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Kann etwas sowohl Brüche als auch Querverbindungen in der DNA verursachen?

Kann etwas sowohl Brüche als auch Querverbindungen in der DNA verursachen?


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Ein Doppelstrangbruch in der DNA ist genau das: Die DNA-Stränge werden durchtrennt. Eine Vernetzung tritt auf, wenn etwas zwischen zwei Nukleotiden in der DNA eine kovalente Bindung eingeht. Ist es jedoch möglich, dass etwas sowohl eine Quervernetzung als auch einen Doppelstrang- (oder Einzelstrang-)Bruch bildet? Könnte beispielsweise ein Teil eines Moleküls einen Bruch verursachen, während ein anderer zu einer Vernetzung reagiert?

Für die Zwecke dieser Frage zählen auch Enzyme oder Proteine, die dies tun (falls vorhanden).


Cisplatin bildet in vitro DNA-Protein-Crosslinks (also DNA-Protein-DNA) in vitro [1] und ein Review [2] sagt, dass Cisplatin zu DSBs führt (obwohl ich im Moment nicht auf die primäre Quelle zugreifen kann). Aber wissen Sie, mit Ausnahme von ionisierender Strahlung verursachen Mutagene normalerweise keine direkten DSBs. Es wird durch Reparaturprozesse oder Dinge wie das Anhalten an Replikationsgabeln aufgrund des Mutagens verursacht.

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1874601/

[2] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4047912/#!po=11.9919


UV-Strahlung kann sowohl DNA-Vernetzung als auch Doppelstrangbrüche induzieren. Hier ist ein Papier, das Sequenzdeterminanten von UV-induzierten Intra-Strang-Crosslinks berichtet:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11342214

Hier ist ein Artikel, in dem die Autoren vorschlagen, dass UV-induzierte Doppelstrangbrüche eine Folge der Reparatur oxidativer Läsionen sind und nicht ein primäres Ergebnis der UV-Photochemie.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3488256/


DNA-Bruch liegt sowohl lernbedingten als auch altersbedingten Schäden zugrunde

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Der Prozess, der es unserem Gehirn ermöglicht, zu lernen und neue Erinnerungen zu generieren, führt laut einer neuen Studie von Forschern des MIT mit zunehmendem Alter auch zu Degeneration.

Das Ergebnis, über das in einem heute in der Zeitschrift veröffentlichten Artikel berichtet wurde Zelle, könnte Forschern letztendlich helfen, neue Ansätze zu entwickeln, um den kognitiven Rückgang bei Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit zu verhindern.

Jedes Mal, wenn wir etwas Neues lernen, brechen unsere Gehirnzellen ihre DNA und verursachen Schäden, die die Neuronen sofort reparieren müssen, so Li-Huei Tsai, Picower Professor für Neurowissenschaften und Direktor des Picower Institute for Learning and Memory am MIT.

Dieser Prozess ist für das Lernen und das Gedächtnis unerlässlich. „Zellen brechen ihre DNA physiologisch auf, damit bestimmte wichtige Gene exprimiert werden können“, sagt Tsai. „Im Fall von Neuronen müssen sie ihre DNA brechen, um die Expression von Genen für die frühe Reaktion zu ermöglichen, die letztendlich den Weg für das Transkriptionsprogramm ebnen, das Lernen und Gedächtnis und viele andere Verhaltensweisen unterstützt.“

Langsamere DNA-Reparatur

Mit zunehmendem Alter lässt jedoch die Fähigkeit unserer Zellen, diesen DNA-Schaden zu reparieren, nach, was zu Degeneration führt, sagt Tsai. „Wenn wir jung sind, erzeugt unser Gehirn DNA-Brüche, wenn wir neue Dinge lernen, aber unsere Zellen sind absolut oben und können den Schaden schnell reparieren, um die Funktionsfähigkeit des Systems aufrechtzuerhalten“, sagt Tsai. „Aber während des Alterns und insbesondere bei einigen genetischen Bedingungen wird die Effizienz des DNA-Reparatursystems beeinträchtigt, was zu einer Anhäufung von Schäden führt, und dies könnte unserer Meinung nach sehr schädlich sein.“

In früheren Forschungen zur Alzheimer-Krankheit bei Mäusen fanden die Forscher heraus, dass Neuronen in der Hippocampus-Region des Gehirns bereits in der präsymptomatischen Phase der Erkrankung eine große Anzahl von DNA-Läsionen enthalten, die als Doppelstrangbrüche bezeichnet werden.

Um herauszufinden, wie und warum diese Doppelstrangbrüche entstehen und welche Gene davon betroffen sind, begannen die Forscher zu untersuchen, was passieren würde, wenn sie solche Schäden in Neuronen verursachen. Sie applizierten ein toxisches Mittel auf die Neuronen, von denen bekannt ist, dass sie Doppelstrangbrüche induzieren, und ernteten dann die RNA aus den Zellen zur Sequenzierung.

Sie entdeckten, dass von den 700 Genen, die infolge dieser Schädigung Veränderungen zeigten, die überwiegende Mehrheit erwartungsgemäß reduzierte Expressionsniveaus aufwies. Überraschenderweise zeigten jedoch 12 Gene – von denen bekannt ist, dass sie schnell auf neuronale Stimulation wie eine neue sensorische Erfahrung reagieren – nach den Doppelstrangbrüchen erhöhte Expressionsniveaus.

Um festzustellen, ob diese Unterbrechungen während der neuronalen Stimulation auf natürliche Weise auftreten, behandelten die Forscher die Neuronen anschließend mit einer Substanz, die Synapsen ähnlich einer neuen Erfahrung verstärkt.

„Natürlich haben wir festgestellt, dass die Behandlung die Expression dieser frühen Reaktionsgene sehr schnell erhöhte, aber auch DNA-Doppelstrangbrüche verursachte“, sagt Tsai.

Das Gute mit dem Bösen

In weiteren Studien konnten die Forscher bestätigen, dass ein Enzym namens Topoisomerase IIβ für die DNA-Brüche als Reaktion auf die Stimulation verantwortlich ist, so der Hauptautor des Papiers, Ram Madabhushi, Postdoc in Tsais Labor.

„Als wir dieses Enzym zerstörten, stellten wir fest, dass sowohl die Bildung von Doppelstrangbrüchen als auch die Expression von Genen der frühen Reaktion reduziert wurden“, sagt Madabhushi.

Schließlich versuchten die Forscher herauszufinden, warum die Gene einen so drastischen Mechanismus benötigen, damit sie exprimiert werden können. Mithilfe von Computeranalysen untersuchten sie die DNA-Sequenzen in der Nähe dieser Gene und entdeckten, dass sie mit einem Motiv oder Sequenzmuster für die Bindung an ein Protein namens CTCF angereichert waren. Dieses „architektonische“ Protein ist dafür bekannt, Schleifen oder Krümmungen in der DNA zu erzeugen.

In den Frühreaktionsgenen wirken die von diesem Protein erzeugten Krümmungen als Barriere, die verhindert, dass verschiedene Elemente der DNA miteinander interagieren – ein entscheidender Schritt bei der Expression der Gene.

Die von den Zellen erzeugten Doppelstrangbrüche ermöglichen es ihnen, diese Barriere zu überwinden und die Expression der Gene der frühen Reaktion zu ermöglichen, sagt Tsai.

„Obwohl die konventionelle Weisheit besagt, dass DNA-Läsionen sehr schlimm sind – da dieser „Schaden“ mutagen sein und manchmal zu Krebs führen kann – stellt sich überraschenderweise heraus, dass diese Brüche Teil der physiologischen Funktion der Zelle sind“, sagt Tsai.

Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die Expression von Genen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind, mit zunehmendem Alter abnimmt. Daher planen die Forscher nun, weitere Studien durchzuführen, um herauszufinden, wie sich das DNA-Reparatursystem mit dem Alter verändert und wie dies die Fähigkeit der Zellen beeinträchtigt, mit der fortgesetzten Produktion und Reparatur von Doppelstrangbrüchen fertig zu werden.

Sie planen auch zu untersuchen, ob bestimmte Chemikalien diese DNA-Reparaturkapazität verbessern könnten.

Laut Bruce Yankner, einem Professor für Genetik und Neurologie an der Harvard Medical School, der nicht an der Forschung beteiligt war, stellt das Papier einen wichtigen konzeptionellen Fortschritt in unserem Verständnis der Genregulation dar.

