme beobachtet ( 4C im Vergleich zu 3B ).

(A) Repräsentatives Feld aus der Zelllinie L-GFP-M1-7x, erzeugt durch Lipofektion, wobei die mRNA an die FISH-Sonde P1-TMR hybridisiert wurde. Das Bild wurde durch Zusammenführen eines dreidimensionalen Stapels von Bildern erhalten.

(B) Histogramm, das die Verteilung von mRNA-Molekülen pro Zelle für die Zelllinie L-GFP-M1-7x zeigt, wenn sie in Medien gezüchtet wird, die kein Doxycyclin enthalten.

(C) Diagramme, die den Bevölkerungsdurchschnitt (oben) und das Rauschen (definiert als Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert [unten]) als Funktion der Doxycyclinkonzentration zeigen. Fehlerbalken wurden durch Bootstrapping erhalten.

Für diese Beobachtung gibt es zwei alternative Erklärungen. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die massiven Schwankungen der Anzahl der mRNA-Moleküle pro Zelle auf Schwankungen globaler Faktoren zurückzuführen sind, die gleichzeitig die Expression aller Reportergene beeinflussen (z. B. Schwankungen in den Spiegeln von tTA oder RNA-Polymerase II). üblicherweise als extrinsisches Rauschen bezeichnet [3,15]. Da die Gene in denselben genomischen Locus integriert wurden, ist es alternativ möglich, dass die Gene als Reaktion auf ein zufälliges, lokales Genaktivierungsereignis (wie die Chromatindekondensation) koordiniert exprimieren, das alle benachbarten Gene betrifft [1]. Wenn jedoch lokale Genaktivierungsereignisse zufällig auftreten, dann würden Gene, die an entfernten Stellen lokalisiert sind, unabhängig aktiviert und deaktiviert. Diese Art von Rauschen wird aufgrund des zufälligen Auftretens von Ereignissen, die an der Genexpression beteiligt sind, normalerweise als intrinsisches Rauschen bezeichnet und ist nicht von globalen Faktoren abhängig.

Um diese beiden alternativen Erklärungen zu untersuchen, konstruierten wir ein weiteres Reportergen, CFP-M2, das für ein Cyan-fluoreszierendes Protein kodierte und ein anderes Tandem-Array von Sonden-bindenden Sequenzen in seiner 3'-UTR, bezeichnet als M2, enthielt. Dies ermöglichte es, seine mRNA von der mRNA zu unterscheiden, die aus Reportergenen synthetisiert wurde, die das M1-Sequenzarray enthalten, indem FISH mit einer zusätzlichen Sonde durchgeführt wurde, die an das M2-Array bindet, aber an ein anders gefärbtes Fluorophor konjugiert ist. In einer Versuchsreihe wurde dieses Gen in eine Zelllinie (L-GFP-M1-7x) integriert, die bereits ein Reportergen exprimierte, das das M1-Array enthielt, was dazu führte, dass das CFP-M2-Reportergen in einen von der entfernten Locus integriert wurde Integrationsort von GFP-M1 (Abbildung 5A, links). In einer zweiten Versuchsreihe wurden die beiden Reportergene gleichzeitig über Lipofektion integriert, was dazu führte, dass beide Gene am selben Ort integriert wurden (Abbildung 5A, rechts). Wenn die Variationen der mRNA-Expression in jeder Zelle auf globale Faktoren zurückzuführen wären, würden wahrscheinlich Ausbrüche der mRNA-Synthese aus diesen unterschiedlichen Genen gleichzeitig in derselben Zelle auftreten, unabhängig von ihrer genomischen Position (dh beide Zelllinien würden eine starke Korrelation zwischen der Expression zeigen beider Reporter-mRNAs). Wenn die Genexpression jedoch durch lokale Genaktivierungsereignisse kontrolliert wird, die einzelne Loci unabhängig beeinflussen, würde die erste Zelllinie, in der die unterschiedlichen Reportergene an verschiedenen Loci integriert sind, keine Korrelation in der Genexpression zeigen, aber die zweite Zelllinie, in der die unterschiedlichen Reportergene am gleichen Locus integriert sind, würde eine starke Korrelation in der Genexpression zeigen.

(A) Schematische Darstellung von Dual-Reporter-Integrationsexperimenten, bei denen die beiden Reporter entweder an getrennten Stellen im Genom (links) oder am selben Ort (rechts) integriert sind.

(B) Zweifarbige Überlagerung, die einen verschmolzenen dreidimensionalen Stapel von Bildern der Zelllinie zeigt, in der zwei verschiedene Reportergene (eines exprimierende mRNA mit dem M1-Sequenzarray und das andere exprimierende mRNA mit dem M2-Sequenzarray) in separate integriert sind Loci (Zelllinie L-GFP-M1-7x+L-CFP-M2-7x) grün entspricht dem Signal der GFP-M1-mRNA und rot entspricht dem Signal der CFP-M2-mRNA (mit den Sonden P1-TMR und P2- Alexa-594 bzw.). Die relativen mRNA-Spiegel beider Gene wurden durch Zählen der mRNA jeder Farbe in einem einzelnen optischen Schnitt in jeder Zelle (Einschub) quantifiziert.

(C) Zweifarbige Überlagerung, die einen verschmolzenen dreidimensionalen Stapel von Bildern der Zelllinie zeigt, in der die beiden unterschiedlichen Reportergene in denselben Locus integriert sind (Zelllinie L-YFP-M1-CFP-M2), wobei die gleichen FISH-Sonden wurden wie in (B) verwendet. Die relativen mRNA-Spiegel beider Gene wurden durch Zählen der mRNA jeder Farbe in einem einzelnen optischen Schnitt in jeder Zelle (Einschub) quantifiziert. Die Maßstabsbalken sind 5 µm lang.

Wenn sie an getrennten Loci integriert wurden (was durch das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Transkriptionsstellen belegt wurde), zeigten die beiden Reporter-mRNAs jeweils einzeln die zuvor beobachteten großen Fluktuationen (Abbildung 5B), doch das Auftreten dieser Fluktuationen war völlig unkorreliert miteinander (R = 0.056, P = 0,57) (Abbildung 5B, Einschub). Wenn die beiden Gene jedoch am gleichen Locus integriert wurden (wie durch eine einzelne, zweifarbige Transkriptionsstelle Video S2) gezeigt, produzierten die Gene beide Arten von mRNA in gleichzeitigen Bursts (Abbildung 5C und Einschub .). R = 0.89, P = 1,2 × 10 –38 ). Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Experimente, dass seltene Genaktivierungs- und Inaktivierungsereignisse die Variabilität der mRNA-Spiegel kontrollieren, und diese Ereignisse treten zufällig auf und sind nicht von globalen, extrinsischen Faktoren abhängig. Darüber hinaus implizieren die Ergebnisse, dass diese Genaktivierungsereignisse räumlich ausgedehnt sind, indem sie ganze Regionen des Genoms gleichzeitig betreffen.

Variationen von Zelle zu Zelle in der mRNA, die für die große Untereinheit der RNA-Polymerase II . kodiert

Um die Rolle globaler, extrinsischer Faktoren weiter zu untersuchen, überprüften wir auf Fluktuationen eines mutmaßlichen extrinsischen Faktors, der RNA-Polymerase II, um zu sehen, ob das Expressionsniveau seiner mRNA mit dem Expressionsniveau der mRNA eines Reportergens korrelierte. Wir waren in der Lage, einzelne Moleküle der natürlichen mRNA abzubilden, die für die große Untereinheit der RNA-Polymerase II kodiert, indem wir das Vorhandensein einer natürlich vorkommenden, 21 Nukleotide langen Sequenz ausnutzten, die 52-mal in der mRNA wiederholt wird. Wir verwendeten eine FISH-Sonde für die wiederholte Sequenz, die mit einem charakteristisch gefärbten Fluorophor markiert war, und wir zählten fluoreszierende Flecken ähnlich denen, die zuvor beobachtet wurden (Abbildung 6A). Wir fanden, dass diese mRNA auch Ausbrüche der mRNA-Synthese aufwies und dass ihre Verteilung über ein Zellfeld ähnlich der für die Reportergene beobachteten war, mit einer Varianz von über dem 50-fachen des Mittelwerts (Abbildung 6B, oben). Um eine Korrelation zwischen dem Niveau dieser mRNA und dem eines Reportergens (in der Zelllinie E-YFP-M1-7x) zu überprüfen, quantifizierten wir auch das Niveau der mRNA-Expression des Reportergens in denselben Zellen. Es wurde kein signifikanter Zusammenhang gefunden (R = 0.083, P = 0,41) (Abbildung 6B, unten). Durch die Verwendung des Modells der Genaktivierung und -inaktivierung konnten wir die Geschwindigkeiten der Genaktivierung, -inaktivierung und -transkription auf einen Faktor der Halbwertszeit der mRNA abschätzen (Parameterwerte und Konfidenzintervalle siehe Abbildung 6B), was darauf hindeutet, dass die Die Aktivierung war tatsächlich selten und stoßartig. Diese Ergebnisse zeigen zwei Dinge: (a) die Synthese der mRNA aus natürlichen Genen kann auch stoßartig sein und (b) Schwankungen in der Anzahl der mRNA-Moleküle, die für die große Untereinheit der RNA-Polymerase II kodieren, sind keine Rauschquelle bei der Expression von anderen Genen.

