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Hausaufgabenprobleme - Literaturlernmodul: Transkriptionsfaktor Ikaros reprimiert Protein Phosphatase 2A (PP2A): SCHLÜSSEL - Biologie

Hausaufgabenprobleme - Literaturlernmodul: Transkriptionsfaktor Ikaros reprimiert Protein Phosphatase 2A (PP2A): SCHLÜSSEL - Biologie


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Transkriptionsfaktor Ikaros reprimiert die Expression von Protein Phosphatase 2A (PP2A) durch eine intronische Bindungsstelle. The Journal of Biological Chemistry, 289, 13751-13757 (2014).

Hintergrund und Rückblick

Der systemische Lupus erythematös (SLE) ist eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, die vor allem Frauen im gebärfähigen Alter betrifft. Unregelmäßigkeiten des Immunsystems, insbesondere bei T-Zellen, sind einer der Faktoren, die zur Pathologie dieser Krankheit beitragen. Bei T-Zellen, die von SLE-Patienten isoliert wurden, führt eine abweichende Signalübertragung zu atypischen Merkmalen, wie einer verstärkten Tyrosinphosphorylierung.

Eine der Schlüsselkomponenten, die zu den Signalstörungen in der SLE-Pathogenese beitragen, ist die Serin/Threonin-Proteinphosphatase 2A (PP2A). PP2A ist eine ubiquitär exprimierte, hochkonservierte Serin/Threonin-Phosphatase, die eine Schlüsselrolle bei einer Reihe von zellulären Prozessen wie Zellteilung, Motilität, Zytoskelettdynamik usw. spielt. PP2A hat eine dreigliedrige Struktur bestehend aus der Gerüstuntereinheit A und der katalytischen Untereinheit C Bildung des Kernenzyms und einer der vielen regulatorischen Untereinheiten, die an das Kernenzym binden, um ein funktionelles Holoenzym zu bilden. PP2A-Protein- und mRNA-Spiegel sowie die enzymatische Aktivität der katalytischen Untereinheit sind in T-Zellen von SLE-Patienten im Vergleich zu Gesunden erhöht.

Ein zyklisches AMP (cAMP) Response Element (CRE) im PP2A-Promotor ist in SLE-T-Zellen hypomethyliert. Darüber hinaus trägt die Bindung des Transkriptionsfaktors cAMP Response Element-Binding Protein (CREBP) zu den Expressionsniveaus von PP2A bei. cAMP steigt in einer Zelle als Reaktion auf ein externes Signal an, das an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) bindet, was zur Aktivierung von Adenylatcyclase führt, wodurch cAMP gebildet wird. cAMP bindet dann an Proteinkinase A und aktiviert diese, die andere Proteine ​​phosphoryliert, einschließlich des CREB-Proteins, das hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Phosphoryliertes CREB transloziert in den Zellkern, was zur Gentranszipitation führt.

A. Zeichne einen Cartoon, der zeigt, wie ein Anstieg von cAMP zur Transkription von CREB-aktivierten Genen führt.

B. Die Hypomethylierung des Promotors verstärkt die Transkription. Wie würde sich eine Hypermethylierung von Promotoren von Tumorsuppressorgenen auf Tumorzellen auswirken? Welche Auswirkungen könnte die Hypomethylierung auf Gene haben, die an Immunzellen bei Autoimmunerkrankungen wie SLE beteiligt sind?

Antwort: Die DNA-Hypermethylierung der Promotorregion in Tumorsuppressorgenen würde zu deren Stummschaltung führen, was zu einer Disregulierung der Zelle und zur Förderung des Wachstums führen würde. Im Gegensatz dazu könnte die DNA-Hypomethylierung zur Aktivierung von Genen der Immunzellen führen, was das Gleichgewicht der Gentranskription in Richtung eines Phänotyps kippen könnte, der durch chronische Entzündungen und Autoimmunerkrankungen gekennzeichnet ist.

