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Wie töten Caspase-Proteine ​​eine Zelle?

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Wikipedia sagt nur…

Die aktiven Effektorcaspasen bauen dann proteolytisch einen Wirt intrazellulärer Proteine ​​ab, um das Zelltodprogramm durchzuführen.

Okay, aber welche Teile der Zelle spalten sie auf? Und was passiert mit den restlichen internen Komponenten der Zellen, insbesondere den Teilen, die nicht aufgespalten werden?


Caspase tötet die Zelle nicht direkt ab, sondern aktiviert einen Prozess, der als . bekannt ist Apoptoseoder programmierter Zelltod. Die programmiert Teil ist dazu da, ihn von anderen Arten des Zelltods zu unterscheiden, wie z Nekrose, die eher unspezifische Todesprozesse sind.

Um auf Caspasen zurückzukommen, handelt es sich um eine Reihe von Proteasen, die als Reaktion auf ein pro-apoptotisches Signal in Kaskade aktiviert werden können.

Der Einfachheit halber wird das pro-apoptotische Signal zuerst aktiviert Initiator-Kaspasen, wie Caspase 8, 9, 10 (plus eine Reihe anderer Proteine).

Diese wiederum spalten andere Effektor-Kaspasen, die diejenigen sind, die dies effektiv tun Schmutzige Arbeit: Caspase 3, 6 und 7.

Jetzt passieren viele Dinge gleichzeitig (sehen Sie sich dieses PDF von AbCam an, um sich ein Bild von der Komplexität des Systems zu machen).

Auf nuklearer Ebene haben Sie zum Beispiel:

  • Aktivierung von DNA-spaltenden Enzymen wie CAD (Caspase-aktivierbare DNAse), die normalerweise inaktiv ist, aufgrund der Bindung an ihren Inhibitor I-CAD. Letzteres ist ein Ziel von Effektorcaspasen und sein Abbau führt dazu, dass CAD in den Zellkern gelangt und die Fragmentierung der DNA beginnt.

  • Spaltung von PARP (Poly(ADP-ribose)-Polymerase), einem nuklearen Enzym, das am Auffinden und Reparieren von DNA-Einzelstrangbrüchen beteiligt ist.

  • Spaltung von Laminen (durch Effektorcaspasen + andere Proteasen), Proteinen, die für die Bildung der Kernlamina wichtig sind, und Stabilität des Zellkerns

  • Spaltung von U1, einem nuklearen Protein, das für die Verarbeitung von mRNA notwendig ist.

Auch auf der Ebene der Mitochondrien passieren sehr komplexe Ereignisse: Hier haben Sie eine Reihe von Proteinen, die zur Bcl-2-Familie gehören, die die Apoptose hauptsächlich durch die Regulierung des Ca2+-Spiegels in der Zelle steuern. Es gibt 25 Mitglieder dieser Familie, die in zwei "Seiten" unterteilt werden können: pro-apoptotische Proteine ​​wie Bax, Bak und BAD und anti-apoptotische Proteine ​​wie Bcl-2, Bcl-xL und Bcl-w.

Die Funktionsweise der Blc-2-Proteine ​​ist sehr komplex und ich bin nicht auf dem neuesten Stand der Literatur, aber um es zu vereinfachen, passiert im Wesentlichen, dass wenn das Gleichgewicht zwischen anti-apoptotischen und pro-apoptotischen Proteinen in Richtung pro verschoben wird -, Es gibt:

  • Freisetzung von Cytochrom c aus den Mytochondrien in das Cytoplasma, das Effektorcaspasen aktivieren kann.
  • Induktion von MPTPs (Mitochondrial Permeability Transition Pores), Proteinen, die die mitochondriale Permeabilität erhöhen, was alle möglichen Probleme verursacht und schließlich zu einer Schwellung der Mitochondrien und zum Verlust ihrer Funktion führt

Verschiedene Ereignisse führen auch zu einer Erhöhung der zytoplasmatischen Calciumkonzentration, die beispielsweise die Aktivität von Calcium-aktivierter Endonuklease oder anderen pro-apoptotischen Calcium-abhängigen Proteinen induzieren kann.

Dies ist bei weitem keine erschöpfende Liste dessen, was passiert, aber es gibt Ihnen eine Vorstellung von der Komplexität des Systems.


Apoptose oder Nekroptose? Das Caspase-8-Protein entscheidet

Doug Green, PhD, links, und Bart Tummers, PhD, schreiben über ein Protein, das das Schicksal von Zellen bestimmt.

Ein Vermittler des Zelltods

Zellen töten sich die ganze Zeit absichtlich selbst. Dies ist normalerweise eine gute Sache, da es kranke oder unnötige Zellen aus dem Körper entfernt und Krankheiten vermeiden hilft.

Aber der Zelltod ist kein einfaches Ereignis. Viele Auslöser können es verursachen, darunter Stress, Infektionen und krebsvorbeugende Signale. Und es gibt verschiedene Möglichkeiten für Zellen zu sterben. Übermäßiger Schaden kann eine Zelle töten, aber Zellen können auch von selbst entscheiden, zu sterben. Dies wird durch Signale von innen oder außen stimuliert und wird durch ausgeklügelte molekulare Mechanismen reguliert, der Tod ist „programmiert“. Infektionen und pro-Krebs-Signale produzieren extrinsische Faktoren, die zwei Arten des programmierten Zelltods auslösen können: Apoptose und Nekroptose. Ob und wie diese extrinsischen Faktoren die Zelle töten, hängt von einem komplizierten Wechselspiel zwischen molekularen Ereignissen ab.

Caspase-8: Henker, Beschützer

Einer der zentralen Entscheidungsträger ist das Protein Caspase-8. Caspase-8 erhält die Fähigkeit, andere Proteine ​​zu spalten, wenn die Zelle durch extrinsische Signale aktiviert wird. Es verarbeitet dann ein Zelltod-Henker-Protein namens Caspase-3, und die Zelle stirbt durch Apoptose.