(A) Repräsentatives Feld der Zelllinie E-YFP-M1-7x bei der Durchführung von FISH mit unterschiedlich gefärbten Sonden sowohl für YFP-M1-mRNA als auch für die mRNA, die für die große Untereinheit der RNA-Polymerase II kodiert. Das Bild ist eine zweifarbige Überlagerung, wobei Grün dem Signal von YFP-M1-mRNA (ein optischer Schnitt) und Rot dem Signal von RNA-Polymerase-mRNA (zusammengeführter dreidimensionaler Bildstapel) entspricht. Die verwendeten Sonden waren P1-Cy5.5 und P3-TMR.

(B) Histogramm, das die Verteilung von RNA-Polymerase-mRNA-Molekülen pro Zelle (oben) und Streudiagramm (unten) zeigt, das Reporter-mRNA-Spiegel (quantifiziert durch Zählen der mRNA in einem einzelnen optischen Schnitt) und RNA-Polymerase-mRNA-Spiegel (quantifiziert durch Zählen aller mRNA) zeigt. in jeder Zelle. Genaktivierung (λ/δ), Inaktivierung (γ/δ) und Transkriptionsraten (μ/δ) (normalisiert durch die mRNA-Zerfallsrate δ) werden mit 95 % Konfidenzintervallen wie angegeben angegeben. Der Maßstabsbalken ist 5 µm lang.

Propagation der mRNA-Variabilität auf Proteinspiegel

Um die Auswirkungen der Burst-ähnlichen Transkription von mRNA auf die intrazellulären Proteinspiegel zu untersuchen, quantifizierten wir gleichzeitig die Anzahl der mRNA und der fluoreszierenden Proteine, die sie in einzelnen Zellen kodierten. Um die Auswirkungen der Proteinabbaurate auf die Proteinvariabilität zu beurteilen, führten wir diese Analyse an einer Zelllinie durch, die ein fluoreszierendes Protein exprimiert, das aktiv abgebaut wurde, und einer anderen Zelllinie, die ein fluoreszierendes Protein ohne aktiven Abbau exprimiert.

Für den Fall des aktiven Abbaus verwendeten wir eine Zelllinie, die das GFP-M1-Reportergen stabil exprimierte, das für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodierte, das am C-Terminus mit einer kurzen prolinreichen Aminosäuresequenz, Glutamin, markiert war Säure, Serin und Threonin (d2EGFP), die auf das Protein für den aktiven Abbau abzielen (mit einer Halbwertszeit von ungefähr 2 h) und die Korrelationen zwischen den mRNA- und Proteinspiegeln untersucht (Abbildung 7A). Wir fanden heraus, dass die Werte recht gut korrelierten, mit Korrelationskoeffizienten größer als 0,78 (P < 2,6 × 10 –22 ) über einen Bereich von Transkriptionsstärken. Darüber hinaus schien die Verteilung der Gesamtproteinspiegel der der mRNA ziemlich ähnlich zu sein ( 7A , Randhistogramme oben, mRNA und rechts, Protein).

(A) Streudiagramm der Gesamt-GFP- und mRNA-Zahlen in einzelnen Zellen der Zelllinie L-GFP-M1-7x, die unter Bedingungen ohne Doxycyclin (blau), 0,08 ng/ml Doxycyclin (rot) und 0,16 ng/ml Doxycyclin (grün) gezüchtet wurden ). Randhistogramme zeigen die Verteilung der Reporter-mRNA pro Zelle (oben) oder des Gesamt-GFP (rechts) für alle Wachstumsbedingungen.

(B) Streudiagramm der gesamten CFP- und mRNA-Spiegel (erhalten aus einem einzigen optischen Schnitt) in einzelnen Zellen der Zelllinie L-GFP-M1-7x + L-CFP-M2-7x, die unter Bedingungen ohne Doxycyclin gezüchtet wurden. Randhistogramme zeigen die Verteilung der Reporter-mRNA pro Zelle (oben) oder des Gesamt-GFP (rechts) für alle Wachstumsbedingungen.

(C) Histogramm des Gesamt-YFP pro Zelle aus der Zelllinie E-YFP-M1-7x. YFP wurde in lebenden Zellen quantifiziert, um den Verlust der Fluoreszenz aufgrund von Fixierung und Permeabilisierung zu minimieren.

(D) Streudiagramme und zugehörige Randhistogramme zeigen die Ergebnisse stochastischer Simulationen des Modells der mRNA und Proteindynamik, das in Protokoll S1 präsentiert wird. Die mRNA-Dynamik war in allen Fällen gleich, aber die Proteinabbaurate war wie angegeben erhöht. Details zu den Simulationsverfahren und genaue Werte der verwendeten Parameter sind im Abschnitt Materialien und Methoden angegeben.

Für den Fall, dass kein aktiver Proteinabbau stattfindet, haben wir eine andere Zelllinie verwendet, die diesmal das CFP-M2-Reportergen exprimiert, in der das fluoreszierende Protein keine Abbau-Tags enthielt. Wir fanden heraus, dass die Korrelation zwischen mRNA- und Proteinspiegeln signifikant geringer war als zuvor (R = 0.35, P = 1,9 × 10 –4 ) (Abbildung 7B). Während die mRNA-Verteilung noch immer stark mit langen Schwänzen verzerrt war, war die Proteinverteilung darüber hinaus etwas weniger verzerrt. Wir untersuchten auch die Verteilung von Proteinen in lebenden Zellen der Zelllinie E-YFP-M1-7x, deren Reportergen auch ein fluoreszierendes Protein kodiert, das nicht aktiv abgebaut wird. In diesem Fall produzierte die Single-Copy-Integration zu wenige Proteine, die wir nach der Fixierung nachweisen konnten, was uns daran hinderte, gleichzeitig die mRNA-Spiegel zu messen verglichen mit den aktiv abgebauten Proteinen (Abbildung 7C).

Um die Unterschiede in den Proteinverteilungen und die Korrelation zwischen den aktiv degradierten und nicht degradierten Fällen zu erklären, fügten wir dem Modell der mRNA-Dynamik Proteindynamik hinzu und untersuchten das Verhalten dieses Modells unter Verwendung des stochastischen Simulationsalgorithmus von Gillespie [30]. (Die für die Simulationen verwendeten Parameter waren diejenigen, die von der Zelllinie E-YFP-M1-7x unter Bedingungen ohne Doxycyclin erhalten wurden, obwohl die beobachteten qualitativen Merkmale nicht stark von den verwendeten spezifischen Parametern abhängen.) Diese Simulationen zeigen, dass die Verringerung der Rate von Der Proteinabbau führt zu einer starken Abnahme der Korrelation zwischen den mRNA- und Proteinspiegeln ( 7D ). Außerdem änderte sich die Proteinverteilung von stark schiefer zu mehr Gaußscher Natur (Abbildung 7D, rechte Randhistogramme), obwohl die mRNA-Verteilung in allen Fällen stark schief blieb (Abbildung 7D, oberes Randhistogramm). Intuitiv liegt dies daran, dass Proteine ​​mit schnellen Proteinabbauraten nur dann reichlich vorhanden sind, wenn die dafür kodierende mRNA reichlich vorhanden ist, was zu einer hohen Korrelation und ähnlichen Verteilungen führt. Wenn die Proteine ​​jedoch sehr langsam abgebaut werden, können Proteine ​​aus früheren Transkriptionsausbrüchen immer noch vorhanden sein, wenn neue Ausbrüche auftreten. In diesem Fall dienen die Transkriptionsbursts lediglich dazu, die Menge an fluoreszierenden Proteinen von Zeit zu Zeit „aufzufüllen“, was zu weniger schiefen Verteilungen und einer geringeren Korrelation zwischen mRNA und Proteinanzahl führt. Qualitativ stimmen diese Vorhersagen gut mit unseren experimentellen Beobachtungen überein.


Quantifizierung von mRNA in Raum und Zeit

Quantifizierung von mRNA in Raum und Zeit. J Cell Wissenschaft 15. Mai 2010 123 (10): e1002. mach:

Abbildung 1. Prä-mRNA-Spleißen beinhaltet die präzise Entfernung von Introns aus dem primären RNA-Transkript. Der Spleißprozess wird durch Proteinkomplexe, die als Spleißosomen bezeichnet werden, katalysiert, die aus Proteinen und RNA-Molekülen, den sogenannten snRNAs, bestehen. Spleißosomen erkennen Sequenzen am 5′ und 3′ Ende des Introns.

Fehler beim Spleißen werden mit Krebs und anderen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Welche Mutationen können zu Spleißfehlern führen?

Beachten Sie, dass mehr als 70 einzelne Introns vorhanden sein können und jedes den Prozess des Spleißens – zusätzlich zum 5′-Capping und dem Hinzufügen eines Poly-A-Schwanzes – durchlaufen muss, um ein einzelnes, translatierbares mRNA-Molekül zu erzeugen.

Sehen Sie auf dieser Website, wie Introns beim RNA-Spleißen entfernt werden.

