Information

10.2: DNA visualisieren und charakterisieren - Biologie

10.2: DNA visualisieren und charakterisieren - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Fähigkeiten zum Entwickeln

  • Erklären Sie die Verwendung von Nukleinsäuresonden zur Visualisierung spezifischer DNA-Sequenzen
  • Erklären Sie die Verwendung der Gelelektrophorese zur Trennung von DNA-Fragmenten
  • Erklären Sie das Prinzip der Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismusanalyse und ihre Anwendungen
  • Vergleichen und kontrastieren Sie Southern und Northern Blots
  • Erklären Sie die Prinzipien und Anwendungen der Microarray-Analyse
  • Beschreiben Sie die Methoden zur Trennung und Visualisierung von Proteinvarianten
  • Erklären Sie die Methode und den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion und der DNA-Sequenzierung

Die Sequenz eines DNA-Moleküls kann uns helfen, einen Organismus im Vergleich zu bekannten Sequenzen in einer Datenbank zu identifizieren. Die Sequenz kann uns auch etwas über die Funktion eines bestimmten Teils der DNA sagen, etwa ob er für ein bestimmtes Protein kodiert. Der Vergleich von Proteinsignaturen – den Expressionsniveaus spezifischer Proteinarrays – zwischen Proben ist eine wichtige Methode zur Bewertung zellulärer Reaktionen auf eine Vielzahl von Umweltfaktoren und Stress. Die Analyse von Proteinsignaturen kann die Identität eines Organismus oder die Reaktion einer Zelle während einer Krankheit aufdecken.

Die interessierende DNA und Proteine ​​sind mikroskopisch und werden typischerweise mit vielen anderen Molekülen vermischt, einschließlich DNA oder Proteinen, die für unsere Interessen irrelevant sind. Es wurden viele Techniken entwickelt, um interessierende Moleküle zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Methoden wurden ursprünglich zu Forschungszwecken entwickelt, sind aber in vielen Fällen so weit vereinfacht worden, dass eine routinemäßige klinische Anwendung möglich ist. Viele Krankheitserreger, wie das Bakterium Helicobacter pylori, das Magengeschwüre verursacht, kann mit proteinbasierten Tests nachgewiesen werden. Darüber hinaus können heute mit einer zunehmenden Zahl hochspezifischer und genauer DNA-Amplifikations-basierter Identifizierungsassays Krankheitserreger wie antibiotikaresistente Darmbakterien, Herpes-simplex-Virus, Varicella-Zoster-Virus und viele andere nachgewiesen werden.

Molekulare Analyse von DNA

In diesem Unterabschnitt werden wir einige der grundlegenden Methoden skizzieren, die verwendet werden, um spezifische DNA-Fragmente zu trennen und zu visualisieren, die für einen Wissenschaftler von Interesse sind. Einige dieser Verfahren erfordern keine Kenntnis der vollständigen Sequenz des DNA-Moleküls. Vor dem Aufkommen der schnellen DNA-Sequenzierung waren diese Methoden die einzigen, die für die Arbeit mit DNA verfügbar waren, aber sie bilden immer noch das grundlegende Arsenal an Werkzeugen, die von Molekulargenetikern verwendet werden, um die Reaktionen des Körpers auf mikrobielle und andere Krankheiten zu untersuchen.

Nukleinsäure-Sondierung

DNA-Moleküle sind klein und die in ihrer Sequenz enthaltenen Informationen sind unsichtbar. Wie kann ein Forscher einen bestimmten DNA-Abschnitt isolieren oder, nachdem er ihn isoliert hat, feststellen, von welchem ​​Organismus er stammt, welche Sequenz er hat oder welche Funktion er hat? Eine Methode, um das Vorhandensein einer bestimmten DNA-Sequenz zu identifizieren, verwendet künstlich konstruierte DNA-Stücke, die als Sonden bezeichnet werden. Sonden können verwendet werden, um verschiedene Bakterienarten in der Umwelt zu identifizieren, und viele DNA-Sonden sind jetzt verfügbar, um Krankheitserreger klinisch nachzuweisen. DNA-Sonden werden beispielsweise verwendet, um die vaginalen Krankheitserreger nachzuweisen Candida albicans, Gardnerella vaginalis, und Trichomonas vaginalis.

Um eine Genombibliothek nach einem bestimmten Gen oder einer bestimmten Sequenz zu durchsuchen, müssen Forscher etwas über dieses Gen wissen. Wenn Forscher einen Teil der DNA-Sequenz für das interessierende Gen haben, können sie eine DNA-Sonde entwerfen, ein einzelsträngiges DNA-Fragment, das komplementär zu einem Teil des interessierenden Gens ist und sich von anderen DNA-Sequenzen in der Probe unterscheidet. Die DNA-Sonde kann von kommerziellen Laboratorien chemisch synthetisiert werden, oder sie kann durch Klonieren, Isolieren und Denaturieren eines DNA-Fragments aus einem lebenden Organismus erzeugt werden. In jedem Fall muss die DNA-Sonde mit einem molekularen Tag oder Beacon markiert werden, wie einem radioaktiven Phosphoratom (wie es für die Autoradiographie verwendet wird) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (wie es in Fluoreszenz- vor Ort Hybridisierung, oder FISH), so dass die Sonde und die DNA, an die sie bindet, zu sehen ist (Abbildung (PageIndex{1})). Die zu untersuchende DNA-Probe muss auch denaturiert werden, um sie einzelsträngig zu machen, so dass die einzelsträngige DNA-Sonde an Stellen, an denen ihre Sequenzen komplementär sind, an die einzelsträngige DNA-Probe anlagern kann. Während diese Techniken für die Diagnose wertvoll sind, kann ihre direkte Verwendung bei Sputum und anderen Körperproben aufgrund der komplexen Natur dieser Proben problematisch sein. DNA muss oft erst durch chemische Extraktionsverfahren aus Körperproben isoliert werden, bevor eine DNA-Sonde verwendet werden kann, um Krankheitserreger zu identifizieren.

Abbildung (PageIndex{1}): DNA-Sonden können verwendet werden, um das Vorhandensein eines vermuteten Krankheitserregers in Patientenproben zu bestätigen. Dieses Diagramm veranschaulicht, wie eine DNA-Sonde verwendet werden kann, um nach einem interessierenden Gen zu suchen, das mit dem vermuteten Pathogen assoziiert ist.

Teil 2

Die milden, grippeähnlichen Symptome, die Kayla erleidet, können durch eine Vielzahl von Infektionserregern verursacht werden. Darüber hinaus weisen mehrere nicht infektiöse Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes (SLE) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS) Symptome auf, die mit Kaylas frühen Symptomen übereinstimmen. Im Laufe mehrerer Wochen verschlimmerten sich jedoch Kaylas Symptome. Sie verspürte Gelenkschmerzen in den Knien, Herzklopfen und eine seltsame Schlaffheit in ihren Gesichtsmuskeln. Außerdem litt sie unter einem steifen Nacken und schmerzhaften Kopfschmerzen. Widerstrebend entschied sie, dass es an der Zeit war, einen Arzt aufzusuchen.

Übung (PageIndex{1})

  1. Geben Kaylas neue Symptome Hinweise darauf, welche Art von Infektion oder anderen medizinischen Zustand sie möglicherweise hat?
  2. Welche Tests oder Werkzeuge könnte ein Gesundheitsdienstleister verwenden, um den Erreger zu lokalisieren, der Kaylas Symptome verursacht?

Agarose-Gelelektrophorese

Es gibt eine Reihe von Situationen, in denen ein Forscher eine Sammlung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe physisch trennen möchte. Ein Forscher kann auch eine DNA-Probe mit einem Restriktionsenzym verdauen, um Fragmente zu bilden. Das resultierende Muster der Größen- und Fragmentverteilung kann oft nützliche Informationen über die Sequenz von DNA-Basen liefern, die ähnlich wie bei einem Strichcode-Scan verwendet werden können, um das Individuum oder die Spezies zu identifizieren, zu der die DNA gehört.

Gelelektrophorese ist eine Technik, die häufig verwendet wird, um biologische Moleküle basierend auf Größe und biochemischen Eigenschaften, wie Ladung und Polarität, zu trennen. Agarose-Gelelektrophorese wird häufig verwendet, um DNA (oder RNA) unterschiedlicher Größe zu trennen, die durch Restriktionsenzymverdau oder auf andere Weise, wie z. B. PCR, erzeugt werden kann (Abbildung (PageIndex{2})).

Aufgrund ihres negativ geladenen Rückgrats wird DNA stark von einer positiven Elektrode angezogen. Bei der Agarosegelelektrophorese wird das Gel in einer Pufferlösung horizontal ausgerichtet. Die Proben werden in Probenvertiefungen auf der Seite des Gels geladen, die der negativen Elektrode am nächsten liegt, und dann durch das Molekularsieb der Agarose-Matrix in Richtung der positiven Elektrode gezogen. Die Agarose-Matrix behindert die Bewegung größerer Moleküle durch das Gel, während kleinere Moleküle leichter passieren. Somit korreliert die Wanderungsstrecke umgekehrt mit der Größe des DNA-Fragments, wobei kleinere Fragmente eine längere Strecke durch das Gel zurücklegen. Die Größen von DNA-Fragmenten innerhalb einer Probe können durch Vergleich mit Fragmenten bekannter Größe in einer DNA-Leiter, die ebenfalls auf demselben Gel läuft, geschätzt werden. Um sehr große DNA-Fragmente wie Chromosomen oder virale Genome zu trennen, kann die Agarosegelelektrophorese durch periodisches Wechseln der Orientierung des elektrischen Felds während der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) modifiziert werden. Bei PFGE können sich kleinere Fragmente neu orientieren und etwas schneller wandern als größere Fragmente, und diese Technik kann daher dazu dienen, sehr große Fragmente zu trennen, die sonst während der Standard-Agarose-Gelelektrophorese zusammen wandern würden. Bei jeder dieser Elektrophoresetechniken können die Orte der DNA- oder RNA-Fragmente im Gel durch verschiedene Verfahren nachgewiesen werden. Eine gängige Methode ist die Zugabe von Ethidiumbromid, einem Farbstoff, der sich an unspezifischen Stellen in die Nukleinsäuren einfügt und sichtbar gemacht werden kann, wenn er ultraviolettem Licht ausgesetzt wird. Andere Farbstoffe, die sicherer sind als Ethidiumbromid, ein potenzielles Karzinogen, sind jetzt verfügbar.

Abbildung (PageIndex{2}): (a) Das Verfahren der Agarosegelelektrophorese. (b) Ein Forscher lädt Proben in ein Gel. (c) Dieses Foto zeigt einen abgeschlossenen Elektrophoreselauf auf einem Agarosegel. Die DNA-Leiter befindet sich in den Spuren 1 und 9. Sieben Proben befinden sich in den Spuren 2 bis 8. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter ultraviolettem Licht fotografiert. (Credit a: Änderung der Arbeit von Magnus Manske; Credit b: Änderung der Arbeit des US-Landwirtschaftsministeriums; Credit c: Änderung der Arbeit von James Jacob)

Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)

Die Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme sind kurz (nur wenige Nukleotide lang), sequenzspezifische Palindrome und können im gesamten Genom gefunden werden. Somit führen Unterschiede in den DNA-Sequenzen in den Genomen von Individuen zu Unterschieden in der Verteilung von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, die als unterschiedliche Bandenmuster auf einem Gel nach Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht werden können. Die Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) vergleicht die DNA-Bandenmuster verschiedener DNA-Proben nach dem Restriktionsverdau (Abbildung (PageIndex{3})).

Die RFLP-Analyse hat viele praktische Anwendungen sowohl in der Medizin als auch in der Forensik. Epidemiologen verwenden beispielsweise RFLP-Analysen, um die Quelle bestimmter Mikroorganismen zu verfolgen und zu identifizieren, die an Ausbrüchen von Lebensmittelvergiftungen oder bestimmten Infektionskrankheiten beteiligt sind. Die RFLP-Analyse kann auch an menschlicher DNA verwendet werden, um Vererbungsmuster von Chromosomen mit abweichenden Genen zu bestimmen, einschließlich solcher, die mit erblichen Krankheiten assoziiert sind, oder um die Vaterschaft festzustellen.

