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Können Axone als Rezeptoren fungieren?

Können Axone als Rezeptoren fungieren?


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In allen Histologiebüchern heißt es, dass alle sensorischen Nervenenden (Rezeptoren) aus Dendriten bestehen, die physikalische Reize aus der Umgebung in neuronale Signale übersetzen. Einige sensorische Neuronen scheinen jedoch Axone zu enthalten, wie die unten gezeigten Merkel- und Riechzellen. Sie fungieren als Rezeptoren, besitzen aber auch Axone. Sind es die Bilder oder die Texte, die falsch sind?


Kurze Antwort
Die Lehrbücher haben recht; der rezeptorteil von sensorischen neuronen wird immer als dendriten betrachtet. Axone sind dennoch ein wesentlicher Bestandteil einiger Rezeptortypen, um das Signal an das Gehirn zu senden. Andere, spezialisiertere Sinneszellen haben kein Axon und sind daher auf sekundäre Neuronen angewiesen, um das Signal an das Gehirn zu senden.

Hintergrund
Es gibt drei Arten von Sinneszellen, nämlich solche mit freie Nervenenden, diese mit spezialisierte dendritische Strukturen, und spezialisierte Rezeptorzellen, die direkt mit einem sekundären Neuron synapsieren (Abb. 1).


Abb. 1. Arten von sensorischen Neuronen. Quelle: Premed-Hauptquartier.

  1. Sensorische Neuronen mit freien Nervenenden haben einen freiliegenden Dendriten, der als Rezeptor fungiert. Beispiele sind Nozizeptoren (Schmerzrezeptoren) und Haarfollikelrezeptoren.
  2. Andere sensorische Neuronen sind komplexe Zellen, die eine dendritische Region aufweisen, die auf eine bestimmte Rezeptorfunktion spezialisiert ist. Beispiele sind das Pacinsche Korpuskel und Riechneuronen.
  3. Der häufigste Rezeptortyp sind spezialisierte Rezeptorneuronen, die kein Axon haben und ein sekundäres sensorisches Neuron benötigen, um das Signal an das Gehirn zu senden. Beispiele sind die Photorezeptorzellen in der Netzhaut, die Haarzellen in der Cochlea und Merkelzellen.

In allen Histologiebüchern heißt es, dass alle sensorischen Nervenendigungen (Rezeptoren) aus Dendriten bestehen, die Empfindungen von der Umgebung zum Körper weiterleiten, aber das scheint nicht wahr zu sein.

Der Begriff "Nervenenden" (oder "freie Nervenenden". Siehe Wiki-Seite) wird typischerweise mit feinen haarähnlichen Strukturen in der Haut und in den Organen in Verbindung gebracht, die als (eine Art von) Berührungs-, Schmerz- oder Wärmesensoren fungieren. Dies sind, ja, Erweiterungen der Dendriten von sensorischen Neuronen, deren Zellkörper in den Spinalganglien des Rückenmarks leben und die das Signal über Axone entweder lokal im Rückenmark oder an Gehirnstrukturen weiterleiten.

Aber das ist nicht dasselbe wie zu sagen, dass alle Sinnesstrukturen jeder Sinnesmodalität Dendriten oder Erweiterungen davon sind. Jeder Sinn hat spezialisierte Zellen, um diesen Sinnesreiz zu erkennen. Das Auge hat Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen), das Ohr hat innere Haarzellen, die Nase hat Riechrezeptorneuronen, die Zunge hat Geschmackszellen und die Haut und Organe haben freie Nervenenden und spezialisierte Mechanorezeptoren wie Pacinian-Körperchen. Die meisten von ihnen übernehmen die Aufgabe, den Reiz in einem spezialisierten Rezeptorteil der Zelle, wie dem Stäbchen selbst oder den Zilien einer Haarzelle oder eines ORN usw Sinneskette über eine Synapse, manchmal über ein sehr kurzes Axon oder einfach nur eine Art Axon-"Nub".


Neurotrophe Faktoren und Rezeptoren

1987 schlug Lichtman einen Nährstofffaktor vor, von dem angenommen wird, dass er ein Faktor ist, der am Überleben, Wachstum, der Migration und der funktionellen Assoziation anderer Zellen oder dem axonalen Nachwachsen während der Nervenregeneration beteiligt ist. Es heißt Neurotropher Faktor (NTF). Während sich die Erforschung neurotropher Faktoren weiterentwickelt, haben Forscher eine große Gruppe neurotropher Faktoren entdeckt, die von Zielzellen und umgekehrt ernährenden Neuronen abgeleitet werden. Wenn der periphere Nerv geschädigt ist, sind die Axone des distalen Segments degeneriert, die Axone des proximalen Segments knospen und die Knospen wachsen allmählich, bilden schließlich eine Verbindung mit dem Zielorgan, stellen die Funktion wieder her und reparieren den Nerv. Wenn dabei die Unterstützung durch NTFs nicht erreicht wird, degeneriert das proximale Segment schnell und der Zellkörper stirbt ab. Daher ist die Erforschung des Wachstums, der Entwicklung und des Schutzes von Nervenzellen durch die Familie der neurotrophen Faktoren aus Sicht der Grundlagenforschung und der klinischen Forschung von großem Wert. Entsprechend der Größe der Homologie, der Spezifität der Genexpressionsstellen und der Proteinwirkung und den unterschiedlichen Signalmechanismen können neurotrophe Faktoren in drei Familien eingeteilt werden, die Familie der Nervenwachstumsfaktoren, die Familie der ziliaren neurotrophen Faktoren und die Familie der neurotrophen Faktoren aus Gliazellen. Veränderungen des NTF-Spiegels können zu neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AD) oder der Huntington-Krankheit sowie zu psychischen Störungen wie Depressionen und Drogenmissbrauch führen.

Neurotrophe Faktoren und Rezeptorfunktion

Viele Polypeptidfaktoren können das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung des Nervensystems beeinflussen. NTF umfasst den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den aus dem Gehirn stammenden NTF (BDNF), NTF3 und NTF4, die im Nervensystem weit verbreitet sind. Diese NTF-Vorläufer werden durch Enzyme in reife, stabile nicht-kovalente Dimere mit einem Molekulargewicht von 12 bis 14 kD gespalten. Ihr Expressionsniveau im Gehirn ist normalerweise sehr gering. NTF-Vorläufermoleküle können durch intrazelluläre und extrazelluläre Proteasen wie Furin, Plasmin, Matrix-Metalloproteinasen (MMP) 3 und MMP7 gespalten werden, Spaltung der hochkonservierten prä-NTF-Aminodicarbonsäure-Spaltungsstelle, Freisetzung von kohlenstoffreifem Protein. Diese reifen Proteine ​​regulieren das neuronale Überleben, die Differenzierung und die synaptische Plastizität, indem sie an den Rezeptor der Tyrosinkinase (Trk)-Familie oder den p75NTF-Rezeptor (NTFR) binden. Unter ihnen ist NGF der erste entdeckte NTF. Im Zentralnervensystem fördert es das Überleben der cholinergen Neuronen im Basalkörper und lässt sie ihre Funktion erfüllen. Diese Neuronen werden in den Hippocampus projiziert, und es wird angenommen, dass der Hippocampus eng mit der Gedächtnisbildung verbunden ist. Eine der Manifestationen der AD ist der Rückgang des Gedächtnisses. Ein anderes NTFS wird im zentralen System weiter verbreitet. Unter ihnen sind BDNF und NT3 stärker an der Regulation des Überlebens und der Funktion verschiedener Neuronen im Kortex und Hippocampus beteiligt. NTF kann nur auf den Trk-Rezeptor und/oder p75NTFR (gehört zur Familie der Tumornekrosefaktoren) wirken. Der Trk-Rezeptor enthält eine extrazelluläre Bindungsregion, eine einzelne Transmembranregion und eine intrazelluläre, hochkonservierte Tyrosinkinaseregion. Es gibt drei verschiedene Subtypen von Trk-Rezeptoren, TrkA, TrkB und TrkC. Alle Subtypen haben eine hochkonservierte katalytische Tyrosinkinasestelle und eine membrannahe Phosphorylierungsstelle in der Zelle. Alle NTFs können an den p75-Rezeptor binden. Obwohl sowohl der Trk-Rezeptor als auch der p75NTR-Rezeptor eine Ligandenbindungsregion und eine zytoplasmatische Region aufweisen, weisen die Sequenzen der beiden keine Ähnlichkeiten auf. Nach der NTF-Dimerisierung bindet es an den Trk-Rezeptor, dimerisiert den Rezeptor und aktiviert die katalytische Tyrosin-Proteinkinase-Region. Der dimerisierte Trk-Rezeptor autophosphoryliert mehrere Signalwege innerhalb der Zelle. Diese werden nach Erkennung eines spezifischen Liganden an einer Erkennungsstelle tyrosinphosphoryliert und enthalten ein Phosphoserin-bindendes Motiv wie die Src-Homologieregion 2 (SH2). Die SH2-Bindungsproteinbindung aktiviert den Trk-Rezeptor, um seine neurotrophe Aktivität hauptsächlich über zwei verschiedene intrazelluläre Signalwege zu erreichen. Die wichtigsten neuronalen Überlebenswege, einschließlich des SH2-gebundenen Trk-Rezeptors, aktivieren die PI3K-Kinase, erhöhen ihren Phosphorylierungsgrad und aktivieren dann nacheinander nachgeschaltete Akts, die mehrere Funktionen im apoptotischen Programm haben. Darüber hinaus phosphoryliert der Trk-Rezeptor SH2 und aktiviert den Weg der Ras/roten Mitogen-aktivierten Proteinkinase (Ras/MAPK), der wiederum auf Transkriptionsfaktoren wie das cyclische Adenosin-Response-Element-Bindungsprotein (CREB) einwirkt. CREB-Proteine ​​spielen mehrere Rollen im Zellzyklus, Neuritenwachstum und synaptischer Plastizität. In ähnlicher Weise initiierte die Aktivierung des Trk-Rezeptors durch Phospholipase Cγ (PLC-γ) die PLCγ-Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat (PIP2), um den IP3/Ca2+/DAG/PKC-Signalweg zu erzeugen. Die Aktivierung des Trk-Rezeptors kann außerdem mehrere nachgeschaltete Wege aktivieren. Jeder NTF bindet selektiv an einen spezifischen Trk-Rezeptor, wie z. B. TrkA-Bindung an NGF, NTF3-TrkB-Bindung an BDNF, NTF3, NTF4-TrkC-Bindung an NTF3. P75NTFR, hat eine ähnliche Affinität zu anderen NTFS. Im Vergleich zum Trk-Rezeptor handelt es sich beim p75NTFR-Rezeptor um Rezeptoren mit niedriger Affinität. Und es interagiert mit Trk-Rezeptoren, um die Erkennung verschiedener neurotropher Faktoren zu verbessern.

Forschungsstand zu neurotrophen Faktoren und Rezeptoren

Während der Entwicklung des Nervensystems kommt es zu einem umfangreichen programmierten Zelltod, der die Anzahl der Zellen und die richtige Verteilung der Neuronen während der Entwicklung bestimmt. NTF wird früh in der Entwicklung stark exprimiert und ist für das neuronale Überleben und die Selektion in verschiedenen Entwicklungsstadien essentiell. Die neurotrophe Hypothese liefert eine funktionelle Analyse der Rolle von NTF bei der Entwicklung des Nervensystems. Das Nervensystem formt sich selbst, um die wettbewerbsfähigsten und angemessensten synaptischen Verbindungen aufrechtzuerhalten. Eine geringe Menge an NTF, die von Neuronen produziert wird, die Zielzellen komprimieren, zeigt das selektive Überleben der Zellen an. Im Zentralnervensystem ermöglicht die wiederholte Expression mehrerer NTF-Rezeptoren und verwandter Liganden eine Vielzahl unterschiedlicher Verknüpfungen, die es dem neuronalen Netzwerk ermöglichen, sich bis zur Reife auszudehnen. Darüber hinaus hat die aktuelle Forschung gezeigt, dass NTF, das von Neuronen sezerniert wird, auch auf sich selbst wirken kann (autokrine Übertragung) oder zum Axon transportiert werden kann, um auf benachbarte Neuronen zu wirken. Gleichzeitig können Gliazellen auch NTF durch parakrine Sekretion an Neuronen absondern. Im peripheren Nerv müssen die vom NTF-Reverse-Signalweg übertragenen Informationen effektiv über lange Distanzen, manchmal sogar über 1 Minute, übertragen werden. NTF fördert das Überleben und die Differenzierung von Neuronen während der Entwicklung, aber sie können auch den Tod von Neuronen steuern. Als pro-apoptotischer Rezeptor spielt p75NTFR eine Rolle bei der Apoptose der Entwicklung des Nervensystems und der Zellschädigung. Während des Apoptoseprozesses wird die Expression von p75NTFR erhöht. Die Bindung von BDNF an p75NTFR fördert die Apoptose und hemmt das Wachstum sympathischer Neuronen. Während der NTF-Produktion induzierten NTF-Vorläufer Apoptose in p75NTFR-verwandten Zellen effizienter als reifer NGF. Diese Ergebnisse zeigen, dass NTF während des Syntheseprozesses unterschiedliche Funktionen hat und NTF-Vorläufer vorzugsweise die p75NTFR-Rezeptor-vermittelte Apoptose aktivieren, während reifes NTF bevorzugt an Trk-Rezeptoren bindet und das neuronale Überleben fördert. NTF bindet an den Trk-Rezeptor, um das neuronale Überleben zu vermitteln, und die Bindung an p75NTFR vermittelt die neuronale Apoptose. Wenn neuronale Synapsen nicht richtig mit dem entsprechenden Ziel verbunden sind, können sie apoptotisch werden. Auf diese Weise kann NTF nicht nur den Trk-Rezeptor aktivieren, sondern auch p75NTFR aktivieren, was den Prozess des neuronalen Absterbens einleitet. Beispielsweise bindet BDNF an p75NTFR in sympathischen Neuronen, denen der TrkB-Rezeptor fehlt, und steuert den Zelltod. In ähnlicher Weise bindet NTF4 an p75NTFR in BDNF-abhängigen Trigeminusneuronen und vermittelt den Zelltod. Der vermutete Grund könnte sein, dass NT3 im Vergleich zum TrkB-Rezeptor bevorzugt an p75NTFR bindet. Daher kann die Aktivierung von Trk oder p75NTFR in derselben Zelle unterschiedliche Ergebnisse zeigen. Der durch p75NTFR vermittelte Zelltod kann bei der Verbesserung der richtigen neuronalen Verteilung während der Entwicklung wichtig sein. Jüngste Studien haben gezeigt, dass NTF eine äußerst wichtige Rolle bei der synaptischen Plastizität im erwachsenen Gehirn spielt. Viele neuronale Gemeinschaften verlassen sich nicht nur auf NTFS, das sie lebensfähig macht, sondern auch auf NTFS, das die neuronale Aktivität reguliert. Die Struktur der visuell dominanten Säule in der kortikalen Schicht 4 wird stark durch exogenes NTF wie BDNF beeinflusst, was auf die Entwicklungsregulation von NTF in der synaptischen Plastizität des visuellen Systems hinweist. Darüber hinaus hat die Verwendung von blockierenden Antikörpern im visuellen System gezeigt, dass eine Änderung der endogenen NTF-Spiegel seine Wirkungen dramatisch verändern kann. Kürzlich durchgeführte klinische Studien haben eine begrenzte Wirksamkeit bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Psychosen direkt mit NTF gezeigt. Erstens ist es ein großes Hindernis, genügend NTF zu liefern, um Neuronen im Körper zu erreichen. Da NTF als makromolekulares Protein wirkt, ist es schwierig, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Zweitens hat NTF eine Vielzahl von neurologischen Wirkungen im Körper. Im Zentralnervensystem kann die Zugabe großer Mengen von nicht unterscheidbarem NTF unvorhersehbare Nebenwirkungen wie Epilepsie verursachen. Darüber hinaus reguliert in klinischen Studien die unregulierte Verwendung von BDNF die Aktivität des TrκB-Rezeptors herunter, was letztendlich zu einer Abnahme der therapeutischen Wirksamkeit führt. Die neue Behandlungsstrategie soll NTF gezielt einsetzen, beispielsweise durch einen einstellbaren viralen Vektor. Diese Methode wurde bei der Behandlung von AD verwendet. Zunächst werden spezifische Neuronen identifiziert. Zum Beispiel unterliegen NGF-abhängige Neuronen an der Basis einer neurologischen Regression, und dann wird exogener NGF in die Stelle injiziert, um seine Verschlechterung zu verhindern. Exogener NTF hat jedoch viele Nachteile, einschließlich kurzer Halbwertszeit, unbefriedigender Pharmakodynamik, leicht oral durch Proteasehydrolyse zu verabreichen, großes Molekulargewicht, schwer durch die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, was einige Nebenwirkungen wie Immunreaktionen verursachen kann. Obwohl künstlich modifiziertes NT die Blut-Hirn-Schranke passieren kann, ist es teuer und in großen Mengen schwierig herzustellen. Die Entwicklung von Nicht-Polypeptiden mit neurotrophen niedermolekularen Verbindungen kann die obigen Probleme lösen. Seine Molekülmasse ist klein, seine Bioverfügbarkeit hoch, es kann die Blut-Hirn-Schranke durchdringen, es ist leicht zu synthetisieren und seine toxischen Wirkungen und Nebenwirkungen sind gering. Es soll ein neues Medikament zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen werden.