RNA-Editierung in Trypanosomen

Figur 2. Trypanosoma brucei ist der Erreger der Schlafkrankheit beim Menschen. Die mRNAs dieses Pathogens müssen durch Zugabe von Nukleotiden modifiziert werden, bevor die Proteinsynthese erfolgen kann. (Kredit: Änderung der Arbeit von Torsten Ochsenreiter)

Die Trypanosomen sind eine Gruppe von Protozoen, zu denen der Erreger gehört Trypanosoma brucei, die beim Menschen Schlafkrankheit verursacht (Abbildung 2). Trypanosomen und praktisch alle anderen Eukaryoten haben Organellen, die Mitochondrien genannt werden, die die Zelle mit chemischer Energie versorgen. Mitochondrien sind Organellen, die ihre eigene DNA exprimieren und von denen angenommen wird, dass sie die Überreste einer symbiotischen Beziehung zwischen einem Eukaryonten und einem verschlungenen Prokaryonten sind. Die mitochondriale DNA von Trypanosomen stellt eine interessante Ausnahme von The Central Dogma dar: Ihre Prä-mRNAs haben nicht die richtigen Informationen, um ein funktionelles Protein zu spezifizieren. Dies liegt in der Regel daran, dass der mRNA mehrere U-Nukleotide fehlen. Um dies zu beheben, führt die Zelle einen zusätzlichen RNA-Verarbeitungsschritt namens RNA-Editierung durch.

Andere Gene im mitochondrialen Genom kodieren für 40 bis 80 Nukleotide lange Leit-RNAs. Eines oder mehrere dieser Moleküle wechselwirken durch komplementäre Basenpaarung mit einigen der Nukleotide im prä-mRNA-Transkript. Die Leit-RNA hat jedoch mehr A-Nukleotide als die Prä-mRNA U-Nukleotide zum Binden hat. In diesen Regionen schleift die Leit-RNA aus. Die 3'-Enden von Guide-RNAs haben einen langen Poly-U-Schwanz, und diese U-Basen werden in Regionen des Prä-mRNA-Transkripts eingefügt, an denen die Guide-RNAs eine Schleife bilden. Dieser Prozess wird vollständig durch RNA-Moleküle vermittelt. Das heißt, Leit-RNAs – und nicht Proteine ​​– dienen als Katalysatoren bei der RNA-Bearbeitung.

RNA-Editing ist nicht nur ein Phänomen von Trypanosomen. In den Mitochondrien einiger Pflanzen werden fast alle Prä-mRNAs editiert. RNA-Editierung wurde auch bei Säugetieren wie Ratten, Kaninchen und sogar Menschen identifiziert. Was könnte der evolutionäre Grund für diesen zusätzlichen Schritt in der Prä-mRNA-Verarbeitung sein? Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Mitochondrien, die Überreste alter Prokaryonten sind, eine ebenso alte RNA-basierte Methode zur Regulierung der Genexpression haben. Um diese Hypothese zu untermauern, unterscheiden sich Änderungen an prä-mRNAs je nach zellulären Bedingungen. Obwohl spekulativ, könnte der Prozess der RNA-Editierung ein Überbleibsel aus einer Urzeit sein, als RNA-Moleküle anstelle von Proteinen für die Katalyse von Reaktionen verantwortlich waren.


Zusätzliche Informationen

Abbildung S1. Bestimmung der Abbaurate der Reporter-mRNA

Das Diagramm zeigt den Unterschied im Schwellenzyklus zwischen PCRs, die mit dem GFP-Reportergen durchgeführt wurden, und dem EF1-Haushalt aus einem Echtzeit-RT-PCR-Experiment, das mit Gesamt-mRNA durchgeführt wurde, die aus der Zelllinie L-GFP-M1-7x extrahiert wurde. Zum Zeitpunkt 0 wurde das zelluläre Medium durch ein Medium ersetzt, das 10 ng/ml Doxycyclin enthielt, wodurch die Transkription des Reportergens wirksam unterbunden wurde, wodurch eine Bestimmung der mRNA-Abbauzeit ermöglicht wurde. Bei der Bestimmung der Halbwertszeit haben wir nur die drei Punkte ganz rechts berücksichtigt, da frühe Zeitpunkte aufgrund vorübergehender Effekte der mRNA-Verarbeitung und des mRNA-Exports einen Abbau nicht erster Ordnung aufweisen können.

Abbildung S2. Auswirkungen des Zellvolumens auf das mRNA-Rauschen

Das Diagramm zeigt das Rauschen (definiert als Standardabweichung dividiert durch den Mittelwert) der mRNA-Konzentrationen für das 1x-tetO-Konstrukt (rot) und das 7x-tetO-Konstrukt (blau) über einen Bereich von Doxycyclinkonzentrationen. Die mRNA-Konzentration wurde bestimmt, indem die Anzahl der mRNA durch das Gesamtvolumen der Zelle dividiert wurde, wie durch Mikroskopie bestimmt. Vergleichen Sie mit Abbildung 3B, unten.

Abbildung S3. Lineare Korrelation, die verwendet wird, um genaue Schätzungen der Anzahl von mRNA-Molekülen in stark exprimierenden Zellen bereitzustellen, die bei der Analyse der mRNA-Spiegel in der L-GFP-M1-7x-Zelllinie angetroffen werden

Das Diagramm zeigt die Korrelation zwischen der Anzahl der mRNA-Moleküle und der Gesamtfluoreszenz integriert über das Zellvolumen (Hintergrund abgezogen). Zellen wurden aus zufälligen Feldern der Zelllinie L-GFP-M1-7x entnommen und Zellen wurden sowohl für angemessene Mengen an mRNA ausgewählt, um eine Segmentierung zu ermöglichen, als auch für das Fehlen von hell fluoreszierenden Merkmalen, die die Kalibrierung möglicherweise beeinflussen könnten. Der lineare Fit ergab einen Wert von ungefähr 53.500 Fluoreszenzeinheiten pro mRNA-Molekül.

Protokoll S1. Modell der Genaktivierung und -inaktivierung, Parameterschätzung und Vergleich mit früheren Studien

Mechanistisches Modell von Bursts in der mRNA-Synthese, Basismodell der Genaktivierung und -inaktivierung, Anpassung von Parametern an experimentelle Verteilungen, Bestimmung von Proteinmittelwerten und -varianzen und Beziehung zwischen Modell und früheren Studien zu intrinsischem und extrinsischem Rauschen.

Tabelle S1. Anzahl der in der Studie verwendeten Reporter-(YFP-M1)-mRNAs pro Zelle aus den Zelllinien E-YFP-M1-1x und E-YFP-M1-7x und Anzahl der RNAPII-mRNAs der großen Untereinheit in der Zelllinie E-YFP-M1- 7x

Video S1. Dreidimensionaler Durchflug eines Paares kürzlich geteilter Schwesterzellen der Zelllinie E-YFP-M1-7x

Jeder weiße Fleck steht für ein mRNA-Molekül. Der dichte weiße Fleck in einer der Zellen ist eine aktive Transkriptionsstelle.

Video S2. Dreidimensionaler Durchflug eines Paares kürzlich geteilter Schwesterzellen aus der Zelllinie mit zwei Reportergenen, die in denselben Locus integriert sind (L-YFP-M1-CFP-M2)

Grün entspricht dem Signal von YFP-M1-mRNA und Rot entspricht dem Signal von CFP-M2-mRNA. Der dichte gelbe Fleck in beiden Zellen ist eine aktive Transkriptionsstelle, was darauf hinweist, dass beide mRNAs am gleichen genomischen Locus transkribiert werden.


Woraus besteht mRNA?

Jede DNA-Sequenz, die schließlich als Protein endet, ist eine Beispiel für mRNA. Jede DNA-Sequenz, die schließlich als Protein endet, ist eine Beispiel für mRNA. Die Boten-RNA oder mRNA ist einfach ein vorübergehender Informationsträger darüber, was vom Zellkern bis zu den Ribosomen synthetisiert werden soll.

Was bedeutet mRNA? Messenger-RNA

Wo wird demnach mRNA hergestellt?

Der Herstellungsprozess mRNA aus der DNA wird als Transkription bezeichnet und findet im Zellkern statt. Die mRNA steuert die Synthese von Proteinen, die im Zytoplasma stattfindet. mRNA im Kern gebildet wird, wird aus dem Kern in das Zytoplasma transportiert, wo es sich an die Ribosomen anlagert.

DNA zur RNA-Transkription. Die RNA, in die die Informationen transkribiert werden, ist Boten-RNA (mRNA). Der mit der RNA-Polymerase verbundene Prozess besteht darin, die DNA und baue einen Strang aus mRNA durch Auflegen auf das Wachsen mRNA Molekül die Base komplementär zu der auf dem Templatstrang des DNA.


Die mRNA-Impfstoffrevolution steht erst am Anfang

NIEMAND ERWARTET der erste Covid-19-Impfstoff, der so gut ist wie er war. „Wir haben auf rund 70 Prozent gehofft, das ist ein Erfolg“, sagt Dr. Ann Falsey, Professorin für Medizin an der University of Rochester, New York, die 2020 eine 150-Personen-Studie für den Pfizer-BioNTech-Impfstoff betrieb.

Sogar Uğur Şahin, der Mitbegründer und CEO von BioNTech, der das Medikament von Anfang an gehütet hatte, hatte einige Zweifel. Alle vorläufigen Labortests sahen gut aus, seit er sie im Juni gesehen hatte. Er sagte den Leuten routinemäßig, dass "das ist immunologisch ein nahezu perfekter Impfstoff". Aber das bedeutet nicht immer, dass es in der realen Welt gegen „das Biest, das Ding da draußen“ funktioniert. Erst am 9. November 2020, drei Monate nach der letzten klinischen Studie, erhielt er endlich die gute Nachricht. „Mehr als 90 Prozent effektiv“, sagt er. „Ich wusste, dass dies ein Game Changer war. Wir haben einen Impfstoff."