„Die Arbeit verknüpft auf elegante Weise die Bildung von DNA-Strangbrüchen durch das Enzym Topoisomerase IIβ mit der zeitlichen Kontrolle der Transkription und liefert den bisher überzeugendsten Beweis dafür, dass dies ein zentraler Kontrollmechanismus der Transkription ist“, sagt er. „Ich gehe davon aus, dass dieser Fortschritt weitreichende Auswirkungen haben wird, die von der grundlegenden Biologie der Transkription bis hin zu pathologischen Mechanismen reichen, die an Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit beteiligt sind.“


Kapitel 14 Mutation und DNA-Reparatur

Beispiel für Darmkrebs:
- mehrere Mutationen in Schlüsselgenen erforderlich (Tumorsuppressoren und Prookton für alle Krebsarten)
- Der entscheidende Punkt ist, dass Mutationen in einer Zelle entstehen und dann an Tochterzellen weitergegeben werden, aber nur in dieser Linie. (also nicht jede Zelle ist betroffen)

Beispiel:
- Die Auswirkungen einer Deletion von drei Nukleotiden können bei Mukoviszidose beobachtet werden.
-Die für Mukoviszidose verantwortlichen Mutationen befinden sich in dem Gen, das für den Transmembran-Leitfähigkeitsregulator der Mukoviszidose kodiert
- Eine Fehlfunktion von CFTR verursacht ein Ionenungleichgewicht, das zu einer abnormalen Sekretion der vielen Zelltypen führt, in denen das CFTR-Gen exprimiert wird.

DELETION: Eine Region des Chromosoms fehlt.
-Eine Deletion kann aus einem Replikationsfehler oder aus der Verbindung von Brüchen in einem Chromosom resultieren, die auf beiden Seiten der deletierten Region auftreten. Auch wenn eine Deletion ein überlebenswichtiges Gen eliminieren kann, kann die Deletion in der Population bestehen bleiben, da Chromosomen normalerweise in homologen Paaren vorkommen. Wenn ein Mitglied eines homologen Paares eine Deletion eines essentiellen Gens aufweist, das Gen jedoch im anderen Mitglied des Paares vorhanden ist, reicht diese eine Kopie des Gens oft für das Überleben und die Reproduktion aus. In diesen Fällen kann die Deletion von Generation zu Generation weitergegeben werden und harmlos bestehen bleiben, solange das Chromosom zusammen mit einem normalen Chromosom vorhanden ist.
-Einige Deletionen verringern die Überlebens- oder Reproduktionschancen eines Organismus, selbst wenn das homologe Chromosom normal ist. Im Allgemeinen gilt: Je größer die Deletion, desto geringer die Überlebenschance.

- Normalerweise ist nicht die Gesamtzahl der Kopien jedes Gens von Bedeutung, sondern die Anzahl der Kopien jedes Gens im Verhältnis zu anderen Genen.

- Einige Schadensarten beeinflussen die Struktur der DNA-Doppelhelix. Dazu gehören Brüche im Zucker-Phosphat-Rückgrat, eine der wichtigsten mutagenen Wirkungen von Röntgenstrahlen. Brüche können in nur einem DNA-Strang oder in beiden auftreten. Ultraviolettes Licht kann Querverbindungen zwischen benachbarten Pyrimidinbasen, insbesondere Thymin, verursachen, was zur Bildung von Thymindimeren führt. Durch kovalente Bindung zwischen benachbarten Thyminen in einem DNA-Strang wird die Doppelhelix eingeklemmt, sowohl die große Furche als auch die kleine Furche werden breiter und die T-A-Basenpaarung wird geschwächt.

- Eine andere Art von Strukturschaden ist der Verlust einer Base von einem der Desoxyribose-Zucker, was zu einer Lücke in einem Strang führt, wo keine Base vorhanden ist. Der spontane Verlust einer Purinbase ist eine der häufigsten Arten von DNA-Schäden, die mit einer Rate von etwa 13.000 verlorenen Purinen pro menschlicher Zelle pro Tag auftritt. Die meisten dieser Mutationen resultieren aus der Interaktion zwischen DNA und normalen Stoffwechselnebenprodukten. Die Rate nimmt mit dem Alter zu und kann auch durch Exposition gegenüber Oxidationsmitteln wie Haushaltsbleiche oder Wasserstoffperoxid erhöht werden.

-Andere Schadensarten betreffen die Basen selbst. Basen, die chemisch beschädigt sind, neigen zu Fehlpaarungen. Einige Basen werden spontan geschädigt, wenn die Reaktion mit einem Wassermolekül eine Aminogruppe (-NH2) durch ein Sauerstoffatom (=O) ersetzt, was die Fähigkeit der Base stört, Wasserstoffbrücken mit einem Komplement zu bilden. Einige natürlich vorkommende Moleküle imitieren Basen und können in DNA eingebaut werden und Nukleotidsubstitutionen verursachen. Koffein ahmt zum Beispiel eine Purinbasis nach (obwohl die Menge an Koffein, um mutagen zu sein, viel mehr ist, als ein normaler Mensch möglicherweise konsumieren könnte).

-Chemikalien, die hochreaktiv sind, neigen dazu, mutagen zu sein, oft weil sie den Basen sperrige Seitengruppen hinzufügen, die eine richtige Basenpaarung verhindern

-Eine Art von Ligase versiegelt einzelsträngige Brüche in der DNA und eine andere Art versiegelt doppelsträngige Brüche. Doppelstrangbrüche führen oft zu Chromosomenumlagerungen, da sie weniger wahrscheinlich repariert werden als Einzelstrangbrüche. Neben ihrer Bedeutung für die DNA-Replikation und -Reparatur sind Ligasen ein wichtiges Werkzeug in der molekularbiologischen Forschung, da sie es ermöglichen, DNA-Moleküle aus verschiedenen Quellen zu verbinden, um rekombinante DNA zu produzieren
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- DNA-Ligase kümmert sich um die Brüche im DNA-Rückgrat
- erfordert eine 5'PO- und 3'OH-Gruppe, um eine phostiered Bindung herzustellen, um diesen Bruch zu reparieren.

- Ungefähr 99% der fehlgepaarten Basen werden sofort durch die Korrekturlesefunktion der DNA-Polymerase korrigiert, bei der das fehlgepaarte Nukleotid sofort nach dem Einbau entfernt und durch das richtige Nukleotid ersetzt wird.
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- Korrekturlesen ist die Funktion der DNA-Polymerase.
- Wenn ein falsches Nukleotid platziert wird, hat die Polymerase eine 3'-zu-5'-Editierfunktion. es geht irgendwie einen Schritt zurück. (Replikation geschieht 5' bis 3')

-Postreplikations-Mismatch-Reparatur Die Korrektur einer Basenfehlpaarung in einem DNA-Strang durch Spaltung eines der Strangrückgrate, Abbau der Sequenz mit der Fehlpaarung und Resynthese aus dem intakten DNA-Strang.
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- MutS (Enzym) erkennt die fehlgepaarten Basen
- MutL identifiziert den Strang, der die falsche Base trägt
- MutH bricht das Rückgrat auf, so dass ein anderes Enzym, das als nächstes kommt (Exonuklease), aufeinanderfolgende Nukleotide entfernen kann, einschließlich der fehlgepaarten Base.
- DNA-Polymerase füllt dann die Lücke und eine Ligase verbindet sich mit dem Rückgrat.

- Basenexzisionsreparatur: korrigiert abnormale oder beschädigte Basen
Im ersten Schritt der Basenexzisionsreparatur wird eine abnormale oder beschädigte Base vom Zucker im DNA-Rückgrat abgespalten. Dann wird der basenlose Zucker vom Rückgrat entfernt, wobei eine Lücke von einem Nukleotid verbleibt. Schließlich fügt eine Reparaturpolymerase das richtige Nukleotid in die Lücke ein.
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- Ein Enzym (Glykosylat) kommt spezifisch und entfernt die Base, während das Rückgrat intakt bleibt.
- die entstandene Lücke wird dann von anderen Enzymen repariert

- Nuceotid-Exzisionsreparatur: Mechanismus zur Reparatur kurzer DNA-Strecken, die fehlgepaarte oder beschädigte Basen enthalten.
-hat einen ähnlichen Wirkmechanismus wie die Mismatch-Reparatur, verwendet aber unterschiedliche Enzyme
-Anstatt einen DNA-Strang Nukleotid für Nukleotid abzubauen, bis die Fehlpaarung beseitigt ist, entfernt die Nukleotidexzisionsreparatur einen gesamten beschädigten Abschnitt eines Strangs auf einmal. Die Nukleotidexzisionsreparatur wird auch verwendet, um Nukleotide mit sperrigen Seitengruppen sowie Thymindimere, die aus ultraviolettem Licht resultieren, zu entfernen.
-Die Bedeutung der Exzisionsreparatur wird durch die Krankheit Xeroderma pigmentosum (XP) veranschaulicht, bei der die Nukleotidexzisionsreparatur defekt ist. Menschen mit XP reagieren äußerst empfindlich auf die UV-Strahlung des Sonnenlichts. Aufgrund des Defekts bei der Nukleotidexzisionsreparatur wird eine durch UV-Licht verursachte DNA-Schädigung nicht korrigiert, was zur Anhäufung von Mutationen in Hautzellen führt. Die Folge sind hohe Hautkrebsraten. Menschen mit XP müssen ihre Sonneneinstrahlung minimieren und in extremen Fällen der Sonne ganz fernbleiben.
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-mehr als eine Basis wurde beschädigt (zum Beispiel: eine sperrige Gruppe könnte hinzugefügt werden)
- ein Enzym spaltet das DNA-Rückgrat an Stellen, die den Schaden flankieren.
- der Schaden wird dann beseitigt
- dann wird die Lücke repariert.