Caspase-8 kann jedoch auch Zellen vor dem Tod schützen. Dafür ist es auf die Expression des Proteins cFLIPL angewiesen. Komplizierterweise wird die cFLIPL-Expression durch die gleichen extrazellulären Signale induziert, die den Tod steuern. Exprimiertes cFLIPL stoppt die Fähigkeit von Caspase-8, Apoptose zu induzieren und die Zelle lebt. Die extrazellulären Signale induzieren eine dritte Ereignisaktivierung der Proteine ​​RIPK1, RIPK3 und MLKL. Dies führt zum Tod der Zelle durch Nekroptose.

Zellen, die durch Apoptose-"bleb" sterben, kurz bevor sie sterben.

Zellen, die durch Nekroptose sterben, werden zusammengetrieben und "platzen" und geben ihren Inhalt in das umgebende Milieu frei.

cFLIPL leitet Caspase-8 an, RIPK1 und RIPK3 zu spalten, und dies stoppt die Nekroptose. Die Expression von cFLIPL schützt somit die Zelle sowohl vor dem apoptotischen als auch vor dem nekroptotischen Zelltod und ermöglicht gleichzeitig die Expression von entzündungsauslösenden Faktoren.

Zellen, die durch Apoptose absterben, „blebben“, kurz bevor sie sterben.

Zellen, die durch Nekroptose absterben, runden sich auf und „platzen“ und geben ihren Inhalt in das umgebende Milieu ab.

Was hängt auf der Waage?

Die gewählte Todesart kann große Auswirkungen auf die Immunantwort des Körpers auf Krebs und entzündliche Erkrankungen haben. Apoptose ist im Allgemeinen ein stiller Modus des Zelltods, die umliegenden Zellen oder das Immunsystem werden nicht alarmiert. Aber nekroptotische Zellen können umliegende Zellen alarmieren und dies kann zu massiven Entzündungen führen.

Warum haben Zellen dieses Gleichgewicht? Warum sind cFLIPL und Caspase-8 wichtig? Einige Krankheitserreger können die Expression von cFLIPL stören. Dadurch kann Caspase-8 aktiviert werden und die Zelle stirbt durch Apoptose. Andere Erreger stören die Funktion von Caspase-8. Caspase-8 kann dann RIPK1 und RIPK3 nicht mehr blockieren und das Gleichgewicht kippt in Richtung Nekroptose. Dies tötet die infizierte Zelle ab, nimmt dem Erreger die „Heimat“ weg, warnt umliegende Zellen und stimuliert die Anziehung von Immunzellen, die die Abwehr gegen den Erreger bilden können. So weit, ist es gut. Aber was passiert, wenn Krankheitserreger in die Nekroptose eingreifen? Bleibt der Körper dann infiziert? Zum Glück nicht.

Zellen haben andere Möglichkeiten, dem Immunsystem zu signalisieren, dass eine Infektion vorliegt. Und das Immunsystem wird die Infektion beseitigen. Wenn Krebse jedoch die Expression von RIPK3 eliminieren, sind sie auch vor Nekroptose geschützt. Immunzellen sind darauf trainiert, körpereigene Zellen nicht anzugreifen, sodass Krebszellen nicht vom Immunsystem beseitigt werden. Viele Krebsarten verwenden diese Strategie zur Reduzierung der RIPK3-Expression, um der Nekroptose zu entgehen. Eine Option könnte darin bestehen, die Expression von cFLIPL zu hemmen, sodass die Krebszellen durch Apoptose absterben könnten. Leider hat dies starke Nebenwirkungen, da auch gesunde Zellen betroffen sind. Daher müssen andere Strategien entwickelt werden. Und dies erfordert ein noch tieferes Verständnis davon, wie diese komplizierten molekularen Mechanismen reguliert werden. Die Identifizierung anderer Moleküle, Wechselwirkungen oder Therapien kann zu einer innovativen Strategie zur Behandlung von Krebs führen.

In einem aktuellen Übersichtsartikel in Immunologische Bewertungenwerfen wir einen genauen Blick auf das komplexe Zusammenspiel von Caspase-8, FADD und cFLIP bei verschiedenen Arten von Zelltod und Entzündung. Lesen Sie den Rezensionsartikel.

Über den Autor

Douglas Green, PhD, ist Vorsitzender der Immunologieabteilung, Co-Leiter des Cancer Biology Program und Peter C. Doherty Endowed Chair of Immunology am St. Jude Children’s Research Hospital und wurde kürzlich in die National Academy of Sciences gewählt. Vollständige Biografie anzeigen.

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Caspasses

Einführung

Caspasen definieren eine Klasse von Cysteinylproteasen, die zur C14-Familie der Barrett- und Rawlings-Klassifikation Barrett (1997) gehören. Diese Enzyme benötigen unbedingt einen Asparaginsäurerest in der P1-Position der Spaltbindung. Die Caspase-Genfamilie umfasst bisher 11 menschliche Mitglieder, die in drei Gruppen unterteilt werden können. Gruppe 1 (Caspasen 1, 4 und 5) besteht aus Enzymen, die an der Regulierung von Entzündungen beteiligt sind. Gruppe 2 (Caspasen 2, 3 und 7) und Gruppe 3 (Caspasen 6, 8, 9 und 10) bestehen aus Caspasen, die die Apoptose regulieren. Caspasen 11 und 12 sind Mausproteine, von denen die Caspasen 5 und 4 die menschlichen Gegenstücke sein können. Die neueste Ergänzung der humanen Caspasen, Caspase-14, scheint nicht an der Regulation von Apoptose oder Entzündung beteiligt zu sein, könnte aber eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielen Eckhart et al. (2000) . Caspase-13, ursprünglich fälschlicherweise als humanes Protein Koenig et al (2001) , entspricht höchstwahrscheinlich dem Rinder-Ortholog der humanen Caspase-4.