„Wir waren überglücklich“, sagt Falsey. „Es schien zu schön, um wahr zu sein. Keine Atemwegsimpfung hatte jemals eine solche Wirksamkeit.“

Die Ankunft eines Impfstoffs vor Jahresende war eine unerwartete Wendung. Zu Beginn der Pandemie war die gängige Meinung, dass die Entwicklung eines Impfstoffs trotz aller gezogenen Register mindestens anderthalb Jahre dauern würde. Talking Heads verwiesen oft darauf, dass der frühere schnellste Impfstoff aller Zeiten, der 1967 gegen Mumps entwickelt wurde, vier Jahre gedauert hat. Moderne Impfstoffe erstrecken sich oft über ein Jahrzehnt der Entwicklung hinaus. BioNTech – und Moderna mit Sitz in den USA, die noch in derselben Woche ähnliche Ergebnisse bekannt gaben – durchbrachen diesen herkömmlichen Zeitplan.

Kein Unternehmen war vor der Pandemie ein bekannter Name. Tatsächlich war noch nie ein einziges Medikament zugelassen worden. Beide glaubten jedoch schon lange, dass ihre mRNA-Technologie, die einfache genetische Anweisungen als Nutzlast verwendet, traditionelle Impfstoffe, die auf der oft mühsamen Montage lebender Viren oder ihrer isolierten Teile beruhen, übertreffen könnte. mRNA erwies sich in der Welt der Wissenschaft und Medizin als eine verschwindend seltene Sache: eine vielversprechende und potenziell transformative Technologie, die nicht nur ihren ersten großen Test überstanden, sondern auch die kühnsten Erwartungen der meisten Menschen übertraf.

Aber der nächste Schritt könnte noch größer sein. Der Anwendungsbereich von mRNA-Impfstoffen ging immer über eine einzelne Krankheit hinaus. Wie beim Wechsel von einer Vakuumröhre zu einem Mikrochip verspricht die Technologie, die gleiche Aufgabe wie herkömmliche Impfstoffe zu erfüllen, jedoch exponentiell schneller und zu einem Bruchteil der Kosten. „Man kann morgens eine Idee haben und abends einen Impfstoff-Prototyp. Die Geschwindigkeit ist erstaunlich“, sagt Daniel Anderson, Forscher für mRNA-Therapie am MIT. Vor der Pandemie hofften Wohltätigkeitsorganisationen wie die Bill & Melinda Gates Foundation und die Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI), mRNA gegen tödliche Krankheiten wie Dengue oder Lassa-Fieber einzusetzen, die die Pharmaindustrie weitgehend ignoriert hat, während die Industrie eine Chance sah, die Suche nach lang gehegten wissenschaftlichen Träumen beschleunigen: eine verbesserte Grippeimpfung oder der erste wirksame HIV-Impfstoff.

Amesh Adalja, Experte für neu auftretende Krankheiten am Johns Hopkins Center for Health Security in Maryland, sagt, dass mRNA „all diese Anwendungen, auf die wir gehofft und auf die wir gedrängt haben, Teil des täglichen Lebens werden lassen könnte“.

„Wenn sie die Geschichte der Impfstoffe schreiben, wird dies wahrscheinlich ein Wendepunkt sein“, fügt er hinzu.

Während sich die Welt weiterhin auf die Einführung von Covid-19-Impfstoffen konzentriert, explodiert der Wettlauf um die nächste Generation von mRNA-Impfstoffen – die gegen eine Vielzahl anderer Krankheiten gerichtet sind – bereits. Moderna und BioNTech haben jeweils neun Kandidaten in der Entwicklung oder frühen klinischen Studien. Mindestens sechs mRNA-Impfstoffe gegen Grippe sind in der Pipeline und eine ähnliche Zahl gegen HIV. Nipah, Zika, Herpes, Dengue, Hepatitis und Malaria wurden angekündigt. Das Feld ähnelt manchmal der frühen Phase eines Goldrausches, wenn Pharmagiganten vielversprechende Forscher für riesige Aufträge gewinnen – Sanofi zahlte kürzlich 425 Millionen US-Dollar (307 Millionen Pfund) für eine Partnerschaft mit einem kleinen amerikanischen mRNA-Biotech namens Translate Bio, während GSK 294 Millionen US-Dollar ( 212 Millionen Pfund), um mit Deutschlands CureVac zusammenzuarbeiten.

„Biotech hat im Allgemeinen nicht so viele Störungen wie die Computertechnologiebranche – die Entwicklungszeiten sind lang, sie ist stark reguliert. Man kann also normalerweise sehen, dass Veränderungen kommen“, sagt Hartaj Singh, ein Branchenanalyst bei Oppenheimer & Co. „Covid hat das auf den Kopf gestellt. mRNA-Impfstoffe haben sich schnell als großer Gewinner herausgestellt. Viele ältere Impfstoffplattformen werden in ein paar Jahren weg – ersetzt – oder zumindest stark reduziert.“

Şahin würde noch weiter gehen. „Es wird transformierend sein, keine Frage. Es wird absolut transformierend sein. Viele ältere Impfstoffplattformen werden nicht überleben.“ Aber, sagt er, die Auswirkungen werden über das hinausgehen, was wir bereits wissen. „Wir können noch viel mehr tun. Dies ist nicht nur ein Ersatz, wir werden andere neue medizinische Innovationen entwickeln, die sonst nicht möglich wären.“

Ugur Sahin, CEO von BioNTech

NICHT JEDER WAR so überrascht, dass mRNA-Impfstoffe ihren ersten Test mit Bravour bestanden haben. Katalin Karikó, eine ungarische Biochemikerin, begann bereits 1989 mit mRNA zu arbeiten. Ihre Forschung an der University of Pennsylvania legte Mitte der 2000er Jahre den Grundstein für die Impfstoffe BioNTech und Moderna (Karikó leitet jetzt als Senior Vice President RNA-Pharmazeutika für BioNTech ). Wenn ich nach ihrer Einstellung zum letzten Jahr frage, ist sie charakteristisch unverblümt. „Es gab kein Nägelkauen. Ich habe erwartet, dass die Impfstoffe sehr wirksam sind“, sagt sie.

Auch im Lockdown ist Karikó eines der Nervenzentren der mRNA-Welt. Von ihrem Zuhause außerhalb von Philadelphia berät sie die Wissenschaftler von BioNTech in Deutschland und arbeitet noch immer mit ehemaligen akademischen Kollegen im nahe gelegenen Penn State zusammen. Sie ist eine eingefleischte Wissenschaftlerin, spickt Gespräche mit Referenzen im akademischen Format – Name, Experiment, Jahr – und sucht ständig nach der nächsten Grenze. Sie ist tief beeindruckt vom Ausmaß der Impfstoffeinführung („die Herstellung, unglaubliches Ausmaß, 200 Millionen Menschen wurden bereits injiziert“). Aber sie scheint fast ungeduldig zu sein, wie lange es dauerte, bis die Leute ihre Faszination für mRNA entdeckten. Die Wissenschaft habe immer gesagt, es würde „wie ein Zauber funktionieren“, sagt sie und rattert kleine Studien aus den letzten zwei Jahrzehnten herunter.

Das Konzept hinter mRNA als Medikament ist verblüffend einfach: Es ist das Molekül, das Ihre eigenen Zellen verwenden, um Anweisungen Ihrer Gene zu übertragen, die in einer einfachen chemischen Sprache aus vier Buchstaben geschrieben sind. Wenn Sie es in einem Labor synthetisieren und an Zellen abgeben können, können Sie ihnen theoretisch sagen, dass sie ein bestimmtes Werkzeug herstellen sollen – ein virales Antigen oder ein krebshemmendes Molekül oder mehr Herzgewebe – alles in ihrer eigenen Sprache. Moderna bezeichnet mRNA-Therapien mittlerweile als „Software des Lebens“ oder als „Betriebssystem“ für die Medizin.

Aber wie so viele andere theoretisch attraktive Vorschläge in der Wissenschaft war es mit praktischen Problemen gestapelt. Der Körper wehrt RNA aus externen Quellen gewaltsam ab – wahrscheinlich, um eine Entführung durch Viren und andere Krankheitserreger zu vermeiden – und oft erwies sich die RNA als so giftig, dass sie die Labortiere, an denen sie getestet wurde, tötete. „Wir konnten nicht davon träumen, es bei Menschen anzuwenden“, sagt Karikó. Dies war jahrelang ein so großes Hindernis, dass nur wenige Wissenschaftler auch nur daran dachten, es für Impfstoffe zu verwenden. „Damals war es so theoretisch, dass niemand so etwas wirklich gemacht hat“, sagt Dr. David Scales, Assistenzprofessor für Medizin an der Cornell University, der als Student mit Karikó zusammengearbeitet hat.

In Zusammenarbeit mit dem Immunologen Drew Weissman von der University of Pennsylvania entwickelte Karikó Anfang der 2000er Jahre synthetische mRNA-Moleküle, die die Abwehrkräfte des Körpers umgehen könnten. Es war ein mühsamer Prozess, der laut Weissman viele Mäuse tötete, bevor sie endlich die erfolgreiche Formel fanden. Aber 2004 funktionierte eines ihrer Konstrukte. Tatsächlich öffnete dies die Kommunikationswege zwischen unseren Zellen und mRNA-Nachrichten, die von Wissenschaftlern erstellt wurden.