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Einführung

Strukturelle Varianten der Myelinscheide sind während der Evolution mehrmals entstanden, um die schnelle Weiterleitung von Nervenimpulsen entlang von Axonen zu ermöglichen, einschließlich bei Wirbeltieren und einigen Arten von Würmern und Garnelen (Roots, 2008). Im Zentralnervensystem (ZNS) von Kieferwirbeltieren erfolgt die Myelinisierung durch Oligodendrozyten, eine hochspezialisierte Gliazelle (Zalc, 2016). Die Förderung der Geschwindigkeit und Effizienz von Aktionspotentialen war in den letzten sieben Jahrzehnten der am besten verstandene Zweck von Oligodendrozyten und Myelin (Hartline und Colman, 2007). Obwohl diese Rolle unbestreitbar wichtig ist, wird auch zunehmend anerkannt, dass Neuronen für ihre langfristige Integrität die Unterstützung durch Glia, einschließlich Oligodendrozyten, benötigen. Wenn die oligodendrogliale Unterstützung verloren geht, werden Axone zunehmend beeinträchtigt und anfällig für Verluste. Daher werden Remyelinisierungsstrategien bei Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) verfolgt, in der Hoffnung, nicht nur kurzfristig die Nervenleitung wiederherzustellen, sondern langfristig auch Axone vor Degeneration zu schützen (Franklin et al., 2012 Franklin und Ffrench- Constant, 2017 Lubetzki et al., 2020b). In diesem Review skizzieren wir Beweise aus Tiermodellen und der Humanpathologie, die darauf hindeuten, dass die Integrität myelinisierter Neuronen von der Unterstützung durch Oligodendrozyten abhängt. Wir konzentrieren uns auf die jüngsten Fortschritte in unserem Verständnis der zellulären Mechanismen, durch die Oligodendrozyten die axonale und neuronale Integrität unterstützen, wie sich Neuronen an die Demyelinisierung anpassen und die intraaxonalen Kaskaden, die zu ihrer Degeneration beitragen.


Ergebnisse

Der attraktive Mittellinienligand Netrin und sein Rezeptor Frazzled (Fra) sind das einzige bekannte attraktive Ligand-Rezeptor-Paar in Drosophila, dennoch kreuzen viele kommissurale Axone in Abwesenheit einer attraktiven Netrin-Frazzled-Signalgebung immer noch die Mittellinie (Kolodziej et al., 1996 Mitchell et al., 1996). Kürzlich wurde gezeigt, dass der Rezeptor der Robo-Familie Robo2 unabhängig von Netrin und Fra über einen noch unbekannten Mechanismus die Überquerung der Mittellinie fördert (Spitzweck et al., 2010). In robo2, fra Doppelmutanten, die Mittellinienkreuzung der kommissuralen Axone ist stark beeinträchtigt, was zu dünnen oder fehlenden Kommissuren führt, einem Phänotyp, der qualitativ und quantitativ schwerwiegender ist als der Verlust von fra allein (Abbildung 1). Dieser Phänotyp kann beobachtet werden, indem das gesamte Axongerüst mit Anti-HRP-Antikörpern (Abbildung 1A–D) gefärbt wird oder indem eine Untergruppe der Kommissuraxone mit . markiert wird zB-GAL4 (Garbe et al., 2007 O'Donnell und Bashaw, 2013) in robo2, fra Doppelmutanten (Abbildung 1F–I). Um die Defekte beim Überqueren der Mittellinie zu quantifizieren, haben wir die Anzahl der Segmente bewertet, in denen die EW-Axone, die normalerweise die Mittellinie in der hinteren Kommissur überqueren, nicht überqueren (Abbildung 1, Histogramm). Das finden wir in robo2, fra Doppelmutanten ca. 70 % der EW-Axone überqueren die Mittellinie nicht, im Vergleich zu ca. 30 % in fra Mutanten. Die Analyse von Zellschicksalsmarkern einschließlich Eg, Even-Skipped und zfh1 zeigte keine groben Unterschiede in der Segmentierung und neuronalen Differenzierung in robo2, fra Doppelmutanten, und obwohl die Zellkörper der EW-Neuronen manchmal verdrängt waren, waren sie leicht identifizierbar (Daten nicht gezeigt). Wichtig ist die Wiederherstellung des Robo2-Ausdrucks durch die Einführung einer Kopie eines 83,9 kb robo2 Bakterielles künstliches Chromosom (BAC)-Transgen, das die gesamten 40 kb . enthält robo2 Transkriptionseinheit in diesem Hintergrund rettet signifikant die EW-Axon-Crossing-Defekte (Abbildung 1E, J), was bestätigt, dass dies a robo2-abhängiger Phänotyp.

Die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 erfordert nicht seine zytoplasmatische Domäne

Wenn Robo2 als Mittellinien-anziehender Rezeptor wirken sollte (Abbildung 1, Modell 1), wäre seine zytoplasmatische Domäne wahrscheinlich für die Anziehung der Mittellinie erforderlich. Um zu testen, ob die zytoplasmatische Domäne von Robo2 zu seiner kreuzungsfördernden Aktivität beiträgt, haben wir getestet, ob ein verkürzter Robo2-Rezeptor, dem seine zytoplasmatische Domäne (Robo2∆C) fehlt, die Mittellinienkreuzung fördern könnte, wenn er in embryonalen Neuronen fehlexprimiert wird. Wir fanden heraus, dass, wie bei Robo2 in voller Länge, eine panneurale Fehlexpression von Robo2∆C (mit elav-GAL4) führte zu einer starken ektopischen Kreuzung von FasII-positiven Axonen im embryonalen ZNS (Abbildung 2). Tatsächlich war der Robo2∆C-Fehlexpressionsphänotyp stärker als der Robo2 in voller Länge. Im Gegensatz dazu führte die panneurale Überexpression von Robo1 nicht zu einer ektopischen Kreuzung (Abbildung 2). In diesen Experimenten werden alle UAS-Robo-Transgene von derselben genomischen Insertionsstelle exprimiert, um sicherzustellen, dass sie auf ähnlichen Niveaus exprimiert werden. Wichtig ist, dass die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2∆C wahrscheinlich nicht allein durch einen dominant-negativen Effekt des verkürzten Rezeptors verursacht wird, da eine ähnlich verkürzte Form von Robo1 (Robo1∆C) in Kombination mit . einen qualitativ schwächeren ektopischen Kreuzungs-Phänotyp aufweist elav-GAL4 (Figur 2). Die Robo2∆C-Expression führt im Gegensatz zu Robo1∆C zu einer ektopischen Kreuzung aller ipsilateralen FasII-Axonbündel und führt auch dazu, dass viele Segmente a . aufweisen Schlitz-ähnlicher Phänotyp (Abbildung 2). Aufgrund der starken phänotypischen Effekte der gezielten Insertionslinien von Robo1∆C und Robo2∆C verglichen wir auch die Phänotypen, die durch niedrigere Expressionsniveaus der beiden verkürzten Rezeptoren unter Verwendung von Standard-UAS-Inserts erzeugt wurden, und beobachteten, dass Robo2∆C signifikant potenter ist beim Treiben der ektopischen Mittellinienüberquerung als vergleichbare Spiegel des Robo1∆C-Rezeptors (Abbildung 3). Zusammen weisen diese Beobachtungen darauf hin, dass die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 unabhängig von der zytoplasmatischen Domäne ist und sprechen gegen die Idee, dass Robo2 die Mittellinienkreuzung durch Signalanziehung fördert.

Robo2 kann das Crossing der Mittellinie unabhängig von seiner zytoplasmatischen Domäne fördern.

(EINE) Stadium 17 Embryonen tragen elav-GAL4 und die angegebenen FH-Robo Transgene, gefärbt mit Anti-HRP (Magenta) und dem longitudinalen Signalweg-Marker Anti-FasciclinII (FasII grün). (EIN) Embryonen tragen elav-GAL4 allein zeigen eine Wildtyp-Anordnung von Axonwegen, einschließlich verschiedener vorderer und hinterer Kommissuren und drei FasII-positiver Längswege, die die Mittellinie nicht kreuzen. (B) In elav-GAL4/UAS-Robo1 Embryonen ist die Kommissurenbildung stark beeinträchtigt und es wird keine ektopische Mittellinienkreuzung von FasII-positiven Axonen beobachtet. (C) Falscher Ausdruck von Robo2 mit elav-GAL4 erzeugt einen biphasischen Phänotyp, bei dem einige Segmente fast kommissurenlos erscheinen (Pfeilspitze mit Sternchen), während andere eine ektopische Kreuzung aufweisen, die an . erinnert robo1 Mutanten (Pfeil). Siehe Abbildung 5 für die Quantifizierung der ektopischen Kreuzung in elav-GAL4/UAS-Robo2 Embryonen. (D und E) Falsche Ausdrücke von abgeschnittenen Formen von Robo1 (Robo1∆C) oder Robo2 (Robo2∆C) mit elav-GAL4 induziert eine ektopische Kreuzung in 100 % der Segmente, obwohl der Robo2∆C-Fehlexpressionsphänotyp qualitativ schwerwiegender ist als der von Robo1∆C. In elav-GAL4/UAS-Robo1C Embryonen (D) nur der mediale FasII-Pfad kreuzt die Mittellinie und das Axongerüst insgesamt weist a robo1-wie Aussehen, während in elav-GAL4/UAS-Robo2C Embryonen (E) kollabieren alle drei FasII-positiven Bahnen an der Mittellinie in fast jedem Segment und das Axongerüst erscheint Schlitz-mögen. Alle hier gezeigten UAS-Robo-Transgene wurden an derselben genomischen Stelle (86FB) eingefügt, um äquivalente Expressionsniveaus sicherzustellen.

Vergleich von Robo1∆C und Robo2∆C Zunahme der Funktionsaktivitäten.

Da die Effekte der Expression von ∆C-Transgenen in der 86Fb-Insertionsstelle zu stark sind, um einen quantitativen Vergleich zu ermöglichen, haben wir traditionelle UAS-Insertionslinien verwendet, die auf niedrigeren und vergleichbaren Niveaus exprimiert werden (rechte Felder, Anti-Myc ist grün und Anti-FasII . dargestellt). in Magenta), um die Aktivitäten von Robo1∆C und Robo2∆C zu vergleichen. Bei Embryonen, die nur an exprimieren elav-GAL4 Transgen (oben links), FasII-Axone erscheinen als Wildtyp und bleiben ipsilateral. Eine Fehlexpression von Robo2 führt zu einem hohen Grad an ektopischer Kreuzung. Die Robo2∆C-Expression führt zu einem viel höheren Grad an ektopischer Mittellinienkreuzung als dies bei Robo1∆C der Fall ist. Segmente mit ektopischer Mittellinienkreuzung von FasII-Axonen sind rechts quantifiziert. Die Signifikanz wurde durch mehrere Vergleiche mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur (*p < 0,001). Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 hängt nicht ausschließlich von der Schlitzbindung ab

Slit ist der kanonische Ligand für Rezeptoren der Robo-Familie, und alle drei Drosophila Robos können sich an die Single binden Drosophila Schlitz (Howitt et al., 2004). Um zu testen, ob die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 von seiner Fähigkeit abhängt, Slit zu binden, haben wir die kanonische Slit-Bindungsdomäne (die erste Immunglobulin-ähnliche Domäne: Ig1) aus Robo2 entfernt. Wie durch frühere in-vitro-Bindungsstudien mit Drosophila Robo1 (Brose et al., 1999, Fukuhara et al., 2008), fanden wir, dass die Deletion von Ig1 aus Robo2 die Slit-Bindung in kultivierten Drosophila Zellen (Abbildung 4 und Abbildung 4 – Abbildungsergänzung 1). Die panneurale Überexpression von Robo2 erzeugt einen Phänotyp, bei dem einige Axone von der Mittellinie abgestoßen werden und einige Axone die Mittellinie ektopisch kreuzen, was die beiden gegensätzlichen Aktivitäten von Robo2 bei der Regulierung der Mittellinienkreuzung widerspiegelt. Wie erwartet verhindert die Deletion der Ig1-Domäne, dass Robo2 in vivo eine Mittellinienabstoßung signalisiert, sowohl in allen Neuronen (bei pan-neuraler Expression mit elav-GAL4) (Abbildung 5) und in einer Untergruppe von kommissuralen Neuronen (die EW-Neuronen, gekennzeichnet mit zB-GAL4) (Abbildung 4), was bestätigt, dass die Schlitzbindung für die Robo2-vermittelte Abstoßung erforderlich ist. Im Gegensatz dazu fanden wir, dass der Robo2-Rezeptor, dem Ig1 fehlt, eine teilweise Fähigkeit zur Förderung der ektopischen Mittellinienkreuzung von FasII-positiven Axonen beibehielt, was darauf hindeutet, dass die Pro-Kreuzungsaktivität von Robo2 nicht streng von seiner Fähigkeit zur Bindung von Slit abhängt (Abbildung 5). Bemerkenswerterweise war der durch die Fehlexpression von Robo2∆Ig1 erzeugte ektopische Kreuzungsphänotyp signifikant schwächer als der, der durch die Fehlexpression von Robo2 in voller Länge verursacht wird (Abbildung 5). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Ig1-Domäne zur Förderung der Mittellinienkreuzung durch Robo2 beiträgt, aber nicht unbedingt erforderlich ist.