Neuere Beweise deuten darauf hin, dass einige der Caspasen, die in einigen zellulären Systemen an der Induktion der Apoptose beteiligt sind, für Differenzierungsprogramme in anderen benötigt werden. Das Überleben von Zellen, die ihre Caspasen aktiviert haben, ist nicht vollständig verstanden, kann aber durch die Spaltung unkonventioneller Caspase-Substrate wie RasGAP vermittelt werden, die anti-apoptotische Signale erzeugen, sobald sie Yang und Widmann (2001) gespalten haben.


Wie Proteine ​​miteinander sprechen: Caspase-3 spaltet sich auf unvorhergesehene Weise

Forscher des Burnham Institute for Medical Research haben neue Spaltstellen für das Enzym Caspase-3 (ein Enzym, das Zielproteine ​​proteolytisch spaltet) identifiziert. Mit einer fortschrittlichen proteomischen Technik namens N-Terminomik bestimmten Guy Salvesen, Ph.D., Professor und Direktor des Apoptose- und Zelltod-Forschungsprogramms des vom NCI benannten Cancer Center in Burnham, und Kollegen die Spaltstellen auf Zielproteinen und fanden im Gegenteil heraus Nach bisherigem Verständnis zielt Caspase-3 sowohl auf α-Helices als auch auf unstrukturierte Schleifen. Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass Caspase-3 und die Substrate, an die es bindet, sich gemeinsam entwickelt haben.

Das Papier wurde am 20. September in der Zeitschrift veröffentlicht Natur Struktur- und Molekularbiologie.

Vor dieser Studie glaubten Wissenschaftler, dass sich Proteasen hauptsächlich in unstrukturierten Schleifen spalten, instabilen Teilen von Proteinen, die leicht zugänglich sind. Die Entdeckung, dass Caspase-3 auch α-Helices spaltet, widerspricht einem gängigen Dogma und bietet neue Einblicke in Protein-Signalwege.

"Das war eine große Überraschung, denn in einer Helix sollte es nichts geben, an dem sich eine Protease festhalten könnte", sagte Dr. Salvesen. "Wir haben festgestellt, dass das grundlegende Konzept, dass sie nicht zu Helices spalten, falsch ist. Obwohl wir festgestellt haben, dass Proteasen Helices spalten können, glauben wir nicht, dass dies ihre biologische Funktion ist."

Neben der Bestimmung von Spaltstellen ermittelte das Team auch, welche Wechselwirkungen "biologisch signifikant" waren. Mit anderen Worten, welche Spaltungen die Funktion des Zielproteins veränderten und welche wenig Einfluss hatten.

Das Team testete die humane Caspase-3 und die Staphylokokken-Protease Glutamyl-Endopeptidase (GluC) gegen die Escherichia coli (E coli) Proteosom. In einem zweiten Satz wurde das Human-Caspase-Substrat mit Human-Caspase-3 herausgefordert. Die Forscher fanden Spaltstellen mit N-terminaler Proteomik (N-Terminomik), bei der gespaltene Substrate an einer exponierten Kante (N-terminal) markiert und massenspektrometrisch analysiert werden. Die Daten aus diesen Assays wurden dann mit Substratlisten in der Proteindatenbank abgeglichen. Bemerkenswerterweise spaltete Caspase-3 nicht E coli Proteine ​​genauso effektiv wie menschliche Proteine. Wenn jedoch Hybrid-Mensch/E coli Proteine ​​konstruiert wurden, wurde die Spaltung stark verbessert, was die Forscher zu dem Schluss brachte, dass Caspase-3 sich mit seinen menschlichen Substraten gemeinsam entwickelt hat.

Da sie die Funktionen anderer Proteine ​​verändern, sind Proteasen wie Caspase-3 für die Zellsignalübertragung von entscheidender Bedeutung. Zu verstehen, wie und wo sie mit Zielproteinen interagieren, verbessert unsere Fähigkeit, den Fortschritt von Krankheiten zu verstehen.


Implikationen der Zell-zu-Zell-Variabilität für die computergestützte Modellierung des Zelltods

Systembiologische Modelle der Zellsignalisierung und des zellulären Verhaltens wurden unter Verwendung verschiedener Strategien erstellt. 19 Für Computermodelle sowohl der extrinsischen (ligandeninduzierten) als auch der intrinsischen (schadensinduzierten) Apoptose umfassen die Strategien Boolesche oder Fuzzy-Logik, 20, 21, 22 datengesteuert 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder Bayes'sche Algorithmen. 31 Jede Methode eignet sich für eine bestimmte Art von Fragestellung, aber der Modellierungsansatz, der sich am einfachsten auf die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen beziehen kann, ist die Verwendung eines Systems gewöhnlicher Differentialgleichungen (ODEs). Das System der ODEs kodiert mathematisch die biochemischen Reaktionen, von denen angenommen oder angenommen wird, dass sie bei einer Entscheidung über Zelltod/Überleben ablaufen. 32, 33 Es wurden viele ODE-Modelle des ligandeninduzierten Zelltods veröffentlicht, die die Zelltodantwort auf Fas-Liganden (FasL), TNF-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) oder Tumornekrosefaktor (TNF) mit unterschiedlichem Grad simulieren und vorhersagen von Einzelheiten. 7, 10, 34, 35, 36, 37, 38

Die meisten ODE-Modelle rekapitulieren eine Reihe von biochemischen Reaktionen, die im Laufe der Zeit stattfinden, und simulieren daher die Reaktion Dynamik in einem Signalisierungsnetz. Es ist erwähnenswert, dass eine Instanz des Modells eine Instanz des biochemischen Netzwerks darstellt und somit eine Zelle. Dementsprechend sollten Simulationsergebnisse mit experimentellen Messungen verglichen werden, die das dynamische Verhalten einzelner Zellen charakterisieren.