Karikó glaubte immer, dass mRNA alles kann. „Jahrelang ging ich zu wissenschaftlichen Meetings und sprach Leute an, um zu sagen: ‚Woran arbeitest du? Vielleicht könnte diese RNA-Technologie helfen“ – was auch immer es war, eine Krankheit, sogar eine Kahlheit. Sie dachten wahrscheinlich alle, ich sei verrückt“, sagt sie lachend.

„Sie war so begeistert von den Dingen, die RNA tun kann“, sagt Scales. „Sie war Evangelistin und Übersetzerin. Sie hat dir geholfen, über alle Möglichkeiten nachzudenken.“

Fast 20 Jahre später haben die durch ihre Arbeit ermöglichten Impfstoffe Karikó zu einer wissenschaftlichen Berühmtheit gemacht. Das, sagt sie, „macht mich nervös“. Sowohl Moderna-Mitbegründer Derrick Rossi als auch der britische Biologe Richard Dawkins haben vorgeschlagen, dass sie für den Nobelpreis in Betracht gezogen werden sollte. Das sei schön, sagt sie, auch wenn die ständigen Anfragen nach Vorstellungsgesprächen in ihre Arbeit eingreifen. Und wichtiger als jedes Lob ist die Tatsache, dass Tausende von Wissenschaftlern inzwischen zu ihrer Denkweise gekommen sind.

Im Gegensatz zu den Anfängen der mRNA-Forschung werden wir nicht Jahrzehnte auf den nächsten großen Test warten. Die Pandemie hat sie ins Rampenlicht gerückt, und Wissenschaftler sind gespannt, ob ihr Erfolg gegen das Coronavirus reproduziert werden kann.

Norbert Pardi, Forschungsassistent an der University of Pennsylvania

DAS NÄCHSTE GROßE Der Durchbruch des mRNA-Impfstoffs wird wahrscheinlich nicht gegen eine andere exotische neue Krankheit sein, sondern gegen eine sehr bekannte. „Grippe ist das Ziel Nummer eins“, sagt Falsey. Die Grippe, eine Krankheit, die die meisten Menschen als unter Kontrolle betrachten, tötet in den meisten Jahren weltweit immer noch über 300.000 Menschen. Dies trotz mehr als einer Milliarde Grippeimpfungen pro Jahr.„Die Impfstoffe sind nicht so wirksam, wie wir es uns wünschen“, sagt sie.

Das mag milde ausgedrückt sein. Laut den Centers for Disease Control and Prevention (CDC), die jedes Jahr die Wirksamkeit des Impfstoffs in den USA verfolgen, erreichen sie selten sogar einen Schutz von 50 Prozent. In der Grippesaison 2018-2019 waren es nur 29 Prozent, in manchen Jahren sind es sogar nur zehn Prozent. Wissenschaftliche Arbeiten, die normalerweise nicht anfällig für ausdrucksstarke Sprache sind, bezeichnen einen verbesserten Grippeimpfstoff oft als den „heiligen Gral“ auf diesem Gebiet.

Ein Wissenschaftler, der diesem Traum nachjagt, ist Norbert Pardi, der in Katalin Karikós alter Abteilung an der University of Pennsylvania arbeitet, wo er 2011 von Karikó rekrutiert wurde. (Er stammt ebenfalls aus Ungarn und zeigt mir stolz ein Schwarzweiß-Bild von sein Großvater neben Karikós Vater in einer Kleinstadt-Metzgerei.) Seit den BioNTech-Ergebnissen im November klingelt das Telefon des Labors. „Unternehmen, Akademiker, sie wollten reden. Wollte alles über diese RNA-Impfstoffe wissen“, sagt Pardi. Aber sein Hauptprojekt, das bis vor die Coronavirus-Pandemie zurückreicht, zielt auf die Grippe ab. "Der saisonale Impfstoff ist einfach nicht sehr gut, wir können einen besseren machen."

Das Problem aktueller Grippeimpfstoffe liegt in der Diskrepanz zwischen der schwer fassbaren Natur des Influenzavirus und der eher antiquierten und langsamen Methode, mit der wir einen Impfstoff dagegen herstellen – ein Prozess, den mRNA wie maßgeschneidert zu ersetzen scheint. Die Krankheit, die wir Grippe nennen, wird durch mehrere verschiedene Arten des Influenzavirus verursacht, und jede Art ist sehr wandelbar (d.h. sie kann sich sehr schnell ändern). Dies bedeutet, dass jedes Jahr ein neuer Impfstoff gegen die tödlichsten Stämme erforderlich ist, und selbst während der Impfstoff hergestellt wird, mutiert das Virus weiter. Der ehemalige Leiter der Impfabteilung der CDC, Bruce Gellin, nennt es ein „bewegliches Ziel“ und sagt, dass ein Impfstoff, der Anfang des Jahres gut passt, einige Monate später umgangen werden könnte.

Dies scheint einen schnell anpassungsfähigen und veränderbaren Impfstoff zu erfordern – und der Impfstoff gegen die saisonale Grippe ist das nicht. Der erste kommerzielle Grippeimpfstoff wurde 1945 in den USA zugelassen, und wir machen ihn heute fast genauso. Der Impfstoff wird hergestellt, indem die Zielgrippevirusstämme in befruchteten Hühnereiern gezüchtet und dann von ihrem Eiweiß gereinigt werden – ein Prozess, der genauso chaotisch klingt, wie es sich anhört. Die Viren werden dann chemisch inaktiviert und den Patienten in die Arme geschossen. Das Ganze ist langsam und dauert mehrere Monate von der Identifizierung der Zielstämme über das Wachstum der Eier bis zur Ernte des Impfstoffs.

Nicht jeder Impfstoff wird auf diese Weise hergestellt – sogenannte „Abtötungsviren“-Impfstoffe sind die ältesten der alten Schule. Bei den meisten Krankheitserregern wurde dieser Ansatz längst durch eine Technologie namens rekombinante Proteinimpfstoffe ersetzt, bei denen ein einzelnes Stück des Virus – ein virales Protein – im Labor gezüchtet wird. Dies ist, was die kürzlich zugelassenen Novavax-Impfstoffe verwenden. Wenn das richtige Ziel ausgewählt wird, kann nur dieses einzelne Teil das Immunsystem so effektiv wie ein ganzes Virus vorbereiten – mit deutlich weniger Durcheinander.

Aber sie haben ihre eigenen Nachteile. Proteine ​​sind komplexe Moleküle und es kann schwierig sein, sie in einem Labor zu züchten. „Ich habe als Biochemiker viel Zeit damit verbracht, Proteine ​​zu reinigen, die sehr kompliziert und sehr speziell sein können“, sagt Pardi.

mRNA macht das alles überflüssig. Es wurde manchmal in der Presse als "Verwandlung Ihres Körpers in eine Impfstofffabrik" beschrieben, aber das deutet auf eine Art Zwangsgewalt hin. Ihr Körper ist bereits eine wundersame Proteinfabrik. Seine Zellen sind millionenfach effizienter als jedes andere Labor auf der Erde und produzieren jeden Tag Billionen von Proteinen für die normale Körperfunktion. Ein mRNA-Impfstoff ist nur eine winzige genetische Anweisung in der Muttersprache der Fabrik – ein Arbeitsauftrag, um der Warteschlange ein paar kleine virale Proteine ​​hinzuzufügen. „Ihre Zellen machen das sowieso ständig. Wir kapern diesen Prozess nur ein wenig, um das virale Protein herzustellen, das das Immunsystem erkennen soll“, erklärt Anna Blakney, RNA-Forscherin an der University of British Columbia.

Dies verschafft der mRNA einen enormen Geschwindigkeitsvorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, was bedeutet, dass das Grippevirus weniger Zeit hat, um zu mutieren, bevor ein Impfstoff eintrifft. „Die Vorlaufzeit für die Herstellung des Impfstoffs ist so viel kürzer. Sie könnten in zwei Wochen eine riesige Menge herstellen. Sie könnten sogar über den Winter mehrere verschiedene Grippeimpfstoffe erhalten, wenn sich dies in Echtzeit ändert“, sagt Blakney.

„Wir können jede Saison davor stehen“, sagt Şahin, der hofft, den Grippeimpfstoff von BioNTech noch in diesem Jahr in Studien am Menschen einsetzen zu können.

