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Red-Transkriptionsreporter in Psudomonas putida

Red-Transkriptionsreporter in Psudomonas putida


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Ich muss einen transkriptionellen Reporter bauen in P. putida mit hoher Anregungswellenlänge, um die Phototoxizität zu verringern (ich habe bis jetzt mNeonGreen verwendet und würde gerne etwas Rotes ausprobieren).

Meine Kollegen berichteten mir, dass frühere Versuche mit mCherry und mKate2 gescheitert sind, weil:

  • mCherry scheint eine sehr lange Reifezeit zu haben, für meine Experimente nicht geeignet
  • mKate2 hat überhaupt keinen Ausdruck angezeigt

Hat jemand Erfahrung mit Transkriptionsreportern in P. putida? Irgendwelche Ideen? (DsRed? erneut mit mKate versuchen?)

Ich messe die Expression eines PsrI (Sigmafaktor für die Siderophorproduktion) regulierten Gens.


Funktionelle Rolle von Lanthaniden bei der enzymatischen Aktivität und transkriptionellen Regulation von PQQ-abhängigen Alkoholdehydrogenasen in Pseudomonas putida KT2440

Die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden ist entscheidend für die Entgiftung und den effizienten Abbau verschiedener flüchtiger organischer Verbindungen (VOCs). So haben viele Gram-negative Bakterien periplasmatische Oxidationssysteme entwickelt, die auf Pyrrolochinolinchinon-abhängigen Alkoholdehydrogenasen (PQQ-ADHs) basieren, die oft funktionell redundant sind. Verwendung gereinigter Enzyme aus dem bodenbewohnenden Modellorganismus Pseudomonas putida KT2440 berichtet die vorliegende Studie über die erste Beschreibung und Charakterisierung einer Lanthanoid-abhängigen PQQ-ADH (PedH) in einem nicht-methylotrophen Bakterium. PedH zeigt Enzymaktivität auf einem ähnlichen Substratbereich wie sein Ca 2+ -abhängiges Gegenstück PedE, einschließlich linearer und aromatischer primärer und sekundärer Alkohole sowie Aldehyde, jedoch nur in Gegenwart von Lanthanoid-Ionen einschließlich La 3+ , Ce 3+ , Pr 3+ , Sm 3+ oder Nd 3+ . Reporter-Assays zeigten, dass PedH nicht nur eine katalytische Funktion hat, sondern auch an der Transkriptionsregulation von . beteiligt ist pedE und pedH, höchstwahrscheinlich als sensorisches Modul fungieren. Bemerkenswert ist, dass das zugrunde liegende Regulierungsnetzwerk nur auf 1 – 10 nM Lanthan reagiert, eine Konzentration, die als ökologisch relevant angenommen wird. Die vorliegende Studie zeigt weiterhin, dass das PQQ-abhängige Oxidationssystem für ein effizientes Wachstum mit einer Vielzahl flüchtiger Alkohole entscheidend ist. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass funktionelle Redundanz und inverse Regulation von PedE und PedH eine adaptive Strategie von P. putida KT2440 zur Optimierung des Wachstums mit flüchtigen Alkoholen als Reaktion auf die unterschiedliche Verfügbarkeit von Lanthaniden.

BEDEUTUNG Aufgrund ihrer geringen Bioverfügbarkeit galten Lanthanoide lange Zeit als biologisch inert. In den letzten Jahren hat die Identifizierung von Lanthaniden als Cofaktor in methylotrophen Bakterien jedoch enormes Interesse auf verschiedenen biologischen Gebieten geweckt. Die vorliegende Studie zeigt, dass eines der beiden vom Modellorganismus produzierten PQQ-ADHs P. putida KT2440 verwendet auch Lanthanoide als Cofaktor und erweitert so den Anwendungsbereich von Lanthaniden, die Bakterien über die Methylotrophen hinaus einsetzen. Ähnlich wie bei methylotrophen Bakterien ist ein komplexes regulatorisches Netzwerk am Lanthanoid-responsiven Wechsel zwischen den beiden PQQ-ADHs beteiligt, die von kodiert werden P. putida KT2440. Wir zeigen außerdem, dass die funktionelle Produktion von mindestens einem der Enzyme für ein effizientes Wachstum mit mehreren flüchtigen Alkoholen entscheidend ist. Insgesamt liefert unsere Studie ein neues Verständnis für die in vielen Organismen beobachtete Redundanz von PQQ-ADHs und unterstreicht die Bedeutung von Lanthaniden für den bakteriellen Stoffwechsel, insbesondere in Bodenumgebungen.