Einführung

Zelluläre DNA wird ständig durch endogene und exogene Faktoren verändert, was täglich zu Zehntausenden von Läsionen in einer menschlichen Zelle führt (Lindahl, 1993). Diese Schäden können je nach Größe in zwei Typen eingeteilt werden: nicht sperrige DNA und sperrige DNA. Nicht sperrige DNA-Läsionen umfassen Basenfehlpaarungen, abasische Stellen und kleine Basenmodifikationen, die im Allgemeinen durch Fehlpaarungsreparatur (MMR), Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidinzisionsreparatur (NIR), direkte Umkehrreparatur (DRR) repariert werden. und Transläsions-DNA-Synthese (TLS) (Gros et al., 2004 Fortini und Dogliotti, 2007 Sharma et al., 2013 Yi und He, 2013 Ignatov et al., 2017). Sperrige DNA-Läsionen umfassen unter anderem: Doppelstrangbrüche, DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und intra- und inter-strang DNA-Crosslinks. Die strukturelle Komplexität bestimmter sperriger DNA-Läsionen erfordert die Verwendung mehrerer koordiniert wirkender DNA-Reparaturwege, darunter homologe Rekombination (HR), nicht-homologe DNA-Endverbindung (NHEJ), Nukleotidexzisionsreparatur (NER), TLS und BER Fanconi-Anämie (FA)-Signalsystem und komplexe proteolytische Maschinerie (Ishchenko et al., 2006 Ho und Schärer, 2010 Duxin et al., 2014 Tretyakova et al., 2015 Martin et al., 2017). Nicht sperrige DNA-Läsionen verursachen begrenzte und lokale DNA-Störungen, während sperrige Läsionen signifikante Verzerrungen in der gesamten DNA-Helixstruktur verursachen (Ide et al., 2011). DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) entstehen, wenn ein Protein kovalent an DNA bindet (Tretyakova et al., 2015). Sie sind aufgrund ihres extrem sperrigen Charakters im Vergleich zu bekannten voluminösen, helixverzerrenden DNA-Läsionen, wie UV-induzierten Pyrimidin-Dimeren, schwer zu reparieren. Diese super-sperrigen Addukte können durch Exposition von Zellen gegenüber endogenen und exogenen Vernetzungsmitteln erzeugt werden (Stingele et al., 2017 Zhang et al., 2020). Das kovalent an DNA gebundene Protein stört stark die DNA-Replikation, Transkription, Reparatur und Chromatin-Remodellierung (Kuo et al., 2007 Klages-Mundt und Li, 2017 Yudkina et al., 2018 Ji et al., 2019). DPCs können je nach Art der kovalenten Verknüpfung im DNA-Protein-Komplex und dem Vorhandensein von DNA-Strangbrüchen in fünf Typen eingeteilt werden (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). Typ 1, der häufigste DPC-Typ, wird gebildet, wenn Proteine ​​kovalent an eine stickstoffhaltige Base in ungestörter DNA binden. Quervernetzungen vom Typ 2-4 treten auf, wenn DNA-spaltende Enzyme in einem kovalenten Zwischenprodukt mit einem DNA-Strang gefangen werden (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). Typ 2 wird gebildet, wenn bifunktionelle DNA-Glykosylasen und Reparaturenzyme mit β-Lyase-Aktivität wie DNA-Polymerase β und Parp1 irreversibel an eine gespaltene Apurin-/Apyrimidin-(AP)-Stelle binden (Ide et al., 2015, 2018 Nakanoet al., 2017). Typ 3 wird während der abgebrochenen DNA-Strangspaltung durch die Topoisomerase 1 (Top1) und die Bildung einer kovalenten Tyrosinylphosphodiester-Bindung zwischen dem Protein und der 3′-terminalen DNA-Phosphateinheit von SSB gebildet (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017). Die abortive Wirkung der Topoisomerase 2 (Top2) erzeugt Typ-4-DPC, in dem Tyrosin an die 5′-terminalen Phosphate von Doppelstrangbrüchen (DSB) gebunden ist (Ide et al., 2015, 2018 Nakano et al., 2017 ). Kürzlich entstand nach der Entdeckung von HMCES, einem 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC)-bindenden Protein, ein neuer DPC-Typ, der abasische Stellen in einzelsträngiger DNA (ssDNA) erkennen und eine kovalente ssDNA-HMCES-Vernetzung bilden kann, um eine fehleranfällige Transläsionssynthese zu verhindern hinter der Läsion (Mohni et al., 2019). Aufgrund der Unterschiede in Struktur und Zusammensetzung zwischen diesen fünf Gruppen wird jeder DPC-Typ durch einen eigenen Reparaturmechanismus verarbeitet. Es scheint schwierig zu sein, sehr sperrige Typ-1-DPC in den kanonischen linearen DNA-Exzisionsreparaturwegen zu entfernen, da das Vorhandensein eines Proteinmoleküls den Zugang zur DNA blockiert. Dennoch haben neuere Studien gezeigt, dass Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und homologe Rekombination (HR) bestimmte Arten von DPCs nukleaseabhängig entfernen können (Zhang et al., 2020). Es ist jedoch noch nicht klar, ob diese Reparaturwege mit anderen Arten von DPC umgehen könnten. Stingeleet al. (2017) haben vorgeschlagen, dass jeder Bestandteil von DPC: DNA, Protein und die kovalente Verknüpfung zwischen ihnen durch drei verschiedene Reparaturmechanismen verarbeitet werden könnte. Ein kürzlich erschienenes Papier von Kühbacher und Duxin (2020) bietet einen umfassenden Überblick über die Bildung und Reparatur von DPCs. In diesem Review fassen wir das aktuelle Wissen über die Reparaturmechanismen zusammen, die an der Entfernung von DHCs beteiligt sind, die durch verschiedene genotoxische Wirkstoffe induziert werden. Kovalente Quervernetzung mit DNA tritt häufiger bei DNA-bindenden Proteinen auf, wie Histone, Transkriptionsfaktoren und DNA-metabolisierenden Enzymen, einschließlich Reparaturfaktoren und Topoisomerasen (Klages-Mundt und Li, 2017). Im Zellkern werden Histone zu einem Oktamer zusammengebaut, das den Nukleosomkern mit 147 bp DNA umwickelt und fest daran gebunden bildet (Luger et al., 1997, 2012). Diese grundlegende Chromatinstruktur macht Histone zu primären Zielen von DNA-Vernetzungsmitteln, was zur Bildung von DNA-Histon-Vernetzungen (DHC) führt (Solomon und Varshavsky, 1985). Derzeit begannen sich die Reparaturmechanismen, die durch verschiedene Faktoren erzeugten DHCs entgegenwirken, erst zu enträtseln.