Schlitzbindung und Robo-Funktionsgewinn.

(EINE) Schlitzkonditioniertes Medium wurde gesammelt und verwendet, um Zellen zu behandeln, die die angegebenen HA-markierten Rezeptoren exprimieren. Die Rezeptorexpression wird mit Anti-HA in den oberen Feldern (Magenta) und Anti-Slit-Färbung in den unteren Feldern (grün, A′–E′). Robo1 (EIN), Robo2 (B) und Robo2∆Ig2 (D) binden effizient an Slit, während in Zellen, die Robo2∆Ig1 exprimieren (C) oder Robo2∆Ig1+2 (E). (FJ) Embryonen der Stufe 16, die das angegebene Transgen in den zB kommissuralen Interneuronen exprimieren. HRP markiert das Axongerüst (magenta) und Anti-GFP markiert die Eg-Neuronen. Die Prozentsätze unter jedem Feld geben den Prozentsatz der EW-Axone an, die in jeder Bedingung die Mittellinie nicht überschreiten. Ausdruck von Robo1 (F), Robo2 (g) und Robo2∆Ig2 (ich) führen alle zu einer starken Unterbrechung der Mittellinienüberquerung, während die Expression von Robo2∆Ig1 (h) und Robo2∆Ig1+2 (J) führen zu kaum oder gar keinen Kreuzungsfehlern.

Die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 hängt von seiner Ig2-Domäne ab.

(EINF) Stadium 17 Embryonen tragen elav-GAL4 und die angegebenen FH-Robo Transgene, gefärbt mit Anti-HRP und Anti-FasII. (EIN) Embryonen tragen elav-GAL4 allein zeigen eine Wildtyp-Anordnung von Axonwegen, einschließlich dreier FasII-positiver Längswege, die die Mittellinie nicht kreuzen. (B) Robo1 fördert nicht die Mittellinienkreuzung von FasII-positiven Axonen, wenn es in allen Neuronen mit fehlexprimiert wird elav-GAL4. (C) Die Fehlexpression von Robo2 in voller Länge induziert in über 80% der Segmente eine ektope Mittellinienüberquerung (Pfeil). (D) Das Deletieren der Ig1-Domäne (Robo2 ∆Ig1) unterbricht die Schlitzbindung, verhindert jedoch nicht vollständig, dass Robo2 das Überqueren der Mittellinie fördert. (E und F) Robo2-Rezeptoren, denen die Ig2-Domäne (Robo2 Ig2) oder sowohl die Ig1- als auch die Ig2-Domäne (Robo2 ∆Ig1+2 ) fehlt, sind nicht in der Lage, die ektopische Mittellinienüberschreitung oberhalb des Hintergrundniveaus zu fördern (beide sind mit Robo3 vergleichbar, siehe Histogramm). Schemata zeigen die Domänenzusammensetzung von Rezeptoren, die in (EINF). Alle hier gezeigten UAS-Robo-Transgene wurden an derselben genomischen Stelle (86FB) eingefügt, um äquivalente Expressionsniveaus sicherzustellen. Das Histogramm quantifiziert die ektopische Mittellinienkreuzung in den angegebenen Genotypen. Die Signifikanz wurde durch mehrere Vergleiche mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur (*p < 0,01). Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Die Ig2-Domäne von Robo2 ist für seine Pro-Crossing-Aktivität erforderlich

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 zumindest teilweise durch seine Ig2-Domäne vermittelt wird: Ersetzen der Ig1-Ig2-Region von Robo1 durch die äquivalente Region von Robo2 (Robo1 R2Ig1+2 ) verleiht Robo2-ähnliche Pro-Crossing-Aktivität an Robo1 (Evans und Bashaw, 2010b). Darüber hinaus beseitigt das Ersetzen von Ig1–Ig2 von Robo2 durch Robo1 Ig1–Ig2 (Robo2 R1Ig1+2 ) seine kreuzungsfördernde Aktivität (Evans und Bashaw, 2010b). Um direkt zu testen, ob Ig2 für Robo2 notwendig ist, um die Mittellinienüberquerung zu fördern, haben wir einen Robo2-Rezeptor generiert, dem Ig2 fehlt, aber alle anderen Ig-Domänen intakt sind (Robo2∆Ig2). Wir fanden heraus, dass das Löschen der Ig2-Domäne von Robo2 weder die Slit-Bindung (Abbildung 4) noch die Fähigkeit von Robo2 beeinflusste, die Abstoßung in kommissuralen Neuronen zu signalisieren (Abbildung 4). Die Deletion der Ig2-Domäne von Robo2 störte jedoch stark seine Fähigkeit, die ektopische Mittellinienkreuzung zu fördern (Abbildung 5). Die geringe ektopische Kreuzung, die durch Robo2∆Ig2 induziert wurde, war nicht zu unterscheiden von der durch Robo3 verursachten, einem verwandten Rezeptor, der die pro-Mittellinien-Kreuzungsaktivität von Robo2 nicht teilt (Abbildung 5). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen, die mit Robo2∆Ig1 beobachtet wurden, dem die spaltabhängige Mittellinien-Abstoßungsaktivität fehlt, aber eine gewisse Pro-Mittellinien-Kreuzungsaktivität beibehält (Abbildungen 4, 5). Diese Daten zeigen, dass die Ig2-Domäne von Robo2 für die Förderung der Mittellinienüberquerung essentiell ist, wenn Robo2 in allen Neuronen fehlexprimiert wird. In diesen Experimenten werden alle UAS-Robo-Transgene von derselben genomischen Insertionsstelle exprimiert, um sicherzustellen, dass sie auf ähnlichen Niveaus exprimiert werden. Darüber hinaus haben wir die Proteinlokalisation und die Expressionsniveaus von Robo2 und seinen Deletionsvarianten untersucht und eine vergleichbare Oberflächenexpression in kultivierten S2R+-Zellen in vitro sowie vergleichbare Expressionsniveaus und Lokalisation in ZNS-Axonen in vivo beobachtet (Abbildung 4 – Abbildungsergänzung 2). .

Robo2 kann das nicht-autonome Überqueren fördern

Mittellinienkreuzung wird stark reduziert in robo2, fra Doppelmutanten und panneurale Fehlexpression von Robo2 können ektopische Mittellinienkreuzungen fördern. Es ist jedoch unklar, ob Robo2 autonom oder nicht autonom agiert, um das Überqueren der Mittellinie zu fördern. Die Ektodomänen-abhängige Natur der Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 und unsere panneuralen Fehlexpressions-Assays unterscheiden nicht zwischen diesen Möglichkeiten. In der Tat, elav-GAL4 wird vorübergehend sowohl in der Mittellinie der Glia als auch in postmitotischen Neuronen exprimiert, was uns daran hindert, einen nicht-neuronalen Beitrag zu den beobachteten Fehlexpressions-Phänotypen auszuschließen. Bemerkenswerterweise haben wir nie einen eindeutig zellautonomen Pro-Crossing-Phänotyp beobachtet, der durch Robo2 verursacht wird. Wir haben zuvor eine Reihe von Experimenten beschrieben, in denen wir vollständige, verkürzte oder chimäre Rezeptorvarianten von Robo1 und Robo2 in einer Untergruppe von ipsilateralen Neuronen (den apterösen Neuronen, gekennzeichnet mit ap-GAL4) (Evans und Bashaw, 2010b). Im Gegensatz zu den sehr unterschiedlichen Phänotypen, die durch panneurale Fehlexpressionen dieser beiden verkürzten Rezeptoren verursacht werden (wobei Robo2∆C viel stärker bei der Induktion der Mittellinienüberquerung ist als Robo1∆C), induzieren Robo1∆C und Robo2∆C ähnlich niedrige Spiegel der ektopischen Kreuzung, wenn sie in den apterösen Neuronen exprimiert wird (Abbildung 6A). Wir interpretieren dies als einen zellautonomen dominant-negativen Effekt dieser verkürzten Rezeptoren.

Robo2 wirkt zellunautonom, um die Mittellinienüberquerung in ipsilateralen Neuronen zu fördern.

(EIN) Embryonen der Stufe 17, gefärbt mit Anti-HRP (Magenta) und Anti-GFP (Grün) Antikörpern. Anti-GFP markiert die apterösen (ap) Zellkörper und Axone, die normalerweise ipsilateral vorspringen. Eine Fehlexpression von Robo2ΔC in ap-Neuronen führt zu einem milden ektopischen Kreuzungs-Phänotyp, der der Wirkung von Robo1ΔC ähnlich ist (Pfeilspitzen mit Sternchen). Segmente mit ektopischer Kreuzung von Ap-Axonen werden im Histogramm quantifiziert. (B) Embryonen der Stufe 17, gefärbt mit Anti-FasII (Magenta) und Anti-GFP (grün) Antikörpern. Anti-GFP markiert die Axone von hb9-GAL4 Zellen exprimieren. Falscher Ausdruck von Robo2 mit hb9-GAL4 führt zu einer seitlichen Verschiebung von hb9-Gal4+ Axone und verursacht FasII+ Axone, die nicht exprimieren hb9-GAL4 die Mittellinie ektopisch zu überqueren.

Robo2 in voller Länge ist nicht in der Lage, die Mittellinienüberquerung der apterösen Axone autonom zu fördern (Evans und Bashaw, 2010b). Stattdessen leitet Robo2-Fehlexpression apteröse Axone in seitliche Regionen des Neuropils um. Im Zuge der Untersuchung dieser seitlichen Positionierungsaktivität von Robo2 haben wir Robo2 in einer zweiten Klasse von longitudinalen Interneuronen falsch exprimiert: denjenigen, die mit . gekennzeichnet sind Hb9-GAL4. Interessanterweise haben wir bei Embryonen zwei verschiedene Phänotypen beobachtet, bei denen Hb9-GAL4 treibt den Robo2-Ausdruck an. Zuerst, Hb9-positive Axone wurden in seitlichere Positionen innerhalb des Neuropils verschoben. Sekunde, Hb9-negative FasII-positive Axone überquerten ektopisch die Mittellinie (Abbildung 6B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Robo2 die seitliche Position von Hb9-positive Axone, während sie nicht autonom FasII-Axone anweisen, die Mittellinie zu überqueren. Wir notieren das Hb9-GAL4 Ausdruck beginnt früher als ap-GAL4 und umfasst eine größere Anzahl von Neuronen, einschließlich einiger in der Nähe der ZNS-Mittellinie (wie die RP-Motorneuronen), was auf die Möglichkeit hindeutet, dass die frühe mittelliniennahe Expression von Robo2 für den nicht-autonomen Effekt verantwortlich ist, der bei . beobachtet wurde Hb9-GAL4.

Um expliziter zu testen, ob Robo2 das nicht-autonome Überqueren der Mittellinie fördern kann, haben wir verwendet Schlitz-GAL4 um die Robo2-Expression in der Mittellinie von Glia und Neuronen zu fördern. Wir fanden heraus, dass eine Fehlexpression von Robo2 oder Robo2∆C in Mittellinienzellen viele FasII-positive Axone verursacht, die nicht exprimieren Schlitz-GAL4 die Mittellinie ektopisch zu überqueren, was bestätigt, dass Robo2 nicht autonom agieren kann, um die Mittellinienkreuzung von Axonen zu fördern, und dass dieser Effekt nicht von der zytoplasmatischen Domäne abhängt (Abbildung 7). Wir beobachteten einen signifikant milderen Effekt bei der Fehlexpression von Robo1, was darauf hindeutet, dass die nicht zellunabhängige Aktivität von Robo2 nicht ausschließlich eine Folge der Schlitztitration ist (Abbildung 7). Darüber hinaus scheint diese nicht zellunabhängige Aktivität von Robo2 Ig1/Ig2-abhängig zu sein, da Robo1 R2Ig1+2, aber nicht Robo2 R1Ig1+2 eine starke ektopische Mittellinienkreuzung förderte, wenn sie unter Verwendung von exprimiert wurde Schlitz-GAL4 (Abbildung 7). Darüber hinaus wird die Expression von Robo2-Varianten, denen entweder Ig1 oder Ig2 fehlt, mit Schlitz-Gal4 führte zu keiner ektopischen Mittellinienkreuzung (Abbildung 7). Der Bedarf an sowohl Ig1 als auch Ig2 steht in diesem Zusammenhang im Gegensatz zu unseren Ergebnissen mit pan-neuraler Fehlexpression, bei der Robo2∆Ig1 eine gewisse Pro-Crossing-Aktivität beibehielt. Es ist jedoch erwähnenswert, dass der von erzeugte Phänotyp elav-GAL4 Fehlausdruck von Robo2 ist stärker als der von Schlitz-GAL4, vielleicht weil Schlitz-GAL4 wird in einer viel kleineren Anzahl von Zellen exprimiert.

Robo2 kann das nicht zellautonome Kreuzen fördern.