Roter transkriptioneller Reporter in Psudomonas putida - Biologie

<div><p>Die Wurzelbesiedelung von pflanzenwachstumsfördernden Bakterien ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der von mehreren Faktoren beeinflusst wird. Zum Beispiel müssen Bakterien während der Anhaftung an Pflanzenwurzeln reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ertragen, die von Pflanzen produziert werden. In dieser Studie berichten wir, dass der globale Transkriptionsregulator Fis an der Regulierung der ROS-Toleranz von <i>Pseudomonas putida</i> beteiligt ist und dadurch die Besiedlung der Gerstenwurzel beeinflusst. <i>Fis</i> Überexpression reduzierte sowohl die ROS-Toleranz als auch die Adhärenz an Gerstenwurzeln und aktivierte die Transkription des <i>nuoA-N</i> Operons, das für NADH Dehydrogenase I kodiert, das erste Enzym einer membrangebundenen Elektronentransportkette. Die <i>nuoA-N</i> Knockout-Mutation im <i>fis</i>-Überexpressionshintergrund erhöhte die ROS-Toleranz und Adhärenz an Gerstenwurzeln. Wir zeigen, dass <i>nuoA</i> zwei Transkriptionsstartstellen hat, die 104 und 377 Nukleotide stromaufwärts der kodierenden Sequenz lokalisiert sind, was die Anwesenheit von zwei Promotoren anzeigt. Die DNase I-Fußabdruckanalyse ergab vier Fis-Bindungsstellen: Fis-nuo1 bis Fis-nuo4, die sich zwischen diesen beiden Promotoren befinden. Ortsgerichtete Mutagenese in einem Promotor-lacZ-Reporter- und β-Galactosidase-Assay bestätigte weiter die direkte Bindung von Fis an Fis-nuo2 und wahrscheinlich an Fis-nuo4, aber nicht an Fis-nuo1 und Fis-nuo3. Außerdem implizierten die Ergebnisse, dass die Fis-Bindung an Fis-nuo4 die Transkription des <i>nuoA-N</i>-Operons durch Modifikation der stromaufwärts gelegenen DNA-Topologie beeinflussen könnte. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse der Transposon-Mutagenese, dass Fis an der Regulierung mehrerer alternativer ROS-Entgiftungsverfahren unter Verwendung von NADH beteiligt sein könnte.</p></div


Einführung

Pseudomonas putida KT2440 ist ein Gram-negatives Bodenbakterium, das als allgemein als sicherer (GRAS)-zertifizierter Stamm eingestuft wird (Loeschcke und Thies, 2015 Nikel und de Lorenzo, 2018). Diese Sorte hat aufgrund ihres schnellen Wachstums, ihrer nativen metabolischen Vielseitigkeit und ihrer hohen Robustheit unter rauen Umweltbedingungen große Aufmerksamkeit für industrielle Anwendungen auf sich gezogen, die besonders geeignete Eigenschaften für die Biosanierung von Umweltverschmutzungen und das Metabolic Engineering sind (Nikel et al., 2016 Nikel und de Lorenzo, 2018). Darüber hinaus werden metabolische Modelle auf Genomskala von P. putida KT2440 wurden entwickelt, um den vielseitigen Metabolismus des Stammes auf Systemebene besser zu verstehen, die zur Umprogrammierung des Phänotyps für biotechnologische Implementierungen (Nogales et al., 2008 Sohn et al., 2010 Hintermayer und Weuster-Botz, 2017). In der Tat wurden etablierte molekularbiologische Werkzeuge, einschließlich Systeme für die Genexpression und Genom-Engineering, genutzt P. putida KT2440 zur Herstellung von Biokraftstoffen und Pharmazeutika durch Metabolic Engineering (Martínez-García und de Lorenzo, 2011 Cook et al., 2018 ).

Obwohl P. putida KT2440 wurde weithin als Chassis für Metabolic Engineering, Synthetische Biologie und Bioremediation verwendet, es gibt keine zuverlässige und standardisierte Methode zur sequenzspezifischen Regulation von interessierenden Genen. Kürzlich haben sich Clustered Regular Interspaced Palindrome Repeats (CRISPR) und CRISPR-assoziiertes (Cas) Protein als vielseitige Werkzeuge zur Genom-Editierung für verschiedene Organismen, einschließlich Bakterien (Cho et al., 2018 ), Säugetierzellen (Komor et al., 2017 ) und Pflanzen (Ma et al., 2016). Neben der Genom-Editierung wurde das CRISPR-Cas-System umfunktioniert, um die Genexpression in einer Methode namens CRISPR-Interferenz (CRISPRi) (Qi et al., 2013). Wie CRISPR-Cas-Systeme benötigt auch CRISPRi ein Nuklease-defizientes Cas9 (dCas9)-Protein und eine speziell entwickelte Single Guide RNA (sgRNA), die eine 20-Nukleotide (nt) lange Spacersequenz umfasst, die komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist. Der dCas9-sgRNA-Komplex bindet dann an den Strang der Ziel-DNA, der die Transkriptionsinitiation oder -verlängerung durch Blockieren der RNA-Polymerase-Bindung (Qi et al., 2013). Das CRISPRi-System wird auch als außergewöhnlich einfaches und effizientes Werkzeug zur sequenzspezifischen Regulation von Zielgenen in einer Reihe von Organismen eingesetzt, darunter Escherichia coli (Qi et al., 2013 ), Bacillus subtilis (Peters et al., 2016 ) und Säugerzellen (Gilbert et al., 2013 ).