Forensiker verwenden die RFLP-Analyse als eine Form des DNA-Fingerabdrucks, der für die Analyse von DNA von Tatorten, Verdächtigen und Opfern nützlich ist. DNA-Proben werden gesammelt, die Anzahl der Kopien der Proben-DNA-Moleküle wird unter Verwendung von PCR erhöht und dann einem Restriktionsenzymverdau und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um spezifische Bandenmuster zu erzeugen. Durch den Vergleich der Streifenmuster von am Tatort entnommenen Proben mit denen von Verdächtigen oder Opfern können Ermittler definitiv feststellen, ob am Tatort gesammelte DNA-Beweise von Verdächtigen oder Opfern zurückgelassen wurden.

Abbildung (PageIndex{3}): Die RFLP-Analyse kann verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu unterscheiden. In diesem Beispiel wird ein normales Chromosom in zwei Fragmente verdaut, während die Verdauung eines mutierten Chromosoms nur ein Fragment erzeugt. Die kleinen roten Pfeile, die auf die beiden unterschiedlichen Chromosomensegmente zeigen, zeigen die Positionen der Erkennungsstellen des Restriktionsenzyms. Nach dem Verdau und der Agarosegelelektrophorese spiegeln die Bandenmuster die Veränderung wider, indem sie den Verlust von zwei kürzeren Banden und die Zunahme einer längeren Bande zeigen. (Kredit: Änderung der Arbeit des National Center for Biotechnology Information)

Southern Blots und Modifikationen

Mehrere molekulare Techniken nutzen Sequenzkomplementarität und Hybridisierung zwischen Nukleinsäuren einer Probe und DNA-Sonden. Typischerweise ist die Sondierung von Nukleinsäureproben innerhalb eines Gels nicht erfolgreich, da die Probennukleinsäuren innerhalb des Gels ausdiffundieren, wenn die DNA-Sonde in ein Gel eindringt. Daher werden üblicherweise Blotting-Techniken verwendet, um Nukleinsäuren auf eine dünne, positiv geladene Membran aus Nitrozellulose oder Nylon zu übertragen. Bei der Southern Blotechnique, die 1975 von Sir Edwin Southern entwickelt wurde, werden DNA-Fragmente innerhalb einer Probe zunächst durch Agarosegelelektrophorese getrennt und dann durch Kapillarwirkung auf eine Membran übertragen (Abbildung (PageIndex{4})). Die DNA-Fragmente, die an die Oberfläche der Membran binden, werden dann einer spezifischen einzelsträngigen DNA-Sonde ausgesetzt, die mit einem radioaktiven oder fluoreszierenden molekularen Beacon markiert ist, um den Nachweis zu erleichtern. Southern-Blots können verwendet werden, um das Vorhandensein bestimmter DNA-Sequenzen in einer gegebenen DNA-Probe nachzuweisen. Sobald die Ziel-DNA innerhalb der Membran sichtbar gemacht wurde, können die Forscher den Teil der Membran ausschneiden, der das Fragment enthält, um das interessierende DNA-Fragment zu gewinnen.

Abbildung (PageIndex{4}): Bei der Southern-Blot-Technik werden DNA-Fragmente zuerst durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, dann durch Kapillarwirkung auf eine Nylonmembran übertragen, die dann mit einer DNA-Sonde getränkt wird, die mit einem Molecular Beacon markiert ist, um eine einfache Visualisierung zu ermöglichen.

Variationen des Southern-Blots – Dot-Blot, Slot-Blot und Spot-Blot – beinhalten keine Elektrophorese, sondern konzentrieren stattdessen DNA aus einer Probe an einer kleinen Stelle auf einer Membran. Nach der Hybridisierung mit einer DNA-Sonde wird die detektierte Signalintensität gemessen, wodurch der Forscher die Menge der in der Probe vorhandenen Ziel-DNA abschätzen kann.

Ein Kolonie-Blot ist eine weitere Variante des Southern-Blots, bei der Kolonien, die verschiedene Klone in einer genomischen Bibliothek repräsentieren, durch Drücken der Membran auf die Kulturplatte auf eine Membran übertragen werden. Die Zellen auf der Membran werden lysiert und die Membran kann dann sondiert werden, um zu bestimmen, welche Kolonien innerhalb einer genomischen Bibliothek das Zielgen beherbergen. Da die Kolonien auf der Platte noch wachsen, können die interessierenden Zellen von der Platte isoliert werden.

Beim Northern-Blot, einer anderen Variante des Southern-Blots, wird RNA (nicht DNA) auf der Membran immobilisiert und sondiert. Northern Blots werden typischerweise verwendet, um die Menge an mRNA nachzuweisen, die durch Genexpression in einer Gewebe- oder Organismusprobe hergestellt wird.

Microarray-Analyse

Eine andere Technik, die von der Hybridisierung zwischen komplementären Nukleinsäuresequenzen profitiert, wird als Mikroarray-Analyse bezeichnet. Die Microarray-Analyse ist nützlich für den Vergleich von Genexpressionsmustern zwischen verschiedenen Zelltypen – zum Beispiel mit einem Virus infizierte Zellen mit nicht infizierten Zellen oder Krebszellen mit gesunden Zellen (Abbildung (PageIndex{5})).

Typischerweise wird DNA oder cDNA aus einer experimentellen Probe neben bekannten DNA-Sequenzen auf einem Glasobjektträger aufgebracht. Jeder Objektträger kann mehr als 30.000 verschiedene DNA-Fragmenttypen aufnehmen. Auf einem Objektträger können einzelne DNA-Fragmente (die die gesamte Genombibliothek eines Organismus umfassen) oder cDNA-Fragmente (entsprechend dem vollständigen Komplement der exprimierten Gene eines Organismus) einzeln aufgetupft werden.

Nach dem Ablegen auf dem Objektträger kann genomische DNA oder mRNA zum Vergleich aus den beiden Proben isoliert werden. Wenn mRNA isoliert wird, wird sie unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA revers transkribiert. Dann werden die beiden Proben genomischer DNA oder cDNA mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (typischerweise rot und grün) markiert. Die markierten genomischen DNA-Proben werden dann in gleichen Mengen kombiniert, auf den Microarray-Chip gegeben und an komplementäre Spots auf dem Microarray hybridisieren gelassen.

Die Hybridisierung von genomischen DNA-Probenmolekülen kann durch Messen der Fluoreszenzintensität an bestimmten Stellen auf dem Mikroarray überwacht werden. Unterschiede im Ausmaß der Hybridisierung zwischen den Proben können leicht beobachtet werden. Wenn nur die Nukleinsäuren einer Probe an einen bestimmten Punkt auf dem Mikroarray hybridisieren, erscheint dieser Punkt entweder grün oder rot. Wenn jedoch die Nukleinsäuren beider Proben hybridisieren, erscheint der Fleck aufgrund der Kombination der roten und grünen Farbstoffe gelb.

Obwohl die Microarray-Technologie einen ganzheitlichen Vergleich zwischen zwei Proben in kurzer Zeit ermöglicht, erfordert sie hoch entwickelte (und teure) Detektionsgeräte und Analysesoftware. Aus Kostengründen ist diese Technologie in der Regel auf Forschungsumgebungen beschränkt. Forscher haben Microarray-Analysen verwendet, um zu untersuchen, wie die Genexpression in Organismen beeinflusst wird, die mit Bakterien oder Viren infiziert oder bestimmten chemischen Behandlungen unterzogen wurden.

Abbildung (PageIndex{5}): (a) Die Schritte der Mikroarray-Analyse werden veranschaulicht. Hier werden Genexpressionsmuster zwischen Krebszellen und gesunden Zellen verglichen. (b) Microarray-Informationen können als Heatmap ausgedrückt werden. Gene sind auf der linken Seite gezeigt; Unten sind verschiedene Proben dargestellt. Gene, die nur in Krebszellen exprimiert werden, sind in unterschiedlichen Rottönen dargestellt; Gene, die nur in normalen Zellen exprimiert werden, sind in unterschiedlichen Grüntönen dargestellt. Gene, die sowohl in Krebszellen als auch in normalen Zellen exprimiert werden, sind gelb dargestellt.

Entdecken Sie die Mikrochip-Technologie auf dieser interaktiven Website.

Übung (PageIndex{2})

  1. Woraus besteht eine DNA-Sonde?
  2. Warum wird nach der Gelelektrophorese eines DNA-Verdaus ein Southern-Blot verwendet?

Molekulare Analyse von Proteinen

In vielen Fällen ist es möglicherweise nicht wünschenswert oder möglich, DNA oder RNA direkt zu untersuchen. Proteine ​​können speziesspezifische Informationen zur Identifizierung sowie wichtige Informationen darüber liefern, wie und ob eine Zelle oder ein Gewebe auf die Anwesenheit eines pathogenen Mikroorganismus reagiert. Verschiedene Proteine ​​erfordern unterschiedliche Methoden zur Isolierung und Charakterisierung.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Eine Variation der Gelelektrophorese, die als Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bezeichnet wird, wird üblicherweise zum Trennen von Proteinen verwendet. Bei PAGE ist die Gelmatrix feiner und besteht aus Polyacrylamid anstelle von Agarose. Außerdem wird PAGE typischerweise unter Verwendung eines vertikalen Gelgeräts durchgeführt (Abbildung (PageIndex{6})). Aufgrund der unterschiedlichen Ladungen, die mit Aminosäureseitenketten verbunden sind, kann PAGE verwendet werden, um intakte Proteine ​​basierend auf ihren Nettoladungen zu trennen. Alternativ können Proteine ​​denaturiert und mit einem negativ geladenen Detergens namens Natriumdodecylsulfat (SDS) beschichtet werden, das die nativen Ladungen maskiert und eine Trennung nur basierend auf der Größe ermöglicht. PAGE kann durch die Verwendung von zweidimensionaler PAGE weiter modifiziert werden, um Proteine ​​basierend auf zwei Eigenschaften zu trennen, wie beispielsweise ihrer Ladung bei verschiedenen pH-Werten sowie ihrer Größe. In jedem dieser Fälle werden Proteine ​​nach der Elektrophorese durch Färben sichtbar gemacht, üblicherweise mit Coomassie-Blau oder einer Silberfärbung.

Abbildung (PageIndex{6}): (a) SDS ist ein Detergens, das Proteine ​​denaturiert und ihre nativen Ladungen maskiert, wodurch sie einheitlich negativ geladen werden. (b) Das Verfahren der SDS-PAGE wird in diesen Schritten veranschaulicht. (c) Eine Fotografie eines SDS-PAGE-Gels zeigt Coomassie-gefärbte Banden, bei denen Proteine ​​unterschiedlicher Größe als Reaktion auf die angelegte Spannung entlang des Gels gewandert sind. Auf der rechten Seite des Gels ist eine Spur für den Größenstandard sichtbar. (Credit b: Änderung der Arbeit durch „GeneEd“/YouTube)

Übung (PageIndex{3})

Auf welcher Grundlage werden Proteine ​​in SDS-PAGE aufgetrennt?

Teil 3

Als Kayla ihre Symptome beschrieb, vermutete ihr Arzt zunächst eine bakterielle Meningitis, die mit ihren Kopfschmerzen und ihrem steifen Nacken einhergeht.Dies schloss sie jedoch bald als Möglichkeit aus, da die Meningitis in der Regel schneller fortschreitet als das, was Kayla durchmachte. Viele ihrer Symptome ähnelten immer noch denen der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und des systemischen Lupus erythematodes (SLE), und der Arzt hielt auch die Lyme-Borreliose für möglich, wenn man bedenkt, wie viel Zeit Kayla im Wald verbringt. Kayla erinnerte sich nicht an kürzliche Zeckenstiche (die typischen Übertragungswege der Lyme-Borreliose) und sie hatte nicht den typischen Ausschlag im Zusammenhang mit der Lyme-Borreliose (Abbildung (PageIndex{7})). Allerdings entwickeln 20–30% der Patienten mit Borreliose nie diesen Ausschlag, sodass der Arzt ihn nicht ausschließen wollte.