(EIND) Embryonen der Stufe 17, gefärbt mit Anti-HRP (Magenta) und Anti-FasII (grün). (EIN und B) Falscher Ausdruck von Robo1 (EIN) in Mittellinienzellen mit Schlitz-GAL4 führt zu einem milden ektopischen Kreuzungs-Phänotyp. Im Gegensatz dazu ist die Fehldarstellung von Robo2 (B) erzeugt einen viel stärkeren Effekt, wie durch die Quantifizierung der ektopischen FasII-Kreuzung im Histogramm (ich). (C und D) Fehlexpression von entweder Robo2∆Ig1 (C) oder Robo2∆Ig2 (D) mit Schlitz-GAL4 erzeugt keine ektopische Kreuzung von FasII-Axonen. (E und F) In Übereinstimmung mit den ersten beiden IG-Domänen von Robo2 produziert das chimäre Protein Robo1 R2IG(1+2) einen ektopischen Kreuzungs-Phänotyp (F), während Robo2 R1(IG1+2) keine Wirkung hat (E). (g und h) Fehlausdruck von Robo2∆C mit Schlitz-GAL4 führt auch zu schweren ektopischen Kreuzungsdefekten (h), die viel stärker sind als die mit Robo1∆C beobachteten (g), wie durch die Quantifizierung der ektopischen FasII-Kreuzung (ich) und fusionierte Kommissuren, die in Anti-HRP-gefärbten Embryonen beobachtet wurden (J). Alle UAS-Robo-Transgene wurden an derselben genomischen Stelle (86FB) eingefügt. Die Signifikanz wurde durch mehrere Vergleiche mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur (*p < 0,001). Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Robo2 wird in der Mittellinie Glia und Neuronen während der Kommissurenbildung exprimiert

Robo2 kann das Überqueren der Mittellinie fördern, wenn es in einer Untergruppe von embryonalen Neuronen und Glia sowie endogen exprimiert wird robo2 trägt zur Mittellinienkreuzung der kommissuralen Axone bei. Während der Embryogenese, robo2 Die Expression wird dynamisch reguliert: Sie wird in frühen Stadien der ZNS-Entwicklung im Allgemeinen in Neuronen exprimiert, einschließlich der vorübergehenden Expression in einer Reihe von ipsilateralen Pionierneuronen, und wird später auf Neuronen beschränkt, deren Axone longitudinale Bahnen in den lateralen Regionen des Neuropils bilden (Simpson et al., 2000a). Um zusätzliche Einblicke in die Rolle von Robo2 bei der Förderung der Mittellinienüberquerung kommissuraler Neuronen zu gewinnen, untersuchten wir robo2 mRNA- und Proteinexpression in Embryonen während der frühen Stadien der Axonpfadfindung, wenn die ersten kommissuralen Axone die Mittellinie überqueren (Stadien 12-13). Mittels fluoreszierender mRNA-in-situ-Hybridisierung konnten wir robo2 mRNA-Expression in Zellen, die mit markiert sind Schlitz-GAL4 in Embryonen im späten Stadium 12, ungefähr zu der Zeit, zu der Pionier-Kommissuralaxone die Mittellinie kreuzen (Abbildung 8B). robo2 Die mRNA-Expression bleibt bis zum Ende von Stufe 13 bestehen, ist aber in Stufe 14 nicht mehr nachweisbar, daher Mittellinienexpression von robo2 fällt mit der Zeit zusammen, zu der die meisten kommissuralen Axone die Mittellinie kreuzen (Abbildung 8, Abbildung 8 – Abbildungsergänzung 1). Außerdem, a robo2-GAL4 Enhancer-Trap-Insertion wird zu diesem Zeitpunkt in der Mittellinie der Glia exprimiert, wie durch Anti-GFP-Färbung in nachgewiesen robo2-GAL4, UAS-TauMycGFP Embryonen (Abbildung 8A). Ausdruck von FH-HARobo2 mit robo2-Gal4 und der Nachweis von transgenem Robo2 mit Anti-HA zeigt ein Expressionsmuster, das dem endogenen Muster des Robo2-Proteins sehr ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass die robo2-GAL4 meldet getreu den Robo2-Ausdruck (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus konnten wir eine schwache Expression des Robo2-Proteins nachweisen, das von einem HA-markierten Knock-in-Allel von . produziert wird robo2 (Spitzweck et al., 2010) in einer Teilmenge von Schlitz-GAL4 exprimierende Zellen im Stadium 12, was bestätigt, dass das Robo2-Protein in den Mittellinienzellen während der Stadien der Auffindung des kommissuralen Axonpfades produziert wird, und die Möglichkeit erhöht, dass Robo2 in diesen Zellen endogen wirkt, um die Mittellinienkreuzung von kommissuralen Axonen zu fördern (Abbildung 8B).

Robo2 wird in Mittellinienzellen während der kommissuralen Axonpfadfindung exprimiert und robo2 überexprimiert mit Schlitz-GAL4 stellt die Überquerung der Mittellinie in . wieder her robo2, fra Doppelmutanten.

(EIN) EIN robo2-GAL4 Verstärkerfalle, die rekapituliert robo2's endogenes Expressionsmuster treibt UAS-TauMycGFP Expression (grün) in Mittellinienzellen in den Stadien 12–13, wenn viele kommissurale Axone die Mittellinie kreuzen. Die Mittellinien-Glia wird durch einen Anti-Wrapper-Antikörper (Magenta) markiert. (B) Oben: Fluoreszierend in situ für robo2 mRNA (grün). robo2 wird vorübergehend in der Mittellinie Glia und Neuronen (Magenta) während des Stadiums 12 (Pfeile) exprimiert. Dieses in-situ-Signal wird in nicht beobachtet robo2 mutierte Embryonen, die die Spezifität des mRNA-Nachweises bestätigen (rechts). (B) Unten: Robo2-Protein wird in Mittellinienzellen während der Phasen der kommissuralen Axonpfadfindung exprimiert, wie das Expressionsmuster eines HA-markierten . zeigt robo2 cDNA-Knock-in-Allel (robo2 HArobo2 ). Embryonen im Stadium 12 tragen robo2 HArobo2 , Schlitz-GAL4, und UAS-TauMycGFP HARobo2-Ausdruck anzeigen in SchlitzGAL4-exprimierende Zellen (Pfeile), während dieses Signal in Kontrollembryonen (rechts) nicht nachgewiesen wird. (Cg) Embryonen im Stadium 14 der angegebenen Genotypen, gefärbt mit Anti-HRP-Antikörpern, um alle ZNS-Axone zu markieren. Das Fehlen von PC wurde in den abdominalen Segmenten A1–A8 bewertet (Pfeile zeigen Beispiele für fehlende Kommissuren an). Die PC-Defekte von robo2, fra Doppelmutanten (D) werden durch Überexpression erheblich gerettet UAS-Robo2 mit Schlitz-GAL4 (E), während die Überexpression von UAS-Robo2ΔIg1 (F) oder UAS-Robo2ΔIg2 (g) hat keine Auswirkung. Embryonen wurden blind bezüglich des Genotyps bewertet. Die Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA bewertet, gefolgt von mehreren Vergleichen mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur (*p < 0,01). Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Mittellinienausdruck von Robo2 rettet die kommissuralen Defekte in fra, robo2 Mutanten

Robo2 kann die Überquerung der Mittellinie nicht-autonom und endogen fördern robo2 Ausdruck kann nachgewiesen werden in Schlitz-GAL4-exprimierende Zellen sowie in kontralateralen und ipsilateralen Neuronen während der Anfangsstadien der Kommissurenbildung ( 8 und Daten nicht gezeigt). Unsere Fähigkeit zur teilweisen Rettung der Mittellinienüberquerung in robo2, fra Doppelmutanten mit dem robo2 BAC bestätigt, dass dies a robo2-spezifischen Phänotyp, geht aber nicht darauf ein, in welchen Zellen robo2 wirkt, um kommissurale Axone anzuweisen, die Mittellinie zu überqueren. Um diese Frage zu beantworten, haben wir versucht zu retten robo2's endogene Pro-Crossing-Aktivität durch Wiederherstellung robo2 Expression in eingeschränkten Teilmengen von Zellen in robo2, fra Doppelmutanten. Wir haben Robo2 zuerst in den kommissuralen EW-Neuronen exprimiert (unter Verwendung von zB-GAL4) in robo2, fra Doppelmutanten. Wir fanden heraus, dass weder Robo2 in voller Länge noch Robo2ΔC die Mittellinienüberquerung retten können, wenn sie autonom in den EW-Neuronen exprimiert werden (Abbildung 9), was darauf hindeutet, dass Robo2 möglicherweise nicht zellautonom agiert, um die Mittellinienüberquerung zu fördern. Als nächstes versuchten wir, die Überquerung der Mittellinie in zu retten robo2, fra Doppelmutanten durch Expression von Robo2 mit Schlitz-GAL4. Auffallenderweise fanden wir heraus, dass die Förderung der Robo2-Expression in diesen Zellen die Bildung der hinteren Kommissur signifikant wiederherstellt, wie durch Anti-HRP-Färbung gemessen (Abbildung 8C–G). Darüber hinaus ist dieser Effekt von Ig1 und Ig2 abhängig (Abbildung 8C–G). Zelltyp-spezifische Funktionsverlustexperimente werden notwendig sein, um den Ort der endogenen Aktivität von Robo2 zu bestätigen, und unsere Versuche, dies zu rekapitulieren robo2, fra Phänotyp durch Überexpression von RNAi-Transgenen waren bisher erfolglos, wahrscheinlich aufgrund der bekannten Schwierigkeit, in embryonalen Stadien einen ausreichenden Knockdown zu erreichen. Nichtsdestotrotz legen unsere Ergebnisse nahe, dass Robo2 die Mittellinienkreuzung nicht-zellautonom fördert und in den Mittellinien-Glias und Neuronen, wo es während der Phasen der Auffindung des kommissuralen Axonpfads exprimiert wird, wirken kann, um die Mittellinienkreuzung von kommissuralen Axonen zu fördern.

Robo2 kann die Mittellinie kreuzende Zelle nicht autonom retten.

(EIND) Embryonen im Stadium 16 der angegebenen Genotypen, gefärbt mit Anti-HRP (Magenta) und Anti-GFP (Grün) Antikörpern. Anti-GFP markiert die EG- und EW-Zellkörper und Axone. EW-Kreuzungsfehler in robo2, fra Doppelmutanten (EIN) werden nicht gerettet von zB-GAL4 vermittelte Überexpression von UAS-Robo2 (B), UAS-Robo2ΔIG1 (C), oder UAS-Robo2ΔC (D), was darauf hindeutet, dass Robo2 nicht zellautonom agieren kann, um das Crossing der Mittellinie zu fördern. Segmente mit sich nicht kreuzenden EW-Axonen sind durch Pfeilspitzen mit Sternchen gekennzeichnet. Die Signifikanz wurde durch mehrere Vergleiche mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen irgendeinem der Genotypen beobachtet (p > 0,3). Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Robo2 kann der Slit-Robo1-Abstoßung entgegenwirken

Robo2 kann das Kreuzen von Axonen in der Mittellinie unabhängig von seiner zytoplasmatischen Domäne und seiner Slit-bindenden Ig1-Domäne fördern, was darauf hindeutet, dass Robo2 das Kreuzen nicht fördert, indem es als attraktiver Signalrezeptor wirkt oder allein durch die Titration von Slit. Wirkt Robo2 der Abstoßung von Slit-Robo1 durch einen anderen Mechanismus entgegen? Um diese Hypothese zu testen, nutzten wir Komm Mutanten, die einen genetischen Hintergrund liefern, bei dem die hyperaktive Slit-Robo1-Signalgebung das Überqueren der Mittellinie vollständig verhindert. In Komm Mutanten wird endogenes Robo1 in unangemessener Weise in die kommissuralen Axone vor der Kreuzung zur Plasmamembran des Wachstumskegels transportiert, was eine vorzeitige Spaltabstoßung auslöst und die Bildung von Kommissuren verhindert. Wir kamen zu dem Schluss, dass, wenn Robo2 die Abstoßung von Slit-Robo1 antagonisiert, die Fehlausdrücke von Robo2 die Mittellinienüberquerung in wiederherstellen könnten Komm mutierte Embryonen. Tatsächlich panneurale Fehlausdrücke von Robo2 mit elav-GAL4 deutlich restaurierte Kommissurenbildung in Komm mutierte Embryonen (Abbildung 10). Um die Ig1/Ig2-Abhängigkeit der Pro-Kreuzungsaktivität von Robo2 in diesem Assay spezifisch zu testen, haben wir unsere chimären Ig1+2-Rezeptoren (Robo1 R2Ig1+2 und Robo2 R1Ig1+2 ) mit . fehlexprimiert elav-GAL4 in Komm mutierte Embryonen. Wir fanden heraus, dass eine panneurale Fehlexpression von Robo1 R2Ig1+2 in Komm mutierte Embryonen unterdrückten den kommissurenlosen Phänotyp stark und stellten die Mittellinienkreuzung vieler Axone wieder her, wie durch Anti-HRP-Antikörper-Färbung untersucht wurde, während die Fehlexpression von Robo2 R1Ig1+2 eine viel mildere Wirkung hatte ( 10 ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Robo2 die Mittellinienüberquerung in einer Ig1/Ig2-abhängigen Weise fördert, indem er der kanonischen Slit-Robo1-Abstoßung entgegenwirkt.

Robo2-Rezeptoren, die das Überqueren der Mittellinie fördern, unterdrücken Komm Mutanten.

(EIN) Schematische Darstellung der beiden chimären Rezeptoren in (B und C). Robo1-Sequenzen sind blau und Robo2-Sequenzen gelb dargestellt. (B und C) Embryonen der Stufe 16 des angegebenen Genotyps, gefärbt mit Anti-HRP, um ZNS-Axone sichtbar zu machen, und Anti-HA, um den Epitop-markierten chimären Rezeptor sichtbar zu machen. Einkanalbilder von HRP und HA werden rechts neben den Farbtafeln angezeigt. Expression des chimären Rezeptors HA-Robo2 R1Ig1−2 in a Komm mutierter Hintergrund (B) stellt die Kommissurenbildung nicht wieder her, während die Expression des reziproken HA-Robo1 R2Ig1+2 chimären Rezeptors (C) unterdrückt stark die Komm mutierten Phänotyp. (D und E) Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl von Kommissuren pro Embryo in Komm Mutanten, die die angegebenen HA-markierten Rezeptortransgene entweder in allen Neuronen exprimieren, unter Verwendung von elav-GAL4 (D) oder in Mittellinienzellen mit Schlitz-GAL4 (E). Die Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA bewertet, gefolgt von mehreren Vergleichen mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur (*p < 0,0001) (**p < 1,0 e−10). Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Wir konnten auch die Komm mutierten Phänotyp durch Überexpression von Robo2 mit Schlitz-GAL4, und dieser Effekt war vollständig von Ig1 und Ig2 von Robo2 abhängig (Abbildung 10). Dies stimmt mit unseren Beobachtungen überein, dass Robo2 zellunabhängig agieren kann, um ektopische Mittellinienkreuzungen (Abbildung 7) zu fördern und Mittellinienkreuzungsdefekte (Abbildung 8) in einer Ig1/2-abhängigen Weise zu retten. Bemerkenswert ist die unterdrückende Wirkung der Robo2-Expression in Komm Mutanten ist viel größer, wenn sie in Mittellinienzellen exprimiert werden, als wenn sie panneural exprimiert werden ( 10 ). Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Robo2 in voller Länge bei pan-neuraler Expression zusätzlich zu seiner kreuzungsfördernden Aktivität auch eine abstoßende Aktivität aufweist. Im Gegensatz dazu wäre Robo2, wenn es in Mittellinienzellen exprimiert wird, nicht in der Lage, als abstoßender Rezeptor zu wirken.

