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Was ist das Prinzip der Verwendung von DMS (Dimethylsulfat) für die Strukturanalyse von rRNA?

Was ist das Prinzip der Verwendung von DMS (Dimethylsulfat) für die Strukturanalyse von rRNA?


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Ich möchte die Sekundärstruktur von rRNA (PTC) an einer bestimmten Position mit Hilfe von DMS-Footprinting überprüfen. Ich habe das modifizierte Nukleotid (m5c), das im PTC vorhanden ist, deletiert und es hilft bei der ribosomalen strukturellen Stabilität. Ich bin daran interessiert, nach der Deletion des modifizierten Nukleotids zu wissen.

Ich verwende DMS-behandelte RNA mit Primer-Extension. Ich verstehe das Grundprinzip der Reaktion von DMS auf RNA nicht. kannst du mir bitte erklären.

Ich habe diesen Artikel als Referenz verwendet:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2701642/


Hier ist eine gute Erklärung der Theorie und Chemie hinter dem DMS-Footprinting aus Kapitel 11 von Untersuchung der RNA-Struktur in lebenden Zellen :

In vivo chemischer Sondierungsassay unter Verwendung von Dimethylsulfat (DMS). (A) DMS methyliert das N1-Atom von Adenosinen und das N3-Atom von Cytosinen. Beide dieser Positionen befinden sich auf der Watson-Crick-Seite der jeweiligen Nukleotide. (B) Schema einer strukturierten RNA, die mit einem Proteinliganden interagiert, um beispielhaft Reste darzustellen, die einer DMS-Modifikation zugänglich sind. (C) Kartierung der modifizierten Positionen durch reverse Transkription. Das Enzym beendet die Verlängerung aufgrund sterischer Hinderung durch die sperrige Methylgruppe an der Watson-Crick-Seite von A und Cs. (D) Der Pool von cDNAs wird auf einem Standard-Denaturierungsgel aufgetrennt. A und C bezeichnen die Sequenzierungsspuren, die wesentlich sind, um die modifizierten Positionen abzubilden. Darüber hinaus ist eine RT-Kontrolle, die aus aus unbehandelten Zellen extrahierter RNA hergestellt wird, unerlässlich, um eventuelle natürliche Stopps der RT (Spur –) zu bestimmen. Ein Vergleich der RT-Kontrollspur mit dem cDNA-Pool, der aus DMS-modifizierter RNA (Spur +) erzeugt wurde, zeigt Modifikationsstellen. Beachten Sie, dass die aus einer DMS-Modifikation resultierende Bande ein Nukleotid schneller wandert als die entsprechende Bande in der Sequenzierungsspur, da das ddNTP in die entstehende cDNA eingebaut wird, während die Methylgruppe zu einem Stopp einen Rest vor der Modifikation führt.

Meine Meinung – DMS fügt eine Methylgruppe an der Wasserstoffbrückenbindungsfläche des exponierten hinzu EIN und C Basen. EINs und Cs entweder durch Proteine ​​oder Basenpaarungswechselwirkungen geschützt sind nicht methyliert. Methylierte Basen hemmen die reverse Transkriptase, was zu einem verkürzten DNA-Produkt führt, das auf einem Gel sichtbar gemacht werden kann. Der Vergleich mit einer unbehandelten Kontrolle lässt Rückschlüsse auf welche EINs und Cs der RNA-Sequenz exponiert und geschützt sind, woraus auf die native RNA-Konformation geschlossen werden kann (oder die Möglichkeiten stark eingeschränkt sind).


Schau das Video: THE REASTI PRINZIP (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Aethelwulf

    Klingt verlockend

  2. Durrell

    Es scheint mir eine großartige Idee zu sein

  3. Gryfflet

    Sie haben einen neugierigen Verstand :)

  4. Arashilkree

    Sie liegen falsch. Ich schlage vor, darüber zu diskutieren. Schreiben Sie mir in PM, sprechen Sie.

  5. Chu'a

    Ich denke, er ist falsch. Schreiben Sie mir in PM.



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