Welche Zelle sollte ein Modell zu rekapitulieren versuchen: eine Zelle, die den bevölkerungsgemittelten Messungen entspricht, oder vielleicht eine „typische“ Zelle? Obwohl dies scheinbar anspruchsvoll ist, ist dies eine entscheidende Entscheidung im Kontext von Zelltodmodellen, vor allem, weil bestimmte messbare Schritte des Zelltodprozesses, wie die Caspase-3-Aktivierung, einen 𠆊lles-oder-nichts-Charakter haben, wie wir besprochen haben im vorherigen Abschnitt. Im Allgemeinen gibt es in der Population keine einzelne Zelle, die mit einem Verhalten reagiert, das dem gemessenen Durchschnitt folgt ( Abbildung 2b). Ein klares Beispiel für das Risiko, sich bei der Entwicklung von ODE-Modellen des Zelltods auf populationsbasierte Messungen zu verlassen, ist das Konzept eines ‘EC50' (oder halbmaximale effektive Konzentration). Bei der EC50 für einen bestimmten Zelltod-induzierenden Wirkstoff oder Liganden stirbt die Hälfte der behandelten Zellen, aber aller Wahrscheinlichkeit nach stirbt keine Zelle ‘halb. Daher kann das Abgleichen eines Modells ausschließlich mit einer Messung des Bevölkerungsdurchschnitts eine vereitelte Übung sein und ein Modell ergeben, das sich nicht wie irgendeine Zelle in der Population verhält.

Was ist, wenn die einzigen zugänglichen quantitativen Daten aus populationsbasierten Assays stammen? Wie wir in Kasten 1 diskutieren, zeigen neuere Arbeiten Wege auf, um populationsbasierte Daten zu analysieren, um abzuleiten, ob die interessierenden zellulären Reaktionen heterogen sind. Dies könnte durch die Interpretation einer Dosis-Wirkungs-Kurve oder durch die statistische Analyse wiederholter Messungen an kleinen Zellzahlen erfolgen (Kasten 1). Wie sollten wir dann jedoch die Ergebnisse der Modellsimulation mit populationsbasierten Daten vergleichen? Ein vielversprechender Ansatz zur Modellierung heterogener Zellantworten besteht darin, ‘Populationen von Modellen durchzuführen, um das Verhalten von Zellpopulationen zu rekapitulieren. Bei diesem Ansatz werden Sätze von vielen Simulationen desselben Modells mit Variationen in Parametern verwendet, die für die Quellen der Variabilität von Zelle zu Zelle repräsentativ sind (die Quellen dieser Variabilität werden im nächsten Abschnitt erörtert), um das Verhalten eines Ensembles von Zellen anzunähern. 11, 39, 40, 41, 42, 43, 44 Gemittelte Simulationsergebnisse können mit Bevölkerungsdurchschnittsmessungen verglichen werden, oder wenn Einzelzelldaten verfügbar sind, können Simulationssätze direkt mit Einzelzelldatensätzen verglichen werden. Zu diesem Zweck hat die jüngste Entwicklung von Bayesian- und Monte-Carlo-Markov-Chain-Ansätzen zur Parameterschätzung, bei denen die Ausschüttungen der möglichen Parameterwerte werden durch Berechnung der besten Anpassungen an Ausschüttungen von Einzelzellmessungen, sollte sich als besonders nützlich erweisen. 45

Kasten 1. Bewertung der Heterogenität von Zelle zu Zelle durch populationsbasierte Messungen

Die traditionelle Interpretation eines Ergebnisses aus einem populationsbasierten Assay besteht darin, dass es ein erwartetes oder mittleres zelluläres Verhalten definiert. Das Vorhandensein von Zell-zu-Zell-Heterogenität kann jedoch immer noch durch sorgfältiges experimentelles Design und sorgfältige Untersuchung von populationsbasierten Daten aufgedeckt werden.

Einzelzellheterogenität aus Dosis-Wirkungs-Kurven

Eine Möglichkeit, um festzustellen, ob die zellulären Antworten zwischen den Zellen variieren, besteht darin, Dosis-Wirkungs-Kurven genau zu untersuchen, die mit einer herkömmlichen logistischen Sigmoidfunktion parametrisiert werden können (Gleichung 1 und Abbildung Box 1a).

Hier, ja misst die Reaktion von Zellen bei Dosis D (z. B. Lebensfähigkeit von Zellen bei einer gegebenen Wirkstoffkonzentration), E0 und Einf sind die theoretischen minimalen und maximalen Effekte, wie sie durch die obere und untere Asymptote der Antwortkurve definiert sind, EC50 ist die Dosis, bei der die halbmaximale Wirkung (E50) wird beobachtet und HS ist der Hangneigungskoeffizient. Obwohl E0 messbar ist, da die Wirkung des Fehlens von Medikamenten, Einf wird aus der Dosis-Wirkungs-Kurve geschätzt, oder aus Emax, das Maximum gemessen Wirkung. Bei Lebensfähigkeitsmessungen, wenn der theoretische maximale Effekt (Einf) suboptimal ist und daher nicht Null oder 100% erreicht (je nachdem, ob der Stimulus den Zelltod fördert bzw. hemmt), dann muss in der Zellpopulation Heterogenität vorliegen.

Bei der Messung eines Signals oder eines Ergebnisses, das nicht binärer oder kategorialer Natur ist, können andere subtilere Metriken aussagekräftiger sein. Kürzlich Fallahi-Sichani et al. 76 zeigte, dass für die relative Lebensfähigkeit von Krebszellen, die mit Inhibitoren des Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-3-Kinase (PI3K)-Signalwegs behandelt wurden, eine flache Dosis-Wirkungs-Kurve mit einer Variabilität von Zelle zu Zelle im Grad der Signalhemmung verbunden war. Bei kompetitiven Kinasehemmern würde man erwarten, dass die Dosis-Wirkungs-Kurve gut mit a HS von 𢏁 hätte eine flache Kurve HS 〈〈 1 (z. B. Abbildung Box 1). Fallahi-Sichani et al. 76 fanden heraus, dass die Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve für einige PI3K/Akt/Säugetier-Targets von Rapamycin-Signalweg-Inhibitoren besonders flach war, mit HS 〈〈 1 für mehrere Krebszelllinien. Einzelzellanalysen zeigten, dass die Reaktion auf diese speziellen PI3K-Signalweg-Inhibitoren größere Variationskoeffizienten aufwies, was auf eine größere Variabilität von Zelle zu Zelle in der Population hinweist.