Ein wirksamerer Grippeimpfstoff wäre bereits ein großer Schritt, aber Pardi und seine Gruppe gehen darüber hinaus und versuchen, einen Impfstoff zu entwickeln, der auf die unveränderlichen Kernstrukturen des Influenzavirus abzielt. „Ein universeller Impfstoff, eine Impfung, die jahrelang halten würde“, sagt er. Jahrzehntelange Forschung legt für einen solchen Impfstoff viele wahrscheinliche Angriffspunkte auf das Influenzavirus nahe, aber die Ausrichtung auf mehrere Standorte bei mehreren Influenzastämmen erhöht schnell die Komplexität und die Kosten für den traditionellen Ansatz. Anders bei mRNA, sagt Pardi: „Wir können problemlos 12 oder 14 Ziele in einem einzigen Schuss haben. Vier Proteine ​​und ihre Varianten in mehreren Stämmen.“

Pardis Gruppe und ihre Mitarbeiter haben bereits gute Ergebnisse für einen Impfstoff bei Mäusen gezeigt. Frettchen stehen als nächstes auf der Tierversuchsleiter – „hoffentlich noch dieses Jahr“, sagt er. Es ist möglich, dass, wenn ihr universeller Impfstoff in einigen Jahren funktioniert, er nicht mit herkömmlichen Grippeimpfstoffen konkurrieren wird, sondern mit den mRNA-basierten saisonalen Impfstoffen, die BioNTech und Moderna jetzt testen werden. „Über viele Jahre mussten wir die Leute von dieser Technologie überzeugen – die Welt hat sich in dieser Hinsicht total verändert“, sagt er. Wie Karikó freut er sich, dass sich mehr Wissenschaftler häufen. „Das sehen wir gerne. In den nächsten Jahren werden wir viel über die Funktionsweise der Technologie lernen.“

Ein Labormitarbeiter am Standort Mainz von BioNTech

INFLUENZA IST AN offensichtliches Ziel für mRNA, sagt Dr. Lynda Stuart, stellvertretende Direktorin für Impfstoffe bei der Gates Foundation. Sie erwartet, dass die Plattform „Grippeimpfstoffe transformieren“ wird und dass es viele andere Impfstoffe gibt, die sie verbessern oder ersetzen könnte. Aber darüber hinaus könnte es auch bei den „echten, harten, hartnäckigen Problemen und Krankheiten“ helfen, wie sie es nennt. Weil die Plattform so schnell und günstig neue RNA herstellen kann, „muss man nicht bei jeder Idee diesen langen Herstellungsprozess durchlaufen. Es wird schneller, sie zu testen. Wir kommen schneller zu neuen Ideen.“

Vielleicht hat sich kein Virus als härter oder widerspenstiger als HIV erwiesen. „Wir sind fast 40 Jahre nach der Entdeckung von HIV“, sagt Mark Feinberg, Leiter der International AIDS Vaccine Initiative (IAVI), und trotz Fortschritten bei Behandlungen und Prophylaxe ist eine Heilung „nicht nahe“. Es gibt ein Dickicht von Problemen. HIV ist eine langfristige Infektion – sie versteckt sich leise in unseren Zellen, anstatt einen sofortigen Kampf mit dem Immunsystem wie Covid-19 oder die Grippe zu führen. Es mutiert unglaublich schnell und erzeugt oft mehrere Varianten innerhalb eines einzelnen Patienten, sodass es kein einziges, stabiles Ziel hat, auf das ein Impfstoff ausgerichtet werden kann. Ein Biochemiker beschrieb mir das Coronavirus-Spike-Protein als „saftiges Ziel“, weshalb so viele verschiedene Impfstoffe dagegen wirken. „Ein Spike erzeugt eine sehr gute Immunantwort. HIV-Proteine ​​nicht so sehr“, sagt Feinberg.

Wissenschaftler glauben jedoch, dass sie einen Fahrplan für einen Impfstoff haben. Wie Derek Cain, Professor am Human Vaccine Institute der Duke University, erklärt, entwickelt ein kleiner Teil der Menschen mit langfristigen HIV-Infektionen schließlich sogenannte „weitgehend neutralisierende Antikörper“ gegen das Virus, die es stoppen können, bevor es in die Zellen eindringt . Zu diesem Zeitpunkt der Krankheit, sagt er, seien diese Antikörper wie „ein Feuerlöscher gegen einen Hausbrand mit vier Alarmen“. Sie können die Infektion nicht alleine rückgängig machen. Aber wenn eine neu HIV-exponierte Person die gleichen Antikörper aufwies, „ist es plötzlich ein Feuerlöscher gegen ein Streichholz“, und die Infektion könnte gestoppt werden.

Es ist, als wäre das Immunsystem dieser Patienten ein Trainer, der in den letzten Minuten eines Spiels eine Gewinnstrategie entwickelt, zu spät, um der eigenen Mannschaft zu helfen. Aber Cain sagt: „Wir können diesen Kampf mit einer Reihe von Impfungen wiederherstellen“, indem wir einem ungetesteten Immunsystem-Impfstoff Schnappschüsse derselben HIV-Infektionen zeigen, die bei den anderen Patienten über Jahre hinweg fortschritten. Es wird viele Versuche und Irrtümer, mehrere Impfungen und Feinabstimmungen erfordern – was Stuart potenziell „Impfschwärme mit vielen Zielen“ nennt.

Mit traditionellen Impfstoffmethoden wäre dies ein massiver Krieg der wissenschaftlichen Abnutzung. Feinberg sagt, dass bei proteinbasierten Impfstoffen „die Zeitspanne zwischen einer Idee und einer Studie leicht zwei Jahre betragen kann“.

„Es ist schwer vorstellbar, dass man diesen Prozess für jedes Immunogen und jedes Ziel durchlaufen muss“, sagt Cain. Aber RNA lässt sich nicht nur schneller herstellen, weil sie nicht nur ein Protein, sondern nur das chemische Signal ist – sie hat auch immer die gleichen Inhaltsstoffe. Es braucht keine neuen langwierigen Sicherheitstests, bevor es vor Gericht geht. „Sie können in einer noch nie dagewesenen kurzen Zeit von einer Sequenz dazu übergehen, einen Impfstoff in die Klinik zu bringen. Damit könnten wir viel schneller vorankommen“, sagt Feinberg.

Plötzlich wird der wissenschaftliche Zeitplan für dieses unglaublich ehrgeizige Projekt um Jahre komprimiert – sogar um Jahrzehnte, sagt Cain. Seine Gruppe arbeitet derzeit mit Pardi und Weissman in Pennsylvania zusammen, um mit der Auswahl von Zielen zu beginnen, während das IAVI und die Gates Foundation mit Moderna zusammenarbeiten. „Die Millionenfrage ist immer noch, ob das funktioniert“, sagt Cain, aber der mRNA-Ansatz könnte viel früher eine Antwort liefern, als man es noch vor wenigen Jahren für möglich gehalten hätte.

„Diese Größenordnung war vorher unvorstellbar. Wir befinden uns an einem sehr spannenden Punkt“, sagt Feinberg.

Hauptsitz und Hauptlabor von BioNTech in Mainz, Deutschland

DIE SELBE GESCHICHTE spielt sich in Hunderten von verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen ab. 2020 öffneten die Schleusen. Nicht nur, dass die Covid-19-Impfstoffe mRNA als wissenschaftlichen Ansatz validierten, durch die Einführung des Impfstoffs wurde in weniger als einem Jahr auch ein riesiges Regulierungs- und Herstellungsnetzwerk für eine brandneue Technologie aufgebaut. Covid hat gewissermaßen die Infrastruktur für die mRNA-Zukunft aufgebaut. Forscher hatten immer versprochen, dass es sauberer und schneller als herkömmliche Methoden sein würde, aber jetzt bauen Unternehmen auch die Kapazität aus, um Milliarden von Dosen pro Jahr zu machen, und es wurde bei Millionen von Menschen getestet und als sicher befunden. „Diese Sicherheitsdaten, der Fertigungsmaßstab, das alles ist ein Mehrwert, dessen Entwicklung Jahre hätte dauern können“, sagt Stuart. So viele der Barrieren, denen andere Blue-Sky-Technologien gegenüberstehen, wurden durch die Dringlichkeit der Pandemie hinweggefegt.

Aus diesem Grund explodiert die Zahl der neuen Projekte. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht von Roots Analysis zählte über 150 mRNA-Impfstoffe und andere Therapien in der Entwicklung. Ob mRNA wirklich eine neue Ära in der Vakzinologie ist, werden wir wahrscheinlich in naher Zukunft anhand der schieren Anzahl der Medikamente wissen, die in Tests gehen. BioNTech arbeite an mindestens sieben neuen Impfstoffen, einige „mit dem gleichen Ansatz wie bei Covid“, sagt Şahin. Andere, wie Tuberkulose und HIV, können länger dauern. Moderna hat neun Impfstoffe in der Pipeline. Auch neue Labore und Biotech-Unternehmen stehen Schlange, um sich selbst zu versuchen, angezogen von der wachsenden Community und dem Versprechen schneller Ergebnisse.

Ziphius Vaccines, ein kleines belgisches Unternehmen, das 2019 gegründet wurde, um sich auf mRNA-Behandlungen gegen Krebs zu konzentrieren, hat sich während der Pandemie auf Infektionskrankheiten konzentriert. „Niemand hat geglaubt, dass man so schnell einen Impfstoff herstellen kann, aber plötzlich kann man mit der [mRNA]-Plattform innerhalb von sechs Wochen ein Ziel erreichen“, sagt Mathieu Ghadanfar, Chief Medical Officer des Unternehmens. Ziphius wählte schnell zehn Ziele aus, darunter Dengue-Fieber, Hepatitis und durch Zecken übertragene Enzephalitis, und hofft, bis Ende 2022 für mindestens vier präklinische Ergebnisse zu haben. Aufgrund der Fortschritte des vergangenen Jahres verfügen größere Unternehmen über das Know-how um vielversprechende Ergebnisse, die aus einem kleineren Labor stammen, schnell zu skalieren. „Es gibt all diese Einrichtungen, die jetzt jeden mRNA-Impfstoff herstellen können, und die werden bleiben“, sagt Ghadanfar. „Jeden Tag sehe ich, wie ein neues Unternehmen in die mRNA einsteigt.“

Sogar der bereits optimierte Herstellungsprozess für diese Impfstoffe könnte noch weiter schrumpfen – so dass sie nicht nur einfacher, sondern praktisch überall hergestellt werden können. Da ihre chemische Zusammensetzung im Vergleich zu den ganzen Viren oder lebenden Zellen, die wir für herkömmliche Impfstoffe extrahieren, relativ einfach ist, benötigen mRNA-Fabriken nur einen Bruchteil des Platzes. Von der Größe eines „Fußballfeldes bis hin zu einem Vorgarten“, witzelte mir ein Ingenieur. Aber es gibt keinen Grund, warum sie nicht noch kleiner und einfacher werden könnten. „Wie auf einem Schreibtisch, so groß wie ein Fotokopierer. Sie haben Ihre Chemikalien in einer Kartusche und los geht's“, sagt Harris Makatsoris, Professor für nachhaltige Produktionssysteme am King’s College London.