Robo2 bindet in vivo an Robo1 und die Interaktion hängt von Ig1 und Ig2 ab

Wie oben gezeigt, ist Robo2 in der Lage, der Slit-Robo1-Abstoßung auf Ig1/Ig2-abhängige Weise entgegenzuwirken. Eine Möglichkeit besteht darin, dass Robo2 mit Robo1 einen inhibitorischen Rezeptor-Rezeptor-Komplex bilden könnte, um zu verhindern, dass es als Reaktion auf Slit eine Abstoßung der Mittellinie signalisiert. Wenn dies der Fall ist, argumentierten wir, dass wir in der Lage sein könnten, eine physikalische Interaktion zwischen Robo2 und Robo1 in embryonalen Proteinextrakten nachzuweisen. Um diese Idee zu testen, haben wir mit Epitopen markierte Formen von Robo1 und Robo2 falsch ausgedrückt Drosophila embryonale Neuronen mit elav-GAL4 und suchte nach physikalischen Wechselwirkungen durch Co-Immunpräzipitation (Abbildung 11). Wir fanden heraus, dass Robo1-myc und HA-Robo2 aus embryonalen Lysaten co-immunpräzipitierten, wenn beide in embryonalen Neuronen exprimiert wurden ( 11A ). Interaktionen wurden auch zwischen Robo1 und dem eng verwandten Robo3-Rezeptor beobachtet, jedoch nicht mit einem ähnlich markierten und strukturell verwandten Fra-Rezeptor (Abbildung 11A). Wie wir aus unseren Gain-of-Function-Experimenten vorhersagen würden, ist die Fähigkeit von Robo2, an Robo1 zu binden, unabhängig von seiner zytoplasmatischen Domäne (Abbildung 11, Abbildung 11 – Abbildungsergänzung 1). Wichtig ist, dass die Fähigkeit von Robo2, Robo1 zu binden, von der Ig1-Ig2-Region von Robo2 abhängt, da Robo1 R2Ig1+2 leicht mit Robo1 co-immunpräzipitiert wurde, während die Bindung zwischen Robo1 und dem reziproken Rezeptor Robo2 R1Ig1+2 nur schwach nachgewiesen wurde (Abbildung 11B). . Konsequenterweise führt die Deletion sowohl der Ig1- als auch der Ig2-Domäne aus Robo2 zu einer verminderten Interaktion mit Robo1 in vivo und in vitro (Abbildung 11, Abbildung 11 – Abbildungsergänzung 1). Die Tatsache, dass nicht alle Bindungen eliminiert werden, wenn sowohl Ig1 als auch Ig2 deletiert werden, legt nahe, dass andere Regionen des Robo2-Rezeptors zur Interaktion mit Robo1 beitragen können. Somit sehen wir eine Korrelation zwischen dem Vorhandensein der Ig1- und Ig2-Domänen, einer biochemischen Interaktion mit Robo1 und der Pro-Crossing-Aktivität im Robo2-Rezeptor. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Robo2 das Überqueren der Mittellinie durch inhibitorische Interaktionen mit Robo1 fördern könnte, die wahrscheinlich zumindest teilweise durch die Robo2-Ig1- und Ig2-Domänen vermittelt werden. Bemerkenswert ist, dass die Ig2-Domäne für die Pro-Crossing-Aktivität von Robo2 essentiell ist, aber nicht für die Interaktion mit Robo1 oder Slit erforderlich ist, was auf die Existenz einer Ig2-spezifischen Aktivität hindeutet, die sich von der Fähigkeit unterscheidet, Robo1 oder Slit zu binden. Ein möglicher Mechanismus, der erklären könnte, wie Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen die Robo1-Signalgebung verhindern könnten, besteht darin, den Zugang von Slit zur Ig1-Region von Robo1 zu blockieren. Das Löschen der Ig1-Domäne von Robo1 schwächt die Interaktion mit Robo2 nicht signifikant ab, aber es sind weitere Experimente erforderlich, um festzustellen, ob Robo2 die Interaktion von Robo1 mit Slit stört (Abbildung 11, Abbildung 11 – Abbildungsergänzung 1).

Robo2 bindet in vitro und in vivo an den Robo1-Rezeptor.

(EINC) Proteinextrakte aus Embryonen, die Robo1-Myc und verschiedene HA-markierte Rezeptoren in allen Neuronen exprimieren, wurden mit Anti-Myc-Antikörpern immunpräzipitiert und durch Western-Blot analysiert. Immunpräzipitate wurden mit Anti-HA (Top-Blots) sondiert und Gesamtlysate wurden auf HA-Expression und Myc-Expression verglichen, um sicherzustellen, dass gleiche Inputs analysiert wurden. Repräsentative Western-Blots aus mehreren Experimenten sind gezeigt. (EIN) Robo1-Myc bindet an HARobo1, HARobo2 und HARobo3, aber nicht an einen HA-markierten Fra-Rezeptor (zwei Expositionen sind gezeigt). Gesamtlysat-Blots zeigen eine vergleichbare Beladung mit Ausnahme der Fra-Negativkontrolle, in der wesentlich mehr HA-markierter Rezeptor vorhanden ist. (B) Robo1-Myc bindet effizient an HARobo2, HARobo2∆Ig1 und die HARobo1Robo2(IG1-2)-Chimäre, aber nicht an die reziproke Chimäre, die Ig1- und Ig2-Domänen von Robo1 (Sternchen) besitzt. (C) Die Deletion von entweder Robo2 Ig1 oder Ig2 allein beeinflusst die Robo1-Bindung nicht wesentlich, während die Deletion beider Domänen zu einer reduzierten Bindung führt (Sternchen). Siehe Abbildung 11 – Abbildungsergänzung 1 für ein weiteres Beispiel. (D) Zelllysate von S2R+-Zellen, die separat für Robo1-Myc oder HA-markierte Robo2-Varianten transfiziert waren, wurden gemischt, mit Anti-Myc immunpräzipitiert und durch Western-Blot analysiert. In diesem Assay bindet Robo1-Myc effizient an HARobo2, HARobo2∆Ig1 und HARobo2∆Ig2 und weniger gut an HARobo2∆Ig1+2 (Sternchen). In den Bahnen 1–4 waren die Zellen unbehandelt, in den Bahnen 5–8 wurden die Zellen vor der Lyse mit Schlitz-konditionierten Medien behandelt. Wir stellen fest, dass wir zusätzlich zum Nachweis des vorhergesagten Robo2-Rezeptors voller Länge mit Anti-HA auch routinemäßig ein kleineres 80 kD-Fragment nachweisen, das einem Spaltprodukt der extrazellulären Domäne entspricht. Die Größe dieses Fragments wird zu vorhersehbar kleineren Größen verschoben, wenn Ig1, Ig2 oder sowohl Ig1 als auch Ig2 deletiert werden. Wir wissen derzeit nicht, ob dieses Spaltungsereignis in irgendeinem Zusammenhang für die Robo2-Funktion erforderlich ist, da wir keine nicht spaltbare Version des Rezeptors generieren konnten.

Unsere biochemischen Experimente, die Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen untersuchen, wenn die Robo-Rezeptoren in allen Neuronen exprimiert werden, unterscheiden nicht zwischen cis- und trans-Wechselwirkungen. Da wir beobachteten, dass Robo2 in der Lage ist, die Robo1-Abstoßung nicht-zellautonom zu hemmen und die Mittellinienüberquerung zu fördern, kamen wir zu dem Schluss, dass wir in der Lage sein könnten, physische Interaktionen zwischen Robo1- und Robo2-Rezeptoren zu erkennen, wenn sie in trans präsentiert werden. Wir haben diese Vorhersage durch Transfektion getestet Drosophila kultivierte S2R+-Zellen entweder mit Robo1-myc oder HA-markiertem Robo2 und Testen auf physikalische Wechselwirkungen durch Co-Immunpräzipitation. Obwohl wir starke Interaktionen zwischen Robo1 und Robo2 in co-transfizierten Zellen entdeckten, konnten wir keine Interaktionen in Zellen nachweisen, die separat transfiziert und miteinander vermischt wurden (Abbildung 11, Abbildung 11 – Abbildungsergänzung 1 und Daten nicht gezeigt). Beim Mischen der Membranlysate von Zellen, die separat transfiziert wurden, beobachteten wir jedoch, dass Robo1 Robo2 in Abhängigkeit von Ig1-2 leicht co-immunpräzipitierte (Abbildung 11). Diese Daten legen nahe, dass physikalische Interaktionen zwischen Robo1- und Robo2-Rezeptoren auftreten können, die in verschiedenen Zellen exprimiert werden, und stimmen mit der Möglichkeit einer physikalischen Interaktion über Zellmembranen in vivo überein. Es ist wichtig zu erkennen, dass die mit gemischten Zelllysaten nachgewiesene Bindung entweder in cis oder trans erfolgen könnte. Zukünftige Arbeiten sollten das Potenzial für Trans-Interaktionen strenger bewerten.

Die Ig2-Domäne von Robo2 wird für ihre endogene Aktivität bei der Förderung der Mittellinienüberquerung benötigt

Unsere Daten stimmen mit einem nicht-autonomen Bedarf an Ig1 und Ig2 von Robo2 bei der Antagonisierung von Robo1 überein, um die Mittellinienkreuzung zu fördern. Die genetischen Daten, die dieses Modell unterstützen, stammen jedoch aus Funktionsgewinn- und Rettungsexperimenten unter Verwendung der GAL4/UAS-Überexpression. Um den endogenen Bedarf an Robo2 bei der Förderung der Mittellinienkreuzung rigoroser anzugehen, haben wir modifizierte BACs generiert und die Fähigkeit von Robo2 oder Robo2∆Ig2 vom Wildtyp untersucht, die Mittellinienkreuzung in robo2, fra Doppelmutanten, wenn sie unter . exprimiert werden robo2körpereigene Kontrollelemente. Da Ig1 sowohl für die kreuzungsfördernde Aktivität von Robo2 als auch für seinen abstoßenden Signalausgang benötigt wird, bietet die Robo2ΔIg2-Variante ein spezifischeres Reagenz zum Testen unseres Modells. Daher haben wir das ursprüngliche Robo2-BAC durch Rekombination modifiziert, um Wildtyp-Robo2-cDNA oder Robo2∆Ig2-cDNA einzufügen, und diese BAC-Transgene in robo2, fra Doppelmutanten. Wir haben die Rettungsaktivität jedes BAC durch zwei Assays bestimmt: erstens durch die Bewertung der Mittellinienkreuzung von EW-Axonen, die mit . markiert sind zB-GAL4und zweitens durch Analysieren der Kommissurenbildung in Embryonen, die mit Anti-HRP gefärbt wurden, um alle Axone zu markieren (Fig. 12).

Die endogene Aktivität von Robo2 bei der Förderung der Mittellinienüberquerung hängt von Ig2 ab.

(EIND) Embryonen der Stufe 16, gefärbt mit Anti-HRP (Magenta) und Anti-GFP (Grün) Antikörpern. Anti-GFP markiert die EG- und EW-Zellkörper und Axone. Pfeilspitzen zeigen EW-Axone an, die die Mittellinie gekreuzt haben, und Pfeilspitzen mit Sternchen zeigen nicht kreuzende EW-Axone an. (EIN) Fast alle EW-Axone kreuzen die Mittellinie in robo2, fra/+, + Doppelheterozygoten. (B) EW-Kreuzungsdefekte werden in 85% der Segmente in . beobachtet robo2, fra Doppelmutanten. (CD) Das FL Robo2-cDNA-BAC-Transgen (C) rettet signifikant die EW-Kreuzung, bei 66 % der Segmente mit Defekten (Student's T-test, **p < 0,001) während das Robo2ΔIG2-Transgen (D) rettet nicht wesentlich. Rechts: Entfernen einer Kopie von robo2 verbessert signifikant die Mittellinienüberquerungsdefekte in fra Mutanten. (Eh) Embryonen des Stadiums 14 der angegebenen Genotypen, gefärbt mit Anti-HRP. Hintere Kommissuren wurden in den abdominalen Segmenten A1–A8 bewertet. Fehlende hintere Kommissuren sind durch Pfeilspitzen mit Sternchen gekennzeichnet. (Eg) Die Defekte der hinteren Kommissur von robo2, fra Doppelmutanten werden signifikant durch ein Robo2-cDNA-BAC-Transgen voller Länge (FL) gerettet (Student's T-test, **p < 0,001) (F), sowie von einem Robo2ΔIG2 BAC (*p < 0,0167) (g). Der Robo2ΔIG2 BAC rettet nicht so gut wie der FL Robo2 (*p < 0,0167). Alle Embryonen wurden blind bezüglich des Genotyps bewertet. Die Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA bewertet, gefolgt von mehreren Vergleichen mit dem Student's T-Test und eine Bonferonni-Korrektur. Fehlerbalken repräsentieren s.e.m. n, Anzahl der Embryonen, die für jeden Genotyp bewertet wurden.

Wir haben festgestellt, dass die Fähigkeit des Robo2 BAC, Mittellinienüberquerungsfehler in robo2, fra Doppelmutanten wurde durch Deletion der Ig2-Domäne stark beeinträchtigt. Im EW-Crossing-Assay bietet eine Kopie des Robo2 FL-cDNA-BAC eine signifikante Rettung von robo2, fra Doppelmutanten im Stadium 16, während eine Kopie des Robo2ΔIg2-BAC keine Wirkung hat (Abbildung 12A–D). Bemerkenswert ist das Entfernen eines Allels von robo2 verbessert Mittellinien-Kreuzungsdefekte in fra Mutanten, was teilweise die unvollständige Rettung erklärt (Abbildung 12). Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass der Robo2 BAC nicht alle regulatorischen Elemente enthält, die für robo2die Pro-Crossing-Funktion von , da eine Kopie des BAC die EW-Kreuzung nicht auf das Niveau von wiederherstellt fra Mutanten heterozygot für robo2 (Abbildung 12).