CRISPRi-basierte Genregulation wurde auch für einige berichtet Pseudomonas spp. Bräunen et al. ( 2018 ) entwickelte ein abstimmbares CRISPRi-System zur Realisierung dynamischer Genrepression in Pseudomonas aeruginosa unter Verwendung des Typ-II-dCas9-Homologs von Streptococcus pasteurianus. Konkret konstruierten sie zwei Plasmide, um die dCas9 Gen und sgRNA aus einem Plac und Ptet Promoter bzw. Das entwickelte Zwei-Plasmid-CRISPRi-System zeigte jedoch eine undichte Expression des dCas9 Gen in P. aeruginosa, was in Abwesenheit des Induktors zur Repression des Zielgens führte. Darüber hinaus wurde das Typ-I-CRISPR-dCas-System als Transkriptionsrepressor in P. aeruginosa PA14, das die Löschung der Cas3 Gen von P. aeruginosa oder Expression von Anti-CRISPR-Proteinen aus einem Prophagen (Bondy-Denomy et al., 2015). In jüngerer Zeit wurde eine CRISPRi-Technik mit dCas9 of . entwickelt Streptococcus pyogenes (SpdCas9), das seine Funktionalität unter Verwendung des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) in . demonstrierte P. putida KT2440 (So et al., 2018). In dieser Studie fehlten jedoch CRISPRi-Anwendungen für das Metabolic Engineering oder die synthetische Biologie von P. putida KT2440.

Hier präsentieren wir ein l-Rhamnose-induzierbares Single-Plasmid-CRISPRi-System zur einfachen und effizienten Regulation von Zielgenen in P. putida KT2440. Dieses regulierbare CRISPRi-System war in der Lage, die Expression von exogenen und endogenen Genen in P. putida KT2440. Darüber hinaus stellen wir Beispiele für seine Anwendung zur Veränderung des Stoffwechselflusses zur Verfügung, um die Produktion von Mevalonat (MVA) zu steigern, einem wichtigen Zwischenmetaboliten für die Biosynthese einer Vielzahl von Terpenoiden. Pseudomonas putida KT2440 zeigt eine verlängerte Lag-Phase von Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle, daher könnten Strategien zur Reduzierung dieser Lag-Phase helfen, diese Belastungsbeschränkung durch die Verwendung einer kostengünstigen erneuerbaren Ressource für die mikrobielle Produktion von Terpenoiden zu überwinden. Verwendung eines Schlüsselregulators, der am Glycerinstoffwechsel von P. putida KT2440 als Zielgen für das Single-Plasmid-CRISPRi-System erwies sich als robuste Plattform zur Modulation der endogenen Genexpression. Dieses System kann daher das metabolische Engineering von beschleunigen P. putida KT2440 für die Entwicklung von mikrobiellen Zellfabriken, die in Zukunft industriell wertvolle Produkte herstellen können.


Diskussion

Die Verbesserung der Versorgung mit IPP und DMAPP für die biotechnologische Produktion von wertschöpfenden Isoprenoiden in Mikroorganismen war das Ziel vieler Studien. Allerdings müssen viele andere Faktoren berücksichtigt werden, um eine effiziente Produktion von Isoprenoiden zu erreichen, ohne die Fitness der Zelle zu beeinträchtigen. Dazu gehören (A) Erschöpfung metabolischer Substrate, (B) Toxizität akkumulierter Zwischen- oder Endprodukte und (C) Sättigung der Zellspeicherkapazität. Strategien zur Bewältigung der letzten beiden Probleme sind reichlich vorhanden, aber dem ersten wurde trotz der negativen Wachstumsauswirkungen der Umleitung der Pools zentraler Metaboliten wie Pyruvat und GAP auf die Synthese von IPP und DMAPP weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Während die meisten Studien zur Verbesserung der IPP- und DMAPP-Versorgung mit gut charakterisierten Organismen wie E coli (ein Modell für Bakterien, die den MEP-Weg nutzen) und S. cerevisiae (ein Modell für Hefen, die nur den MVA-Weg nutzen), sind andere Mikroorganismen, die zusätzliche Vorteile für die Produktion und Akkumulation hoher Isoprenoid-Titer aufweisen, noch kaum erforscht. Dies ist der Fall bei P. putida, ein Bakterium, das eine sehr hohe Toleranz gegenüber toxischen Verbindungen wie Monoterpenen zeigt [4, 5]. Ein zusätzlicher Vorteil von P. putida ist, dass Glukose metabolisiert wird, um ausgewogene Mengen der MEP-Pfad-Substrate Pyruvat und GAP zu produzieren [6, 10, 23]. Diese zentralen Stoffwechselsubstrate werden in anderen Bakterien wie z E coli, wobei diese unausgewogene Verfügbarkeit von Pyruvat und GAP die Aktivität des MEP-Wegs einschränken kann [24]. Erhöhung der Pyruvat- und GAP-Werte in P. putida führte tatsächlich zu einer (1,3-fachen) Erhöhung der Carotinoid-(β-Carotin)-Produktion [10], was darauf hindeutet, dass die Zufuhr von metabolischen Substraten den Fluss des MEP-Pfads begrenzt. Unsere hier berichteten Daten unterstützen weiter die Schlussfolgerung, dass die Sicherstellung einer angemessenen Versorgung mit Pyruvat und GAP auch wichtig ist, um die Isoprenoidproduktion hoch zu regulieren und gleichzeitig größere Störungen des gesamten mikrobiellen Stoffwechsels zu verhindern, die zu fehlerhaftem Wachstum führen.