Einzelzellheterogenität aus stochastischem Profiling

Viele experimentelle Techniken reagieren empfindlich auf die Fülle des Ausgangsmaterials, was ihre Nützlichkeit für die Einzelzellanalyse einschränkt. Ein cleverer Ansatz, um diese Einschränkungen zu umgehen und die Variabilität innerhalb einer Zellpopulation abzuleiten, besteht darin, mehrere Messungen an Proben einiger weniger Zellen durchzuführen (10�) und die Variabilität zwischen den Proben zu quantifizieren. Der statistische Ansatz, der als „stochastisches Profiling“ bezeichnet wird, zeigt Heterogenität, oder genauer gesagt Bimodalität, in der Verteilung der Antworten über eine Zellpopulation. 77 Heterogenität wird erkannt, wenn die aus 12 bis 15 Wiederholungsmessungen von kleinen Zellpopulationen erhaltene Verteilung breiter ist, als aufgrund von einfachen Stichproben- und Messfehlern erwartet wird ( Abbildung Box 1b ). 78 Unter Anwendung dieses Ansatzes hat Bajikar et al. verwendeten Microarray-Genexpressionsdaten aus 10-Zell-Proben 78 und Maximum-Likelihood-Inferenz, um ein überraschend großes Spektrum von Einzelzell-Regulationszuständen in Brustepithelzellen in azinären Strukturen aufzudecken. Einige dieser regulatorischen Zustände waren häufig (�% der Zellen in jeder azinären Struktur), andere waren selten (nur 𢏁 von 40 Zellen) 79 und daher zuvor nicht beobachtet oder beschrieben. Einzelzellheterogenitäten in der Genexpression können daher aus populationsbasierten Experimenten entfaltet werden, indem statistische Datenmodelle der erwarteten Messverteilungen verwendet werden.

Zusammenfassend sollten Computermodellierer beim Vergleich von Ergebnissen aus Simulationen und Experimenten fragen: Sind die Daten semiquantitativ, quantitativ oder qualitativ? Liefern die Daten Einzelzellinformationen? Wenn ja, liefern sie Informationen über die Dynamik einzelner Zellen? Jede Art von Messung kann nützlich sein, aber die Kenntnis ihres Informationsgehalts ermöglicht es dem Modellierer, die Daten mit den entsprechenden Modellierungsergebnissen zu vergleichen. Ein letzter Punkt, den wir noch nicht angesprochen haben, ist, dass wir, um experimentelle Ergebnisse genau vorhersagen zu können, genau verstehen müssen, welche Aktivität jeder Assay misst. Um auf unser im vorherigen Abschnitt diskutiertes Beispiel der Caspase-Aktivierung zurückzukommen, muss man wissen: (1) ob der Assay die Aktivität einer bestimmten Caspase misst oder ob es sich um eine Messung der gesamten Caspase-Aktivität handelt (sogar �spase-spezifische" Substrate neigen zu Kreuzreaktivität mit anderen Caspasen), 46 und (2) ob der Assay die Caspase-Spaltung, Caspase-Aktivität oder das angesammelte Caspase-Spaltprodukt misst. Zum Beispiel ist bekannt, dass gespaltene Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, ein Produkt der Effektor-Caspase-Aktivität, relativ stabil ist und daher als Beweis für vergangene Caspase-Aktivität bestehen kann. Im Gegensatz dazu ist gespaltene Caspase-3 selbst relativ instabil, und der Nachweis ihrer Aktivierung kann mit der Zeit verschwinden, wenn sie ausschließlich über die Häufigkeit von gespaltener Caspase-3 überwacht wird. Tatsächlich haben Modellierungen vorhergesagt und Experimente bestätigt, dass die kurze Halbwertszeit von Caspase-3 für die Dynamik des Zelltods wichtig ist: Wenn man die E3-Ubiquitin-Ligase-Domäne von XIAP löscht, die für die Markierung von Caspase-3 für den Abbau verantwortlich ist, können Zellen verlieren die ‘Snap-Action-Dynamik des Zelltods und können mit beschädigten Proteinen und DNA überleben. 8 Genauso wichtig wie der Vergleich von Bevölkerungsdurchschnitten mit Simulationsdurchschnitten und der Vergleich von Einzelzelldatensätzen mit Sätzen einzelner Modellinstanzen, ist die genaue Paarung von gemessenen und modellierten Einheiten der Schlüssel zur Entwicklung hochwertiger Modelle.


Amerika

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Perspektiven

Nur BH3-Proteine ​​sind essentiell für die Initiierung der Apoptose über den mitochondrialen Weg. Die Aufklärung, welche der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine ​​für die Abtötung bösartiger Zellen durch konventionelle und gezielte Anti-Krebs-Wirkstoffe essentiell sind, kann wertvolle Erkenntnisse darüber liefern, warum bestimmte Therapien bei einigen Patienten erfolgreich sind, bei anderen jedoch versagen. Im Zeitalter der BH3-Mimetika wird dieses Wissen dazu beitragen, den Einsatz einer rationalen Kombinationstherapie anzupassen und die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen, während Kollateralschäden an normalem Gewebe begrenzt werden.