Wir bewerteten auch die Fähigkeit der BAC-Transgene, Defekte in der Mittellinie zu retten, wenn alle Axone unter Verwendung von Anti-HRP analysiert wurden. Durch diese Methode sehen wir eine robuste Rettung bei der Bildung der hinteren Kommissur (PC) in robo2, fra doppelt mutierte Embryonen mit einer Kopie der Robo2-cDNA-BAC im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 12E–H). Im Gegensatz dazu bietet der Robo2ΔIg2 BAC eine viel schwächere Rettung (Abbildung 12G). Die teilweise Rettung durch den Robo2ΔIg2 BAC in diesem Assay deutet darauf hin, dass die schweren fra, robo2 Phänotyp ist auf den kombinierten Bedarf an mehreren Aktivitäten von Robo2 zurückzuführen, einschließlich einer, die Ig2-unabhängig ist. Dennoch zeigen diese Daten eindeutig einen endogenen Bedarf an der Ig2-Domäne von Robo2 während der kommissuralen Axonführung. Wichtig ist, dass Robo2∆Ig2 BAC die abstoßende Aktivität von Robo2 an der Mittellinie vollständig rettet (Daten nicht gezeigt), was weiter zeigt, dass die Ig2-Domäne spezifisch für Robo2 erforderlich ist, um die Mittellinienüberquerung erfolgreich zu fördern, jedoch nicht für andere bekannte Aktivitäten des Robo2-Rezeptors. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Ig2-Domäne von Robo2 zur Förderung der Mittellinienüberquerung benötigt wird, wenn sie unter seinen endogenen Kontrollelementen exprimiert wird, und unterstützen das Modell, dass Robo2 die Mittellinienüberquerung von kommissuralen Axonen fördert, indem die Abstoßung durch eine Ig1/Ig2-vermittelte inhibitorische Interaktion mit Robo1 . antagonisiert wird .


Umami

Umami-Rezeptoren bestehen wie der süße Rezeptor aus dem T1R3-Protein, sind jedoch mit dem T1R1-Protein gepaart. Sobald der G-Protein-gekoppelte Rezeptor aktiviert ist, ist der Transduktionsweg der gleiche wie bei Zellen mit bitterem und süßem Geschmack.

Abbildung 24.7. Umami-Verbindungen aktivieren G-Protein-Rezeptor-Dimere, die das Second-Messenger-System der Phospholipase C initiieren. IP3 setzt Kalzium aus intrazellulären Speichern frei, und das Kalzium öffnet Ionenkanäle, die den Natriumeinstrom ermöglichen. Die resultierende Depolarisation bewirkt die Freisetzung von ATP an das afferente Geschmacksaxon. „Umami Taste Transduction“ von Casey Henley ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung, nicht kommerzielle Weitergabe unter gleichen Bedingungen (CC BY-NC-SA) 4.0 International License.


Rezeptoren:

Das Simple eines Pacinian-Körperchens sollte bekannt sein, das unten veranschaulicht wird.

Rezeptoren sind spezifisch, da sie nur auf bestimmte Reize reagieren. Ein Beispiel ist das Pacini-Körperchen, das ein Mechanorezeptor ist, der nur auf mechanische Reize reagiert. Das Bindegewebe um das Neuronenende verformt sich, wenn Druck ausgeübt wird, wodurch die dehnungsvermittelten Natriumionenkanäle geöffnet werden. Dies bewirkt einen Einstrom von Na+-Ionen in das Axon und eine Depolarisation der Axonmembran. Die Änderung der Potentialdifferenz bis zu diesem Punkt wird Generatorpotential genannt. Wird der Schwellenwert erreicht, entsteht ein Aktionspotential.

Stäbchen und Zapfen befinden sich in der lichtempfindlichen Schicht im peripheren Bereich des Auges. Bei Stäbchen und Zapfen müssen Pigmente, Lichtempfindlichkeit, Schärfe und Farbempfindlichkeit bekannt sein, um Unterschiede erkennen zu können:

Stäbchen: (Pigment – Rhodopsin, hohe Lichtempfindlichkeit, geringe Sehschärfe, geringe Farbempfindlichkeit)

  • Pigmente: Stäbchen enthalten ein Pigment namens Rhodopsin.
  • Lichtempfindlichkeit: Viele Stäbchen sind durch räumliche Summation mit einer Nervenfaser verbunden. Licht kann aus einem weiten Bereich erkannt werden und die Kombination dieser stimulierenden Wirkungen jedes Stabes macht ihn empfindlich.
  • Schärfe: Aufgrund der räumlichen Summation hat jeder Stab eine andere stimulierende Wirkung. Diese werden dann vom Gehirn zu einem Bild kombiniert, das verschwommen herauskommt.
  • Farbempfindlichkeit: In allen Stäbchen findet sich nur eine Pigmentsorte, die uns schwarz-weiß sehen lässt. Ein Beispiel ist im Dunkeln, wo die Stäbe nur in Gebrauch sind und keine Zapfen. Es ist nicht viel Farbe zu sehen.

Zapfen: (Pigment – Iodopsin, geringe Lichtempfindlichkeit, hohe Sehschärfe, hohe Farbempfindlichkeit)


ERGEBNISSE

Fehlausdruck von TDP-43 in Drosophila Motoneuronen beeinträchtigen das synaptische Wachstum

Um die Beziehung zwischen Membranverkehr und synaptischen Wachstumssignalen bei TDP-43-Fehlregulation zu untersuchen, wählten wir zunächst Funktionsgewinn und Funktionsverlust Drosophila Modelle von TDP-43. Wir verwendeten das binäre GAL4/UAS-System, um Expressionsniveaus und Lebensdauer-Phänotypen für zuvor erzeugte humane TDP-43 (hTDP-43)-Überexpressionstransgene zu vergleichen (Abbildung 1, A und B Lu et al., 2009 Hanson et al., 2010). Stark überexprimierende Linien und entweder ubiquitärer oder Motoneuron-spezifischer Verlust des Drosophila TDP-43-Homolog tbph beide führten innerhalb weniger Tage nach dem Schlüpfen zum Tod (Feiguin et al., 2009). Wir haben eine dieser stark überexprimierenden Linien als Gain-of-Function-Modell zum Vergleich mit ausgewählt tbph Mutanten mit Funktionsverlust.

ABBILDUNG 1: Fehlregulation von TDP-43 führt zu Defekten im synaptischen Wachstum. (A) Vergleich von hTDP-43-Überexpressionsmodellen. Immunblot von erwachsenen Köpfen mit panneuronalen (Appl-GAL4)-getriebenen Expressionsniveaus von zuvor berichteten UAS-hTDP-43-Linien. Die Expressionsspiegel wurden durch den Einschluss eines zusätzlichen UAS-Transgens (UAS-lacZ) nicht verändert. (B) Lebensdauer-Assays für Appl-GAL4-gesteuerte UAS-hTDP-43-Linien. Nur stark überexprimierende Linien führten zu signifikanten Mängeln in der Lebensdauer ähnlich der tbph null (Feiguin et al., 2009). Kontrolle ist w 1118 . (C) NMJ-Morphologie in TDP-43-fehlexprimierenden Larven. Repräsentative maximale Intensitätsprojektionen von Muskel 4 NMJs. Die Pfeile zeigen einen repräsentativen kleinen Knopf im Maßstab von 10 μm an. (D) Quantifizierung der mittleren Bouton-Anzahl vom Typ Ib und der Hauptachse (ohne Satelliten) der Bouton-Zahl ± SEM (E) Quantifizierung des mittleren Anteils der Boutons <2 μm im Durchmesser/Gesamthauptachsen-Boutons ± SEM (F) Quantifizierung des mittleren α-HRP –positiver NMJ-Bereich vom Typ 1b ± SEM. (G) Quantifizierung der mittleren Länge des längsten NMJ-Zweigs. Die statistische Signifikanz wurde mit Kruskal-Wallis-Tests (D) oder durch Einweg-ANOVA (E-G) berechnet. n ist die Anzahl der NMJs.

Um die Auswirkungen von Gewinn und Verlust von TDP-43 auf das synaptische Wachstum in zu testen Drosophila, untersuchten wir die NMJ-Morphologie bei Larven im dritten Larvenstadium. Wie bereits für Mensch und berichtet Drosophila TDP-43 (Li et al., 2010 Lin et al., 2011), führte die Motoneuron-Überexpression von hTDP-43 zu einer Verringerung der Bouton-Anzahl, einer Zunahme des Anteils kleiner (<2 μm) Boutons entlang der NMJ-Hauptachse, einer Abnahme der gesamten NMJ-Fläche und einer Abnahme der Länge des längsten NMJ-Zweigs (Abbildung 1, C–G). Obwohl wir keine signifikante Veränderung der Gesamtzahl der Boutons oder der Astlänge auf Muskel 4 Zoll fanden tbph-null Larven (Feiguin et al., 2009), beobachteten wir eine signifikante Abnahme der NMJ-Fläche und eine Zunahme des Anteils kleiner (<2 μm) Boutons (Abbildung 1, C–G). Larven heterozygot für tbph ∆23 und ein Chromosomenmangel, der die tbph Locus zeigte einen ähnlichen Anstieg des Anteils kleiner Boutons zu tbph ∆23 homozygot, was darauf hindeutet, dass dieser Phänotyp nicht auf Mutationen an der zweiten Stelle der tbph ∆23 Chromosom (Abbildung 1, C–G). Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass sowohl die Zunahme als auch der Verlust von TDP-43 zu synaptischen Wachstumsdefekten führen und eine Überexpression von TDP-43 am NMJ schädlichere Auswirkungen haben kann als bei tbph Funktionsverlust, möglicherweise aufgrund von Dosiseffekten einer Überexpression (Abbildung 1, A und B) oder einer toxischen Funktionsverstärkungsunterbrechung von TDP-43-Zielen.

Verringerungen der Anzahl und Größe der Boutons sind Merkmale einer reduzierten BMP-Signalgebung am NMJ (Aberle et al., 2002 Marques et al., 2002 McCabe et al., 2003 Rawson et al., 2003 Choi et al., 2014). Tatsächlich fanden wir, dass pMad sowohl bei hTDP-43-Überexpression als auch bei tbph Funktionsverlust NMJs (Abbildung 2A), im Einklang mit einer reduzierten synaptischen BMP-Signalgebung. Um zu testen, ob die TDP-43-Fehlexpression die nukleäre BMP-Signalgebung beeinflusst, haben wir die pMad-Intensität in einer Untergruppe von Motoneuron-Zellkörpern untersucht, die durch den Transkriptionsfaktor Even-Skipped (eve Landgraf et al., 1999) und fand keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrollen und TDP-43-fehlexprimierenden Larven (Abbildung 2B). Als nächstes untersuchten wir einen BMP-Transkriptionsreporter, der aus einer grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Insertion in ein Intron von . besteht Ziel des Witzes (Trottel), ein BMP-Transkriptionsziel (Kim und Marques, 2012 Sulkowski et al., 2016). Die mittleren Twit::GFP-Spiegel wurden in eve-positiven Motoneuron-Kernen nicht verändert, und die Verteilung der Twit::GFP-Intensitäten in diesen Kernen unterschied sich nicht signifikant zwischen Kontroll- und TDP-43-überexprimierenden Larven (Abbildung 2C). Endlich endogen Witz, tkv, und Trottel RNA-Spiegel und Wit-Proteinspiegel wurden in Larvengehirnen weder bei Überexpression noch bei Funktionsverlust von TDP-43 signifikant reduziert (Fig. 2D). Im Gegensatz dazu ist eine frühe Nonsense-Mutation im BMP-Rezeptor Witz (Marken et al., 2002) verursachte einen signifikanten Anstieg der Tkv-RNA und eine Abnahme beider Witz und Trottel RNAs sowie der Verlust des Wit-Proteins voller Länge (Fig. 2D), was darauf hindeutet, dass die TDP-43-Fehlexpression nicht einfach den Phänokopieverlust von BMP-Rezeptoren verursacht. Somit reduziert die TDP-43-Fehlexpression stark die synaptische BMP-Signalgebung, hat aber in unseren Assays keine nachweisbare Wirkung auf die nukleäre BMP-Signalgebung oder die BMP-Rezeptor-Transkript-Spiegel.

ABBILDUNG 2: Fehlregulation von TDP-43 führt zu Defekten in der BMP-Signalgebung. (A) pMad-Spiegel sind bei TDP-43 reduziert – fehlexprimierende NMJs. Die Bilder zeigen repräsentative Projektionen maximaler Intensität von Muskel-4-NMJs. Maßstabsleiste, 5 μm. Das Diagramm zeigt die mittlere NMJ-pMad-Intensität ± SEM pro NMJ. n ist die Anzahl der NMJs. (B) pMad-Spiegel sind in TDP-43-fehlexprimierenden Motoneuron-Zellkörpern nicht signifikant verändert. Die Bilder zeigen repräsentative Projektionen maximaler Intensität von ventralen Nervensträngen. Maßstabsleiste, 20 μm. Die Quantifizierung zeigt das mittlere pMad/eve-Verhältnis ± SEM. n ist die Anzahl der Tiere. (C) Ausdruck von a Trottel Der Reporter ist in TDP-43-missexprimierenden Motoneuron-Zellkörpern nicht signifikant verändert. Bilder zeigen repräsentative Projektionen maximaler Intensität von ventralen Nervensträngen. Maßstabsleiste, 20 μm. Die Quantifizierung zeigt das mittlere pMad/eve-Verhältnis ± SEM pro Tier. Oben, Quantifizierung des mittleren pMad oder Twit::GFP, normalisiert auf den Motoneuronmarker eve. Unten, Histogramm der Twit::GFP/Eve-Intensitätsverteilungen. n ist die Anzahl der Tiere. (D) Links, Fehlexpression von hTDP-43 beeinflusst die mRNA-Spiegel der BMP-Rezeptoren nicht Witz oder tkv oder das BMP-Ziel Trottel im Larvenhirn. Das Diagramm zeigt die mittlere qPCR-Log-Fold-Änderung (relativ zu rpl32) normalisiert auf Wildtyp ± SD. Die statistische Signifikanz wurde für jeden Primersatz separat berechnet. Richtig, eine Fehlexpression von hTDP-43 beeinflusst den Wit-Proteinspiegel nicht. Das Bild zeigt einen repräsentativen Immunoblot von Larvenhirnlysaten. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Einweg-ANOVA (A), Kruskal-Wallis-Tests (B, D) oder Zweiweg-ANOVA (C, unten) und Student's . berechnet T Prüfungen (C, rechts)

Als nächstes testeten wir auf genetische Interaktionen zwischen TDP-43 und dem BMP-Signalweg. Wir untersuchten zunächst, ob die BMP-Signalgebung in TDP-43-überexprimierenden NMJs durch Mutation des negativen Regulators wiederhergestellt werden könnte Töchter gegen Dekapentaplegiker (Vati), die Mad antagonisiert. Funktionsverlustmutationen in Vati synaptisches Überwachsen verursachen (Sweeney und Davis, 2002), und wir fanden, dass sie hTDP-43-induziertes Unterholz, einschließlich Bouton-Zahl, NMJ-Fläche und NMJ-Zweiglänge, unterdrückten (Abbildung 3, A–D). Schließlich, während das Entfernen einer Kopie von Vati hatte wenig Einfluss auf die NMJ-Morphologie bei ansonsten Wildtyp-NMJs (Abbildung 3, B–D O’Connor-Giles et al., 2008), unterdrückte es signifikant den erhöhten Anteil kleiner Boutons in TDP-43-überexprimierenden NMJs (Abbildung 3F). Diese Ergebnisse legen nahe, dass synaptische Wachstumsdefekte, die durch TDP-43-Fehlexpression verursacht werden, zumindest teilweise aus dem Verlust der BMP-Signalgebung resultieren.