DNA-Histon-Cross-Links (DHCs)

Nukleosomale DNA wird in kompakte Einheiten verpackt, die als Chromosomen bezeichnet werden, in denen Kernnukleosomenpartikel durch Abschnitte von Linker-DNA mit einer Länge von bis zu 80 bp verbunden sind. Ein Nukleosom-Kernpartikel (NCP) besteht aus jeweils zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4. Das Molekulargewicht einzelner Histone reicht von 11 bis 22 KDa, während das Molekulargewicht von Histonoctamer in NCP 210 KDa beträgt (Eickbush und Moudrianakis, 1978 Luger et al., 1997). Die Stabilität des Nukleosoms basiert auf verschiedenen Protein-Protein-Wechselwirkungen und zahlreichen nicht-kovalenten elektrostatischen und Wasserstoffbrücken zwischen Histone und dem DNA-Duplex (Luger et al., 1997, 2012 Davey et al., 2002 Rohs et al., 2009 ). Die Primärstruktur des Chromatins lässt sich als Bead-on-a-String-Organisation einzelner Nukleosomen darstellen, die mit Hilfe von Histonvarianten in bestimmten Nukleosomen und posttranslationalen Modifikationen zu kompakten Sekundär- und Tertiärstrukturen weiter gefaltet werden können ( PTMs), die sich in ungeordneten Histonschwänzen befinden (Woodcock und Dimitrov, 2001, Luger et al., 2012). Die Faltung von Chromatin in Primär-, Sekundär- und Tertiärstrukturen ist entscheidend für die Regulierung der Zugänglichkeit der DNA zu komplexen Multiprotein-Maschinen, die an der DNA-Replikation, Transkription und Reparatur beteiligt sind. Nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen DNA und Histone ermöglichen es der Chromatindynamik, zwischen der geschlossenen und der offenen Konformation zu wechseln. DHCs beeinträchtigen die Chromatinflexibilität, was in weiterer Folge Langstreckeninteraktionen im Chromatin beeinflussen kann, die indirekt die DNA-Replikation, Transkription und Reparatur innerhalb einer topologisch assoziierenden Domäne (TAD) stören würden (Hinz et al., 2010 Todd und Lippard, 2010 Tretyakova et al. , 2015 Hauer und Gasser, 2017 Nakano et al., 2017). DHCs gehören zum Typ 1, einer nicht-enzymatischen Form von DPC, bei der ein Protein kovalent an eine unzerstörte DNA gebunden ist (Ide et al., 2011). In letzter Zeit wurden mehrere umfassende Studien veröffentlicht, die die Mechanismen der DHC-Bildung beschreiben (Ming et al., 2017 Shang et al., 2019 Yang und Greenberg, 2019), jedoch ist nicht bekannt, ob es spezifische Reparaturmechanismen zur Entfernung von DHCs gibt . In diesem Aufsatz konzentrieren wir uns hauptsächlich auf die Reparaturwege von DHCs und beschreiben kurz ihre Bildung.

Bildung von DHCs

Ein wasserlöslicher kovalenter Komplex aus DNA und Histonen (H2A und H2B) wurde erstmals in einem UV-Crosslinking-Assay identifiziert (Smith, 1966, Sperling und Sperling, 1978). Mit dieser Erkenntnis wurde deutlich, dass neben bekannten Pyrimidindimeren auch DHCs durch UV-Bestrahlung induziert werden können. Es wurde dann entdeckt, dass auch exogene und endogene Aldehyde in Zellen DHCs bilden können (Lam et al., 1985, Kuykendall und Bogdanffy, 1992). Mehr als 10 % der Aminosäurereste in Histone sind Lysine, wohingegen Aldehyde bevorzugt mit ε-Aminogruppen von Lysinseitenketten unter Bildung einer Schiffschen Base reagieren, die weiter mit exocyclischen Aminogruppen von Guanin, Adenin, und Cytosin-DNA-Basen, die eine Methylenbindung erzeugen. Viele Vernetzungsmittel wie Chromat, Metallionen und Cisplatin (cis-diamindichloroplatinum-II), induzieren ebenfalls DHCs in Zellen (Zhitkovich und Costa, 1992). Platinverbindungen verursachen nicht nur DNA-DNA-Crosslinks, sondern verknüpfen auch DNA-Protein-Komplexe kovalent. Im Fall von Histonen (Abbildung 1A) vernetzen diese Verbindungen ε-Aminogruppen von Lysinen und N 7 -Atome von Guanosinen (Tretyakova et al., 2015 Ming et al., 2017). Querverbindungen zwischen DNA und Methioninresten wurden auch in einer Röntgenstruktur von mit Platinverbindungen behandelten Nukleosomen beobachtet (Wu et al., 2008). Die Exposition von gereinigten Nukleosomen gegenüber bifunktionellen Alkylierungsmitteln (z. B. Stickstoffsenf) vernetzt auch Histone mit Guanosinen in der DNA (Shang et al., 2019), jedoch sind diese Arten von Vernetzungen in Zellen viel weniger häufig als DNA-Kreuze -Verbindungen mit Cysteinen und Histidinen von Nicht-Histon-Proteinen (Loeber et al., 2009).

Abbildung 1. Mechanismen der Bildung von Histon-DNA-Crosslinks. (EIN) Reaktionsmechanismen von DNA-Vernetzungsmitteln. (B) Direkte Vernetzung von Histonen mit modifizierten DNA-Basen. (C) Abasic-Site-vermittelte Quervernetzung von Histonen an DNA. NCP-NH2: n-terminales Amin (Lysin) der Histone im Nukleosomkern.

Histone können auch direkt mit 5-Formylcytosin, einer natürlich vorkommenden modifizierten DNA-Base, und 8-Oxoguanin, einem wichtigen oxidativen DNA-Schadensprodukt, reagieren. Lysin-Aminogruppen reagieren mit 5-Formylcytosin (Abbildung 1B) unter Bildung einer reversiblen Schiff-Base (Li et al., 2017 Raiber et al., 2018). Die Reaktion von Lysin-Seitenketten mit 8-Oxoguanosin erzeugte ein stabiles proteinvernetztes Spiroiminodihydantoin (Sp)-Addukt (Xu et al., 2008).

Schließlich werden die meisten DHCs durch eine Reaktion zwischen Histon-Lysinen und einer Aldehydform der 2′-Desoxyribose an apurin/apyrimidinischen (AP)-Stellen (Abbildung 1C) produziert, die entweder direkt bei Beschädigung gebildet werden oder während der Entfernung beschädigter Basen im Reparaturweg der Basenexzision (Solomon und Varshavsky, 1985, Sczepanski et al., 2010). Die resultierende Schiff-Base unterliegt häufig einer strangbrechenden ß-Eliminierung, gefolgt von einer Umkehrung einer Histon-DNA-Vernetzung. Da Histon unverändert aus der Reaktion hervorgeht, wird der gesamte Prozess manchmal als histonkatalysierte Strangspaltung an AP-Stellen bezeichnet (Ren et al., 2019). Es sollte beachtet werden, dass Histon-PTMs und der Chromatinzustand einen signifikanten Einfluss auf die DHC-Bildung an abasischen Stellen und mit DNA-Basen haben könnten (Sczepanski et al., 2010 Bowman und Poirier, 2015).

Mechanismen der Reparatur von DHC

Obwohl DPCs, insbesondere DHCs, häufig in Zellen vorkommen und eine ständige Bedrohung der Genomstabilität darstellen, wird angenommen, dass es mit Ausnahme von Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterasen keinen spezialisierten DNA-Reparaturweg gibt, der diesen extrem sperrigen Herausforderungen gerecht wird. Stattdessen setzt die Zelle mehrere unterschiedliche DNA-Reparatur- und Proteinabbaumechanismen ein, um auf vernetzte DNA und Protein-/Histonkomponenten in einem gegebenen DPC/DHC abzuzielen. Das kovalent gebundene Protein konnte durch die proteolytische Maschinerie der Zelle, wie die spezialisierten Proteasen SPRTN/Wss1, Ddi1 und GCNA1, oder durch das Proteasom, einen ATP-abhängigen Proteasekomplex mit mehreren Untereinheiten, nachgewiesen und zu einem kleinen Peptid abgebaut werden, während die beschädigte DNA Komponente wird in den NER-, BER-, HR-, NHEJ- und FA-Pfad erkannt und repariert.