Perspektiven

LCD wurde lange Zeit als ein Modus des regulierten Zelltods übersehen. Nichtsdestotrotz beginnen sich endlich seine Regulierung und enge Verbindungen zu anderen Zelltodwegen zu entwickeln. Wie oben diskutiert und an anderer Stelle besprochen (Boya und Kroemer, 2008 Česen et al., 2012 Kirkegaard und Jäättelä, 2009 Yamashima und Oikawa, 2009), hat LCD wichtige physiologische Funktionen und trägt zu zahlreichen degenerativen und infektiösen Erkrankungen bei (siehe Poster). Dennoch könnte es eine alternative Strategie für die Behandlung von Apoptose- und multiresistenten Krebsarten darstellen (Groth-Pedersen und Jaattela, 2010 Kallunki et al., 2012 Kreuzaler und Watson, 2012). Allerdings ist noch viel Grundlagenforschung nötig, um unser Wissen über die komplexe Regulation der lysosomalen Stabilität auf ein Niveau zu bringen, das ein optimales Design von LCD-Targeting-Therapien ermöglicht.


Wie töten Caspase-Proteine ​​eine Zelle? - Biologie

Selbstmord und Totschlag: Apoptose und Nekrose

Wenn der programmierte Zelltod als Selbstmord aufgefasst werden kann, bei dem sich Zellen unter bestimmten physiologischen oder pathologischen Bedingungen selbst töten, kann die Nekrose als Tötungsdelikt angesehen werden. Der Killer ist hohe Temperatur, Sauerstoffmangel, Nährstoffmangel oder andere physikalische oder chemische Faktoren. Was die inneren Zellen betrifft, so unterscheiden sich der Selbstmord und der Mord offensichtlich vor allem in der Morphologie (siehe unten).

Beim Apoptose-Zytoplasma verändern sich Kern und Membranen mit Variation biochemischer und physikalischer Faktoren. Im frühen Stadium der Apoptose dehnen sich Zellen aus und drehen sich um, lösen sich von benachbarten Zellen und schrumpfen. Im Zytoplasma dehnt sich das endoplasmatische Retikulum aus und wird zur Vakuole. Im Kern kondensiert Chromatin sichelförmig um die Kernmembranen und wird basophiler. Schließlich bricht der Kern in Fragmente, die von Kernmembranen umhüllt sind. Auf Zellmembranen lösen sich Zellen ab und Membranen werden aktiver und stülpen sich ein. Diese Veränderungen führen zur Umwandlung von intakten Zellen zu apoptotischen Körpern, die fragmentierte zelluläre Bestandteile enthalten. Unter physiologischen Bedingungen treten an Zellmembranen bestimmte regulatorische Reaktionen auf, die apoptotische Körper induzieren, die von Phagozyten erkannt und verdaut werden, ohne Entzündungsreaktionen auszulösen.

Autophagie ist ein Prozess, bei dem ein Teil des Zytoplasmas und der Organellen eine Reihe von Abbauvorgängen in Lysosomen durchlaufen. Es zeichnet sich dadurch aus, dass Phagosomen in kleinen Vakuolen gebildet werden, ER dispergiert und chromosomenmäßig kondensiert. Obwohl das Zytoskelett bei der Autophagie zerfällt, ist der Abbau des Zytoskeletts weniger offensichtlich als bei der Apoptose.

Nekrose führt zu einer Expansion von Organellen wie Mitochondrien, Brüchen von Membranen und einem schweren Verlust von Zellinhaltsstoffen mit Entzündungsreaktionen im umgebenden Gewebe. In einigen Fällen ist es einfach, Apoptose und Nekrose zu unterscheiden. In einigen Fällen ist es jedoch fast unmöglich, sicherzustellen, ob Zellen sich selbst töten oder getötet werden, da sterbende Zellen sowohl Merkmale der Apoptose als auch der Nekrose aufweisen.

Mechanismus: Signalübertragungswege

Wie alle anderen molekularbiologischen Mechanismen ist der Mechanismus der Apoptose kompliziert und umfasst viele Moleküle. Wie allgemein akzeptiert, gibt es zwei Arten von Apoptose: Todesrezeptoren induzierte Apoptose oder extrazelluläre Faktoren induzierte Apoptose und Mitochondrien induzierte Apoptose oder intrazelluläre Faktoren induzierte Apoptose. Obwohl die Upstream-Ereignisse der beiden Apoptose-Stile unterschiedlich sind, führen sie beide zur Aktivierung von Caspasen. In normalen Zellen wird die Apoptose streng kontrolliert und die Caspasen befinden sich in einem nicht aktivierten Pro-Enzym-Zustand. Wenn Caspasen aktiviert werden, was die Apoptose darstellt, beginnt es, es treten die Kaskadenreaktionen auf und lösen die irreversible Apoptose aus.

Es bezieht sich darauf, dass bestimmte Todesliganden (z. B. Fas-Liganden, TNF-α und TRAIL) mit den Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche (z. B. Mitglieder der TNF [Tumornekrosefaktor]-Superfamilie) interagieren, um Apoptose zu induzieren. Verschiedene Signalwege, die durch verschiedene Todesrezeptoren aktiviert werden, sind ähnlich. Die Bindung von Rezeptoren und Liganden führt zur Bildung von Ceramid. Die Freisetzung von Ceramid soll dann die Fusion von Lipid-Rafts beschleunigen und die Todesrezeptoren sammeln. Es wird angenommen, dass diese Aggregation das Signal der Apoptose verstärkt. Obwohl in einigen Zellen wie Lymphozyten keine Aggregation von Rezeptoren stattfindet, löst sie Apoptose aus. In den meisten Fällen ist eine Amplifikation der Signaltransduktionswege notwendig, um einen typischen Apoptoseprozess zu aktivieren.

Nach der Bindung mit Liganden nimmt ein Rezeptor eine Konformationsänderung vor und die "Todesdomäne" exponiert. Gleichzeitig werden verschiedene Apoptoseproteine ​​rekrutiert. Dieser Proteinkomplex wird DISC (death-inducing signaling complex) genannt. Schließlich rekrutiert es eine bestimmte Art von Caspasen, normalerweise Vorläufer von Caspase-8, und führt zur Aktivierung von Caspase-8 und zur Initiierung der Apoptose.