Zusätzliche Mechanismen beeinflussen die Expression von PP2A. Eine genomweite Assoziationsstudie (GWAS) identifizierte einen Einzelnukleotid-Polymorphorismus (SNP) im ersten Intron von PPP2CA, das mit SLE assoziiert war. Das Risikoallel dieses SNP war mit Nierenerkrankungen, anti-doppelsträngiger DNA und anti-Ribonukleoprotein-Antikörpern verbunden, beides Marker für SLE. Darüber hinaus war die PP2A-Expression bei Patienten mit diesem Allel höher, was darauf hindeutet, dass dieser SNP eine Rolle bei der Regulierung der PP2A-Expression spielen könnte. Wie könnte eine Mutation in einem Intron die Gentranskription beeinflussen?

Antwort: Mutationen in Introns könnten die Genexpression (die letztendlich durch die Menge des Proteintranslationsprodukts definiert wird) beeinflussen, indem sie das Schneiden verändern, was alle Aspekte der RNA-Produktion und -Verarbeitung beeinflussen könnte, einschließlich Transkription, Polyadenylierung, mRNA-Export, mRNA-Lokalisierung, Translationseffizienz und Geschwindigkeit des mRNA-Zerfalls. Sie können als Bindungsstelle (Promoter, Enhancer, Silencer) für Transkriptionsfaktoren (Proteine, RNA) dienen, die die Chromatinstruktur und die Transkriptionskompetenz beeinflussen. Sie könnten auch in verschiedenen Leserastern transkribiert werden, um Genregulationsprodukte herzustellen.


Fragen zum Artikel

1. Basierend auf dem SNP, der in Intron 1 von PP2A bei SLE-Patienten gefunden wurde, stellten die Forscher die Hypothese auf, dass die Bindung eines Transkriptionsfaktors an das Wildtyp-Intron 1 an der Regulation der PP2A-Transkription beteiligt ist.

A. Nennen Sie zwei verschiedene Möglichkeiten, wie ein SNP im Intron die PP2A-Transkription beeinflussen könnte?

Antwort: Wenn der SNP in Intron 1 bei SLE-Patienten zu einer erhöhten Transkription von PP2A führt, dann würde die Bindung des mutmaßlichen Transkriptionsfaktors an das normale Intron 1 höchstwahrscheinlich die Transkription des PP2A-Gens unterdrücken (d. h. Funktionsverlust). Eine alternative, weniger wahrscheinliche Erklärung wäre, dass die Bindung des Transkriptionsfaktors nur in Gegenwart des SNP erfolgt. Dies würde eine Funktionsverstärkungsmutation bedeuten, die dann die Expression des Gens erhöhen würde.

Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Genstruktur von PP2A (im Originalpapier falsch markiert). Die grünen Kästchen stellen die Introns dar.

Die Sequenz, die die Variantenstelle enthält, ist in Rot und einem Pfeil dargestellt.

B. Die Forscher entdeckten einen potenziellen Transkriptionsfaktor, Ikaros, durch in silico Experimente, die an Intron 1 binden könnten. Um die Bindung zu untersuchen, verwendeten sie einen Chromatin-Immunopräzipitations-(ChIP)-Assay. Kurz gesagt wurden Kontroll- und Versuchszellen mit Formaldehyd behandelt, um DNA-bindende Proteine ​​kovalent an ihre Zielstellen auf der DNA zu binden. Die Zellen werden zuerst vorsichtig lysiert, um zytoplasmatische Proteine ​​zu entfernen. 1% SDS wird zugegeben, um die Zellen vollständig zu lysieren. Darauf folgt eine Ultraschallbehandlung, um die DNA in kleine Fragmente zu scheren. Ein Antikörper gegen ein Zielprotein wird dem gescherten Chromatin zugesetzt und durch ein Kügelchen, das kovalent an ein Protein (Protein A oder G) gebunden ist, das an die Fc-Domäne bindet, die nicht an der Erkennung des Antikörpers für das Zielprotein beteiligt ist, immunpräzipitiert. Die Querverbindung kann rückgängig gemacht und die DNA-Bindungsstelle und/oder das Zielprotein identifiziert werden. Zeichne einen Cartoon, der die relevanten Interaktionen zeigt.