Kaylas Arzt ordnete eine MRT ihres Gehirns, ein komplettes Blutbild zur Untersuchung auf Anämie, Bluttests zur Beurteilung der Leber- und Nierenfunktion und zusätzliche Tests zur Bestätigung oder zum Ausschluss von SLE oder Borreliose an. Ihre Testergebnisse stimmten sowohl mit SLE als auch mit ALS nicht überein, und das Ergebnis des Tests, der nach Lyme-Borreliose-Antikörpern suchte, war "zweideutig", dh nicht schlüssig. Nachdem er ALS und SLE ausgeschlossen hatte, beschloss Kaylas Arzt, zusätzliche Tests auf Lyme-Borreliose durchzuführen.

Übung (PageIndex{4})

  1. Warum würde Kaylas Arzt immer noch den Verdacht auf Borreliose vermuten, auch wenn die Testergebnisse keine Lyme-Antikörper im Blut nachweisen?
  2. Welche Art von molekularem Test könnte zum Nachweis von Blut-Antikörpern gegen Borreliose verwendet werden?
Antworten

Fügen Sie hier Antworttext hinzu und er wird automatisch ausgeblendet, wenn Sie eine "AutoNum"-Vorlage auf der Seite aktiv haben.

Abbildung (PageIndex{7}): Ein Bulls-Eye-Ausschlag ist eines der häufigsten Symptome von Borreliose, aber bis zu 30% der infizierten Personen entwickeln nie einen Ausschlag. (Kredit: Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten)

Amplifikationsbasierte DNA-Analysemethoden

Es können verschiedene Verfahren verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu erhalten, die zum Studium von krankheitserregenden Organismen nützlich sind. Mit dem Aufkommen der Rapid-Sequencing-Technologie ist unsere Wissensbasis über das gesamte Genom pathogener Organismen phänomenal gewachsen. Wir beginnen mit einer Beschreibung der Polymerase-Kettenreaktion, die keine Sequenzierungsmethode ist, aber es Forschern und Klinikern ermöglicht hat, die großen DNA-Mengen zu erhalten, die für die Sequenzierung und andere Studien benötigt werden. Die Polymerase-Kettenreaktion beseitigt die Abhängigkeit, die wir früher von Zellen hatten, um mehrere DNA-Kopien herzustellen, und erreicht das gleiche Ergebnis durch relativ einfache Reaktionen außerhalb der Zelle.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die meisten Methoden der DNA-Analyse, wie Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese oder DNA-Sequenzierung, erfordern große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments. In der Vergangenheit wurden große Mengen an DNA durch das Züchten der Wirtszellen einer genomischen Bibliothek hergestellt. Die Vorbereitung von Bibliotheken erfordert jedoch Zeit und Mühe, und die interessierenden DNA-Proben liegen oft in winzigen Mengen vor. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht eine schnelle Amplifikation in der Anzahl der Kopien spezifischer DNA-Sequenzen zur weiteren Analyse (Abbildung (PageIndex{8})). Eine der leistungsfähigsten Techniken in der Molekularbiologie, die PCR, wurde 1983 von Kary Mullis bei der Cetus Corporation entwickelt. PCR hat spezifische Anwendungen in Forschungs-, Forensik- und klinischen Labors, darunter:

  • Bestimmung der Nukleotidsequenz in einer bestimmten DNA-Region
  • Amplifizieren einer Zielregion der DNA zur Klonierung in einen Plasmidvektor
  • Identifizierung der Quelle einer DNA-Probe, die an einem Tatort hinterlassen wurde
  • Analyse von Proben zur Feststellung der Vaterschaft
  • Vergleich von Proben alter DNA mit modernen Organismen
  • Bestimmung des Vorhandenseins von schwer zu kultivierenden oder nicht kultivierbaren Mikroorganismen in Menschen oder Umweltproben

PCR ist ein in vitro Labortechnik, die den natürlichen Prozess der DNA-Replikation nutzt. Die bei der PCR verwendeten hitzestabilen DNA-Polymerase-Enzyme stammen von hyperthermophilen Prokaryonten. Taq DNA-Polymerase, häufig in der PCR verwendet, leitet sich von der Thermus aquaticus Bakterium, das aus einer heißen Quelle im Yellowstone-Nationalpark isoliert wurde. Die DNA-Replikation erfordert die Verwendung von Primern für den Start der Replikation, um freie 3'-Hydroxylgruppen für die Addition von Nukleotiden durch DNA-Polymerase zur Verfügung zu haben. Während jedoch normalerweise aus RNA zusammengesetzte Primer in Zellen verwendet werden, werden DNA-Primer für die PCR verwendet. DNA-Primer sind aufgrund ihrer Stabilität bevorzugt, und DNA-Primer mit bekannten Sequenzen, die auf eine spezifische DNA-Region abzielen, können kommerziell chemisch synthetisiert werden. Diese DNA-Primer sind funktionell ähnlich den DNA-Sonden, die für die verschiedenen früher beschriebenen Hybridisierungstechniken verwendet werden, und binden aufgrund der Komplementarität zwischen der Ziel-DNA-Sequenz und dem Primer an spezifische Ziele.

Die PCR erfolgt über mehrere Zyklen, die jeweils drei Schritte umfassen: Denaturierung, Annealing und Extension. Für die PCR werden sogenannte Thermocycler verwendet; Diese Maschinen können so programmiert werden, dass sie bei jedem Schritt automatisch die erforderlichen Temperaturen durchlaufen ([Link]). Zuerst wird doppelsträngige Matrizen-DNA, die die Zielsequenz enthält, bei ungefähr 95 °C denaturiert. Die hohe Temperatur, die erforderlich ist, um die DNA-Stränge physikalisch (und nicht enzymatisch) zu trennen, ist der Grund, warum die hitzestabile DNA-Polymerase benötigt wird. Anschließend wird die Temperatur auf etwa 50 °C gesenkt. Dies ermöglicht es den DNA-Primern, die zu den Enden der Zielsequenz komplementär sind, an die Matrizenstränge zu hybridisieren (kleben), wobei ein Primer an jeden Strang anlagert. Schließlich wird die Temperatur auf 72 °C erhöht, die optimale Temperatur für die Aktivität der hitzestabilen DNA-Polymerase, was die Addition von Nukleotiden an den Primer unter Verwendung des einzelsträngigen Targets als Matrize ermöglicht. Jeder Zyklus verdoppelt die Anzahl der doppelsträngigen Ziel-DNA-Kopien. Typischerweise umfassen PCR-Protokolle 25–40 Zyklen, was die Amplifikation einer einzelnen Zielsequenz um mehrere zehn Millionen bis über eine Billion ermöglicht.

Die natürliche DNA-Replikation ist so konzipiert, dass sie das gesamte Genom kopiert und an einer oder mehreren Ursprungsstellen beginnt. Primer werden während der Replikation konstruiert, nicht vorher, und bestehen nicht aus einigen wenigen spezifischen Sequenzen. Die PCR zielt unter Verwendung sequenzspezifischer Primer auf spezifische Regionen einer DNA-Probe ab. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von isothermen PCR-Amplifikationsverfahren entwickelt, die die Notwendigkeit von thermischen Zyklen umgehen, indem sie akzessorische Proteine ​​nutzen, die den DNA-Replikationsprozess unterstützen. Da die Entwicklung dieser Methoden fortschreitet und ihr Einsatz in Forschung, Forensik und klinischen Labors immer weiter verbreitet wird, können Thermocycler obsolet werden.

Abbildung (PageIndex{8}): Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um viele Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz herzustellen.

Vertiefen Sie Ihr Verständnis der Polymerase-Kettenreaktion, indem Sie sich diese Animation ansehen und eine interaktive Übung durcharbeiten.

PCR-Variationen

Mehrere spätere Modifikationen der PCR erhöhen den Nutzen dieser Technik weiter. Die reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) wird verwendet, um DNA-Kopien eines spezifischen mRNA-Moleküls zu erhalten. Die RT-PCR beginnt mit der Verwendung des Reverse-Transkriptase-Enzyms, um mRNA-Moleküle in cDNA umzuwandeln. Diese cDNA wird dann als Matrize für die traditionelle PCR-Amplifikation verwendet. RT-PCR kann erkennen, ob ein bestimmtes Gen in einer Probe exprimiert wurde. Eine weitere neuere Anwendung der PCR ist die Real-Time-PCR, auch bekannt als quantitative PCR (qPCR). Standard-PCR- und RT-PCR-Protokolle sind nicht quantitativ, da jedes der Reagenzien einschränkend werden kann, bevor alle Zyklen innerhalb des Protokolls abgeschlossen sind und die Proben erst am Ende analysiert werden. Da es nicht möglich ist, zu bestimmen, wann im PCR- oder RT-PCR-Protokoll ein bestimmtes Reagenz limitierend geworden ist, ist es nicht möglich zu wissen, wie viele Zyklen bis zu diesem Zeitpunkt abgeschlossen wurden, und daher ist es nicht möglich, zu bestimmen, wie viele Originale Template-Moleküle waren zu Beginn der PCR in der Probe vorhanden. Bei der qPCR ermöglicht es die Verwendung von Fluoreszenz jedoch, den Anstieg einer doppelsträngigen Matrize während einer PCR-Reaktion während des Auftretens zu verfolgen. Diese kinetischen Daten können dann verwendet werden, um die Menge der ursprünglichen Zielsequenz zu quantifizieren. Der Einsatz von qPCR in den letzten Jahren hat die Möglichkeiten der PCR weiter erweitert, so dass Forscher die Anzahl der DNA-Kopien und manchmal auch der Organismen in einer Probe bestimmen können. In klinischen Situationen wird die qRT-PCR verwendet, um die Viruslast bei HIV-positiven Patienten zu bestimmen, um die Wirksamkeit ihrer Therapie zu bewerten.

DNA-Sequenzierung

Eine grundlegende Sequenzierungstechnik ist die Kettenabbruchmethode, auch bekannt als Didesoxy-Methode oder Sanger-DNA-Sequenzierungsmethode, die 1972 von Frederick Sanger entwickelt wurde. Die Kettenabbruchmethode beinhaltet die DNA-Replikation einer einzelsträngigen Matrize unter Verwendung eines DNA-Primers um die Synthese eines komplementären Strangs, DNA-Polymerase, einer Mischung der vier regulären Desoxynukleotid (dNTP)-Monomere und eines kleinen Anteils von Didesoxynukleotiden (ddNTPs), die jeweils mit einem molekularen Beacon markiert sind, zu initiieren. Die ddNTPs sind Monomere, denen eine Hydroxylgruppe (–OH) an der Stelle fehlt, an der normalerweise ein anderes Nukleotid anlagert, um eine Kette zu bilden (Abbildung (PageIndex{9})). Jedes Mal, wenn ein ddNTP zufällig in den wachsenden komplementären Strang eingebaut wird, beendet es den Prozess der DNA-Replikation für diesen speziellen Strang. Dies führt zu mehreren kurzen Strängen replizierter DNA, die jeweils an einem anderen Punkt während der Replikation terminiert werden. Wenn das Reaktionsgemisch einer Gelelektrophorese unterzogen wird, bilden die mehreren neu replizierten DNA-Stränge eine Leiter unterschiedlicher Größe. Da die ddNTPs markiert sind, spiegelt jede Bande auf dem Gel die Größe des DNA-Strangs wider, wenn das ddNTP die Reaktion beendete.