Um verschiedene Wege zur Stimulierung des metabolischen Flusses über den endogenen MEP-Weg zu Isoprenoid-Vorstufen zu untersuchen, haben wir a P. putida Stamm (KTLYC) mit einem exogenen 3-Gen-Operon, um Lycopin als Read-out zu produzieren. Durch Transformieren dieses Stamms mit Plasmiden, um entweder endogene MEP-Weg-Gene zu überexprimieren oder alternative Shunt-Wege einzubauen, konnten wir die Lycopinproduktion (dh IPP- und DMAPP-Versorgung) um 3 (mit nDXS Abb. 8), 7 (mit dem MVA-Weg Abb. 3 .) vervielfachen ), 25 (mit DXS Abb. 4) und 50 (mit DXS und DXR Abb. 10). Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass eine weitere Optimierung zumindest einiger dieser Strategien oder eine Kombination mehrerer dieser Strategien zu noch höheren Steigerungen führen könnte. Additive und synergistische Effekte könnten auch durch eine verbesserte Versorgung mit MEP-Pfad-Substraten erzielt werden. Ein aktuelles Beispiel ist die Neuverkabelung der P. putida Kernmetabolismus für die Glukoseassimilation von der nativen Entner-Doudoroff- zur linearen Embden-Meyerhof-Parnas-Glykolyse, die die Produktion sowohl von Pyruvat als auch von GAP verbessert [10]. Die metabolische Plastizität von P. putida, das in der Lage ist, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen einschließlich Fettsäuren, Glycerin und aromatischen Verbindungen zu metabolisieren [25], bietet eine zusätzliche Möglichkeit, die für die Synthese von IPP und DMAPP erforderlichen Substratpools neu zu gestalten. Das Füttern der Bakterien mit verschiedenen Kohlenstoffquellen könnte dazu beitragen, höhere Pools von Pyruvat, GAP (dh Glukose) oder Acetyl-CoA (dh Fettsäuren) anzuhäufen, und die Kombination verschiedener Kohlenstoffquellen könnte dazu beitragen, die Konkurrenz der produktiven (exogenen) Wege mit den (endogener) Stoffwechsel im Haushalt. Die hierarchische Nutzung verschiedener Kohlenstoffquellen [26] könnte unsere Fähigkeit einschränken, voll aktive Stoffwechselwege zu kombinieren, um gleichzeitig produktive und haushaltsnahe Wege in der Zelle zu versorgen. Unser Wissen über die Mechanismen, die diese Hierarchie steuern, verbessert sich jedoch ständig [27, 28] und bietet neue technische Möglichkeiten.