Antworten:

Die Forscher stellten ein Biotin-markiertes Oligo her, das die relevante Region des normalen Introns 1 darstellt, und ein zufälliges Kontroll-Oligo. Sie fügten Jurkat-Zellkernextrakte hinzu. Der Komplex wurde heruntergezogen (immunpräzipitiert) mit Kügelchen, die kovalent Avidin enthielten, das Biotin fest bindet. Die Eluate wurden auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen, gefolgt von einem Western-Blot, bei dem die getrennten Proteine ​​auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wurden. Die Membranen wurden mit einem Anti-Ikaros-Antikörper sondiert. Die Immunoblot (IB)-Ergebnisse sind in 1B gezeigt. Ergebnisse interpretieren? Wenn die Hypothese der Autoren richtig war, wie würde der Blot aussehen, wenn sie ein Oligo verwendet hätten, das das in SLE gefundene SNP enthält?

Antwort: Die starke Bande für das spezifische Oligo bei etwa 62K repräsentiert den an das Oligo gebundenen Ikaros-Transkriptionsfaktor. Der Kontroll-Oligo-Immunpräzipitationsschritt brachte kleine Ikaros zu Fall, was darauf hindeutet, dass die Bindung von Ikaros an diese Stelle spezifisch ist. Bei der Interpretation dieser Ergebnisse muss man sehr vorsichtig sein, wir gehen jedoch davon aus, dass die Immunblots quantitativ sind. Bei Verwendung eines Oligos mit dem SNP wäre die Bindung von IKZF1 deutlich vermindert, was zu einer schwachen Bande auf dem Western Blot führte.

2. Die Forscher konstruierten Luciferase-Reporterkonstruktoren, in denen sie den Promotor für PP2A gefolgt von Intron 1 klonierten, das direkt stromaufwärts des Gens für das Protein Luciferase, ein biolumineszierendes Protein, das zum Nachweis der Proteinexpression verwendet werden kann, kloniert wurde. Zeichne einen Cartoon dieses Konstrukts.

Antworten:

In Abbildung 2B wurden 2 Millionen 293T-Zellen entweder mit dem obigen Reporterplasmid allein (250 ng) oder in Kombination mit verschiedenen Mengen des Ikaros-Expressionsvektors (enthaltend 50, 100 oder 200 ng Vektor mit dem Gen für Ikaros, IKZF1) unter Verwendung von Lipofectamine 2000. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assay-Systems quantifiziert.

In 2C wurden ähnliche Experimente in einem transienten Expressionsassay mit dem mutierten (mut) Reporterkonstrukt durchgeführt, in dem die Ikaros-Bindungsstelle deletiert war. Die Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert � S.D. von drei Beobachtungen. Die Keile zeigen steigende Konzentrationen an. Es wurde auch ein Kontrollvektor verwendet, der das PP2A-Promotor-Intron-1-Insert nicht enthielt.

B. Erklären Sie die in 2B gezeigten Ergebnisse.

Antwort: Die Koexpression mit steigenden Mengen des IKZF1-Gens für Ikarus hemmte die Expression des PP2A-Promotors in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hindeutet, dass Ikarus an Intron 1 binden und die Transkription von PP2A hemmen könnte.