Zu Sangers Tagen wurden für jedes zu sequenzierende DNA-Molekül vier Reaktionen angelegt, wobei jede Reaktion nur eines der vier möglichen ddNTPs enthielt. Jedes ddNTP wurde mit einem radioaktiven Phosphormolekül markiert. Die Produkte der vier Reaktionen wurden dann in getrennten Bahnen nebeneinander auf langen, schmalen PAGE-Gelen laufen gelassen, und die Banden unterschiedlicher Länge wurden durch Autoradiographie nachgewiesen. Heute wurde dieser Prozess durch die Verwendung von ddNTPs vereinfacht, die jeweils mit einem andersfarbigen Fluoreszenzfarbstoff oder Fluorochrom markiert sind (Abbildung (PageIndex{10})) in einer Sequenzierungsreaktion, die alle vier möglichen ddNTPs für jedes DNA-Molekül enthält. sequenziert (Abbildung (PageIndex{11})). Diese Fluorochrome werden durch Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen. Die Bestimmung der Fluoreszenzfarbe jeder Bande beim Passieren des Detektors erzeugt die Nukleotidsequenz des Matrizenstrangs.

Abbildung (PageIndex{9}): Ein Didesoxynukleotid hat eine ähnliche Struktur wie ein Desoxynukleotid, aber es fehlt die 3'-Hydroxylgruppe (angezeigt durch den schattierten Kasten). Wenn ein Didesoxynukleotid in einen DNA-Strang eingebaut wird, stoppt die DNA-Synthese.

Abbildung (PageIndex{10}): Die Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Frederick Sanger wird anhand von mit Fluorochromen markierten ddNTPs veranschaulicht. Mit ddNTPs kann ein Gemisch aus DNA-Fragmenten jeder möglichen Größe erzeugt werden, die in der Länge um nur ein Nukleotid variieren. Die DNA wird nach Größe getrennt und jede Bande kann mit einem Fluoreszenzdetektor nachgewiesen werden.

Abbildung (PageIndex{11}): Dieses Diagramm fasst die Sanger-Sequenzierungsmethode unter Verwendung von Fluorochrom-markierten ddNTPs und Kapillargelelektrophorese zusammen.

Seit 2005 fallen automatisierte Sequenzierungstechniken, die von Labors verwendet werden, unter dem Oberbegriff Next Generation Sequencing, einer Gruppe automatisierter Techniken, die für die schnelle DNA-Sequenzierung verwendet werden. Diese Methoden haben die Molekulargenetik revolutioniert, weil die kostengünstigen Sequenzer an einem Tag Sequenzen von Hunderttausenden oder Millionen kurzer Fragmente (25 bis 600 Basenpaare) erzeugen können. Obwohl mehrere Varianten der Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation von verschiedenen Unternehmen hergestellt werden (zum Beispiel die Pyrosequenzierung von 454 Life Sciences und die Solexa-Technologie von Illumina), ermöglichen sie alle die schnelle Sequenzierung von Millionen von Basen, wodurch die Sequenzierung ganzer Genome relativ einfach und kostengünstig und alltäglich. Bei der 454-Sequenzierung (Pyrosequenzierung) beispielsweise wird eine DNA-Probe in 400–600-bp-Einzelstrangfragmente fragmentiert, die durch Hinzufügen von DNA-Adaptern an beiden Enden jedes Fragments modifiziert werden. Jedes DNA-Fragment wird dann auf einem Bead immobilisiert und durch PCR amplifiziert, wobei Primer verwendet werden, die so gestaltet sind, dass sie an die Adapter anlagern, wodurch ein Bead erzeugt wird, das viele Kopien dieses DNA-Fragments enthält. Jedes Kügelchen wird dann in eine separate Vertiefung gegeben, die Sequenzierungsenzyme enthält. In die Vertiefung wird jedes der vier Nukleotide nacheinander hinzugefügt; wenn jedes einzelne eingebaut wird, wird Pyrophosphat als Nebenprodukt der Polymerisation freigesetzt, das einen kleinen Lichtblitz aussendet, der von einem Detektor aufgezeichnet wird. Dies stellt die Reihenfolge der eingebauten Nukleotide bereit, wenn ein neuer DNA-Strang hergestellt wird, und ist ein Beispiel für eine Synthesesequenzierung. Sequenzer der nächsten Generation verwenden ausgeklügelte Software, um den mühsamen Prozess des Ordnens aller Fragmente zu bewältigen. Insgesamt schreiten diese Technologien weiterhin schnell voran, senken die Kosten für die Sequenzierung und erhöhen die Verfügbarkeit von Sequenzdaten aus einer Vielzahl von Organismen schnell.

Das National Center for Biotechnology Information beherbergt eine weit verbreitete Datenbank für genetische Sequenzen namens GenBank, in der Forscher genetische Informationen zur öffentlichen Verwendung hinterlegen. Nach der Veröffentlichung von Sequenzdaten laden die Forscher diese in die GenBank hoch und geben anderen Forschern Zugang zu den Informationen. Die Zusammenarbeit ermöglicht es Forschern, neu entdeckte oder unbekannte Sequenzinformationen von Proben mit der Vielzahl bereits vorhandener Sequenzdaten zu vergleichen.

Sehen Sie sich eine Animation zur 454-Sequenzierung an, um Ihr Verständnis dieser Methode zu vertiefen.

VERWENDUNG EINES NAAT ZUR DIAGNOSE VON A C. SCHWIERIGKEIT INFEKTION

Javier, ein 80-jähriger Patient mit einer Vorgeschichte von Herzerkrankungen, kehrte vor kurzem aus dem Krankenhaus nach Hause zurück, nachdem er sich einer Angioplastie unterzogen hatte, um einen Stent in eine Herzarterie einzuführen. Um die Möglichkeit einer Infektion zu minimieren, erhielt Javier während und kurz nach seinem Eingriff intravenöse Breitbandantibiotika. Vier Tage nach dem Eingriff wurde er entlassen, aber eine Woche später bekam er mehrmals täglich leichte Bauchkrämpfe und wässrigen Durchfall. Er verlor seinen Appetit, wurde stark dehydriert und bekam Fieber. Er bemerkte auch Blut im Stuhl. Javiers Frau rief den Arzt an, der ihr anwies, ihn sofort in die Notaufnahme zu bringen.

Das Krankenhauspersonal führte mehrere Tests durch und stellte fest, dass Javiers Nierenkreatininspiegel im Vergleich zu seinem Blutspiegel erhöht waren, was darauf hindeutet, dass seine Nieren nicht gut funktionierten. Javiers Symptome deuteten auf eine mögliche Infektion mit Clostridium difficile, ein Bakterium, das gegen viele Antibiotika resistent ist. Das Krankenhaus sammelte und kultivierte eine Stuhlprobe, um nach der Produktion der Toxine A und B zu suchen C. schwierig, aber die Ergebnisse waren negativ. Die negativen Ergebnisse reichten jedoch nicht aus, um eine C. schwierig Infektion durch Kultivierung von C. schwierig und der Nachweis seiner charakteristischen Toxine kann schwierig sein, insbesondere bei einigen Arten von Proben. Zur Sicherheit führten sie einen diagnostischen Nukleinsäure-Amplifikationstest (NAAT) durch. Derzeit sind NAATs der Goldstandard des klinischen Diagnostikers zum Nachweis des Erbguts eines Erregers. In Javiers Fall wurde qPCR verwendet, um nach dem kodierenden Gen zu suchen C. schwierig Toxin B (tcdB). Als die qPCR-Analyse positiv ausfiel, kam der behandelnde Arzt zu dem Schluss, dass Javier tatsächlich an a . litt C. schwierig Infektion und verschrieben sofort das Antibiotikum Vancomycin, das intravenös verabreicht werden sollte. Das Antibiotikum beseitigte die Infektion und Javier erholte sich vollständig.

Denn Infektionen mit C. schwierig in Javiers Gemeinschaft weit verbreitet waren, wurde seine Probe weiter analysiert, um zu sehen, ob der spezifische Stamm von C. schwierig identifiziert werden konnte. Die Stuhlprobe von Javier wurde einer Ribotypisierung und einer repetitiven sequenzbasierten PCR (rep-PCR)-Analyse unterzogen. Bei der Ribotypisierung wird eine kurze DNA-Sequenz zwischen den Genen 16S rRNA und 23S rRNA amplifiziert und einem Restriktionsverdau unterzogen (Abbildung (PageIndex{12})). Diese Sequenz variiert zwischen Stämmen von C. schwierig, so dass Restriktionsenzyme an verschiedenen Stellen schneiden. Bei der rep-PCR binden DNA-Primer an kurze Sequenzen, die sich häufig innerhalb der C. schwierig Genom wurden für die PCR verwendet. Nach dem Restriktionsverdau wurde bei beiden Analysearten eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, um die Bandenmuster zu untersuchen, die sich aus jedem Verfahren ergaben (Abbildung (PageIndex{13})). Rep-PCR kann verwendet werden, um verschiedene Ribotypen weiter zu subtypieren, wodurch die Auflösung zum Nachweis von Unterschieden zwischen Stämmen erhöht wird. Es wurde festgestellt, dass der Ribotyp des Stammes, der Javier infiziert hat, Ribotyp 27 ist, ein Stamm, der für seine erhöhte Virulenz, Resistenz gegen Antibiotika und erhöhte Prävalenz in den Vereinigten Staaten, Kanada, Japan und Europa bekannt ist.1

Übung (PageIndex{5})

  1. Wie unterscheiden sich die Streifenmuster zwischen den Stämmen von C. schwierig?
  2. Warum, glauben Sie, konnten Labortests die Toxinproduktion nicht direkt nachweisen?

Abbildung (PageIndex{12}): Ein Gel, das PCR-Produkte verschiedener Clostridium difficile-Stämme zeigt. Javiers Beispiel ist unten gezeigt; Beachten Sie, dass es dem Ribotyp 27 im Referenzsatz entspricht. (Kredit: Änderung der Arbeit der American Society for Microbiology)

Abbildung (PageIndex{13}): Stämme von infektiösen Bakterien, wie C. difficile, können durch molekulare Analyse identifiziert werden. Die PCR-Ribotypisierung wird häufig verwendet, um bestimmte C. difficile-Stämme zu identifizieren. Rep-PCR ist eine alternative molekulare Technik, die auch verwendet wird, um bestimmtes C. zu identifizieren (Kredit b: Modifikation der Arbeit der American Society for Microbiology)

Schlüsselkonzepte und Zusammenfassung

  • Das Auffinden eines interessierenden Gens in einer Probe erfordert die Verwendung eines einzelsträngigen DNA-Sonde markiert mit einem molekularen Beacon (typischerweise Radioaktivität oder Fluoreszenz), das mit einer komplementären einzelsträngigen Nukleinsäure in der Probe hybridisieren kann.
  • Agarose-Gelelektrophorese ermöglicht die Trennung von DNA-Molekülen basierend auf der Größe.
  • Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Die Analyse ermöglicht die Sichtbarmachung von unterschiedlichen Varianten einer DNA-Sequenz, die durch Unterschiede in den Restriktionsstellen verursacht werden, durch Agarosegelelektrophorese.
  • Südlicher Fleck Analyse ermöglicht es den Forschern, eine bestimmte DNA-Sequenz in einer Probe zu finden, während Nordfleck Die Analyse ermöglicht es Forschern, eine bestimmte mRNA-Sequenz nachzuweisen, die in einer Probe exprimiert wird.
  • Microarray-Technologie ist eine Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik, die es ermöglicht, viele tausend Gene gleichzeitig zu untersuchen, um Unterschiede in Genen oder Genexpressionsmustern zwischen zwei Proben genomischer DNA oder cDNA zu finden,
  • Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ermöglicht die Trennung von Proteinen nach Größe, insbesondere wenn native Proteinladungen durch Vorbehandlung mit SDS maskiert werden.
  • Polymerase Kettenreaktion ermöglicht die schnelle Amplifikation einer spezifischen DNA-Sequenz. Variationen der PCR können verwendet werden, um die mRNA-Expression nachzuweisen (Reverse Transkriptase PCR) oder um eine bestimmte Sequenz in der Originalprobe zu quantifizieren (Echtzeit-PCR).
  • Obwohl die Entwicklung von Sanger-DNA-Sequenzierung war revolutionär, Fortschritte in Sequenzierung der nächsten Generation ermöglichen die schnelle und kostengünstige Sequenzierung der Genome vieler Organismen, wodurch die Menge an neuen Sequenzdaten beschleunigt wird.