Proteasom-abhängige Proteolyse von mit DNA vernetzten Histonen

Die Proteasom-vermittelte Proteolyse ist der Hauptweg für den Abbau beschädigter Proteine ​​in einer Zelle. Ein 26S-Proteasom besteht aus einem zylindrischen 20S-Kernpartikel und einem oder zwei 19S-Regulationspartikeln (Ciechanover, 1998, Lecker et al., 2006). Obwohl der 20S-Kern an verschiedene regulatorische Partikel binden kann, verleiht nur das 19S-Partikel die Fähigkeit, ubiquitylierte Proteine ​​abzubauen (Coux et al., 1996 Adams, 2004 Stadtmüller und Hill, 2011). Angesichts der entscheidenden Rolle des Proteasoms beim Abbau von beschädigtem Protein bleibt die Beteiligung von Proteasom und Ubiquitin an der Proteolyse von DHCs oder DPCs ein Diskussionsthema. Hemmung des Proteasoms in Xenopus Eiextrakte stabilisierten die DPCs nicht (Nakano et al., 2007 Duxin et al., 2014). Viele Studien zur Reparatur von DPCs in Säugerzellen deuten jedoch auf eine Beteiligung von Proteasomen hin (Adams, 2004 Baker et al., 2007 Zecevic et al., 2010 Larsen et al., 2019). Die Beteiligung von Proteasomen an der DHC-Entfernung tauchte zum ersten Mal in der Forschung von Quievryn und Zhitkovich (2000) auf, die entdeckten, dass Proteasom-Inhibitoren die Entfernung von DHCs verhindern und menschliche Zellen für niedrigere Formaldehydspiegel sensibilisieren. Eine Studie in Xenopus Eiextrakte fanden heraus, dass DPCs durch die TRAIP E3-Ubiquitin-Ligase ubiquityliert und anschließend vom Proteasom abgebaut werden (Duxin et al., 2014 Larsen et al., 2019). Eine frühere Studie zeigte jedoch deutlich, dass DPCs nicht mit Polyubiquitinketten markiert sind, aber dennoch einem proteasomalen Abbau durch einen nicht gut verstandenen Mechanismus unterliegen (Nakano et al., 2009). Das 26S-Proteasom kann gereinigte nicht-ubiquitylierte Histone abbauen (Kisselev et al., 2006), was die Möglichkeit eines proteasomalen Abbaus nicht-ubiquitylierter beschädigter Histone in Zellen erhöht. Einige Studien haben gezeigt, dass während des durch genotoxische Agenzien induzierten Replikationsstresses Histone hyperacetyliert und dann spezifisch auf Ubiquitin-unabhängige Weise durch einen Komplex aus 20S-Proteasom mit PA200-Proteasom-Aktivator, einem bestimmten regulatorischen Partikel, abgebaut werden (Qian et al., 2013 Mandemaker et al., 2018). Obwohl diese Studien gezeigt haben, dass der Ubiquitin-unabhängige Abbau acetylierter Histone den Replikationsstress lindert, kann die zusätzliche Funktion des PA200-20S-Proteasoms bei der DHC-Reparatur nicht ausgeschlossen werden. Darüber hinaus wurde PA200 in nuklearen Speckles nachgewiesen, und seine Rolle bei der DNA-Reparatur wurde vorgeschlagen (Ustrell et al., 2002). Daher erfordert ein detaillierteres Verständnis der Rolle des Proteasoms bei der DHC-Reparatur weitere Untersuchungen.

Das 20S-Proteasom ist ein hohles, tonnenförmiges Partikel, das aus 28 nicht identischen Untereinheiten besteht, die in vier gestapelten Ringen angeordnet sind. Die aktiven Zentren sind in einem internen Hohlraum eingeschlossen, der durch einen gesteuerten Kanal von den regulatorischen 19S- und PA200-Komplexen getrennt ist. Dieser 13Å-Kanal ist zu eng, als dass ein gefaltetes Protein eindringen könnte (Löwe et al., 1995 Groll et al., 1997). Für den vollständigen Abbau eines DNA-vernetzten Proteins müsste das vernetzte DNA-Nukleotid selbst in die proteolytische Kammer eintreten und einen DNA-Strang hineinziehen. Die DNA-Komponente eines DPC könnte jedoch zu sperrig sein, um in den Kanal einzutreten. Daher kann das Proteasom nur einen Teil eines vernetzten Proteins entfernen und DHC in eine kleinere DNA-Peptid-Vernetzung umwandeln. Alternativ könnten herkömmliche Proteasen, bei denen sich ein aktives Zentrum in einem Spalt auf der Enzymoberfläche befindet, an der Exzision des Großteils der nicht vernetzten Polypeptidkette beteiligt sein, die dann von jeder dieser Proteasen abgebaut und durch das Proteasom.


Danksagung

Wir danken S. Polo und P. Huertas für Ratschläge und K. Dry für fachkundige Hilfe bei Text und Abbildungen. Die S.P.J. Labor wird durch Zuschüsse von Cancer Research UK, der Europäischen Kommission (Projekte GENICA und DNA Repair), dem Wellcome Trust und dem Biotechnology and Biological Sciences Research Council unterstützt. Das J.B.-Labor wird durch Stipendien der Dänischen Krebsgesellschaft, der Dänischen Nationalen Forschungsstiftung und der Europäischen Kommission (Projekte GENICA, Active p53, TRIREME und DNA Repair) unterstützt.

Autorenbeiträge S.P.J. und J.B. konzipierten und schrieben alle Aspekte dieses Artikels.


REVIEW Artikel

  • Abteilung für Molekulare Strahlenbiologie, Abteilung für Radioonkologie, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

RecQ-DNA-Helikasen sind eine konservierte Proteinfamilie, die in Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren vorkommt. Diese Helikasen spielen eine wichtige Rolle bei mehreren zellulären Funktionen, einschließlich DNA-Replikation, Transkription, DNA-Reparatur und Telomererhaltung. Humans have five RecQ helicases: RECQL1, Bloom syndrome protein (BLM), Werner syndrome helicase (WRN), RECQL4, and RECQL5. Defects in BLM and WRN cause autosomal disorders: Bloom syndrome (BS) and Werner syndrome (WS), respectively. Mutations in RECQL4 are associated with three genetic disorders, Rothmund–Thomson syndrome (RTS), Baller–Gerold syndrome (BGS), and RAPADILINO syndrome. Although no genetic disorders have been reported due to loss of RECQL1 or RECQL5, dysfunction of either gene is associated with tumorigenesis. Multiple genetically independent pathways have evolved that mediate the repair of DNA double-strand break (DSB), and RecQ helicases play pivotal roles in each of them. The importance of DSB repair is supported by the observations that defective DSB repair can cause chromosomal aberrations, genomic instability, senescence, or cell death, which ultimately can lead to premature aging, neurodegeneration, or tumorigenesis. In this review, we will introduce the human RecQ helicase family, describe in detail their roles in DSB repair, and provide relevance between the dysfunction of RecQ helicases and human diseases.


Advances in Radiation Biology

M.N. Cornforth , J.S. Bedford , in Advances in Radiation Biology , 1993

Publisher Summary

This chapter discusses the early development of ionizing radiation damage in chromosomes. Ionizing radiations are among the most potent of clastogens , apart from being mutagenic and oncogenic. Gross structural changes—such as translocations, inversions, and deletions—appear to constitute the principal genetic alterations that underlie the malignant transformation of cells, whereas dominantly acting point mutations involving single base changes in oncogenes appear to be of minor importance by comparison. Ionizing radiation is extremely inefficient in producing point mutations involving single base changes in mammalian cells. Ionizing radiations produce a wide spectrum of lesions, many of which are known to be produced in numbers exceeding aberration yields. In addition to permanent heritable changes in surviving germ cells leading to harmful effects in future generations, ionizing radiations can lead to cell reproductive death. This cell-killing process also appears to result largely from the production of certain kinds of gross chromosomal aberrations. There have been successful attempts to sequence stretches of DNA that span break points of spontaneous chromosomal exchange-type aberrations and large intragenic deletions within endogenous genes.


The right way to repair DNA

Salk scientists discover that CYREN microprotein helps cells choose best path to repair genes and avoid cancer. Left: Chromosomes (red) with telomeres (green) that are undisturbed remain pristine and separate. Right: when CYREN is absent, chromosomes that have been disturbed to artificially trigger NHEJ show fusions that are characteristic of repair after DNA is copied. Credit: Salk Institute

Is it better to do a task quickly and make mistakes, or to do it slowly but perfectly? When it comes to deciding how to fix breaks in DNA, cells face the same choice between two major repair pathways. The decision matters, because the wrong choice could cause even more DNA damage and lead to cancer.

Salk Institute scientists found that a tiny protein called CYREN helps cells choose the right pathway at the right time, clarifying a longstanding mystery about DNA repair and offering researchers a powerful tool that could guide better treatments for cancer. The work appears in Natur on September 20, 2017.

"Elucidating DNA repair pathways is critical to understanding how they can sometimes be toxic," says Jan Karlseder, a professor in Salk's Molecular and Cell Biology Laboratory and the senior author of the new paper. "Our discovery of CYREN's function not only adds to our body of knowledge, it gives us a new tool with which to potentially fight cancer."