C. Erklären Sie die in 2C gezeigten Ergebnisse.

2C zeigt, dass der mutierte Reporter im Vergleich zum Wildtyp-Reporter eine erhöhte Reporteraktivität aufwies. (d. h. die Mutante war nicht in der Lage, an Intron 1 zu binden und die Expression des Reporters zu unterdrücken). Weiterhin war im Gegensatz zum Wildtyp-Konstrukt die mutierte Reporteraktivität durch die Expression von Ikaros (vergleiche Spalte 3 und 5) = unbeeinflusst. Dies legt nahe, dass die Bindung von Ikaros an die spezifische Stelle im ersten Intron von PP2A zu einer Verringerung der PP2A-Reporteraktivität führt

3. Die Ermittler fragten, ob Ikaros die Expression von PP2A regulieren kann. Zu diesem Zweck überexprimierten wir Ikaros in CD3+ T-Zellen (Immunzellen), die von gesunden Individuen isoliert wurden, nicht in Reporterassays. Nach 36 h in Kultur wurden die Zellen gesammelt und zum Immunblotting verarbeitet. Für 3A (unten) wurden aus gesunden Individuen isolierte T-Zellen mit dem leeren Vektor oder 0,5, 1 oder 2 &mgr;g des Ikaros-Expressionsplasmids/1 Million Zellen transfiziert. Pro Bedingung wurden fünf Millionen Zellen verwendet. 36 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, um entweder mit Echtzeit-PCR (die mRNA in Echtzeit überwacht, linkes Feld) oder Proteinanalyse unter Verwendung von Western-Blotting (mittleres Feld) fortzufahren. Für die Real-Time-PCR wurde das Housekeeping-Gen β-Aktin zur Normalisierung verwendet. Bei Western-Blot-Analysen wurde die Membran mit Anti-Ikaros sondiert, die Proteine ​​abgestreift und erneut mit Anti-PP2A sondiert. β-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. Die Bandendichten von IKZF1 und PP2A wurden mit der Software „Quantity One“ quantifiziert und auf β-Aktin normalisiert. Offene Stäbe, IKZF1; schwarze Balken, PP2A. IB, Immunblot.

Erklären Sie die Ergebnisse. Warum haben die Autoren einen Immunoblot für Aktin durchgeführt?

Antwort: Die erzwungene Expression von Ikaros führte zu einer signifikanten Abnahme der Proteinspiegel von PP2A (Abbildung 3A, rechtes Feld). Darüber hinaus war diese Abnahme dosisabhängig. Eine Erhöhung der in die Zellen transfizierten Menge an Ikaros führte zu einer noch stärkeren Abnahme der PP2A-Expression. Um zu bestimmen, ob Ikaros die PP2A-Expression auf Transkriptionsebene reprimiert, haben wir die mRNA-Spiegel von PP2A in Zellen, die Ikaros exprimieren, untersucht. Die PP2A-mRNA-Spiegel wurden als Reaktion auf die Ikaros-Überexpression in ähnlicher Weise reduziert (Abbildung 3A, linkes Feld). Aktin dient als Kontrolle, da von diesem Haushaltsgen nicht erwartet wird, dass es sich in der Konzentration ändert.

In 3B wurden T-Zellen entweder mit verwürfelter siRNA oder IKZF-spezifischer siRNA (5 oder 10 nm Endkonzentration) unter Verwendung von AMAXA transfiziert. 72 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und entweder einer Echtzeit-PCR-Analyse oder einer Proteinanalyse mittels Western-Blotting unterzogen. Bei Western-Blot-Analysen wurde die Membran mit Anti-Ikaros sondiert, die Proteine ​​abgestreift und mit Anti-PP2A erneut sondiert. Erklären Sie die Ergebnisse.

Antwort: Um zu bestimmen, ob Ikaros die PP2A-Expression auf Transkriptionsebene unterdrückt, haben wir die mRNA-Spiegel von PP2A in Ikaros-exprimierenden Zellen untersucht. Die PP2A-mRNA-Spiegel wurden als Reaktion auf die Ikaros-Überexpression als Protein in ähnlicher Weise reduziert (in 3A). Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von Ikaros-Silencing auf die PP2A-Expression. Die siRNA-aktivierte Stummschaltung von Ikaros führte zu erhöhten Spiegeln der PP2A-Botschaft sowie des Proteins (Abbildung 3B, linke bzw. rechte Abbildung). Somit fungiert Ikaros als Repressor für die PP2A-Expression.