Mehrfachauswahl

Welche Technik wird verwendet, um Proteinfragmente nach Größe zu trennen?

A. Polyacrylamid-Gelelektrophorese
B. Southern Blot
C. Agarosegelelektrophorese
D. Polymerase-Kettenreaktion

EIN

Welche Technik verwendet Restriktionsenzymverdau gefolgt von Agarosegelelektrophorese, um ein Bandenmuster zum Vergleich mit einer anderen Probe zu erzeugen, die auf die gleiche Weise verarbeitet wurde?

A. qPCR
B. RT-PCR
C. RFLP
D. 454-Sequenzierung

C

Alle folgenden Techniken beinhalten die Hybridisierung zwischen einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen außer:

A. Southern-Blot-Analyse
B. RFLP-Analyse
C. Northern-Blot-Analyse
D. Microarray-Analyse

B

Fülle die Lücke aus

Die __________ Blot-Technik wird verwendet, um ein RNA-Fragment in einer Probe zu finden, das zu einer DNA-Sonde komplementär ist.

nördlich

Der PCR-Schritt, bei dem das doppelsträngige Matrizenmolekül einzelsträngig wird, wird als _____________ bezeichnet.

Denaturierung

Die Sequenzierungsmethode, die den Einbau von ddNTPs beinhaltet, heißt __________.

Sanger-Sequenzierung, Didesoxy-Methode oder Kettenabbruchmethode

Wahr falsch

Bei der Agarosegelelektrophorese wird DNA von der negativen Elektrode angezogen.

falsch

Kurze Antwort

Warum ist es wichtig, dass eine DNA-Sonde mit einem Molecular Beacon markiert wird?

Warum muss man bei der Trennung von Proteinen streng nach Größe zuerst SDS ausgesetzt werden?

Warum muss die bei der PCR verwendete DNA-Polymerase hitzestabil sein?

Kritisches Denken

Angenommen, Sie arbeiten in einem molekularbiologischen Labor und haben Schwierigkeiten, die PCR erfolgreich durchzuführen. Sie entscheiden sich, das im Thermocycler programmierte PCR-Protokoll noch einmal zu überprüfen und stellen fest, dass die Annealing-Temperatur auf 65 °C anstatt wie geplant auf 50 °C programmiert wurde. Welche Auswirkungen hätte dieser Fehler auf die PCR-Reaktion? Siehe Abbildung.

Was ist der Vorteil der Microarray-Analyse gegenüber der Northern-Blot-Analyse bei der Überwachung von Veränderungen der Genexpression?

Was ist der Unterschied zwischen reverser Transkriptase-PCR (RT-PCR) und quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR)?

Fußnoten

  1. 1 Patrizia Spigaglia, Fabrizio Barbanti, Anna Maria Dionisi und Paola Mastrantonio. “Clostridium difficile Gegen Fluorchinolone resistente Isolate in Italien: Entstehung des PCR-Ribotyps 018.“ Zeitschrift für Klinische Mikrobiologie 48 Nein. 8 (2010): 2892–2896.

Mitwirkender

  • Nina Parker (Shenandoah University), Mark Schneegurt (Wichita State University), Anh-Hue Thi Tu (Georgia Southwestern State University), Philip Lister (Central New Mexico Community College) und Brian M. Forster (Saint Joseph's University) mit vielen beitragende Autoren. Originalinhalt über Openstax (CC BY 4.0; Zugang kostenlos unter https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


10.2: DNA visualisieren und charakterisieren - Biologie

Neuere methodische Fortschritte ermöglichen es uns, G-Quadruplex-Strukturen mit höherer Auflösung und höherem Durchsatz zu untersuchen.

Ansätze zur Verwendung von G-Quadruplex-Strukturen als molekulare Werkzeuge werden hervorgehoben.

Computergestützte und experimentelle Methoden für G-Quadruplex-Studien werden besprochen.

Die hier besprochenen Arbeiten bieten einzigartige Einblicke, um die biologische Rolle und Verwendung von G-Quadruplexen in der Grundlagen- und angewandten Forschung zu erforschen.

Guanin (G)-reiche Sequenzen in Nukleinsäuren können sich zu G-Quadruplex-Strukturen zusammenfügen, die G-Quartette beinhalten, die durch Schleifennukleotide verbunden sind. Die strukturelle und topologische Vielfalt von G-Quadruplexen erregt seit Jahrzehnten große Aufmerksamkeit. Jüngste methodische Fortschritte haben die Identifizierung und Charakterisierung von G-Quadruplexen vorangetrieben in vivo ebenso gut wie in vitro, und bei einer viel höheren Auflösung und einem viel höheren Durchsatz, was unser derzeitiges Verständnis der G-Quadruplex-Struktur und -Funktion erheblich erweitert hat. Die Ansammlung von Wissen über die strukturellen Eigenschaften von G-Quadruplexen hat dazu beigetragen, ein Repertoire molekularer und chemischer Werkzeuge für biologische Anwendungen zu entwerfen und zu entwickeln. Dieser Aufsatz zeigt, wie diese aufregenden Methoden und Erkenntnisse neue Türen geöffnet haben, um die potenziellen Funktionen und Anwendungen von G-Quadruplexen in den Grundlagen- und angewandten Biowissenschaften zu untersuchen.


Charakterisierung von häufig zitierten Artikeln in der Massenzytometrie durch H-Classics

Die Autoren hier führten bibilometrische Analysen von Massenzytometrie-Publikationen von 2010 bis 2019 durch. Die Massenzytometrie ist in der Tat eine wichtige Technologie für die tiefe Phänotypisierung des Immunsystems und das Manuskript beschreibt diese Bedeutung gut.

Zu den in diesem Manuskript verwendeten Methoden kann ich nichts sagen, da ich mit bibliometrischen Analysemethoden nicht vertraut bin. Das Manuskript ist gut geschrieben und die Begründung ist klar. Ich glaube, dieses Manuskript wäre für die Leser der Biologie von Interesse.

Wir danken dem Gutachter für die sehr positiven und ermutigenden Kommentare zu unserer Arbeit. Das Manuskript wurde geringfügig modifiziert, um den Empfehlungen des Herausgebers und der anderen Gutachter Rechnung zu tragen.

Die Daten aus WOS wurden in R geladen und verarbeitet. Die Daten und der für diese Analyse entwickelte R-Code sollten mit einem Link zu einem persistenten Repository (d. h. DOI der Institution, Zenodo, etc.) zur Verfügung gestellt werden. Dies wird dem Artikel und der wissenschaftlichen Gemeinschaft sehr zugute kommen.

Abbildung 1 sollten die Autoren in Erwägung ziehen, die Schriftgröße zu erhöhen, um den Text gut lesbar zu machen.

Der Text zur Beschreibung von Abbildung 2 &bdquoAbbildung 2 zeigt die durchschnittlichen Zitationen von HCPs pro Jahr im Bereich der Massenzytometrie, was darauf hinweist, dass der höchste Peak im Jahr 2019 mit 208 Zitationen erreicht wurde, nach einem steigenden Trend&ldquo könnte besser gelesen werden &ldquoAbbildung 2 zeigt die durchschnittlichen Zitationen pro Jahr der HCPs im Bereich der Massenzytometrie, die zwischen 2010 und 2018 ziemlich konstant blieben, bevor sie 2019 einen starken Anstieg auf 208 verzeichneten.&rdquo

Wenn der H-Index verwendet wird, um die Autoren in Tabelle 3 einzuordnen, sollte der Autor mit 5 Artikeln und H-Index auf Platz 8 stehen. Darüber hinaus sollten die Daten in Tabelle 3 auch nach TCs geordnet werden (z. B. hoch nach niedrig für Autoren mit gleichem H-Index).

Die Autoren sollten erwägen, Abbildung 3 eine Legende für die Größe und die Farbcodierung der Kreise hinzuzufügen.

Der Text &ldquoSo analysieren Sie die Häufigkeit der zugeordneten Schlüsselwörter&rdquo sollte lauten &ldquoSo analysieren Sie die Häufigkeit der zugeordneten Schlüsselwörter&rdquo

Der Text in Abbildung 4 und Abbildung 5 überlappen sich. Die Autoren sollten auch angeben, wie diese Figuren erstellt wurden. Eine alternative Methode, solche Figuren zu erstellen, ist mit Gephi (Open Source) kompatibel mit dem Datenexport aus R.

Wir danken dem Gutachter für die Berücksichtigung unseres Manuskripts und die konstruktive Rückmeldung. Wir haben alle Kommentare Punkt für Punkt behandelt und eine überarbeitete Version unseres Manuskripts mit dem Titel "Characterizing Highly Cited Papers in Mass Cytometry through H-Classics" erstellt, in der modifizierte Abschnitte mithilfe der Funktion &ldquoTrack Changes in Microsoft Word hervorgehoben werden Kommentare haben dazu beigetragen, die Qualität unseres Manuskripts zu verbessern.

  1. Die Daten aus WOS wurden in R geladen und verarbeitet. Die Daten und der für diese Analyse entwickelte R-Code sollten mit einem Link zu einem persistenten Repository (d. h. DOI der Institution, Zenodo, etc.) zur Verfügung gestellt werden. Dies wird dem Artikel und der wissenschaftlichen Gemeinschaft sehr zugute kommen.

Antwort: Danke für deinen Kommentar. Der R-Code wurde nicht aufgenommen, da für diese Arbeit kein spezieller Code entwickelt oder manuell zugegriffen wurde. Die Autoren verwendeten die grafische Benutzeroberfläche von Biblioshiny, um die mit bibliometrix erhaltenen Informationen darzustellen. Diese Informationen wurden im Abschnitt Material und Methoden (2.3. Bibliometrix. Science Mapping Analysis, Seite 4) erläutert. Wir haben auch die Beschreibung der Netzwerkparameter und der grafischen Parameter, die in den Abbildungen 4 und 5 (Seiten 13-16) der Wissensstrukturen (intellektuell und konzeptionell) dargestellt sind, aufgenommen, damit sie von anderen Forschern leicht reproduziert werden können.

Ihrer Empfehlung folgend haben wir den aus WoS gewonnenen Datensatz, den Datensatz mit den H-Klassikern und den Zitationsbericht in ein Zenodo-Repository aufgenommen, falls es für andere Autoren erforderlich sein sollte, die Analyse zu reproduzieren oder zu erweitern. Das Zenodo-Repository wurde einschließlich seines DOI in der &ldquo2.1. Bibliographische Datenbank und Abschnitt Query Design&rdquo (Seite 3).

  1. Abbildung 1 sollten die Autoren in Erwägung ziehen, die Schriftgröße zu erhöhen, um den Text gut lesbar zu machen.

Antwort: Danke für deinen Kommentar. Abbildung 1 wurde gemäß den Vorschlägen des Gutachters modifiziert. Die Größe des Fließtextes der Achsen, der Legende und der Beschriftungen wurde erweitert. Um die Datenvisualisierung zu verbessern, wurden auch die Schriftfarben sowie der Abstand und die Dicke jeder Spalte geändert.

  1. Der Text zur Beschreibung von Abbildung 2 &bdquoAbbildung 2 zeigt die durchschnittlichen Zitationen von HCPs pro Jahr im Bereich der Massenzytometrie, was darauf hinweist, dass der höchste Peak im Jahr 2019 mit 208 Zitationen erreicht wurde, nach einem steigenden Trend&ldquo könnte besser gelesen werden &ldquoAbbildung 2 zeigt die durchschnittlichen Zitationen pro Jahr der HCPs im Bereich der Massenzytometrie, die zwischen 2010 und 2018 ziemlich konstant blieben, bevor sie 2019 einen starken Anstieg auf 208 verzeichneten.&rdquo

Antwort: Danke für deinen Kommentar. Der Beschreibungstext von Abbildung 2 wurde gemäß den Vorschlägen des Gutachters geändert.

  1. Wenn der H-Index verwendet wird, um die Autoren in Tabelle 3 einzuordnen, sollte der Autor mit 5 Artikeln und H-Index auf Platz 8 stehen. Darüber hinaus sollten die Daten in Tabelle 3 auch anhand von TCs geordnet werden(z. B. hoch zu niedrig für Autoren mit gleichem H-Index).