Makatsoris arbeitet an einem Prototyp, um genau das zu tun. Es ist Teil eines von der britischen Regierung finanzierten Projekts Future Vaccine Manufacturing Research Hub, das ursprünglich dafür gedacht war, für Nationen im globalen Süden Wege zu finden, ihre eigenen Impfstoffe herzustellen. Das ist immer noch das Ziel, aber nachdem fast jede Nation auf der Erde monatelang um begrenzte Vorräte gekämpft und gekämpft hat, ist die Fähigkeit zur Herstellung von Impfstoffen jetzt eine Regierungspriorität. Makatsoris stellt sich vor, dass diese Personenwaagen für kleine Operationen in Krankenhäusern verwendet werden, aber im Falle einer Pandemie zu einer Art nationalem Impfstoffnetz werden. „Mit etwa 60 Maschinen könnte man die gesamte Bevölkerung Englands bearbeiten“, sagt er.

Oder legen Sie sie in eine Schachtel und senden Sie sie dorthin, wo sie benötigt werden. „Technisch ist es ziemlich anspruchsvoll – aber es ist klein, es beinhaltet kein Gefahrgut. Es ist sehr übertragbar“, sagt Cleo Kontoravdi, Professorin für Biosystemtechnik am Imperial College. Robin Shattock vom Imperial College, der den Hub leitet, stellt sich das ähnlich wie die Personal-Computing-Revolution vor. „Das Lab-in-a-Box ist der PC, und Unternehmen oder Labore stellen Software her – Impfstoffe oder andere Medikamente“, sagt er. Solange Sie über die Hardware verfügen, können Sie das Programm überall auf der Welt ausführen.

Ein Labormitarbeiter an einer sauberen Bank im Zellkulturlabor von BioNTech

VIELLEICHT AM MEISTEN Das spannende an den nächsten Jahren ist, dass es, wie Blakney es ausdrückt, „so viele Dinge gibt, die wir noch nicht wissen“ darüber, was genau diese Technologie leisten kann. Der grundlegende RNA-Biologe James Eberwine sagt, dass sie umso leistungsfähiger werden kann, je mehr wir darüber lernen, wie sie in unseren Zellen funktioniert und wie man sie manipuliert. „Die Zukunft ist wirklich RNA“, sagt er. „Ich war die ganze Zeit ein Befürworter davon.“

In naher Zukunft könnten die Grundlagen der RNA-Lieferung enorm verbessert werden. Im Moment funktionieren mRNA-Impfstoffe wie herkömmliche Impfstoffe, die in einen Muskel geschossen und von den Zellen, auf die sie dort treffen, aufgesaugt werden. „Es ist ein sehr stumpfes Werkzeug“, sagt Blakney. Sie konzentriert sich auf die Lipid-Nanopartikel-Beschichtung, das Fettkügelchen, das die mRNA-Impfstoff-Nutzlast wie eine Seifenblase umgibt. „Die Leute finden jetzt Wege, die Zusammensetzung zu ändern, damit sie im Körper anders wirkt, um auf die Milz oder die Lunge zu zielen. Wir beginnen gerade erst zu verstehen, wie wir dieses System steuern können“, sagt sie. Karikó stellt sich vor, neue Anweisungen hinzuzufügen, die mit den körpereigenen Signalen zum Mischen und Organisieren seiner RNA spielen – um zu verhindern, dass sie in bestimmten Zelltypen verwendet wird oder den Zeitpunkt und die Dauer seiner Aktion ändert. Dies könnte die Abgabe präziser, weniger toxisch und letztendlich effektiver machen.

„Es gibt echte Blue-Sky-Möglichkeiten“, sagt Stuart. mRNA, die Proteine ​​​​erzeugt, ist die grundlegende Vorlage. Sie schlägt vor, dass die Technologie auch für den Proteinersatz (Behandlung von Krankheiten wie Mukoviszidose, bei der der Körper ein lebenswichtiges Protein falsch produziert) und für monoklonale Antikörper (kleine Immunzellen, die auf kranke und krebsartige Zellen zur Zerstörung abzielen können) eingesetzt werden könnte. Bei BioNTech hat Şahin an beiden seit langem vor Covid gearbeitet, und er ist auch begeistert von dem, was er "Immune Engineering" nennt, bei dem mRNA verwendet wird, um Anweisungen für verbesserte Versionen der körpereigenen Immunmoleküle zu liefern und seine bestehenden Abwehrkräfte zu stärken länger halten oder Eindringlinge besser erkennen.


Ist die produzierte mRNA über die Zeit konstant? - Biologie

Das zentrale Dogma konzentriert sich auf die Herstellung der großen Nukleinsäure- und Proteinpolymere der Biologie. Die Kontrolle und Aufrechterhaltung der Funktionen der Zelle hängt jedoch von mehr als nur der Synthese neuer Moleküle ab. Der Abbau ist ein weiterer wichtiger Prozess im Leben der Makromoleküle der Zelle und wird selbst streng kontrolliert. Tatsächlich ist im einfachsten Modell der mRNA-Produktion die Dynamik des durchschnittlichen mRNA-Spiegels gegeben durch

wobei r die Geschwindigkeit der mRNA-Produktion und γ die Geschwindigkeitskonstante ist, die den mRNA-Zerfall bestimmt. Der Steady-State-Wert der mRNA ist gegeben durch

Dies zeigt, dass es in erster Näherung das Gleichgewicht der Produktions- und Zerfallsprozesse ist, das die stationären Niveaus dieser Moleküle steuert. Wenn unsere Gleichung für die Kopienzahl von Molekülen pro Zelle gilt, ändert sich die Zahl jedes Mal, wenn sich die Zellen teilen, abrupt, da der gesamte mRNA- und Proteingehalt zwischen den beiden Tochterzellen aufgeteilt wird. Wenn unsere Gleichung stattdessen in der Sprache der Konzentrationen gedacht wird, müssen wir uns diesem Problem nicht stellen, denn mit dem Wachstum der Zelle ändert sich auch die Anzahl der Moleküle und damit die Konzentration. Der Wachstumseffekt auf die Konzentration kann in die Geschwindigkeitskonstante für den Abbau aufgenommen werden, um die Verdünnung zu berücksichtigen. Dies ist eine übliche mathematisch elegante Lösung, aber nicht sofort intuitiv, und daher werden wir versuchen, sie im Folgenden zu klären. Doch was sind zunächst die Kennwerte für mRNA- und Proteinabbauzeiten?

Abbildung 1: Gemessene Halbwertszeiten von mRNAs in E. coli, knospende Hefe und Maus-NIH3T3-Fibroblasten. (A, adaptiert von JA Bernstein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:9697, 2002 B, adaptiert von Y. Wang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:5860, 2002 C. adaptiert nach B. Schwanhausser, Nature, 473:337, 2013).

Die Lebensdauer von mRNA-Molekülen ist im Vergleich zu der fundamentalen Zeitskala der Zellbiologie, die durch die Zeit zwischen den Zellteilungen definiert wird, normalerweise kurz. Wie in Abbildung 1A gezeigt, für E coli, haben die meisten mRNA-Moleküle eine Lebensdauer zwischen 3 und 8 Minuten.Die Experimente, die zu diesen Ergebnissen führten, wurden durchgeführt, indem die Transkription durch die Verwendung des Arzneimittels Rifampicin, das mit der RNA-Polymerase interagiert, inhibiert wurde und dann die Zellen nach ihren mRNA-Spiegeln in zweiminütigen Intervallen nach der Arzneimittelbehandlung abgefragt wurden. Insbesondere wurden die RNA-Spiegel quantifiziert, indem mit komplementären DNAs auf einem Mikroarray hybridisiert und die relativen Fluoreszenzspiegel zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen wurden. Diese Abbauzeiten sind nur um ein Vielfaches länger als die minimale Zeit, die für die transkriptionale und translationale Elongation benötigt wird, wie in der Vignette zu „Was ist schneller, Transkription oder Translation?“ diskutiert. Dies spiegelt die flüchtige Existenz einiger mRNA-Botschaften wider.

Angesichts solcher genomweiter Daten können verschiedene Hypothesen für die mechanistischen Grundlagen der beobachteten Lebensdauern untersucht werden. Gibt es zum Beispiel einen Zusammenhang zwischen der Fülle bestimmter Nachrichten und ihrer Zerfallsrate? Gibt es Sekundärstrukturmotive oder Sequenzmotive, die Unterschiede in den Zerfallsraten verleihen? Eine der großen Überraschungen der Messungen, die zu Abbildung 1A führten, besteht darin, dass keine der herkömmlichen Erkenntnisse über die Ursprünge der mRNA-Lebensdauer mit den Daten übereinstimmten, die keine klare Korrelation mit Sekundärstruktur, Nachrichtenhäufigkeit oder Wachstumsrate zeigten.