4. Die Autoren verwendeten einen ChIP-Assay, um die Rekrutierung von Ikaros an diesem speziellen Standort in einer zellulären Umgebung zu bestätigen. Sie verwendeten 293T-Zellen, die mit dem PP2A-Promotor-Intron-Reporterkonstrukt (oben beschrieben) in Kombination mit entweder dem leeren Vektor (pCMV) oder einem Ikaros-Expressionsvektor transfiziert waren. Immunpräzipitate wurden unter Verwendung eines Ikaros-Antikörpers oder eines Kontroll-IgG hergestellt. Immunpräzipitierte DNA wurde gereinigt und das Vorhandensein der spezifischen intronischen DNA wurde unter Verwendung einer Echtzeit-PCR-Analyse quantifiziert.

A. Ein Schema der mutierten (Mut) Reporter, die in diesen Experimenten verwendet wurden, ist unten gezeigt.

B. In Abbildung 4B unten Reporter-ChIP in 293T-Zellen. 293T-Zellen wurden entweder nur mit dem Wildtyp (linkes Feld) oder der mutierte Reporter (rechte Tafel) oder der Reporter in Kombination mit dem Ikaros-Expressionsplasmid unter Verwendung von Lipofectamine 2000. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen gesammelt und ein ChIP-Assay durchgeführt. Die die spezifische Intronstelle überspannende Region wurde durch quantitative PCR amplifiziert und auf die Werte normalisiert, die aus der Eingangs-DNA erhalten wurden. Die Graph zeigt Mittelwert � S.D. Strg, Steuerung; ab, Antikörper; Rb, Hase. .

Interpretieren und erklären Sie das Ergebnis.

Antwort: Antwort: Wir beobachteten eine signifikant erhöhte Rekrutierung von Ikaros an das Intron von PP2A in den Ikaros-transfizierten Proben im Vergleich zu den pCMV-transfizierten Zellen, was auf die Rekrutierung von Ikaros an diese Stelle im ersten Intron von PP2A hindeutet (Abbildung 4B, links Tafel). Wir mutierten auch den Wildtyp-Reporter, um drei Mutanten zu erzeugen (in 4A dargestellt), um die Spezifität dieser Stelle zu testen. Zwei dieser Mutanten waren Deletionsmutanten, bei denen entweder nur die Kern-Ikaros-Bindungsstelle (Del-2) oder einige wenige Basen zusätzlich zur Kernstelle deletiert wurden (Del-1) und bei der dritten Mutante wurden einige Basen verändert, so dass die Ikaros-Bindungsstelle teilweise intakt. Wir beobachteten, dass beide Deletionsmutanten nicht in der Lage waren, Ikaros zu rekrutieren, was darauf hindeutet, dass das Fehlen dieser Stelle die Bindung von Ikaros ausschließt ( 4B , rechtes Feld). Bei der Mutante, bei der einige der Basen verändert wurden und die Ikaros-Bindungsstelle teilweise intakt blieb, konnten wir eine Verringerung der Rekrutierung im Vergleich zum Wildtyp-Reporter, aber keine vollständige Aufhebung feststellen. Dies legt nahe, dass eine intakte Ikaros-Bindungsstelle für die Rekrutierung von Ikaros an das PP2A-Intron notwendig ist.

4C. Für einen physiologisch relevanteren Test untersuchten die Autoren die endogenen PPP2CA Gen in T-Zellen durch ChIP-Assays in primären T-Zellen und führte eine Immunpräzipitation des endogenen Ikaros-Proteins unter Verwendung eines Ikaros-spezifischen Antikörpers durch. Für jeden Antikörper/jede Probe wurden 5 Millionen frisch isolierte primäre T-Zellen verwendet. Es fand keine Transfektion statt und es wurden endogene Proteine ​​zur Immunpräzipitation des Chromatins verwendet. Die Grafik zeigt den Mittelwert � S.D. Interpretieren und erklären Sie das Ergebnis.