Unter den hier getesteten neuartigen Strategien war die Verwendung von nDXS zur Herstellung von DXP aus Ru5P am erfolgreichsten, da es die Lycopin-Akkumulation um das Dreifache verbesserte, ohne das Zellwachstum negativ zu beeinflussen (Abb. 8). Obwohl dieser Anstieg noch weit von dem des kanonischen DXS-Enzyms entfernt ist (Abb. 4), ist zu beachten, dass nDXS als mutiertes Enzym identifiziert wurde, das die Fähigkeit zur Produktion von DXP durch eine Punktmutation erworben hat und es ist nicht für die DXP-Synthese optimiert. Unsere Schätzung ist, dass nur etwa 10 % des Ru5P-Substrats durch nDXS in DXP umgewandelt werden. Die Erhöhung der DXS-Aktivität des mutierten Enzyms sollte machbar und sogar schnell sein, wenn die neuen automatisierten Plattformen für adaptive Laborevolutionsansätze verwendet werden [29, 30]. Ein optimiertes nDXS würde eine ergänzende Strategie unter Verwendung des kanonischen DXS ermöglichen, um den MEP-Pfad unter Verwendung von Pyruvat und GAP mit einem zusätzlichen DXP-Input, der aus der Transformation von Ru5P durch nDXS erhalten wird, bis an die Grenzen zu bringen, die keine Auswirkungen auf das Wachstum zeigen. Die Verfügbarkeit der Kristallstruktur des Wildtyp-ribB-Proteins [31] sollte es erlauben, abzuleiten, wie die neu ausgewählten Mutationen die DXS-Aktivität von nDXS beeinflussen könnten, eine Information, die sehr wertvoll sein könnte, um schließlich synthetische Enzyme herzustellen, die in der Lage sind, DXP ​​aus Ru5P oder aus Substraten, die den endogenen MEP-Weg oder andere essentielle Stoffwechselprozesse in den Bakterien nicht stören. Als ergänzende Strategie könnte die Zufuhr von Ru5P durch eine Neuverdrahtung des Pentosephosphatwegs verbessert werden. Ru5P ist ein C5-Substrat und wird daher von nDXS in DXP umgewandelt, ohne Kohlenstoff zu verlieren (es sei denn, die durch DXS katalysierte Reaktion beginnt mit zwei C3-Vorstufen und beinhaltet eine Decarboxylierung). Zusammen könnte die Verwendung optimierter Versionen von nDXS entweder allein oder in Kombination mit anderen Strategien die IPP- und DMAPP-Produktion auf ein neues hohes Niveau steigern.

Eine weitere neuartige Strategie, die wir testeten, war die Feinregulierung der DXS-Expression durch Verwendung eines endogenen Promotors, der auf Zellwachstumsstress reagierte (Abb. 6). Verwendung der PkatA Promotor erreichten wir nur eine vierfache Erhöhung der Lycopin-Akkumulation im Vergleich zu leeren Plasmidkontrollen, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionsaktivität dieses Promotors unter den getesteten Bedingungen zu gering ist, um den MEP-Weg effektiv zu verstärken und somit die Stressbedingungen zu erreichen, die schließlich die Transkription unterdrücken könnten. Es ist wahrscheinlich, dass die Verwendung stärkerer, aber immer noch auf Stress reagierender Promotoren besser funktioniert. Die PkatA Promotor könnte so konstruiert werden, dass er seine Transkriptionsaktivität erhöht, während seine regulatorischen Eigenschaften erhalten bleiben. Alternativ sollte die Analyse des Transkriptoms von KTLYC(p424-DXS)-Zellen, die in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von IPTG gezüchtet wurden, die Identifizierung von Genen ermöglichen, die bei normalem Zellwachstum stark exprimiert werden, aber reprimiert werden, wenn das Zellwachstum in einer IPTG-abhängigen Weise beeinträchtigt wird (dh wenn die DXS-Aktivität zu hoch ist). Die Promotoren solcher Gene könnten dann in synthetischen Operons verwendet werden, um die Versorgung mit DXS (und IDI, DXR, nDXS usw.) in Erscheinung treten. Dies gibt den Zellen Zeit, ihren Stoffwechsel neu einzustellen und danach die Isoprenoid-Überproduktion wieder aufzunehmen.

Die von uns getesteten eher „klassischen“ Ansätze, dh die Verwendung eines exogenen MVA-Wegs zur Herstellung von IPP und DMAPP aus Acetyl-coA und die Überexpression von MEP-Weg-Genen, führten zu dem Schluss, dass wir die mit einem Bakterium erhaltenen Ergebnisse nicht direkt extrapolieren können (z.B E coli), um ein anderes Bakterium (z. P. putida). Beispielsweise funktioniert die Verwendung des MVA-Pfads in der Regel besser als die DXS-Hochregulierung in E coli [32,33,34] aber wir beobachteten das gegenteilige Verhalten in P. putida. Eine ähnliche Beobachtung wurde zuvor bei Cyanobakterien berichtet, die unter photoautotrophen Bedingungen wachsen und Isopren produzieren [35]. Das Vorhandensein des bakteriellen MVA-Weg-Operons verbesserte die Lycopin-Akkumulation um das Siebenfache (Abb. 3), ähnlich der zehnfachen Zunahme, von der berichtet wurde, dass sie dasselbe Operon auf die Monoterpen-Produktion in verursacht P. putida DSM 12264-Zellen [4]. Im Gegensatz dazu war die Anwesenheit eines DXS enthaltenden Plasmids in der Lage, die Lycopin-Akkumulation in KTLYC-Zellen ohne jegliche Induktion um das 15-fache zu fördern ( 4b ). Das fast völlige Fehlen der Wirkung der IDI-Überproduktion auf die Lycopinsynthese, wenn die limitierende Rolle von DXS in freigesetzt wird P. putida (Abb. 4d) unterscheidet sich auch von der in E coli [29].