Double-strand breaks, the most serious injuries that happen to DNA, can be repaired by one of two pathways: a fast but error-prone process known as NHEJ (non-homologous end joining) and a slower, error-free pathway known as HR (homologous recombination). The faster pathway efficiently rejoins broken strands, but in the case of multiple breaks it can join the wrong two ends together, making things much worse for a cell. The slower pathway is error-free because it relies on having an undamaged DNA sequence to guide the repair, but this means it can only operate after a cell has copied its genetic information in order to divide. Given that, the fast pathway operates exclusively before DNA is copied, though its machinery is so efficient and prolific that scientists have wondered why it doesn't outcompete the slower, more-exact pathway after copying, too. Scientists have long suspected that something must be holding the faster option back in those cases.

That something, the new work reveals, is a microprotein called CYREN, which inhibits the faster pathway when a DNA copy is available for the slower pathway to use. CYREN was discovered by another Salk scientist, Alan Saghatelian, as part of a 2015 effort to identify small proteins called "short ORF-encoded peptides" or SEPs, which are increasingly being found to have critical biological roles.

The right way to repair DNA. This cartoon illustrates the suppressive effect of CYREN on the normally faster NHEJ DNA-repair pathway, allowing the slower HR pathway a chance to get ahead. Credit: Salk Institute

"We found a lot of these peptides in our earlier study but we didn't really know if any of them were important until the Karlseder lab got involved," says Saghatelian, a professor in the Clayton Foundation Laboratories for Peptide Biology and one of the paper's coauthors. "Thanks to this impressive new work, we now know there are some really important molecules among the hundreds we're discovering."

Saghatelian's research had suggested that CYREN was interacting with the master switch of the faster pathway, a protein called Ku. To determine the exact nature of the interaction, Karlseder's team worked with a region of the genome where repair is normally suppressed to prevent dangerous fusions: the ends of chromosomes, called telomeres. Researchers can artificially disturb telomeres to activate the fast pathway, making it a model system to test CYREN's effects.

"Telomeres offer a great research tool because they really need to repress repair, but there are ways to activate the repair machinery so that you can study it in a very controlled way," says Nausica Arnoult, a Salk research associate and first author of the paper. The Salk team did so, and found that with CYREN present, no repairs occurred after the cell copies its DNA, suggesting that it does flip off the master switch, Ku. Without CYREN around, Ku's fast pathway was active both before DNA was copied and after.

Because the telomere experiments did not tell the team much about the competition between the fast and slow pathways, Arnoult next used molecular tools to compare repair in living cells with and without CYREN. She combined the DNA scissors known as CRISPR with genes for fluorescent proteins that would be triggered by repair so that she could cut DNA in specific ways and see from the ensuing color which pathway had made the repair. She also analyzed all the protein interactions that took place.

These experiments revealed that CYREN directly attaches to Ku to inhibit the fast pathway both depending on timing (before or after DNA copying) and the type of DNA break (smooth versus jagged, for example). Its activity can even tune the ratio of fast to slow repairs.

"Our study shows that CYREN is an important regulator of DNA-repair-pathway choice," says Karlseder, who holds the Donald and Darlene Shiley Chair at Salk. "The work also points to the exciting possibility of potentially introducing DNA damage in cancer cells and using CYREN to prevent them from making repairs."


West Point biochemist warns about threat of bioweapons

In this episode of Intelligence Matters, host Michael Morell speaks with Dr. Ken Wickiser, a biochemist and associate dean of research at U.S. Military Academy West Point, about his piece "Engineered Pathogens and Unnatural Biological Weapons: The Future Threat of Synthetic Biology." Wickiser describes the growing influence of synthetic biology and what can happen if it gets in the wrong hands.

Höhepunkte

Was ist synthetische Biologie? "Synthetic biology is the process of engineering natural genetic systems. In terms of engineering: taking what nature has provided us and optimizing it, co-opting it, repurposing it, making it more efficient, and making it more cost effective. In large part for good purposes, to make new and novel biomaterials, to make new and novel pharmaceuticals. To make existing pharmaceuticals cheaper, more abundant, more available for the population."

Nefarious use of synthetic biology: "What we're concerned about is the production of either small molecules or gene products that could be used in a way that is a negative influence on someone's health. Whatever you can consider in your mind, is probably capable of being produced in the synthetic biology."

Next generation needs to learn about synthetic biology: "Whether we're talking about budding scientists or people who are interested in ethics or people who are interested in economics. We need people to understand the benefits of synthetic biology and the potential threats. That way we can develop common sense policies that will allow the science to progress, will allow us to benefit from the development of the science, but at the same time will assure our safety."

"Intelligence Matters": Ken Wickiser transcript

Producer: Paulina Smolinksi

"Intelligence Matters" Podcast With Michael Morell

DR. KEN WICKISER INTELLIGENCE MATTERS TRANSCRIPT

MICHAEL MORELL: This discussion will be part of a series of episodes that we're doing between now and the inauguration on the key national security issues facing the United States. I'll let our listeners know this one is going to be a bit scary. You and your colleagues wrote a paper published in August that caught my attention. It was published by the Combating Terrorism Center at West Point, which is one of the best-known counterterrorism think tanks in the world. Your piece was titled "Engineered Pathogens and Unnatural Biological Weapons: The Future Threat of Synthetic Biology" which is what I really want to dig into today with you. But before we do that, I wanted to give you an opportunity to mention the other authors of the piece because there were quite a few.

DR. KEN WICKISER: Absolutely. Thank you for allowing me that opportunity. This was a team effort. One of the great things about West Point is that we have a really great combination of both active duty military and the government civilian faculty and staff here in our effort to help develop the next generation of army leaders. My colleagues on this particular paper include Colonel John Burpo, who has a Ph.D. from MIT in bioengineering, Lieutenant Colonel Michael Washington, who has a Ph.D. in microbiology from the Uniformed Services University of Health Sciences, Dr. Kevin O'Donovan, who is a Title 10 government civilian and the deputy director of the Life Science Program here at West Point, his Ph.D. is in neuroscience from Johns Hopkins University. We also have a returning active military officer, Lieutenant Colonel, who is now getting his Ph.D. at at Boston University. We have a group of people who are not only subject matter experts, but they are people who have operational experience. They have operational experience in the military, or in both government and in the civilian academic labs across the United States. We took a holistic view of this in the context of what do our cadets really need to know about this technology? The point here was not to be scared, but to be prepared and understand from a holistic standpoint what synthetic biology is, where it could go, and what we need to be concerned about.

MICHAEL MORELL: What is synthetic biology?

DR. KEN WICKISER: That's a great question, because it depends on who you ask. In the broadest interpretation, synthetic biology is the process of engineering natural genetic systems. In terms of engineering: taking what nature has provided us and optimizing it, co-opting it, repurposing it, making it more efficient, and making it more cost effective. In large part for good purposes, to make new and novel biomaterials, to make new and novel pharmaceuticals. To make existing pharmaceuticals cheaper, more abundant, more available for the population. Synthetic biology has been around for a long time, but it's really increased in its prevalence and its significance since the genomic age. Its prevalence increased since we really understood the nature of DNA and have been able to catalogue the structure of DNA and how genomes in particular are organized: the controlling components, the parts that make proteins, the parts that serve as stoplights or speed bumps along the way.

MICHAEL MORELL: Can you explain the concept of modularity and why that's important to synthetic biology?

DR. KEN WICKISER: I think most people understand if you take a look at an electronic circuit, there's parts that go into the electronic circuit and you have a resistor here that gets set aside, a capacitor over there. You can construct very complicated machinery with some very simplistic parts. If you take that viewpoint of how perhaps a genome is organized, you have this long strand of DNA and embedded within that DNA are the instructions for certain proteins. Some proteins are going to be turned on all the time. Some proteins are going to be turned on only some of the time. Sometimes there's an age or development aspect to it. In terms of modularity, what we're focused on is being able to lift that one segment of DNA out of one particular organism and place it in a completely different novel context, in a completely different organism, and yet have it work. Perhaps not in the way that nature intended, but in the way that you, as the bioengineer, intends for it to function. That's really what we talk about when we use the term modularity is that drag and drop, cut and paste, lift and shift, mentality when you think about engineering DNA and engineering genomes.

MICHAEL MORELL: Can you talk about the good uses that synthetic biology can do for mankind? Your piece was about a potentially bad use. I'd love for you to talk about that from the 50,000 foot level.

DR. KEN WICKISER: Synthetic biology is a tool just like a hammer. You can use it for good or you can use it for nefarious purpose. We are typically in academia focused on the good. That's the whole point of going through a PhD program, learning about how to better mankind in terms of novel materials, novel pharmaceuticals, and understanding the basic machinery of biology so that we can take care of ourselves just that much better.