Antwort: Die Autoren beobachteten im Fall von Ikaros-spezifischen Antikörpern im Vergleich zu Kontroll-IgG eine verstärkte Rekrutierung an diese Stelle und bestätigten damit, dass Ikaros an das Intron des endogenen PPP2CA-Gens rekrutiert wird

5. Ikaros ist ein Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der auch eine Dimerisierungsdomäne an seinem Carboxylende trägt, über die er viele verschiedene Proteine ​​und Transkriptionsregulatoren rekrutieren kann, einschließlich chromatinmodifizierender Komplexe wie Sin3A, Sin3B und Histon-Deacetylase 1 oder HDAC1.

- Wenn HDAC wie oben vermutet an Ikaros bindet, was wäre die wahrscheinliche Wirkung der Deacetylierung von Histonen auf die Transkription von PP2A?

Antwort: Wenn gebunden, würde die Desaceylierung der His-Lysin-Seitenketten zu einer möglichen positiven Ladung an der Epsilon-Amino-Seitenkette von Lys führen, was ihre Wechselwirkung mit negativ geladener DNA und die Neubildung von Nukleosomen um den Promotor herum erhöht, was die Transkription hemmt.

A. Transiente Transfektionen in HEK 293T-Zellen, gefolgt von Immunpräzipitationsassays, wurden durchgeführt. Mit biotinylierten Oligos zeigen wir auch, dass HDAC1 an die bestimmte Stelle im ersten Intron von PP2A bindet (Abbildung 5B). Sowohl bei Reporter-ChIP als auch bei endogenem ChIP in primären T-Zellen konnten wir eine erhöhte Rekrutierung von HDAC1 an die intronische Stelle im Vergleich zu Kontroll-IgG feststellen (Abbildung 5C, linke bzw. rechte Abbildung), was bestätigt, dass HDAC1 an diese Stelle bindet in PP2A-Intron 1.

5A zeigt die Ergebnisse eines Coimmunpräzipitations-(IP)-Assays, der die Bindung von Ikaros an HDAC1 zeigt. 293T-Zellen wurden mit den verschiedenen Kombinationen von Plasmiden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Überstände wurden mit Ikaros-Antikörper für 2 h bei 4°C inkubiert. Nach der Vorinkubation mit dem Antikörper wurden jeder Probe Agarose-A/G-Kügelchen zugesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden anschließend auf einem Gel laufen gelassen, auf eine PVDF-Membran übertragen und auf die angegebenen Proteine ​​geblottet. Die gespeicherten Eingaben wurden auch auf dem Gel laufen gelassen, um die gleiche Expression von Proteinen in allen Proben zu bestätigen. IB, Immunblot.

Interpretieren Sie die Ergebnisse:

Antwort: Wie in Abbildung 5A gezeigt, könnte HDAC1 mit Ikaros koimmunpräzipitiert werden, was darauf hinweist, dass Ikaros und HDAC1 tatsächlich physisch interagieren.

B. 5B zeigt die Ergebnisse eines Biotin-konjugierten, Intron-spezifischen Oligo (sp. Oligo) oder eines zufälligen Kontroll-Oligo-Pulldown-Assays mit Jurkat-Zellkernextrakten. Die Eluate wurden auf einem Gel laufen gelassen und mit Anti-HDAC1-Antikörper sondiert.

Erklären Sie die Ergebnisse.

Antwort: Mit biotinylierten Oligos zeigen wir auch, dass HDAC1 an die bestimmte Stelle im ersten Intron von PP2A bindet (Abbildung 5B).

C. In Abbildung 5C sind Ergebnisse von einem Reporter-ChIP (linkes Feld) und ChIP (rechtes Feld) in 293T- bzw. primären T-Zellen gezeigt. 293T-Zellen (linkes Feld) wurden mit dem Reporter in Kombination mit den Ikaros- und HDAC1-Expressionsplasmiden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und ein ChIP-Assay wurde unter Verwendung des MAGnify ChIP-Kits durchgeführt. Für ChIP mit endogenem Protein in primären T-Zellen (rechtes Feld) wurden 5 Millionen frisch isolierte primäre T-Zellen für jeden Antikörper (ab)/Probe verwendet. Strg, Kontrolle; Rb, Kaninchen; Frau, Maus. Erklären Sie das Ergebnis.