Diskussion

Die Wurzelbesiedelung wird sowohl durch abiotische als auch durch biotische Faktoren in der Nähe von Pflanzenwurzeln beeinflusst, die schädliche oder im Gegenteil positive Auswirkungen haben können. Für eine erfolgreiche Besiedelung müssen Bakterien das Vorhandensein der Pflanze erkennen, mit negativen Auswirkungen schädlicher Faktoren fertig werden und sich erfolgreich an der Wurzeloberfläche der Pflanze anheften.

Das haben wir bereits beschrieben fis-Überexpression erhöht sowohl die Biofilmbildung als auch die Expression von RundeA in P. putida [22,23,31]. LapA ist ein Zelloberflächenprotein, das für P. putida Anheftung an biotische und abiotische Oberflächen [23,45]. Daher, fis-Überexpression in P. putida sollte die Anhaftung von Bakterien an Gerstenwurzeln erhöhen und nicht die ersten Stadien der Besiedelung wie zuvor beschrieben [31] abschwächen. Wir stellten die Hypothese auf, dass Fis an der Regulierung der ROS-Toleranz in beteiligt sein könnte P. putida und die verminderte Einhaltung der fis-Überexpressionsstamm F15 in den ersten Kolonisierungsschritten kann das Ergebnis einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber exogenen ROS sein.

Tatsächlich ist die Überexpression von fis in P. putida reduziert das H2Ö2-Toleranz der Zellen, und wie erwartet, Hinzufügen eines zusätzlichen Katalase-Gens katA linderte die Sensibilität der fis-Überexpressionsstamm zu ROS (Fig. 1B). Darüber hinaus ist die Überexpression von fis in P. putida erhöhte die endogene ROS-Menge und verringerte die Fähigkeit, Gerstenwurzeln zu besiedeln, was noch weiter verringert wurde, wenn die extrazelluläre Menge an ROS durch Supplementation mit Gallussäure erhöht wurde (Abb. 2). Gleichzeitig war der Wildtyp-Stamm nicht empfindlich gegenüber dem durch Gallussäure erhöhten ROS an Gerstenwurzeln (Fig. 2C). Wir vermuten, dass die Empfindlichkeit gegenüber ROS an Gerstenwurzeln von den physiologischen Bedingungen der Bakterienzellen abhängen kann. Höchstwahrscheinlich war der Wildtyp-Stamm in der Lage, einen kompensatorischen Mechanismus zu nutzen, um die exogenen ROS, die von Gerstenwurzeln emittiert werden, zu entgiften, und P. putida mit dem überexprimierten fis war nicht. Dies warf die Frage auf, ob Fis die ROS-Toleranz beeinflussen könnte, indem es die Transkription einiger spezifischer Gene reguliert.

Wir führten Transposon-Mutagenese durch, um Fis-abhängige Gene zu identifizieren, die die ROS-Toleranz von Bakterien regulieren könnten, und identifizierten 19 Mini-Tn5 Einfügungen in die F15 nuoA-N Operon-Gene. Dieser Befund weist darauf hin, dass die Regulierung der nuoA-N Operon von Fis könnte als alternativer Mechanismus zur Reduzierung endogener ROS an der ROS-Toleranz beteiligt sein. Tatsächlich ist die Löschung von nuoA-N verminderte endogene ROS in der fis– Zellen überexprimieren (Abb. 2B) und die Toleranz gegenüber exogenen ROS erhöht (Abb. 1B). Die Gene nuoA zu nuoN kodieren NuoA-N-Proteine, die sich in der zytoplasmatischen Membran zu NADH-Dehydrogenase I assemblieren [15,46,47]. Dieser Komplex ist ein Enzym der Atmungskette, das die Übertragung von zwei Elektronen von NADH auf Chinone in einer Reaktion katalysiert, die mit der Translokation von Protonen durch die Membran verbunden ist [48].