MICHAEL MORELL: We can cure diseases that we've never been able to cure before.

DR. KEN WICKISER: Absolutely. We're certainly on the cusp of that. If you take a look at it from the other vantage point, if you understand biology, if you understand this network of small molecules and genes and environmental influences, then you can disrupt that. Not only for good, but perhaps for bad. What we're trying to do here is just to call attention to this tool and to bring this to the attention of developing leaders, saying 'look, you have to take this into account when developing plans for security and for operations.' We have to understand what might happen out there if technology falls into the into the wrong hands, the hands of someone who is trying to do harm to others. In our case, we're concerned about Americans. We're concerned about the American military in particular. We in no way, shape, or form want to disparage or undermine the support that synthetic biology has in the community. We value it. We use it every day in our labs here at West Point. It's used across the world, in labs, in industry, academia, government labs, all the way down even to high school labs. But I do think that we need to understand that the bar has been lowered in terms of being able to produce something that other people haven't thought of. If that something happens to be perhaps negative in nature. We need to be prepared for that.

MICHAEL MORELL: What is the risk here? What is the threat?

DR. KEN WICKISER: What we're concerned about is the production of either small molecules or gene products that could be used in a way that is a negative influence on someone's health. Whatever you can consider in your mind, is probably capable of being produced out there in the synthetic biology.

MICHAEL MORELL: So we are talking about a bioweapon here, right?

DR. KEN WICKISER: We are talking about bioweapons. Whether you talk about a material or something that happens to be infectious, that's just different levels of threat.

MICHAEL MORELL: Can you talk about the concept of binary weapons and why that's important in the context of what we're talking about here?

DR. KEN WICKISER: If you were able to take two different chemicals, each of them inert, very stable. But then when you mix them, they become robust, explosive, that would be considered a binary weapon. So you need both components in order to have that weapon. So biology could be the same thing. If I have protein X, that happens to be a poison, I could cut that in half in two different segments and have a gene product in one organism, and the gene product in another. I could produce a considerable amount of each one of those subcomponents to the poison and then mix these two together and develop that active poison for nefarious purposes. Likewise, if these two gene products happen to be housed in prokaryotes and bacteria, I could mix these together. Under favorable conditions, they could exchange genetic material and the product could be one single organism that is producing an intact product. So you have both of those halves that can come together and form that particular poison. When we talk about a binary weapon, most people think about it in terms of chemical or mechanical means. But the analogy holds when you talk about biological macromolecules.

MICHAEL MORELL: What I'm thinking is this is the biological equivalent of al-Qaida trying to bring on chemicals to those 10 to 15 aircraft flying from Heathrow. Chemicals that were inert separate, but when you put them on the plane and mix them together, all of a sudden, they became an explosive.

DR. KEN WICKISER: Unfortunately, science goes hand in hand with creativity and curiosity. It really comes down to someone with nefarious purpose, having creativity mixed in with some scientific capability that allows them to produce something that is going to be of significant concern.

MICHAEL MORELL: What's the range of risk here from the least dangerous bioweapon to the most dangerous bioweapon in terms of what synthetic biology could produce?

DR. KEN WICKISER: Part of this is fear. And then part of it is the physical infectivity that a substance might have. Or an organism might have an entity. I use those terms very broadly because it's arguable whether one calls a virus lebendig. Because it doesn't in and of itself have the machinery required for self replication, it requires the host to hijack and and replicate itself. But ignoring that distinction is something that is going to have that very careful balance in between lethality and infectivity across a particular population. If something was so incredibly deadly that it's going to hamstring itself in terms of being able to pass that on to the next host, then that's going to tend to die out faster than something that has that careful balance. That something is likely a virus. It could be an engineered virus. It can be microbes, living systems, small individual cells that produce toxins.

Whether you think about something that's endemic across humankind, like E. coli, without having that one genetic switch that'll change it into something that's virulent. But you can think about something that is genetically engineered like a virus. Knowing that we use this for good, it can also be used for bad. For example, in 2011 Dutch scientists wanted to create a virus and see what mutations were required in order to make it more aerosolized. They did this and they were frightened that it took so few mutations in order to make something that was very dangerous into something that was incredibly deadly. There was a large public outcry. People came back and said, 'you should not even publish this.' There was a lot of ethical considerations that went into the sharing of those data and the publication of that particular work. They used natural selection in the context of the lab in order to generate those five mutations. Now it's known that the information can be used by people to engineer a particular protein in the context of DNA and have that produced by any DNA synthesis companies. Some of them are American, but many of them are outside the continental United States. It's that information that allows us and empowers someone with nefarious purpose to use synthetic biology for their ends.

MICHAEL MORELL: In the paper, you and your co-authors give some examples of where this has already been done. Can you describe very briefly a couple of those? The first was work done in 2002 by scientists at the State University of New York at Stony Brook on the polio virus.

DR. KEN WICKISER: It's always been a goal for someone to build a genome from scratch. The question is, using state of the art chemical synthesis tools, can you construct something that is functional? That is really where that effort was born. It spawned several other efforts that eventually led up to the idea could you actually create a living cell from scratch?

It goes hand in hand with what do you actually need for a living system. What can you throw away? If you take out of a car every bit that you don't need for it to run. Seat warmers etc. That's what has been a major goal in synthetic biology efforts across the globe, because once you have that minimal structure, that biological scaffold, you can then add in whatever you want and and it's less of a load. For example, if you and I are going on a run. If you add a large backpack onto yourself, it's going to be much more exerting. The same thing happens when you engineer a small microbe. You increase the metabolic load and slow it down. But if you can get rid of all the non essential requirements, then when you actually load it up with that new system, then you will have a biological system that is not going to be loaded down as much of a natural one.

That's been the progression, going from the construct of a virus to the construct of an actual living cell. Another piece that we really wanted to bring up here is, on the good part. We have these amazing contests, international genetically engineered machine contests born out of MIT. You have this incredibly rich international group of young men and women. Primarily it was college students. Recently, they've lowered the bar of entry because so many young high school students are really interested in this work. In 2019 there was three hundred and sixty teams from across the world. About 50 percent of them came from Asia. About 20 percent were from North America. There was about one quarter of the teams that were from the high school level. About 65 percent of them are from Asia, predominantly they're from China. The great thing about synthetic biology is that there are no borders. Then again, that applies to the context of threat, to the context of force protection amongst the American population and the DOD. There might be something here of concern.

MICHAEL MORELL: Then no borders become a bad thing. It's this interesting dichotomy. You just raised an issue that caught my attention. When people used to ask me about this threat, I would say, 'yes, terrorist groups have shown interest, but doing this is very, very difficult.' One of the things that really jumped out to me in your article is that this is getting easier and easier.

Let me read a few sentences. 'The sophistication of high school and undergraduate student research projects has matched that of many highly trained personnel who are working in advanced laboratories less than a decade ago.' The second is 'these synthetic bio tools are lowering the education, training, cost, time and equipment threshold required to modify and employ pathogenic organisms as biologic weapons.'

Talk about the extent to which this is getting easier and obviously why that's important.

DR. KEN WICKISER: Let's take a look at the iGEM organization. I'm a huge fan. I participated in it for many years. They have a biosafety and security committee. They're very much attuned to the potential misuse. Outside of the context of a competition, going into perhaps non-state actors who have ill intent toward the United States, you say 'if high school students can do this across Asia, across Europe, across the United States, then take that threat scenario and apply that to something chemical or nuclear. You're not going to have high school students making the next generation nuclear weapon. But one of the amazing things about science is we're all about sharing information. We're all about publishing, we're all about planting your flag and generating bragging rights about these great advances that we make. But that also provides a great recipe for that next person.

That next person can certainly be a young individual that does not have decades of experience in laboratories. He or she can essentially do garage level science that in the past would have taken a lot of people a long time in sophisticated labs. Going back to our polio example, how long did that take these experts in the Stony Brook lab? How many years was that? How many millions of dollars was spent on that? Whereas when you talk about a young team of students, this is on the thousands of dollars scale.

If they needed ten thousand dollars worth of materials, that's highly attainable for a lot of people. These materials then really comes down to synthetic DNA, DNA that has been produced by chemically synthesizing them in a facility. These facilities are all across the world. They're all across the United States. They're all across Europe, but they're all across Asia as well. Honestly, when I have a gene synthesized or when I have a plasmid, which is a small circular chunk of DNA that has many different genes embedded within it, if I have that synthesized and I want to pay someone three thousand dollars to do that, it will probably be subcontract out to China. That's where the materials are coming from. When you talk about the sharing of materials, there's high levels of access for anybody throughout the world. This is not just something that is available to American students or postdocs or professors in American universities. This is available worldwide.