Die Bindung von TNF-α an TNF-Rezeptor-1 führt zur Tripolymerisation und intrazellulären Aggregation von Todesdomänen. Nach der Konformationsänderung rekrutiert TNF R-1 ein Adapterprotein namens TRADD (TNFR-assoziierte Todesdomäne). TRADD rekrutiert dann weitere unterschiedliche Proteine ​​wie den nachgeschalteten TRAF 2 (TNF-assoziierter Faktor 2) und aktiviert die NF-κB- und JNK-Signalwege. TRADD kann an FADD (Fas-associated death domain protein) binden und über Protein-Protein-Interaktionen Vorläufer von Caspase-8 rekrutieren und bildet den DISC-Komplex. Im Prozess der DISC-Bildung brechen Vorläufer von Caspase-8 in aktive Caspase-8, die dann in das Zytoplasma freigesetzt wird und nachgeschaltete Kaskadenreaktionen auslöst. Der FADD-Apoptoseweg kann durch FLIP (Flice-inhibitory protein) gehemmt werden. FLIP ist analog zu Caspase-8 und weist keine proteolytische Aktivität auf. Es kann die Apoptose unterdrücken, indem es die Interaktion von FADD und Vorläufer von Caspase-8 hemmt.

Der Weg, über den Liganden von Fas (FasL oder CD95) die Apoptose aktivieren, ist dem von TNF ähnlich. Die Bindung von Liganden beschleunigt die Aggregation von Rezeptoren, die Bildung von DISC und die Aktivierung von Caspase-Kaskadenreaktionen. Der Signalweg des Fas-Rezeptors ist jedoch einfacher. Das Adapterprotein FADD bindet direkt an die Todesdomäne des Fas-Rezeptors, ohne dass TRADD vorhanden ist. Fas-Rezeptoren scheinen nur bei der Apoptose zu wirken, im Gegensatz dazu nehmen TNF-Rezeptoren auch an anderen Signalwegen teil. Ebenso kann dieser Vorgang durch FLIP gehemmt werden.

In Zellen, die auf Fas reagieren, Typ Ⅰ-Zellen wie Thymozyten, wird Caspase-8 ausreichend durch Fas aktiviert und führt zur Apoptose. In diesen Zellen kann ein hoher Bcl-2 Spiegel die durch Fas induzierte Apoptose nicht hemmen. In Zellen vom Typ Ⅱ wie Hepatozyten wird Caspase-8 durch Fas nicht ausreichend aktiviert, daher müssen die Apoptosesignale in diesen Zellen über die Apoptosemitochondrien verstärkt werden. Aktivierte Caspase-8 führt zu einer Spaltung von zyplasmischem Bid und verwandelt es in tBid (truncated Bid). tBid dringt in die Mitochondrien ein und setzt Cytochrom C frei, das dann die Apoptosesignale verstärkt.

In vielen Zellen kann TRAIL (TNF-related Apoptosis Inducing Ligand) an die Rezeptoren DR4 und DR5 binden und eine schnelle Apoptose auslösen. Intriguingly, there are some decoy receptors that compete with DR4 and DR5. These decoy receptors are called DcR1 and DcR2. Both of them can bind to TRAIL ligands and do not trigger apoptosis, because DcR1 doesn't have intracellular domain and the death domain of DcR2 is truncated for that four of the six amino acids which are necessary for recruiting the adaptor proteins are missed.

NF-κB is an inhibitor of apoptosis. Typically, NF-κB binds inhibitor IkB which presents in cytoplasm. With inducement of TNF, IkB is phosphorylated and then degraded via ubiquitin pathway. Free dimer of Nf-κB is released and transferred to nucleus. NF-κB induced series of expressions of genes such as FLIP, cIAP1 and cIA2 etc. and the products of expressions inhibit apoptosis. Apoptosis inhibitor XIAP (X-chromosome-linked IAP) is also mediated by NF-κB. XIAP inhibits caspase-3 and caspase-7 by binding to the end of NH2 with its BIR domain, thus inhibits apoptosis.

Intracellular factors induced apoptosis is the major cell death pathway in vertebrate. It can be activated by various factors such as retreat of growth factor, activation of heat shock genes, DNA damage, reactive oxygen, excessive intracellular calcium ion and other stress reactions. These factors result enhanced permeability of mitochondrial outer-membrane and release of apoptosis-inducing proteins such as apoptosis inducing factor (AIF), cytochrome C, Smac/DIABIO etc. The release of cytochrome C from the mitochondria doesn't depend on decline of mitochondrial surface potential or enhancement of the permeability of outer-membrane. Smac /DIABIO is an inhibitor of apoptosis-inhibitor protein XIAP. AIF is independent of caspase pathway, and induce apoptosis, too. It is transferred into nucleus after entering in cytoplasm. Probably with endonuclease G, AIF induces condensation of chromatin and fragmentation of high-molecular weight DNA (50kb).

It is key event in apoptosis that cytochrome C is released from intracellular mitochondria. Once cytochrome C is released to cytoplasm, it binds to Apaf-1 molecule which is an apoptosis activator, then they recruit precursor of caspase-9 to form a multi-protein complex called apoptosome. Activated caspae-9 then leads to downstream activation of caspase-3 and caspase-7.

The increase of permeability of mitochondrial outer-membrane is due to the changes of permeability transition pore (PTP) or activation of apoptosis activator in Bcl-2 family. PTP complex consists of voltage dependent anion channel on mitochondrial outer-membrane, adenine nucleotide transferase on mitochondrial inner-membrane and cyclophilin D in mitochondrial matrix. High level calcium ion induces the open of the PTP which then leads to diffusion of water and 1.5 kD solute molecule from cytoplasm to mitochondrial matrix, then causes expansion of mitochondria and disintegration of the trans-membrane potential. The other mechanism that induces the increase of the permeability of mitochondrial outer-membrane refers to Bcl-2 family.