Zwei Hypothesen könnten erklären, wie die NADH-Dehydrogenase I die Menge an endogenen ROS beeinflussen könnte: die Erzeugung von ROS selbst oder die Abreicherung des Reduktionsmittels NADH. Es wurde gezeigt, dass die NADH-Dehydrogenase I während des Elektronentransports ROS in . produzieren kann Escherichia coli [16]. In diesem Fall können ROS während der NADH-Oxidation und des Elektronentransports durch den Cofaktor FMN entstehen [16]. Alternativ ist es möglich, dass die Abreicherung von NADH als Reduktionsmittel die endogene ROS erhöhen kann. Zum Beispiel induziert die Anwesenheit von Antibiotika im Wachstumsmedium viele oxidative Stressgene, z. NADH-Peroxidase und Glutathion-Reduktase [21], und dadurch benötigen Bakterien NADH, um es zur ROS-Entgiftung zu verwenden. Somit ist der erzwungene Ausdruck von nuoA-N Gene von fis-Überexpression kann zu einem NADH-Defizit führen, wodurch die Entgiftung von endogenen ROS verhindert wird. Welche Hypothese auch immer zutrifft, die Summe der endogenen und exogenen ROS für F15ΔnuoA-N ist niedriger, was zu einer höheren Toleranz der Bakterien gegenüber exogenen ROS und einer erhöhten Kolonisierungseffizienz führt ( 1B , 2C und 2D ). Darüber hinaus war im Gegensatz zu F15 die Kolonisierungseffizienz von F15ΔnuoA-N in der fis-Überexpressionshintergrund (Fig. 2C). Es scheint, dass die Befestigung von P. putida hängt von zwei Faktoren ab: der Entgiftung von ROS und der Anwesenheit des Hauptadhäsins LapA, wie wir zuvor berichtet haben fis-Überexpression erhöht den Ausdruck von RundeA [22,23]. Somit würde die erhöhte Menge an LapA auf der Zelloberfläche die Anheftung an Wurzeln verstärken, wenn die Bakterien in der Lage wären, ROS effektiv zu entgiften.

Die Identifizierung von Mini-Tn5 Insertionen in mehreren anderen Genen, die für die Aufrechterhaltung der Reduktionskraft verantwortlich sind, unterstützen die Hypothese der NAD(P)H-Verarmung. Obwohl nur wenige Mini-Tn5 Insertionen in die Methionin-Biosynthesegene wurden ausgewählt, die Mini-Tn5 Einfügen in die PP_5275 und metR-1 (PP_1063) stellte das H . wieder her2Ö2-Toleranz auf Wildtyp-Niveau trotz fis-Überexpression (S3-Tabelle). Es ist bekannt, dass ROS Thiolstress erzeugen, indem sie Thiolreste in Biomolekülen, insbesondere in Proteinen, oxidieren, wodurch Disulfidbindungen entstehen, die Enzyme inaktivieren können [49]. Daher benötigen Bakterien reduzierende Kraft, um Disulfidbindungen in Proteinen zu reduzieren, und NADPH, das in der Methionin-Biosynthese verwendet wird, ist ein starkes Reduktionsmittel zur Entgiftung von ROS in Bakterien [50,51]. Somit kann die erhöhte Menge an Fis die Reduktion oxidierter Biomoleküle in beeinflussen P. putida da es die Methionin-Biosynthese aufrechterhält, die unter natürlichen Umständen herunterreguliert würde. Da Pflanzenwurzeln Aminosäuren absondern, um pflanzenwachstumsfördernde Bakterien anzulocken [52,53], ist es wahrscheinlicher, dass die Aminosäurebiosynthese in Bakterien in der Nähe von Pflanzenwurzeln herunterreguliert wird. Der Grund für die Herunterregulierung ist wahrscheinlich nicht nur, Energie zu sparen, sondern auch die Erschöpfung von Reduktionsmitteln wie NADPH zu vermeiden.

Darüber hinaus können Ketosäuren ROS auf NADPH-unabhängige Weise neutralisieren [54]. Zum Beispiel erhöht ein Überschuss an ROS die Akkumulation von Alpha-Ketoglutarat, dem Metaboliten des Krebs-Zyklus, der zur Reduzierung von Disulfidbindungen in verwendet wird Pseudomonas fluorescens [54]. Daher ist es möglich, dass die Einfügung von Mini-Tn5 in den Genen der Methionin-Biosynthese und der Alpha-Ketoglutarat-Stoffwechselgene lindert den Thiol-Stress im fis-Überexpressionshintergrund (S3-Tabelle). Somit könnten Bakterien während des Kolonisationsprozesses ihren Stoffwechsel regulieren, um mit der toxischen Wirkung von exogenen ROS fertig zu werden, indem sie die Expression des nuoA-N Operon und Erhöhung der Reduktionskraft, indem die Menge an NADH, NADPH und Ketosäuren hoch gehalten wird.

Da eine signifikante Anzahl von Transposon-Mutanten Transposon-Insertionen in der nuo Operon-Gene und vier potenzielle Fis-Bindungsstellen wurden in der stromaufwärts gelegenen Sequenz des nuoA Gen haben wir die Regulation dieses Operons durch Fis eingehend untersucht. Die Organisation der nuoA-N Gene ist bei verschiedenen Bakterien ähnlich: Sie befinden sich in einem Operon und werden in E. coli, Salmonella enterica und P. fluoreszierend [15,55,56]. Das Vorhandensein von Ähnlichem nuo Operonstruktur in P. putida impliziert, dass die nuoA-N Operon-Gene könnten in co-transkribiert werden P. putida sowie.