There are no boundaries when it comes to information. There are no boundaries when it comes to science, and there's certainly no boundaries when it comes to scientific expertise and interest. There is such an enormous level of interest coming out of Asia, particularly China. It's something to consider when thinking about where synthetic biology could go, not only for the good, but potentially for the bad.

MICHAEL MORELL: In your article, you and your co-authors push back on those who say that making bioweapons is much too difficult for a non-professional. You use two metaphors. Can you share those?

DR. KEN WICKISER: Twenty years ago, I would have said, 'yes, they're absolutely right, the bar is way too high.' 10 years ago, I would have said, 'yeah, sure, it's a little bit lower, but that's going to be a tough ask.' But today, it's just really not. If you go back to some of the examples we used in the paper, our home PC example. When I was young, I vividly remember my very first Apple computer. Seeing that at a college. It was almost like a museum where I was looking behind the glass, not allowed to touch it. Today look where we have gone. Along with Moore's Law. This has just exploded in terms of technology where people now have the ability to customize their entire home and have that controlled by a cell phone.

You have Moore's Law that has been allowing us via the increased computational power to do so many amazing things that we just couldn't have dreamed of 20, 30 years ago. Biology and our understanding of biology has followed a similar path. There's been an absolute explosion in our understanding of what a gene is, how to control a gene, how to get these genes from one context and put them into another.

It comes down to being able to design this online. You can do genetic engineering right from your phone. You can purchase DNA on the spot. At the end of the purchasing process, there's a little form to sign that says 'is this a poison, yes or no? Can this impact human health? Yes or no?' It really comes down to you as the purchaser being honest. We have this incredible capability in biology. Yet the controls haven't caught up to that yet, whereas perhaps controls in electronic means have. That's because to the regular nonscientist the capabilities and limitations of electronics are a lot more understandable compared to that of biology.

MICHAEL MORELL: In terms of your concerns about this, it sounds like it's primarily non-state actors, terrorist groups rather than states. Is that fair to say?

DR. KEN WICKISER: That's absolutely fair to say. At the end of the day, both Russia and China have incredibly robust scientific programs. The United States has taken steps after the fall of the Soviet Union to provide scientists from the former Soviet Union opportunities to engage in science for the benefit of mankind by setting up laboratories in countries like Georgia. But our concern here is the lowering of that bar and allowing for the ability for an untrained group of people to develop something that might negatively impact human health.

MICHAEL MORELL: Let me read two more sentences from your article. The first sentence is, 'as molecular engineering techniques of the synthetic biologists become more robust and widespread, the probability of encountering one or more of these threats is approaching certainty.' The second is 'the change to the threat landscape created by these techniques is rivaled only by the development of the atomic bomb.' Those are two pretty significant sentences, so what do we do about this? What's the right policy response? How do we defend ourselves?

DR. KEN WICKISER: I go back to say the iGEM field. They are very much interested in biosecurity and infusing the thought of biosecurity in these young budding scientists. Whether they be Americans or people from foreign countries. But we also have in the United States several organizations dedicated to biosecurity, including the Defense Threat Reduction Agency and their chemical biological defense division. The entire research there is a lead by Dr. Ronald Han, and he has an amazing portfolio. They are very dedicated to addressing this field. There's BARTA. There's DARPA. DARPA has several different programs that are addressing the potential threat of synthetic biology, whether it be a normal genetic engineering or the whole CRISPR effort. That has really exploded the field over the past several years. So we do have organizations, whether they be private, non-profits, or governmental organizations that are addressing this. I think it's probably incumbent upon us to weave this into the educational experience of young people. Whether we're talking about budding scientists or people who are interested in ethics or people who are interested in economics. We need people to understand the benefits of synthetic biology and the potential threats. That way we can develop common sense policies that will allow the science to progress, will allow us to benefit from the development of the science, but at the same time assure our safety.

MICHAEL MORELL: Thank you so much for joining us. Thank you for your service to our country, which continues to this very day. And in educating the young women and young men who will lead the United States Army in the future.


Positions within DNA that lack a DNA base also known as apurinic or apyrimidinic (AP) sites. They can occur spontaneously or through base excision by DNA glycosylases.

Intrastrand and interstrand DNA crosslinks

Chemical crosslinking of DNA can occur between positions on the same DNA strand (intrastrand) or between opposing strands (interstrand).

Poly(ADP-ribose) polymerase 1

(PARP1). A member of a family of enzymes that catalyse the formation of poly(ADP-ribose) chains, thereby regulating various cellular processes, most notably DNA repair.

Any molecule that inhibits an enzyme by mimicking a substrate.

(HR). A process resulting in the exchange of identical or highly similar DNA sequences between two DNA molecules it is involved in meiosis, DNA repair and DNA replication.

The DNA polymerase required for gap filling during base excision repair and DNA single-strand break repair.

A medical condition that is characterized by a lack of coordination of voluntary muscle movements it is often caused by inherited or acquired cerebellum diseases (cerebellar ataxia).

The absence of neurological reflexes.

Small dilated blood vessels in the outer layer of the skin or in mucosae. Usually a benign condition, which can be associated with serious genetic or acquired diseases.

A neurological motor disorder that is caused by partial brain damage affected individuals experience difficulty with motor planning to carry out motor tasks or movements.

A motor speech disorder characterized by poor articulation of phonemes. It is caused by injuries to the motor component of the motor–speech system of the brain.

A neurological condition in which affected individuals present with a smaller than normal head owing to defective brain development.

A medical condition that is characterized by underdevelopment of the jaw.

A protein complex that degrades unneeded or damaged proteins. Proteins are commonly marked for degradation by modification with polyubiquitin chains.

A post-translational modification, also known as polyADP-ribosylation, by which polymers of ADP-ribose are attached to substrate proteins by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs).

X-ray repair cross-complementing protein 1

(XRCC1). A molecular scaffold protein that orchestrates the repair of DNA single-strand breaks by recruiting and stabilizing multiple other repair factors.

Ataxia telangiectasia mutated

(ATM). A protein kinase best known for its function in signalling the presence of DNA double-strand breaks, thereby activating a highly sophisticated cellular response.

DNA-abhängige Proteinkinase

(DNA-PK). Heterotrimeric DNA-dependent kinase that comprises KU70, KU80 and the catalytic subunit DNA-PKcs best known for its central function in non-homologous end joining repair of DNA double-strand breaks.

If a replication fork encounters a single-strand break, the replicative helicase runs off the template strand, resulting in the formation of a highly toxic single-ended DNA double-strand break.

Non-homologous end joining

(NHEJ). The repair of DNA double-strand breaks by directly ligating two DNA ends, irrespective of DNA sequence.

A type II DNA topoisomerase that is required for the generation of DNA double-strand breaks during meiosis, which is crucial for genetic recombination.

Synthetic lethality screen

A genetic screening method, which aims to reveal genes that when knocked out cause lethality in combination with a knockout of a gene of interest.

A cellular signalling mechanism that pauses the cell cycle in response to the presence of DNA damage, thereby providing enough time to ensure that repair can occur before the next cell division.

A diverse class of enzymes that are involved in various cellular processes. AAA-ATPases use energy obtained from ATP hydrolysis to generate mechanical forces through conformational changes.

Mutations that cause a partial loss of function for example, by reduced gene expression or decreased protein stability. Hypomorphic mutations mostly display less severe phenotypes than a complete gene loss.

The most common type of liver cancer often caused by hepatitis virus (B or C) and substances such as aflatoxin and ethanol.

Translesion synthesis polymerases

DNA polymerases with the ability to synthesize past DNA lesions due to a flexible active site they often display low fidelity and thus tend to incorporate mutations.

Nukleotidexzisionsreparatur

(NER). A DNA repair pathway that repairs primarily bulky adducts, such as those induced by ultraviolet (UV) light. Repair is achieved by excision of a short stretch of nucleotides that contains the DNA lesion.

A recombination process that allows the replication of damaged DNA strands by using the newly replicated sister strand as a template for DNA synthesis.

A conserved DNA repair pathway that detects and repairs base–base mismatches and insertion–deletion mispairs, which can be generated by mistakes during replication.



Bemerkungen:

  1. Jayar

    Du hast einen guten Blog.

  2. Makani

    Ich denke, es ist eine gute Idee.



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