Antwort: Danke für deinen Kommentar. Wir haben die Position des Autors korrigiert, der jetzt Platz 8 in Tabelle 3 einnimmt, und zusätzlich haben wir die Autoren, die den gleichen H-Index hatten, gemäß den TCs wie vorgeschlagen eingestuft.

  1. Die Autoren sollten erwägen, Abbildung 3 eine Legende für die Größe und die Farbcodierung der Kreise hinzuzufügen.

Antwort: Vielen Dank für diesen Kommentar. Die Autoren haben die Legende von Abbildung 3 neu geschrieben und die Farbcodes der Kreise und Linien verdeutlicht.

  1. Der Text &ldquoSo analysieren Sie die Häufigkeit der zugeordneten Schlüsselwörter&rdquo sollte lauten &ldquoSo analysieren Sie die Häufigkeit der zugeordneten Schlüsselwörter&rdquo

Antwort: Vielen Dank für diesen Kommentar. Der vom Gutachter angegebene Text wurde durch den Vorschlag ersetzt.

  1. Der Text in Abbildung 4 und Abbildung 5 überlappen sich. Die Autoren sollten auch angeben, wie diese Figuren erstellt wurden. Eine alternative Methode, solche Figuren zu erstellen, ist mit Gephi (Open Source) kompatibel mit dem Datenexport aus R.

Antwort: Vielen Dank für diesen Kommentar. Wir haben die Abbildungen 4 und 5 mit der Biblioshiny-Webschnittstelle überarbeitet, um die Überschneidung von Begriffen und Namen zu korrigieren.

Ich gratuliere den Autoren des Papiers, ich finde es sehr interessant. Die Massenzytometrie ist eine neuartige Technik und eine solche Arbeit für diejenigen Leser, die sich mit den meistzitierten Arbeiten aus der Praxis vertraut machen wollen. Ich empfehle wirklich, das Papier in seiner aktuellen Version zu drucken.

Die Autoren danken dem Gutachter für die positiven und ermutigenden Kommentare zu unserem Manuskript. Das Manuskript wurde geringfügig modifiziert, um den Empfehlungen der anderen Gutachter Rechnung zu tragen.


Charakterisierung der Interaktion zwischen DNA und GelRed-Fluoreszenzfarbe

Wir haben Einzelmoleküldehnungs- und dynamische Lichtstreuungsexperimente (DLS) durchgeführt, um die Interaktion zwischen dem DNA-Molekül und dem fluoreszierenden Farbstoff GelRed zu charakterisieren. Die Ergebnisse der Einzelmolekülstreckung zeigen, dass die Persistenzlänge von DNA-GelRed-Komplexen mit zunehmender Ligandenkonzentration bis zu einer kritischen Konzentration zunimmt und dann bei höheren Konzentrationen abnimmt. Andererseits nimmt die Konturlänge der Komplexe monoton als Funktion der GelRed-Konzentration zu, was darauf hindeutet, dass die Interkalation der Hauptbindungsmechanismus ist. Um die physikalische Chemie der Wechselwirkung zu charakterisieren, haben wir die McGhee-von-Hippel-Bindungsisotherme verwendet, um physikalisch-chemische Daten für die Wechselwirkung aus den Konturlängendaten zu extrahieren. Diese Analyse ermöglichte uns den Schluss, dass es sich bei der GelRed-Färbung tatsächlich um einen Bis-Interkalator handelt. Darüber hinaus wurden DLS-Experimente durchgeführt, um die Veränderungen der effektiven Größe der DNA-GelRed-Komplexe, gemessen als hydrodynamischer Radius, als Funktion der Ligandenkonzentration zu untersuchen. Wir beobachteten eine qualitative Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der beiden Techniken durch den Vergleich des Verhaltens des hydrodynamischen Radius und des Trägheitsradius, da letztere Größe als Funktion der mechanischen Eigenschaften, die aus den Dehnungsexperimenten bestimmt wurden, ausgedrückt werden kann.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


10.2: DNA visualisieren und charakterisieren - Biologie

Alle von MDPI veröffentlichten Artikel werden sofort weltweit unter einer Open-Access-Lizenz verfügbar gemacht. Für die Wiederverwendung des gesamten oder eines Teils des von MDPI veröffentlichten Artikels, einschließlich Abbildungen und Tabellen, ist keine besondere Genehmigung erforderlich. Bei Artikeln, die unter einer Open-Access-Creative Common CC BY-Lizenz veröffentlicht wurden, darf jeder Teil des Artikels ohne Genehmigung wiederverwendet werden, sofern der Originalartikel eindeutig zitiert wird.

Feature Papers stellen die fortschrittlichste Forschung mit erheblichem Potenzial für eine große Wirkung auf diesem Gebiet dar. Feature Papers werden auf individuelle Einladung oder Empfehlung der wissenschaftlichen Herausgeber eingereicht und vor der Veröffentlichung einem Peer Review unterzogen.

Das Feature Paper kann entweder ein origineller Forschungsartikel, eine umfangreiche neue Forschungsstudie sein, die oft mehrere Techniken oder Ansätze umfasst, oder ein umfassendes Übersichtspapier mit prägnanten und präzisen Updates zu den neuesten Fortschritten auf diesem Gebiet, das die aufregendsten Fortschritte in der Wissenschaft systematisch überprüft Literatur. Diese Art von Papier gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsrichtungen oder mögliche Anwendungen.

Editor’s Choice-Artikel basieren auf Empfehlungen der wissenschaftlichen Herausgeber von MDPI-Zeitschriften aus der ganzen Welt. Redakteure wählen eine kleine Anzahl kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichter Artikel aus, die ihrer Meinung nach für Autoren besonders interessant oder in diesem Bereich wichtig sind. Ziel ist es, eine Momentaufnahme einiger der spannendsten Arbeiten zu geben, die in den verschiedenen Forschungsbereichen der Zeitschrift veröffentlicht wurden.


Erweiterte Daten Abb. 1 Syntheseschema und Charakterisierungen von RSDTPs.

ein, Die Strukturen und Oligonukleotidsequenzen von 17-pN, 45-pN und 56-pN RSDTPs. B, Detaillierte chemische Schemata für die Synthese von RSDTPs. C, Repräsentative HPLC-Spuren von DNA-Strang I’, der mit einem Cy3B-Farbstoff modifiziert wurde (gekennzeichnet durch einen gestrichelten Rechteckrahmen.) (D) Analyse der Testprodukte durch 10 % denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Spur 1: Strang I'-Cy3B Spur 2: Strang I'-Cy3B-c(RGDfK) Spur 3: extralange einzelsträngige DNA (elssDNA, hervorgehoben durch a schwarzer Pfeil). Beachten Sie, dass die obige schwächere Bande ein Komplex ist, der aus einer kleinen Menge elssDNA und dem Matrizenstrang gebildet wird. Das Bild ist der Vertreter von mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten. e, Repräsentative Elektrospray-Ionisations-Massenspektren von elssDNA.

Erweiterte Daten Abb. 2 Schematische Diagramme der Zusammensetzung der Haarnadelspannungssonden zur Kalibrierung und experimentelle Methode von Einzelmolekül-Magnetpinzettenexperimenten.

ein, Die Geometrien und Zusammensetzungen der für die Kalibrierung verwendeten Kraftsonden. Alle Sonden, kombiniert mit einem komplementären Strang (blau) an ihrem 3'-Ende, wurden an den Biotin-modifizierten dsDNA-Griff ligiert. Bei der 56-pN-Sonde wird die durch ein Rechteck hervorgehobene Sequenz nur verwendet, um die gesamte Sondenlänge zu verlängern, ohne die mechanischen Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. B, Schematische Darstellung der Einzelmolekül-Magnetpinzetten-Experimente. Die Sonden werden durch ihre DNA-Griffe an der Streptavidin-beschichteten Glasoberfläche immobilisiert. Zum Entfalten der Sonde wurden durch Permanentmagnete Zugkräfte auf eine Streptavidin-beschichtete Magnetperle aufgebracht. C, Mechanische Stabilitätsmessungen für 56-pN-DNA-Sonde mit reversibler Scherung. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die 56-pN-Sonde nicht entfaltet, selbst wenn die Sonde länger als 10 Minuten geringeren Kräften (30–44 pN) ausgesetzt war, und das Entfaltungsereignis wird nur beobachtet, wenn die aufgebrachte Kraft über 50 pN ansteigt und dauerte mehr als zehn Sekunden.

Erweiterte Daten Abb. 3 Charakterisierung von AuNPs und RSDTPs funktionalisierten Oberflächenpräparationen.

a-b, Repräsentative TEM-Bilder von AuNPs (ein) und entsprechende Größenverteilungsprofile (B). C, UV-VIS-Spektren von 5 nm AuNPs. D, Schrittweise Verfahren zur Vorbereitung von RSDTPs funktionalisierten Oberflächen (siehe Online-Methoden). e, Das repräsentative AFM-Bild, das die räumliche Verteilung der auf einem Deckglas immobilisierten AuNPs zeigt.

Erweiterte Daten Abb. 4 Bestimmung der DNA-Sondendichte auf der Oberfläche von Au-Nanopartikeln.

Um die Oberflächendichte des DNA-Spannungssensors zu kalibrieren, verwendeten wir die von Wang und Ha et al. 23, um die Beziehung zwischen den Fluoreszenz-Graustufeneinheiten der Probe (mittlere Intensität) und der DNA-Sondendichte aufzuzeichnen. Zuerst inkubierten wir wässrige Lösungen, die 25 nM, 12,5 nM und 6,25 nM Cy3B-entfaltete DNA-Sonde enthielten (eine verwürfelte DNA-Haarnadelsonde, die mit einem komplementären Strang annealt, die Struktur wurde in ein) auf den AuNPs-modifizierten Deckgläsern für 30 Minuten, wusch dann die unbindenden Sonden ab und maß die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von Glas als Funktion der Inkubationskonzertation der Cy3B-entfalteten DNA-Sonde (B). Innerhalb dieses Konzentrationsbereichs besteht ein linearer Zusammenhang zwischen der mittleren Fluoreszenzintensität der Oberfläche und der DNA-Inkubationskonzentration (C). Durch Extrapolation sollte die Inkubation von 0,05 nM Cy3B-entfalteter DNA-Sonde auf der Oberfläche einer mittleren Fluoreszenzintensität von 14,4 entsprechen. wir fanden auch eine molekulare Dichte von 0,149 Molekülen/μm 2 auf der Oberfläche (0,05 nM) unter Verwendung eines Einzelmolekül-TIRF-Bildes (B). Zusammengenommen entsprechen 96,6 Einheiten der mittleren Fluoreszenzintensität auf der Cy3B-entfalteten DNA-Sondenoberfläche 1 Molekül/μm 2 . Angesichts der Tatsache, dass die durchschnittliche QE der Cy3B-gefalteten DNA-Sonde 98,3% beträgt (Abb. 1 im Haupttext), sollte die mittlere Fluoreszenzintensität von 1,6 Einheiten auf der mit RSDTP-Cy3B beschichteten Oberfläche 1 Molekül/μm 2 entsprechen. Wir konnten auch eine Kalibrierungskurve zwischen Intensität und molekularer Dichte für eine mit RSDTP (Cy3B) beschichtete Oberfläche zeichnen, wie in gezeigt D. Diese Kalibrierungskurve ermöglicht es uns, die Oberflächendichte von RSDTP (Cy3B) zu bestimmen, indem wir die durchschnittliche Intensität eines Deckglases messen. Zum Beispiel wurde die Moleküldichte der 45-pN-RSDTP-beschichteten Oberfläche auf 671 Moleküle/μm 2 geschätzt (e).