There are two groups of proteins in Bcl-2 family: Bcl-2 and Bcl-XL are apoptosis inhibitors Bad, Bax and Bid are apoptosis-inducing proteins. Cells' susceptibility to apoptosis depends on the balance of the two groups of proteins. When apoptosis-inducing proteins are more, cells tend to be susceptible to apoptosis. On the contrast, when apoptosis inhibitors are dominant, cells tend to have resistance. Excessive Bcl-2 on mitochondrial surface is thought to be the key point of PTP's formation.

Apoptosis-inducing proteins of Bcl-2 family spread all over the cytoplasm and are sensors of any cell damage or stress. When cell stress occurs, they transfer to locations of apoptosis inhibitors on mitochondrial surface. Their interactions disturb the functions of apoptosis inhibitors and leads to the formation of PTP complex and release of other molecules. Then apoptosome is generated and cascade reactions of caspases are activated.

Bid is the linkage of death receptors and mitochondria pathway. Bid exists in cytoplasm with an unactivated state, and transfers to mitochondrial membranes after being activated. Then Bid antagonizes the apoptosis inhibitors of Bcl-2 to induce apoptosis. In some types of cells, Bid is cut into activated tBid by caspase-8 after being activated by death receptors. tBid then binds to the mitochondrial membranes and interacts with Bax, making Bax inserted in the membranes and oligomerized. Mitochondrial membranes turn more permeable, and cells get into apoptosis program. Bcl-XL can inhibit the combination of tBid and Bax and thus inhibit apoptosis. Moreover, Bid can be activated by other enzymes such as granzyme B and protease in lysosome.

Executants in apoptosis process:

Caspases are major executants in apoptosis. They are cysteine protease with presence of inactive state in cells. During apoptosis these pro-enzymes are cut into active enzymes. Extracellular factors induced apoptosis leads to activation of caspase-8 or caspase-10. These caspases activate other caspases in cascade reactions. The cascade reactions eventually lead to activation of effective caspases such as caspase-3 and caspase-6. Effective caspases cleave important intracellular proteins like cytoskeletal proteins and causes morphologically changes of cells.

Caspase-3 is considered to be the most important executant. It is activated by upstream caspases (caspase-8, caspase-9 or caspase-10). Caspase-3 specifically activates endonuclease CAD (caspase activated DNase). In proliferating cells, CAD normally combines with ICAD (an inhibitor of CAD) to form an inactive complex. In apoptosis, ICAD is cut by caspase-3 and release CAD, followed by rapid fragmentation of DNA.

Other than death receptors, there are other mechanisms that can activate cascade reactions of caspases. Granzyme B can be transported into cells by cytotoxic T lymphocyte and directly activate caspase-3, caspase-7, caspase-8 and caspase-10. Mitochondria is important regulator of caspase-cascade reactions and apoptosis. Released cytochrome C from mitochondria leads to activation of caspase-9, and caspase-3. This process is mediated by formations of apoptotic bodies.

PARP (Poly Adp Ribose Polymerase) is the first substrate of caspases that has been identified. PARP catalyzes production of ADP-ribose via which it binds to DNA cracks and modifies nuclear proteins, and it means PARP participates in the repairment of DNA damage. Caspase-3 can cut PARP and stop its repairing function. Lamin is a nuclear protein that is capable of sustaining shapes of nucleus and regulating interactions of chromatin and nuclear membranes. The degradation of lamin by caspase-6 will lead to condensation of chromatin and fragmentation of nucleus.

In spite always we focus on apoptosis and caspases, they can't represent everything in field of apoptosis. There are other enzymes that are important in executing programed cell death including calpain, cathepsin, endonuclease and some other protease. They function alone or cooperatively with assistance of some organelles like mitochondria, lysosome and ER. More attentions should be paid on factors other than caspases in order to find effective therapeutic solutions for curing diseases like cancer.


What is a Caspase? (mit Bild)

A caspase, or cysteine aspartate-specific protease, is one of a group of enzymes involved in cell death. Each types has a particular role in cell death, or apoptosis, as it is technically known. Caspases are proteins that cut, or cleave, other proteins at a specific point.

There are 14 human caspases. Each enzyme can be placed into one of three groups, depending on the job it does. Caspase 2, 8, 9 and 10 are activator enzymes. They begin the process of apoptosis by cleaving and activating other caspases.

The group known as the executioner group has three members, Caspase 3, 6 and 7. Executioner versions cut cellular proteins to break down the cell. Members of the third group are known as cytokine processors. This group contains the seven remaining caspases, and they signal the immune system to start the process of inflammation to clean up the bits of dead cell.

These enzymes are known as cysteine aspartate-specific proteases because each one cuts another protein at a specific site. All proteins are made up of a sequence of amino acids, and caspases cut proteins after an aspartate amino acid. Each type recognizes the proteins it is supposed to cut by reading the three amino acids present in the sequence before the aspartate.

Caspases are present in each cell in inactive forms known as zymogens. When other molecules, called death receptors, in the cell signal to the activator caspases that apoptosis is to begin, the zymogen activator caspases are cleaved and activated. The activators begin what is called the caspase cascade, during which different caspases activate each other when necessary. The cascade can also be activated by molecules released from the mitochondria of the cell or by the enzyme Granzyme B, which is released from cell-killing T-cells.

The caspases cleave the structural proteins of the cell to break it down. For example, Caspase 6 breaks down laminins, the structural proteins of the nucleus. They do not just destroy proteins sometimes they affect other cellular enzymes.

Caspase 3 cleaves a complex that is normally inactive in the cell, releasing a deoxyribonuclease (DNAse) enzyme. This Caspase-Activated DNAse (CAD) breaks DNA into pieces. It also prevents an enzyme involved in DNA repair, poly ADP-ribose polymerase (PARP), from repairing the DNA damage. To do this, the caspase cleaves the PARP enzyme, rendering it inactive.


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Bemerkungen:

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