ABBILDUNG 3: TDP-43 interagiert genetisch mit dem BMP-Weg. (A) hTDP-43-induzierte synaptische Wachstumsdefekte werden durch Mutation von gerettet Vati. Repräsentative maximale Intensitätsprojektionen von Muskel 4 NMJs. Maßstabsleiste, 20 μm. (B) Quantifizierung der mittleren Bouton-Zahl des Typs Ib und der Hauptachse (ohne Satelliten) der Bouton-Zahl ± SEM. (C) Quantifizierung des mittleren α-HRP-positiven Typ 1b NMJ-Bereichs ± SEM. (D) Quantifizierung der mittleren Länge des längsten NMJ-Zweigs ± SEM. (E) Heterozygotie für Vati unterdrückt den TDP-43-induzierten Anstieg des Small-Bouton-Verhältnisses. Quantifizierung des mittleren Anteils von Boutons <2 µm im Durchmesser/Gesamthauptachsen-Boutons ± SEM. (B–E) Wildtyp- und hTDP-43-Kontrollen sind identisch mit Abbildung 6, B–D. Die statistische Signifikanz wurde mit Kruskal-Wallis-Tests (B-D) oder Einweg-ANOVA (E) berechnet. n ist die Anzahl der NMJs.

Veränderte TDP-43-Spiegel stören die endosomale Lokalisation des BMP-Rezeptors, aber nicht den axonalen Transport

Die Signalübertragung des neuronalen Wachstumsfaktors hängt stark vom intrazellulären Transport ab. Ein axonaler Langstreckentransport ist erforderlich, um trophische Signale vom Nervenende zum Zellkörper zu leiten, während der lokale endosomale Transport von Signalkomplexen an der Synapse die Intensität und Dauer der Signalübertragung moduliert (Cosker und Segal, 2014, Deshpande und Rodal, 2015). Um zu testen, ob die TDP-43-Fehlexpression entweder den lokalen oder den axonalen Verkehr von BMP-Rezeptoren veränderte, erzeugten wir transgene Fliegen, die Tkv-mCherry unter der Kontrolle des GAL4/UAS-Systems exprimieren. Neuronal getriebenes Tkv-mCherry hatte keinen Einfluss auf die Bouton-Zahl und war ähnlich lokalisiert wie ein zuvor charakterisiertes rettendes Tkv-GFP-Transgen (Dudu et al., 2006 Abbildung 4A), was darauf hindeutet, dass diese Expressionsniveaus und der mCherry-Tag das synaptische Wachstum nicht stören.

ABBILDUNG 4: TDP-43-Fehlexpression verursacht keine starken Defekte beim axonalen Transport von Tkv-enthaltenden Partikeln. (A) Tkv-mCherry kolokalisiert am NMJ mit einem zuvor beschriebenen rettenden Tkv-GFP-Transgen (Dudu et al., 2006). Links, repräsentative maximale Intensitätsprojektion von konfokalen Z-Stapel. Maßstabsleiste, 5 μm. Die Tkv-mCherry-Expression beeinflusst das synaptische Wachstum nicht. Rechts, mittlere Knopfzahl auf Muskel 6/7 ± SEM n ist die Anzahl der NMJs. (B) Repräsentativer Kymograph des axonalen Transports von Vglut>Tkv-mCherry. Maßstabsleiste, 10 μm. (C) Quantifizierung der mittleren Teilchengeschwindigkeit. Die Daten repräsentieren die pro Tier abgebildete mittlere Partikelgeschwindigkeit/Axon ± SEM. n ist die Anzahl der Tiere. (D) Quantifizierung der mittleren Stalllänge (für Stalls >3 s). Die Daten repräsentieren die mittlere Stalldauer ± SEM. n ist die Anzahl der Stände. Wildtyp: Vglut-GAL4/w oder Y UAS-Tkv-mCherry/+ (sieben Tiere 16 Axone 505 retrograde Partikel 505 anterograde Partikel 111 Stalls). tbph ∆23 : Vglut-GAL4/w oder Y tbph ∆23 UAS-Tkv-mCherry/tbph ∆23 (sieben Tiere 16 Axone 492 retrograde Partikel 437 anterograde Partikel 136 Ställe). Vglut>hTDP-43: Vglut-GAL4/w oder Y UAS-Tkv-mCherry/+ UAS-TDP-43-IIId/+ (acht Tiere 16 Axone 411 retrograde Partikel 326 anterograde Partikel 208 Stände). Die statistische Signifikanz wurde mit Student berechnet T Test (A) oder Kruskal-Wallis-Test (C, D).

Wir untersuchten zunächst den schnellen axonalen Transport, der bei neurodegenerativen Erkrankungen (Maday et al., 2014), einschließlich in Drosophila Modelle (Torroja et al., 1999 Gunawardena und Goldstein, 2001 Gunawardena et al., 2003 Fuger et al., 2012 Lloyd et al., 2012 Kang et al., 2014 Butzlaff et al., 2015). Motorneuronen-getriebene Tkv-mCherry zeigte einen schnellen bidirektionalen axonalen Transport mit gelegentlichen Partikelstillständen und -umkehrungen und wenigen stationären Partikeln (Abbildung 4B). Bei der hTDP-43-Überexpression beobachteten wir einen kleinen, aber signifikanten Anstieg der retrograden Transportrate von Tkv-mCherry (Abbildung 4C), während sowohl Überexpression als auch tbph Der Funktionsverlust verursachte eine geringfügige Abnahme der mittleren Tkv-mCherry-Stalldauer (Abbildung 4D). Der anterograde Transport von Tkv-mCherry wurde weder bei hTDP-43-Überexpression noch bei . verändert tbph funktionslose Tiere. Diese subtilen Phänotypen deuten eher auf einen mäßig verstärkten als auf einen stark gestörten Verkehr hin und legen nahe, dass ein veränderter axonaler Transport von BMP-Rezeptoren wahrscheinlich nicht für die von uns beobachtete Verringerung der BMP-Signalgebung und des synaptischen Wachstums verantwortlich ist. Dies veranlasste uns, lokale intrazelluläre Transportdefekte als zugrunde liegende Ursache zu untersuchen.

Um zu testen, ob der endosomale Transport von BMP-Rezeptoren zu Signalstörungen führen könnte, die durch TDP-43-Fehlexpression verursacht werden, untersuchten wir als nächstes die subzelluläre Lokalisation von Tkv am NMJ (Abbildung 5, A–D). Wir fanden, dass die Fraktion von Tkv-mCherry puncta, die mit Rab5-positiven frühen Endosomen kolokalisiert wurde, in Larven, die TDP-43 über- oder unterexprimierten, deutlich reduziert war (Fig. 5E). Darüber hinaus beobachteten wir einen gleichzeitigen Anstieg der Fraktion von Tkv puncta, die mit Rab11-positiven Recycling-Endosomen kolokalisiert (Abbildung 5E). Die Überexpression von hTDP43 verursachte auch eine Abnahme der Kolokalisation von Tkv mit dem frühen/späten Endosomenmarker SNX16-GFP (Rodal et al., 2011), während der Verlust von tbph leicht erhöhte SNX16-Kolokalisation (Abbildung 5E). Diese Ergebnisse legen wiederum nahe, dass schwerwiegendere Defekte aus einer Zunahme als aus einem Funktionsverlust von TDP-43 resultieren. Wir bestätigten unsere Kolokalisierungsergebnisse durch die Messung von Pearsons R für Tkv-mCherry und GFP-Rab5 (das aufgrund seines hohen Signal-Rausch-Verhältnisses am besten für diese Analyse geeignet war) und fanden eine ähnliche TDP-43-induzierte Abnahme der Überlappung (Abbildung 5F). Bemerkenswert ist, dass die mittleren Tkv-Spiegel am NMJ von der TDP-43-Fehlexpression nicht beeinflusst wurden, was darauf hindeutet, dass Tkv nicht einfach auf den endolysosomalen Abbau in diesen NMJs abzielt (Abbildung 5G). Um zu testen, ob die Verschiebung von Tkv von frühen zu recycelten Endosomen einer zuvor beobachteten TDP-43-induzierten allgemeinen Störung des Autophagosom-Lysosomen-Verkehrs in Säugerzellen und in Drosophila fetter Körper und Köpfe (Xia et al., 2016) haben wir die Expression und Lokalisation des Autophagiemarkers Atg8-GFP mit Tkv-mCherry untersucht. Atg8-GFP wurde in NMJs bei Überexpression von TDP-43 nicht verändert, was darauf hindeutet, dass eine allgemeine Hochregulation des autolysosomalen Signalwegs in NMJs wahrscheinlich nicht für die Fehlregulation der BMP-Signalgebung verantwortlich ist (Abbildung 5, D und H). Somit induzierte eine Über- oder Unterexpression von TDP-43 eine spezifische Verschiebung von Tkv von frühen Endosomen, die permissiv signalisieren, zu Recycling-Kompartimenten, die nicht permissiv signalisieren (Rodal et al., 2011 Liu et al., 2014 Westen et al., 2015), in Übereinstimmung mit synaptischem Wachstum und BMP-Signalgebungsphänotypen (Abbildungen 1, C–E und 2A).

ABBILDUNG 5: TDP-43-Fehlexpression verschiebt die Tkv-Lokalisierung von frühen zu recycelten Endosomen. (A–D) NMJs, die Tkv-mCherry exprimieren und (A) endogen markiertes GFP-Rab5 (Fabrowski et al., 2013), (B) UAS-SNX16-GFP, (C) gefärbt für endogenes Rab11 oder (D) UAS-Atg8-GFP. Repräsentative maximale Intensitätsprojektionen von Muskel 4 NMJs. Pfeile zeigen kolokalisierende Puncta-Maßstabsbalken, 5 µm. (E) Mittlerer Prozentsatz kolokalisierender Puncta/NMJ ± SEM. (F) Mittlere Pearsons R ± SEM für GFP-Rab5 und Tkv-mCherry innerhalb des präsynaptischen Terminals. Rab5-Spiegel wurden durch TDP-43-Fehlexpression nicht verändert (mittlere Pixelintensität/μm ± SEM. Rab5: Kontrolle, 45,4 ± 4,3 tbph ∆23, 37,7 ± 3,6 hTDP43, 52,6 ± 3,6). (G) Tkv-Spiegel werden durch TDP-43-Fehlexpression nicht beeinflusst. Mittlere NMJ-Tkv-Intensität ± SEM für den α-Rab11-Datensatz. (H) NMJ-Autophagie wird nicht durch TDP-43-Fehlexpression induziert. Mittlere NMJ ATG8-GFP- und Tkv-Intensitäten ± SEM. n ist die Anzahl der NMJs. Die statistische Signifikanz wurde mit Einweg-ANOVA (E–G) oder Mann-Whitney-Tests (H) berechnet.

Die Hemmung von Rab11 rettet TDP-43-induziertes synaptisches Wachstum und motorische Defekte

Als nächstes überlegten wir, ob die Umleitung von BMP-Rezeptoren durch Manipulation des Recycling-Kompartiments die synaptische Wachstumssignalisierung und motorische Defekte, die durch die TDP-43-Fehlregulation verursacht werden, unterdrücken könnte. Wir konzentrierten uns auf unser TDP-43-Überexpressionsmodell, da es zellautonom gegenüber dem Neuron ist und einen stärkeren synaptischen Wachstumsphänotyp hervorbrachte als das tbph Mutant. Frühere Berichte zeigten, dass der Verlust oder die Hemmung von Rab11 bei ansonsten Wildtyp-Larven zu übermäßigem synaptischem Wachstum führt, indem die BMP-Signalgebung verändert wird (Khodosh et al., 2006 et al., 2014). Wir fanden, dass der durch TDP-43 induzierte synaptische Wachstumsdefekt (einschließlich Bouton-Zahl und NMJ-Bereich) durch eine dominant-negative Mutante von Rab11 (Rab11 DN Abbildung 6, A–D) teilweise unterdrückt wurde, ohne dass sich die hTDP-43-Überexpressionsniveaus änderten (Abbildung 6E). Darüber hinaus rettete Rab11 DN signifikant die synaptischen pMad-Spiegel sowohl bei hTDP-43-Überexpression als auch bei tbph Tiere mit Funktionsverlust (Abbildung 6F). Somit korrelierte die Rab11-vermittelte Unterdrückung des Tkv-Verkehrs und des synaptischen Wachstums mit der wiederhergestellten BMP-Signalgebung.

ABBILDUNG 6: Die Manipulation von Rab11 stellt TDP-43-induzierte Defekte im synaptischen Wachstum und der BMP-Signalübertragung wieder her. (A) Rab11 DN unterdrückt teilweise TDP-43-induzierte synaptische Wachstumsdefekte. Repräsentative maximale Intensitätsprojektionen von α-HRP-markierten Muskel 4 NMJs. Maßstabsleiste, 20 μm. (B) Quantifizierung der mittleren Bouton-Zahl des Typs Ib und der Hauptachse (ohne Satelliten) der Bouton-Zahl ± SEM. (C) Quantifizierung des mittleren α-HRP-positiven Typ 1b NMJ-Bereichs ± SEM. (D) Quantifizierung der mittleren Länge des längsten NMJ-Zweigs ± SEM. (E) TDP-43-Überexpressionsniveaus werden von Rab11 DN nicht beeinflusst. Das Bild zeigt einen repräsentativen Immunoblot von 10 Larvenhirnen/Genotyp. Das Diagramm zeigt die mittlere TDP-43/Tubulin-Intensität ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten. (F) Rab11 DN unterdrückt TDP-43-induzierte BMP-Signaldefekte. Bilder zeigen repräsentative Summenintensitätsprojektionen von konfokalen Stapeln. Blaue Umrisse repräsentieren den α-HRP-positiven Bereich. Maßstabsleiste, 5 μm. Die Grafik zeigt die Quantifizierung der mittleren NMJ-pMad-Intensität ± SEM. (G) Rab11 DN rettet keine reduzierten Futsch-Spiegel in hTDP-43-exprimierenden NMJs. Oben, repräsentative Projektionen maximaler Intensität konfokaler Stapel. Maßstabsleiste, 10 μm. Unten, mittlere α-Futsch-Intensität ± SEM. Für B–D sind Wildtyp- und hTDP-43-Kontrollen identisch mit denen in Abbildung 3. Die statistische Signifikanz wurde mit Kruskal-Wallis- (B-G) oder Mann-Whitney-Tests (E) berechnet. n ist die Anzahl der NMJs.