Erweiterte Daten Abb. 5 Bestimmung der Fluoreszenzlöschungseffizienz (QE) von RSDTPs auf einem Deckglas.

ein, Schätzen Sie den Abstand zwischen der AuNP-Oberfläche und den Fluorophoren auf sich mechanisch entfaltenden RSDTPs mit unterschiedlichen Bruchkräften ab, indem Sie eine Konturlänge von 0.44 nm pro nt annehmen. B, Auftragung der Löscheffizienz als Funktion des Abstands vom Fluorophor zu AuNPs mit Durchmessern von 5 nm und 10 nm basierend auf dem NSET-Modell (Ergänzende Anmerkung 2). Die Ergebnisse der Quenching Efficiency (QE)-Distanzsimulation legten nahe, dass der Effekt von 5 nm AuNP auf das Cy3B-Fluorophor über eine Distanz von 20 nm hinaus vernachlässigbar ist. C, Schematische Darstellung der Messung der Fluoreszenzlöschungseffizienz von RSDTPs auf einer festen Oberfläche. Um die gefalteten und ungefalteten Zustände verschiedener RSDTPs nachzuahmen, hybridisieren wir komplementäre DNA-Stränge (vorgewärmt auf 95 °C) unterschiedlicher Länge zu einer verschlüsselten Haarnadelsonde (Sequenzen in e). Die QE-Werte werden durch Messung der Fluoreszenzintensitäten vor und nach Zugabe komplementärer Stränge berechnet. D, Ein Beispiel für QE-Messung. Der QE-Wert von 17-pN-RSDTP wurde zu 97,3% berechnet, indem das Ausleserauschen von EMCCD, Oberflächenfluoreszenzintensitäten vor und nach Zugabe von komplementären Strängen gemessen wurden. e, Tabelle, die die Sequenzen der in diesem Assay verwendeten DNA auflistet.

Erweiterte Daten Abb. 6 Kontrollexperimente bestätigten die Zuverlässigkeit und Reversibilität der Zugsonden.

ein, Vergleich von DIC-Bildern für auf Sensoren plattierte Zellen mit und ohne RGD-Peptid. Auf Oberflächen, die mit Sensoren ohne RGD-Peptid beschichtet waren, wurde keine Zellanhaftung gefunden, was darauf hindeutet, dass das Spannungssignal speziell durch RGD-Integrin-Wechselwirkungen erzeugt wird. B, Repräsentative DIC-Bilder von NIH 3T3-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten auf Spannungssonden und Fibronektin-beschichteten Deckgläsern ausgesät wurden. C, Ein 45-pN-RSDTP, dem das Quencher-Oligonukleotid fehlt, wurde verwendet, um die Stabilität und Reversibilität von Spannungssonden weiter zu validieren. Die Bilder zeigen, dass der fluoreszierende Hintergrund der Oberfläche, der das Quencher-Oligonukleotid fehlt, dreimal höher ist als die einer Oberfläche mit der Quencher-Strang-DNA. Trotz des hohen Fluoreszenzhintergrunds dieser Oberflächen können wir auf diesen Oberflächen immer noch ein Spannungssignal während der Zellausbreitung nachweisen, da Au-NP hier einen zweiten Quencher spielt. Nach der Behandlung von Zellen mit Cyto D stellten wir fest, dass die Spannungssignale sofort verschwanden und keine dunklen Merkmale hinterließen, die oft verwendet werden, um die Stabilität von Spannungssonden auf der Oberfläche zu bestimmen 18 . Die Fluoreszenzprofile entlang der gelben Linien in den Bildern werden auch im rechten Feld angezeigt.

Erweiterte Daten Abb. 7 Weitere Bestätigung des Kraftgradienten innerhalb von FA und der Beziehung zwischen FA-Langlebigkeit und mechanischen Hotspots.

ein, Repräsentative 17-pN (Atto647N), 56-pN (Cy3B) und die Überlagerungsspannungsbilder für eine einzelne NIH/3T3-Zellen, ausgewählt aus 2 unabhängigen Replikaten, die sich auf einem Deckglas ausbreiten, das mit Multiplex-RSDTPs codiert ist. B, Repräsentatives 56-pN-Spannungsbild zusammen mit GFP-Paxillin einer 3T3-Zelle, ausgewählt aus 4 unabhängigen Replikaten. Die Kontur von GFP-Paxillin wurde mit einem Spannungssignal überlagert. C, Vergrößerte Zeitrafferbilder aus dem gelb umrandeten Bereich in B zeigen, dass Adhäsionsstrukturen, die schwache Kräfte tragen, einem schnellen Demontageprozess unterzogen werden. D, Langlebigkeit von schwachen und starken Adhäsionen. Das Kästchen stellt das 25. und 75. Perzentil dar, der Median wird durch die mittlere horizontale Linie gekennzeichnet, wobei der Mittelwert über jedem Kästchen beschriftet ist und die Whiskers den 1,5-fachen Interquartilabstand darstellen. n = 49 für schwache Adhäsionen (Strukturen ohne 56-pN-Signal) und n = 34 für starke Adhäsionen (Strukturen mit 56-pN-Signal) in der Zelle von B. Zweischwänzig, Student's T-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu messen, und P-Werte werden in der Grafik angezeigt.

Erweiterte Daten Abb. 8 Testen der Zuverlässigkeit photospaltbarer RSDTPs.

ein, Repräsentative RICM- und Spannungsbilder vor und nach UV-Belichtung (Zeit=30 s, UV-Licht wird mit periodischer Beleuchtung betrieben, Leistungsdichte = 1.3 × 10 -4 μW/μm 2 ) für Zellen, die auf verschiedenen photospaltbaren RSDTPs-beschichteten Oberflächen aussäen. Nach der Spaltung der Sondenschleife zeigte die Zelle eine schnelle Kontraktion auf photospaltbarem 17-pN-RSDTP und langsame Kontraktion auf photospaltbarem 56-pN-RSDTP, was darauf hindeutet, dass die RSDTP auf eine TGT-ähnliche Sonde umgestellt wurde. Die Bilder waren repräsentativ für mindestens 2 unabhängige Replikate. B, FA-Dynamik von GFP-Paxillin exprimierenden 3T3-Zellen, die auf 56-pN-RSDTP-, 56-pN-TGT- und 56-pN-photospaltbarer RSDTP-beschichteter Oberfläche als Reaktion auf UV-Beleuchtung ausgesät wurden. Gleiche Beleuchtungsbedingung wie in ein wurden hier verwendet. Es wurde keine signifikante Wirkung auf Zellen beobachtet, die auf mit 56-pN-RSDTPs und 56-pN-TGT-Sonden beschichteten Oberflächen ausgesät wurden. Die Bilder waren repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Replikate.

Erweiterte Daten Abb. 9 Bilder der Myosin-unabhängigen Integrinkraft.

ein, Spannungsbilder von mit Blebbistatin vorbehandelten Zellen, die an RSDTPs mit unterschiedlichen Bruchkräften haften. NIH 3T3-Zellen wurden mit 10 &mgr;M Blebbistatin für 30 Minuten vorbehandelt und dann auf die Deckgläser ausgesät. Die Bilder waren repräsentativ für 3 unabhängige Replikate. B, Repräsentative 45-pN-Spannungsbilder einer Y-27632 vorbehandelten NIH 3T3-Zelle, ausgewählt aus 2 unabhängigen Replikaten vor und nach Zugabe von Cytochalasin D. C, Co-Lokalisierung des Integrin-Spannungssignals mit GFP-Paxillin und GFP-Actin in 3T3-Zellen, die mit Y27632 auf einer 45-pN-RSDTP-beschichteten Oberfläche behandelt wurden. Es wurden Bilder von RICM (grau), GFP (grün), Spannung (rot) und Überlagerungskanälen gezeigt. Das Linienscan-Analysediagramm der mit gestrichelten weißen Pfeilen in den Überlagerungsbildern hervorgehobenen Region zeigt die Co-Lokalisierung der Spannung mit GFP-Paxillin und GFP-Aktin. Die Bilder waren repräsentativ für 3 unabhängige Replikate. DRepräsentative 33-pN-Spannungsbilder einer Y-27632 vorbehandelten NIH 3T3-Zelle, ausgewählt aus 3 unabhängigen biologischen Replikaten vor und nach Zugabe von 100 mM Saccharose. Das rechte Feld zeigt die Änderung des Spannungssignals der dünnen Kante vor und nach einer hypertonischen Behandlung, n=9 Zellen.

Erweiterte Daten Abb. 10 Einzelmolekül-Untereinheitszählung der krafttragenden Integrine an dünnen Kanten von mit Y27632 vorbehandelten NIH 3T3-Zellen.

ein, Links, ein repräsentatives Spannungsbild (45-pN RSDTP) einer einzelnen lebenden Zelle, die mit Y27632 behandelt wurde und punktförmige fluoreszierende Punkte zeigt. Rechts, repräsentative Intensitätsspuren unter kontinuierlicher Anregung, die ausreicht, um ein Ausbleichen der Fluorophore zu bewirken, von vier Clustern, die durch gelbe Pfeile im Spannungsbild gekennzeichnet sind. Unten Histogramm und Gaußscher Fit der Fluoreszenzintensitäten für die Bleichschritte in den Spuren (n = 39 Schritte ab Zelle 1). B, Zusätzliche Daten wurden an zwei fixierten Zellen durchgeführt und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten. (n = 38 Schritte für Zelle 2 n = 36 Schritte für Zelle 3).


Zugangsoptionen

Erhalten Sie vollen Zugriff auf Zeitschriften für 1 Jahr

Alle Preise sind Nettopreise.
Die Mehrwertsteuer wird später an der Kasse hinzugefügt.
Die Steuerberechnung wird während des Bezahlvorgangs abgeschlossen.

Erhalten Sie zeitlich begrenzten oder vollständigen Artikelzugriff auf ReadCube.

Alle Preise sind Nettopreise.


10.2: DNA visualisieren und charakterisieren - Biologie

Alle von MDPI veröffentlichten Artikel werden sofort weltweit unter einer Open-Access-Lizenz verfügbar gemacht. Für die Wiederverwendung des gesamten oder eines Teils des von MDPI veröffentlichten Artikels, einschließlich Abbildungen und Tabellen, ist keine besondere Genehmigung erforderlich. Bei Artikeln, die unter einer Open-Access-Creative Common CC BY-Lizenz veröffentlicht wurden, darf jeder Teil des Artikels ohne Genehmigung wiederverwendet werden, sofern der Originalartikel eindeutig zitiert wird.

Feature Papers stellen die fortschrittlichste Forschung mit erheblichem Potenzial für eine große Wirkung auf diesem Gebiet dar. Feature Papers werden auf individuelle Einladung oder Empfehlung der wissenschaftlichen Herausgeber eingereicht und vor der Veröffentlichung einem Peer Review unterzogen.

Das Feature Paper kann entweder ein origineller Forschungsartikel, eine umfangreiche neue Forschungsstudie sein, die oft mehrere Techniken oder Ansätze umfasst, oder ein umfassendes Übersichtspapier mit prägnanten und präzisen Updates zu den neuesten Fortschritten auf diesem Gebiet, das die aufregendsten Fortschritte in der Wissenschaft systematisch überprüft Literatur. Diese Art von Papier gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsrichtungen oder mögliche Anwendungen.

Editor’s Choice-Artikel basieren auf Empfehlungen der wissenschaftlichen Herausgeber von MDPI-Zeitschriften aus der ganzen Welt. Redakteure wählen eine kleine Anzahl kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichter Artikel aus, die ihrer Meinung nach für Autoren besonders interessant oder in diesem Bereich wichtig sind. Ziel ist es, eine Momentaufnahme einiger der spannendsten Arbeiten zu geben, die in den verschiedenen Forschungsbereichen der Zeitschrift veröffentlicht wurden.


Jacqueline Barlow

Eine genaue Zellteilung erfordert eine vollständige Duplizierung der nuklearen DNA, die der Tochterzelle eine genaue Kopie der kodierten Genominformation zur Verfügung stellt. Für eine getreue Replikation müssen die Replikationsphasen Initiation, Elongation und Termination koordiniert werden, um die Kern-DNA nur einmal pro Zellzyklus zu kopieren. Eine zuverlässige Replikation muss auch epigenetische Komponenten höherer Ordnung des Chromatins beibehalten, die transkriptionale Regulation, dreidimensionale Organisation und Zellidentität verleihen.