Abbildung 2: L’éléphant et l’Escheria Coli, Dezember 1972 Elefant". Von: http://www.pasteur.fr/infosci/archives/mon/im_ele.html

Inwiefern ist Monods Aussage „Was gilt für? E coli gilt für den Elefanten“ (von Monod in Abbildung 2 dargestellt) uns bei unserer Einschätzung der mRNA-Lebensdauer in anderen Organismen? Die kurze Antwort ist nicht sehr. Während die mediane Lebensdauer des mRNA-Abbaus etwa 5 Minuten in . beträgt E coli, die mittlere Lebensdauer beträgt ≈20 Minuten bei Hefe (siehe Abbildung 1B) und 600 Minuten (BNID 106869) bei menschlichen Zellen. Interessanterweise ist bei den Zellzykluszeiten für diese drei Zelltypen von etwa 30 Minuten eine deutliche Skalierung zu beobachten (E coli), 90 Minuten (Knochenhefe) und 3000 Minuten (Mensch), unter den schnellen exponentiellen Wachstumsraten, in denen die interessierenden Zellen für diese Experimente kultiviert wurden. Als Faustregel legen diese Ergebnisse nahe, dass die Zeitskala des mRNA-Abbaus in diesen Fällen somit etwa ein Fünftel der schnellen exponentiellen Zellzykluszeit beträgt.

Messenger-RNA ist nicht das einzige Ziel des Abbaus. Proteinmoleküle sind selbst auch das Ziel einer spezifischen Zerstörung, obwohl ihre Lebensdauer im Allgemeinen länger ist als die der mRNAs, die zu ihrer Synthese führen, wie unten diskutiert. Aufgrund dieser langen Lebensdauer wird bei schnellen Wachstumsraten die Anzahl der Kopien eines bestimmten Proteins pro Zelle nicht aufgrund eines aktiven Abbauprozesses reduziert, sondern einfach weil die Zelle alle ihre anderen Bestandteile verdoppelt und sich in zwei Töchter teilt, wobei jede der Töchter zurückbleibt mit halb so vielen Kopien des interessierenden Proteins, wie in der Mutterzelle vorhanden waren. Um den Verdünnungseffekt zu verstehen, stellen Sie sich vor, dass die gesamte Proteinsynthese für ein bestimmtes Protein abgeschaltet wurde, während die Zelle ihr Volumen weiter verdoppelt und sich kurz darauf teilt. In absoluten Werten ausgedrückt, wenn die Anzahl der Kopien unseres interessierenden Proteins vor der Teilung N beträgt, ist sie danach N/2. Was die Konzentrationen anbelangt, wenn es mit einer Konzentration c begann, wurde es während des Zellzyklus durch die Verdoppelung des Volumens auf c/2 verdünnt. Dieser Mechanismus ist insbesondere im Zusammenhang mit Bakterien relevant, bei denen die Proteinlebensdauer oft von der Zellteilungszeit dominiert wird. Als Ergebnis ist die Gesamtproteinverlustrate α (der Begriff hat die gleiche Bedeutung wie γ für mRNA) die Summe eines Teils aufgrund des aktiven Abbaus und eines Teils aufgrund der Verdünnung, die bei der Zellteilung auftritt, und wir können die Gesamtmenge schreiben Abtragsleistung in der Form α=αaktivVerdünnung.

Die Aussage, dass die Proteinlebensdauer in schnell wachsenden Bakterien länger ist als der Zellzyklus selbst, wird durch Messungen bereits aus den 1960er Jahren gestützt, in denen radioaktive Markierungen zur Messung der Raten verwendet wurden. In diesem Fall wurde der Abbau markierter Proteine ​​überwacht, indem man die Akkumulation radioaktiver Aminosäuren in einem schnell ausgetauschten Perfusat betrachtete. Es wurde geschätzt, dass nur 2–7% des Proteoms aktiv abgebaut werden, mit einer Halbwertszeit von etwa 1 Stunde (BNID 108404). In jüngerer Zeit zeigten Studien spezifische Fälle eines schnellen Abbaus, einschließlich einiger Sigma-Faktoren, Transkriptionsfaktoren und Kälteschockproteine, doch die allgemeine Aussage, dass Verdünnung der dominante Proteinverlustmechanismus bei Bakterien ist, bleibt gültig.

Abbildung 3: Gemessene Halbwertszeiten von Proteinen in knospender Hefe und einer humanen HeLa-Krebszelllinie. Das Hefeexperiment verwendete den Translationsinhibitor Cycloheximid, der die normale Zellphysiologie stört. Die mittlere Halbwertszeit der 4100 Proteine ​​gemessen in der sich nicht teilenden HeLa-Zelle beträgt 36 Stunden. (A, adaptiert von A. Belle et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 103:13004, 2006 B, adaptiert von S. Cambridge et al., J. Proteome Res. 10:5275, 2011.)

Genau wie bei den genomweiten Studien der mRNA-Lebensdauern, die oben beschrieben wurden, wurden Proteinlebensdauern einer ähnlichen Prüfung unterzogen. Überraschenderweise konnten wir in der Literatur keine genomweiten Angaben zu den Abbauzeiten von Proteinen in E coli in knospender Hefe wurde jedoch ein translationshemmender Wirkstoff (Cycloheximid) verwendet, um die makromolekulare Synthese zu hemmen, und dann wurde der Proteingehalt zu späteren Zeitpunkten unter Verwendung von Western-Blots quantifiziert. Die Western-Blot-Technik ist ein Schema, bei dem die interessierenden Proteine ​​durch spezifische Bindung an einen Teil des Proteins (z ein Standard. Die Hemmung der Translation könnte zu Artefakten führen, aber unter Berücksichtigung dieses Vorbehalts zeigen die in Abbildung 3A gezeigten gemessenen Lebensdauern mit der Methode der Translationsinhibierung die längere Lebensdauer von Proteinen im Vergleich zu ihren mRNA-Gegenstücken mit einer mittleren Lebensdauer von etwa 40 Minuten (BNID 104151). Probleme mit der Genauigkeit dieser Ergebnisse erfordern immer noch die Entwicklung neuer Methoden zur Erstellung solcher Erhebungen.

Abbildung 4: Verteilung von 100 Proteinen aus einer menschlichen H1299-Zelllinie, wobei die Abbaurate mit der Verdünnung verglichen wird, um herauszufinden, welcher Entfernungsmechanismus für jedes der Proteine ​​dominant ist. Die Gesamtabtragsrate alpha liegt zwischen 0,03 und 0,82 h-1 mit einem Durchschnitt von 0,1+/-0,09 h-1. Dies entspricht einer Halbwertszeit von ≈ 7 Stunden über die Beziehung Halbwertszeit, T1/2 = ln(2)/alpha. Angepasst von E. Eden et al., Science, 331: 764, 2011.

Mit modernen Fluoreszenztechniken ist es möglich geworden, Abbauraten menschlicher Proteine ​​zu messen in vivo ohne dass die Zellen lysiert werden müssen. Die in menschlichen Zellen beobachteten langen Entfernungszeiten sind in Fig. 3B gezeigt. Die Messungen erfolgten durch Fusion des interessierenden Proteins mit einem fluoreszierenden Protein. Dann ist es durch Aufteilen der Population in zwei Gruppen, von denen eine photogebleicht und die andere nicht ist, und Beobachten des Wiederauftretens der Fluoreszenz in der photogebleichten Population möglich, die Abbauzeit direkt zu messen. Wie in Abbildung 4 gezeigt, besteht für menschliche Zellen ein interessantes Zusammenspiel zwischen aktivem Abbau und Proteinentfernung durch Verdünnung. Es zeigte sich, dass die Halbwertszeiten des aktiven Abbaus breit verteilt waren, wobei der schnellste beobachtete Umsatz von weniger als einer Stunde und der langsamste nur einen vernachlässigbaren aktiven Abbau in den wenigen Tagen der Zeitraffermikroskopie zeigten. Diese Ergebnisse können mit einer Vorhersage auf der Grundlage der N-Ende-Regel verglichen werden, die besagt, dass die Aminosäure am N-Terminus des Proteins einen starken Einfluss auf den aktiven Abbau durch das Ubiquitinierungssystem hat. Zum Beispiel sagt es in Säugetiersystemen voraus, dass Arginin, Glutamat und Glutamin innerhalb von etwa einer Stunde zu einem Abbau führen, während Valin, Methionin und Glycin für mehrere zehn Stunden stabil sind.

Um die Lebensdauer der stabilsten Proteine ​​zu charakterisieren, wurde Mäusen in jungen Jahren für kurze Zeit isotopenmarkiertes Futter verabreicht und ein Jahr später analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die meisten Proteine ​​innerhalb weniger Tage umgesetzt werden, aber einige wenige zeigen eine bemerkenswerte Stabilität. Histon-Halbwertszeiten wurden mit ≈200 Tagen gemessen, noch verlockender, die Kernpore besteht aus einem Proteingerüst mit einer Halbwertszeit von >1 Jahr, während alle umgebenden Komponenten viel schneller aufgefüllt werden.


Schau das Video: Ist Impfung mit mRNA Genmanipulation? Der Faktist. (Juni 2022).


Bemerkungen:

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