Antwort: Sowohl bei Reporter-ChIP als auch bei endogenem ChIP in primären T-Zellen konnten wir eine erhöhte Rekrutierung von HDAC1 an die intronische Stelle im Vergleich zu Kontroll-IgG feststellen (Abbildung 5C, linke bzw. rechte Abbildung).

D. In 5D wurden T-Zellen mit Kontroll-siRNA oder 10 nm HDAC1-spezifischer siRNA mit oder ohne Cotransfektion des Ikaros-Plasmids transfiziert. 72 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und einer Echtzeit-PCR-Analyse unterzogen. Zur Normalisierung wurde das Housekeeping-Gen β-Aktin verwendet. Erklären Sie die Ergebnisse.

Antwort: Nachdem wir festgestellt haben, dass HDAC1 mit Ikaros interagiert und für diese Site rekrutiert wird, wollten wir beweisen, dass die Repression der PP2A-Expression, die wir sehen, auf HDAC1 zurückzuführen ist. Zu diesem Zweck haben wir zwei verschiedene Ansätze verwendet. Mit siRNA haben wir HDAC1 in Zellen, die Ikaros überexprimieren, zum Schweigen gebracht und die mRNA-Spiegel von PP2Ac untersucht. Wie erwartet führte die Überexpression von Ikaros zu einer Verringerung der PP2A-mRNA-Spiegel. Die siRNA-vermittelte Stilllegung von HDAC1 in diesen Zellen stellte jedoch die PP2A-Spiegel auf etwa 50% des Originals wieder her, was darauf hindeutet, dass die Ikaros-vermittelte PP2A-Repression in Abwesenheit von HDAC1 nicht so kompetent ist (Abbildung 5D).

Abbildung 5E. E, primäre T-Zellen wurden mit dem Ikaros-Plasmid unter Verwendung von AMAXA transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen 12 h mit 100 ng/ml Trichostatin A (TSA) behandelt. Es wurde das gleiche Volumen an Dimethylsulfoxid wie bei der Fahrzeugkontrolle verwendet. Die Zellen wurden geerntet und eine Real-Time-PCR durchgeführt. Erklären Sie das Ergebnis.

Antwort: Zweitens haben wir einen HDAC1-Inhibitor, Trichostatin A, verwendet, um dies zu bestätigen. T-Zellen wurden mit Ikaros transfiziert, gefolgt von einer 12-stündigen Behandlung mit Trichostatin A. Die Behandlung von Zellen mit Trichostatin A führte zur vollständigen Wiederherstellung der PP2A-Expression (Abbildung 5E). Somit ist die Repression der PP2A-Expression, die bei der Ikaros-Überexpression beobachtet wird, zumindest teilweise auf die Rekrutierung von HDAC1 an derselben Stelle zurückzuführen. Die Rekrutierung von HDAC1 an diese Stelle könnte die Zugänglichkeit von Transkriptionsfaktoren für den Promotor beeinflussen und somit die Genexpression von PP2A . beeinflussen

6. Schreiben Sie einen Absatz, in dem Sie die wichtigsten Schlussfolgerungen dieses Papiers zusammenfassen:

Ikaros ist ein Modulator der PP2A-Expression. Es bindet an eine Stelle im ersten Intron von PPP2CA und reduziert die Expressionsniveaus von PP2A. Die repressive Fähigkeit von Ikaros hängt zumindest teilweise von der Rekrutierung der Histondeacetylase HDAC1 ab und beeinflusst damit die Zugänglichkeit zum Chromatin. Dieser neuartige Mechanismus für einen klassischen Transkriptionsfaktor könnte helfen, die Fehlregulation der PP2A-Aktivität bei systemischem Lupus erythematose zu erklären.



Bemerkungen:

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