Als nächstes fragten wir, ob andere synaptische wachstumsfördernde Mutanten, die den Membranverkehr beeinflussen, TDP-43-induzierte Defekte unterdrücken könnten. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine dominant-aktive Mutante von Snx16 (Snx16 3A ) fängt aktivierte BMP-Rezeptoren (Tkv Q199D ) an frühen Endosomen ein, fördert das synaptische Wachstum und erhöht den pMad-Spiegel (Rodal et al., 2011). Im Gegensatz zur Rab11-DN-Suppression von TDP-43-Phänotypen fanden wir, dass Larven, die Snx16 3A , Tkv Q199D und hTDP-43 koexprimieren, nicht zu unterscheidendes synaptisches Unterholz von Larven, die hTDP-43 allein überexprimieren (Abbildung 6, A und B). In ähnlicher Weise konnte die Hemmung von Rab5 mit einer dominant-negativen Mutante nicht die TDP-43-induzierten NMJ-Morphologiedefekte retten (Abbildung 6, A und B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Rettung von synaptischen Wachstumsdefekten spezifisch für die Manipulation von Rab11 ist.

TDP-43 beeinflusst die Expression, das Spleißen, den Transport, die Stabilität und die Translation einer Vielzahl von RNA-Targets, von denen viele zu dem von uns beobachteten Membranverkehr und Wachstumsfaktor-Signaldefekten beitragen könnten. Ein besonderes Ziel von TDP-43, das relevant sein könnte, ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein Futsch, das für das synaptische Wachstum erforderlich ist und sowohl durch TDP-43 als auch durch BMP-Signale reguliert wird (Roos et al., 2000 Godena et al., 2011 Coyne et al., 2014). Rab11 DN stellte jedoch trotz der Rettung von synaptischen Wachstumsdefekten keine reduzierten Futsch-Spiegel in TDP-43-überexprimierenden Larven wieder her (Abbildung 6G), was darauf hindeutet, dass Rab11 DN TDP-43-induzierte Defekte über einen Futsch-unabhängigen Weg unterdrückt. Daher ist weitere Arbeit erforderlich, um zu bestimmen, welches von vielen TDP-43-Targets (oder eine Kombination von Targets) zu Defekten beim Transport des BMP-Rezeptors führen könnte.

Rab11 DN leitet den BMP-Rezeptorverkehr um

Um besser zu verstehen, wie Rab11 DN durch TDP-43-Fehlausdrücke verursachte synaptische Defekte rettet, haben wir gefragt, ob der Verkehr von Tkv umgeleitet wurde. Überraschenderweise stellte die Expression von Motoneuronen von Rab11 DN den Anteil kolokalisierender Tkv-mCherry- und GFP-Rab5-positiver früher Endosomen in TDP-43-überexprimierenden NMJs nicht wieder her (Abbildung 7, A und B), obwohl sie die BMP-Signalgebung teilweise rettete Defekte (Abbildung 6). Stattdessen veränderte Rab11 DN die räumliche Verteilung von Tkv-mCherry-Punkten innerhalb des Nervenendes. In Wildtyp-NMJs wurde Tkv-mCherry im terminalen Bouton des NMJ-Arbors angereichert. Diese Anreicherung wurde in TDP-43-überexprimierenden Larven signifikant reduziert und in Larven gerettet, die TDP-43 und Rab11 DN koexprimieren (Abbildung 7C), während die mittleren Tkv-mCherry-Werte unverändert blieben (Abbildung 7D). Somit rettet Rab11 DN den TDP-43-induzierten Defekt der Tkv-Umverteilung von terminalen Boutons.

ABBILDUNG 7: Rab11 DN leitet den BMP-Rezeptorverkehr am NMJ um. (A) Repräsentative maximale Intensitätsprojektionen von Muskel-4-NMJs, die Tkv-mCherry und ein endogen markiertes GFP-Rab5 exprimieren. Maßstabsleiste, 5 μm. (B) Rab11 DN stellt die Tkv-Rab5-Kolokalisation nicht wieder her. Mittlerer Prozentsatz kolokalisierender Puncta ± SEM. (C) Rab11 DN rettet die Tkv-Anreicherung in terminalen Boutons. Mittlere Intensität des terminalen Bouton/Gesamt-NMJ-Intensität ± SEM. (D) Rab11 DN hat keinen Einfluss auf die Tkv-Werte. Mittlere NMJ Tkv-mCherry-Intensität ± SEM. (E, F) Rab11 DN unterdrückt TDP-43-induzierte Tkv-Mobilitätsdefekte am NMJ. TDP-43 hat keinen Einfluss auf die Snx16-Mobilität. Repräsentative Kymographen aus Zeitraffer-Serien einer einzelnen konfokalen Schicht eines Muskels 4 NMJ. Maßstabsleiste, 10 μm. (G) Quantifizierung der Fachmobilität. Mittlerer mobiler Partikelindex ± SEM n ist die Anzahl der NMJs (B–D) oder Tiere (G). Kontrollgenotypen: (A–G) Vglut-GAL4/w oder Y UAS-Tkv-mCherry/+ (F) Vglut-GAL4/w oder Y UAS-Snx16-GFP/+. Die statistische Signifikanz wurde mit Einweg-ANOVA (B–D, G) oder Mann-Whitney-Tests (G) berechnet. Siehe auch Zusatzfilm S1.

Um zu untersuchen, wie die Manipulation von Rab11 die Verteilung von Tkv wiederherstellen könnte, haben wir das Verhalten der Tkv-mCherry-Kompartimente am NMJ durch Live-Bildgebung charakterisiert (Abbildung 7, E–G). In Wildtyp-NMJs zeigten Tkv-mCherry-Partikel kleine Bewegungen innerhalb eines einzelnen Boutons, bewegten sich jedoch selten über längere Distanzen (>10 μm) zwischen benachbarten Boutons (Abbildung 7, E und G und Supplemental Movie S1). Im Gegensatz dazu zeigten TDP-43-überexprimierende NMJs signifikant häufigere bidirektionale Langstrecken-Bewegungen von Tkv-mCherry (Abbildung 7, E und G und Ergänzungsfilm S1). Diese erhöhte Mobilität wurde bei der Coexpression von Rab11 DN unterdrückt (Abbildung 7, E und G und ergänzender Film S1). Wir konnten nicht direkt testen, ob das sich schnell bewegende Tkv-mCherry-Kompartiment direkt dem Rab11-Kompartiment entsprach, da GAL4/UAS-getriebenes GFP-Rab11 weitgehend zytosolisch ist (Rodal et al., 2011). SNX16-GFP puncta veränderte jedoch die Mobilität bei TDP-43-Überexpression nicht ( 7 F und G ), was darauf hindeutet, dass erhöhte Mobilität kein allgemeiner Phänotyp für alle Kompartimente ist. Somit reguliert die Mobilität des Tkv-positiven Kompartiments seine Verteilung unter den Boutons, und die Anreicherung im terminalen Bouton korreliert mit erhöhten BMP-Signalwegen.

Rab11 DN unterdrückt TDP-43-induzierte Motordefekte

Schließlich testeten wir, ob die Manipulation von Rab11 motorische Defekte bei Larven, die TDP-43 falsch exprimieren, unterdrücken könnte. Sowohl die Überexpression von hTDP43 als auch der Verlust von tbph führen zu stark reduzierten Larvenkriechen (Abbildung 8, A und B), wie zuvor beschrieben (Feiguin et al., 2009 Li et al., 2010 Lin et al., 2011 Windel et al., 2013). Rab11 DN rettete teilweise die Larvenkriechdefekte, die aus der TDP-43-Überexpression resultieren, während die Koexpression von Snx16 3A und Tkv Q199D diese Larvenkriechdefekte nicht unterdrückte (Abbildung 8, A und B). Von Bedeutung, Verlust von Vati rettete hTDP-43-Überexpression-induzierte Larvenkriechdefekte auf einem ähnlichen Niveau wie Rab11 DN (Abbildung 8B). Dies legt nahe, dass die Komponente des Crawling-Defekts, die auf den Verlust der BMP-Signalgebung zurückzuführen ist, durch Rab11-Manipulation wiederhergestellt werden kann. Schließlich rettete Rab11 DN kriechende Defekte der Larven in tbph Funktionsverlust-Larven ( 8B ), was darauf hindeutet, dass sowohl der Funktionsgewinn als auch der Funktionsverlust von TDP-43 empfindlich auf Rab11-Manipulation reagieren.

ABBILDUNG 8: Rab11 DN unterdrückt TDP-43-induzierte Larvenkriechdefekte. (A) Repräsentative Spuren zeigen Larvenverschiebung in einem 2-minütigen Aufnahmefenster. (B) Quantifizierung der mittleren Larvenverschiebung pro Sekunde ± SEM. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer Einweg-ANOVA berechnet. n ist die Anzahl der Tiere.


Axonale Führung

Neuronales Überleben, Synapsenbildung und -verfeinerung
Verbindungen zwischen Nervenzellen und Muskelzellen bei Wirbeltieren sind neuromuskuläre Verbindungen.
Wenn Motoneuron-Axone ihre Ziele erreichen, bilden Interaktionen zwischen dem Neuron und der Muskelfaser die neuromuskuläre Verbindung.

Wechselwirkungen zwischen Nerv und Muskel bilden die neuromuskuläre Verbindung.
Die Axonäste enden in großen Kontakten mit der Endplatte der Muskelfaser.
Die neuromuskuläre Verbindung (oder Synapse) ist der Ort, an dem die Plasmamembranen des Muskels und des Axons durch den engen synaptischen Spalt getrennt sind, der die Basallamina (ECM) enthält, die von beiden Zellen sezerniert wird.
Der elektrische Impuls, der sich entlang des Axons ausbreitet, wird in ein chemisches Signal umgewandelt, das über den Spalt diffundiert, um mit Rezeptoren in der Muskelzelle zu interagieren, um eine Kontraktion zu bewirken.
Die Aggregation von Acetylcholin-Rezeptoren wird durch die Agrin-Aktivierung des Musk-Rezeptors und durch die Neuregulin-Induktion der lokalisierten Acetylcholin-Rezeptor-Synthese unterstützt.

Neurotrophe Faktoren fördern das neuronale Überleben.
Neuronen, die sich nicht mit ihrem Ziel verbinden, durchlaufen eine Apoptose.
20.000 Motoneuronen werden im Rückenmark des Kükens gebildet, aber

halb sterben
Das Überleben kann vom Aufbau einer funktionellen Synapse mit einer Muskelzelle abhängen.
Selbst nachdem neuromuskuläre Verbindungen hergestellt wurden, werden einige eliminiert, bis jede Muskelfaser von nur einem Motoneuron innerviert wird.

NGF (Nervenwachstumsfaktor), BDNF (Gehirn-derived neurotrophic factor),
NT-3 (Neurotrophin-3) und NT-4/5 (Neurotrophin-4/5) sind neurotrophe Faktoren, von denen das neuronale Überleben abhängt.
Trk-Proteine, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, sind die Neurotrophin-Rezeptoren und wirken in der Spezifität des Überlebens des Neuronentyps.


Perspektiven

Ich begann diesen Artikel mit der Frage, warum es so schwierig und so lange gedauert hat, herauszufinden, wie man axonale Wege im ZNS regenerieren kann. Die obigen Abschnitte zeigen, wie komplex die Regeneration ist und wie viele Interventionen signifikante, aber unzureichende Auswirkungen auf die Stimulation der Regeneration hatten. Warum hat sich das Problem als so kompliziert herausgestellt? Als die Forschung zu diesem Thema in den 1980er Jahren begann, Mechanismen zu untersuchen, ging man davon aus, dass die Regeneration weitgehend die Entwicklung rekapitulieren würde und dass ein oder zwei hemmende Mechanismen korrigiert werden müssten. Es hat sich herausgestellt, dass sich die Regeneration stark von der Embryonalentwicklung unterscheidet und dass es eine Vielzahl von Mechanismen gibt, die Regeneration und Reparatur blockieren. Wie oben argumentiert, muss die Restriktionsregeneration erhebliche evolutionäre Vorteile haben, daher hat die Evolution die Regeneration auf die übliche Weise abgestellt. Wenn menschliche Ingenieure ein Problem lösen wollen, suchen sie nach einer einzigen eleganten und leistungsstarken Lösung. Evolution funktioniert so gut wie nie. Da es mit zufälligen Ereignissen arbeiten muss, die einen selektiven Vorteil bieten müssen, neigt es dazu, Probleme zu lösen, indem es mehrere parallele Mechanismen schafft, die oft einzeln nicht sehr effizient sind und die zusammen eine robuste und ausfallsichere Lösung ergeben. Es scheint wahrscheinlich, dass das Abschalten von Regeneration und Reparatur in diese Richtung gegangen ist, mit den vielen oben genannten Mechanismen als Konsequenz. Wie reparieren wir das beschädigte ZNS? Es wird mit ziemlicher Sicherheit nicht notwendig sein, alle potentiellen Hemmmechanismen anzugehen. Es ist zum Beispiel ermutigend, dass die relativ einfache Einzelintervention der Expression eines geeigneten Integrins und Integrinaktivators in der Lage war, die sensorische Regeneration über lange Distanzen zu fördern. Für ZNS-Neuronen ist das Problem schwieriger, da das Transkriptionsprogramm der Regeneration unterdrückt wird und weil die Neuronen so aufgeteilt sind, dass viele wachstumsbezogene Moleküle von reifen Axonen ausgeschlossen werden. Aus praktischer Sicht erscheint es sinnvoll, sowohl an den Axonen, die den Transport und Verkehr der Schlüsselmoleküle wiederherstellen, als auch am Transkriptionsprogramm in Zellkörpern zu arbeiten. Wenn wir die richtigen Moleküle zum Ausdruck bringen und sie dann an die richtige Stelle bringen können, regenerieren sich Axone.


Schau das Video: T - 95 Aerotachka - coaxial circuit testing (Juni 2022).


Bemerkungen:

  1. Ridwan

    Ich hoffe, Sie finden die richtige Entscheidung. Nicht verzweifeln.

  2. Yao

    Ganz, alles kann sein

  3. Mu'ayyad

    Diese unterhaltsame Meinung



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