DNA-Schäden können als Folge von Replikationsstress auftreten, ein Phänomen, das eine Vielzahl von Bedingungen umfasst, die zum Abwürgen oder Zusammenbruch der Replikationsgabel führen. Replikationsdefekte können zu DNA-Schäden führen und eine unsachgemäße Reparatur kann zu vererbbaren Mutationen führen – einschließlich Punktmutationen, Deletion oder Duplikationsereignissen oder chromosomalen Translokationen – die alle Kennzeichen von Krebs sind. Die DNA-Replikation beginnt mit der koordinierten Assoziation von über 100 Proteinen an die DNA an Startpunkten – den sogenannten Ursprüngen – an Zehntausenden unterschiedlicher genomischer Stellen bei Säugetieren. Der Kollaps der Replikationsgabel führt zu einem Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA, der an der homologen Rekombination (HR) beteiligte Proteine ​​für die Reparatur der Läsion und den anschließenden Neustart der Gabel benötigt. Durch die Untersuchung der HR-Proteinrekrutierung mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-Seq) identifizierten wir genomische Loci, die mit mehreren DNA-Replikations- und Reparaturfaktoren als Reaktion auf das Replikationsgift Hydroxyharnstoff (HU) assoziiert sind, und bezeichneten diese Regionen als frühe Replikation fragile Websites oder ERFS.

Das Barlow-Labor verwendet eine Kombination aus Molekularbiologie, Mikroskopie und genomweiten Sequenzierungstechniken, um die molekularen und genetischen Faktoren zu untersuchen, die DNA-Schäden und Genominstabilität replizierender Zellen prädisponieren, wobei das Immunsystem der Maus als unser Modell verwendet wird. Aktivierte B-Lymphozyten können eine Verdopplungszeit von nur 8 Stunden aufweisen, was darauf hindeutet, dass diese schnell proliferierenden Zellen besonders anfällig für Replikationsstress sind und zur Lymphomogenese beitragen können.

Gruppenzugehörigkeiten

  • Biochemie, Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie
  • Integrative Genetik und Genomik

Spezialitäten / Schwerpunkte

  • Krebsbiologie
  • Chromosomenbiologie
  • Chromosomendynamik und Kernfunktion
  • Computerbiologie
  • DNA-Reparatur
  • Epigenomik
  • Genetik von Modellorganismen
  • Molekulare Genetik

Kurse

Ehren und Auszeichnungen

  • 2008 Samuel W. Rover und Lewis Rover Award für Genetik und Entwicklung, Columbia University
  • 2013 NIH Fellows Award for Research Excellence
  • 2014 National Institutes of Health Career Development Award

Abschlüsse

  • 2000 BA Biologie Reisuniversität
  • 2008 PhD Genetik und Entwicklung Columbia University

Veröffentlichungen

Waisertreiger I, Popovich K, Block M, Anderson KR und Barlow JH. Die Visualisierung des ortsspezifischen Schwesterchromatidaustauschs zeigt unterschiedliche Muster des durch Replikationsstress induzierten Bruchs von fragilen Stellen. Onkogen. 39(6): 1260-1272. 2020.

Lopes-Contreras, A. J., Specks, J., Barlow, J. H., Ambrogio, C., Desler, C., Vikinsson, S., Rodrigo-Perez, S., Green, H., Rasmussen, L. J., Murga, M. , Nussenzweig, A. und Fernandez-Capetillo, O. Erhöhte Rrm2-Dosierung reduziert das Aufbrechen der fragilen Stelle und verlängert das Überleben von ATR-Mutantenmäusen. Gene Dev. 29(7):690-5. 2015.

Barlow, J. H. und Nussenzweig, A. Replikationsinitiation und Genominstabilität: eine Kreuzung für die DNA- und RNA-Synthese. Cell Mol Life Sci. 71 (23): 4545-59. 2014.


Adduktomik: Charakterisierung von Expositionen gegenüber reaktiven Elektrophilen

Um die Umweltursachen von Krankheiten zu verstehen, sind unvoreingenommene Methoden zur Charakterisierung des menschlichen Exposoms erforderlich, das alle Giftstoffe darstellt, denen Menschen sowohl aus exogenen als auch aus endogenen Quellen ausgesetzt sind. Da sie DNA und wichtige Proteine ​​direkt modifizieren, sind reaktive Elektrophile wahrscheinlich die wichtigsten Bestandteile des Exposoms. Expositionen gegenüber reaktiven Elektrophilen können durch Messung von Addukten aus Reaktionen zwischen zirkulierenden Elektrophilen und Blutnukleophilen charakterisiert werden. Wir definieren ein „Adduktom“ als die Gesamtheit solcher Addukte mit einem bestimmten nukleophilen Ziel. Wegen ihrer größeren Häufigkeit und Verweildauer im menschlichen Blut sind Addukte von Hämoglobin (Hb) und menschlichem Serumalbumin (HSA) denen von DNA und Glutathion zur Charakterisierung von Adduktomen vorzuziehen. Tatsächlich bietet der nukleophile Hotspot, der durch die einzige freie Sulfhydrylgruppe in HSA (HSA-Cys(34)) repräsentiert wird, besondere Vorteile für adduktomische Experimente. Obwohl gezielte Addukte von HSA-Cys(34) seit Jahrzehnten beobachtet werden, wurde erst vor kurzem über eine unvoreingenommene Methode zur Visualisierung des HSA-Cys(34)-„Subadduktoms“ berichtet. Das Verfahren beruht auf einer neuartigen Massenspektrometrie-Anwendung, die als Fixed-Step-Selected-Reaction-Monitoring (FS-SRM) bezeichnet wird, um Cys(34)-Addukte in tryptischen Verdauen von HSA zu profilieren. Hier überprüfen wir selektiv die Literatur bezüglich des Potenzials der Adduktomik, das menschliche Exposom teilweise aufzuklären, mit besonderem Augenmerk auf das HSA-Cys(34)-Subadduktom.

Copyright © 2011 Elsevier Ireland Ltd. Alle Rechte vorbehalten.

Figuren

Konzentrationen von HSA-Addukten von Benzoloxid (BO-Alb) und 1,4-Benzochinon (1,4-BQ-Alb) im Vergleich zur Exposition…

Der Mensch ist reaktiven…

Menschen sind reaktiven und potenziell toxischen Elektrophilen sowohl von exogenen als auch…

Schema zur Profilierung von HSA-Cys 34…

Schema zur Profilierung von HSA-Cys 34-Addukten (Li et al., 2011). Thiol-affine Harze sind…

HSA-Cys 34-Addukte nachgewiesen in…

HSA-Cys 34-Addukte in archiviertem HSA von Probanden, stratifiziert nach Rasse, Geschlecht...


10.2: DNA visualisieren und charakterisieren - Biologie

Der Zellzyklus ist der Prozess, durch den unsere Zellen auf sorgfältig orchestrierte und kontrollierte Weise wachsen und sich teilen. Ein unkontrollierter Zellzyklus ist ein grundlegendes Kennzeichen von Krebs, bei dem übermäßiges Zellwachstum zu negativen Auswirkungen auf Gewebe- und Organebene führt. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist für die Zerstörung unerwünschter Proteine ​​in der Zelle verantwortlich, aber es wurde auch identifiziert, dass es regulatorische Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen übernimmt. Ziel dieser Arbeit war es, den Zellzyklus und das Ubiquitin-Proteasom-System mit Hochdurchsatz- und High-Content-Ansätzen zu untersuchen.

Der erste Ansatz zielte darauf ab, die endogenen Fluktuationen von mRNA, Proteinen, Phosphorylierungen und intrazellulärer Kompartimentierung während des Zellzyklus zu beobachten und wie diese Systeme während des Zellzyklus reguliert und koordiniert werden, beschrieben in Studie I und II. Neben der Charakterisierung von Zellzyklus-Oszillationsmustern von Transkripten, Proteinen, Phosphorylierungsereignissen und subzellulären Lokalisationsänderungen wurde die Dynamik zwischen transkriptionaler und proteomischer Regulation durch den Vergleich von Oszillationsmustern entsprechender mRNA- und Proteinpaare weiter untersucht.

Der zweite Ansatz zielte darauf ab, zu untersuchen, wie eine der größten Enzymfamilien im menschlichen Proteom, das UPS, den Zellzyklus und die Reaktionen auf externe und intrinsische DNA-Schäden beeinflusst. Dies geschah durch eine phänotypische Charakterisierung, nachdem die Gene der Familie in einer High-Content-Imaging-Studie, Studie III, stummgeschaltet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass viele neue UPS-Gene für das richtige Fortschreiten durch den Zellzyklus und die Aufrechterhaltung der DNA-Integrität unerlässlich sind. Durch die Kombination mehrerer Reportersysteme in einer High-Content-Studie konnten Korrelationen zwischen Zellzyklus, Lebensfähigkeit und DNA-Schadensreaktions-Phänotypen durchgeführt werden. Dies zeigte eine erhöhte Tendenz zu G1/S-Phasen-Zellzyklusarresten nach Anzeichen spontaner DNA-Schäden und eine Anreicherung für G2-Zellzyklusarreste nach Versagen der 53bp1-Rekrutierung zu Doppelstrangbrüchen.

Neben der Bereitstellung von Datenressourcen und systembiologischen Ergebnissen zur Interaktion zwischen verschiedenen zellulären Prozessen identifizierten die Studien auch spezifische Gene und Proteine ​​mit neuen Rollen in diesen grundlegenden zellulären Prozessen. In Studie II wurde entdeckt, dass das Methyltransferase-Protein MAT2A die subzelluläre Lokalisation synchron mit dem Zellzyklus verändert, was möglich ist, um die höhere Quelle von Methylgruppen bereitzustellen, die während der S-Phase und G2-Phase benötigt werden. In Studie IV wurden die E3-Ubiquitin-Ligasen ARIH1 und ARIH2 auf Auswirkungen auf die Proliferation und das Wachstum von Glioblastoma multiforme untersucht. Die High-Content-Studie III identifizierte viele neue UPS-Gene mit einer Vielzahl von Phänotypen für Zellzyklus und DNA-Schäden, darunter den E3-Ubiquitin-Adapter BTBD1. Die Stilllegung von BTBD1 führte zu dramatischen Phänotypen des Zellzyklus und der Reaktion auf DNA-Schäden, und BTBD1 wurde weiter charakterisiert und als essentiell für die ordnungsgemäße Funktion der DNA-Topoisomerase TOP1 identifiziert.

Während dieser Projekte wurden zur Validierung neuer Erkenntnisse Methoden zur Kontrolle spezifischer Genexpressionsniveaus entwickelt, die shRNA und CRISPR/Cas9-vermitteltes Silencing sowie eine flexible Methode der Überexpression verwenden. Diese Systeme werden in Studie IV beschrieben.

Die vorgestellten Studien kombinieren High-Content- und High-Throughput-Ansätze mit neuartigen Visualisierungs- und Analysemethoden, um Informationen aus komplexen Daten zu destillieren, um sowohl Wechselwirkungen zwischen mRNA, Proteinen und Funktion zusammenzufassen, als auch um neue Regulatoren basaler zellulärer Prozesse zu identifizieren.


Schau das Video: Genetik: Warum sehen wir so aus, wie wir aussehen? (Juni 2022).


Bemerkungen:

  1. Voodoot

    Stimme ihr voll und ganz zu. In diesem Nichts gibt es eine gute Idee. Bereit, Sie zu unterstützen.

  2. Efrem

    wunderbar, sehr nützliches Stück

  3. Cecilius

    Es ist unmöglich.

  4. Shaktizil

    Ich denke, du hast nicht Recht. Ich bin sicher. Ich lade Sie zum Diskutieren ein.

  5. Maunfeld

    Ich würde nichts sagen, na ja, nicht alles im Allgemeinen, nicht schlecht

  6. Pekka

    Ich stimme zu, es ist der lustige Satz



Eine Nachricht schreiben