Die nuoA-N Operon in P. putida hat zwei Promoter vor dem nuoA Gen und diese Promotoren werden indirekt durch RpoS herunterreguliert (Fig. 4). Fis bindet an mehrere Bindungsstellen stromaufwärts des Fis-abhängigen Promotors (Fig. 5 und 6) und reguliert die Transkription hoch (Fig. 7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transkription von nuo-operon in P. putida wird in Gegenwart von Nährstoffen verstärkt, wenn Bakterien die Energie haben, ROS zu neutralisieren und durch Stress herunterreguliert, wenn die Verfügbarkeit von Entgiftung zusätzlicher ROS abnimmt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass zwei Fis-Bindungsstellen die Transkription der P. putida nuoA positiv. Die proximale Fis-Bindungsstelle Fis-nuo2 befindet sich ca. -70 bp vom 5´-Ende des nuoA mRNA N-I (Fig. 3). Ein solcher Abstand ist charakteristisch für Aktivatoren, die direkt mit der RNA-Polymerase interagieren [57]. Die als Fis-nuo4 bezeichnete Region scheint auch an der Transkriptionsregulation beteiligt zu sein, wahrscheinlich durch die Modulation der DNA-Topologie. Der Fis-nuo4 befindet sich -290 bp vom 5´-Ende des nuoA mRNA N-I (Fig. 3) und kann die Transkription aus dieser Entfernung nur durch Erzeugung einer DNA-Schleife aktivieren. Daher schlagen wir vor, dass die Bindung von Fis an Fis-nuo4 die DNA-Topologie verändern könnte, die die Transkription von nuoA-N Operon.

Zusammenfassend haben wir in dieser Studie die Beteiligung des globalen Regulators Fis an der ROS-Toleranz und der Gerstenwurzelkolonisierung von . beschrieben P. putida. Der negative Effekt von Fis auf die ROS-Toleranz und damit auf die Wurzelbesiedelungseffizienz könnte über eine Erhöhung des Transkriptionsniveaus des nuoA-N Operon und die Akkumulation von endogenen ROS. Fis bindet an die Promotorregion des nuoA-N Operon und erleichtert seine Transkription durch Bindung an Fis-nuo2- und Fis-nuo4-Stellen stromaufwärts des Operon-Promotors.


Die differentielle Antwort des Pben Promoter von Pseudomonas putida mt-2 zu BenR und XylS verhindert Stoffwechselkonflikte in m-Bioabbau von Xylol

Pseudomonas putida mt-2 umfasst zwei alternative und potenziell widersprüchliche Wege für den Benzoat-Stoffwechsel, einen Meta Pfad kodiert von xyl Gene des pWW0-Plasmids und gemastert von den Pm Promotor und XylS und einer chromosomal kodiert ortho Weg initiiert von Pben und das BenR-Protein. Jede Kreuzaktivierung von Pben Promotor durch XylS einen metabolischen Konflikt beim Abbau von m-Xylol, weil das als Zwischenprodukt erzeugte 3-Methylbenzoat (3MBz) durch die ortho Stoffwechselweg und produzieren toxische Dead-End-Metaboliten. Die Aktivierung von Pben von XylS wurde erneut untersucht, wobei sowohl die Reporter-Technologie als auch Tiling-Arrays verwendet wurden, die auf die interessierenden Sequenzen um die Boten-RNA-Initiation von beiden ausgerichtet waren Pben und Pm Förderer. Analyse von überempfindlichen luxCDABE Fusionen, Inspektion von xylX gegen benA Transkripte und Wachstumstests von benR Mutanten zeigten, dass die natürlichen Expressionsbereiche von XylS unter verschiedenen Bedingungen nicht ausreichen, um eine signifikante Kreuzregulation von . zu bewirken Pben ob Zellen endogenen oder exogenen 3MBz gegenüberstehen. Dies scheint von der Natur der Operatoren für die Bindung eines der Transkriptionsfaktoren herzurühren, die im Fall der Pben Promoter von P. putida mt-2 scheint sich entwickelt zu haben, um eine starke Wechselwirkung mit XylS zu vermeiden.


Inhalt

Wie die meisten Bakteriengattungen lebte der letzte gemeinsame Vorfahre der Pseudomonade [Anm. 1] vor Hunderten von Millionen Jahren. Sie wurden ursprünglich Ende des 19. Jahrhunderts klassifiziert, als sie von Walter Migula erstmals identifiziert wurden. Die Etymologie des Namens wurde damals nicht angegeben und erschien erstmals in der siebten Auflage von Bergeys Handbuch der systematischen Bakteriologie (die wichtigste Autorität in der bakteriellen Nomenklatur) als Griechisch pseudo (ψευδής) "falsch" und -monas (μονάς/μονάδος) "eine einzelne Einheit", was eine falsche Einheit bedeuten kann, Migula hat es jedoch möglicherweise als falsch gemeint Monas, ein nanogeißelter Protist [7] (später wurde der Begriff "Monade" in der Frühgeschichte der Mikrobiologie verwendet, um einzellige Organismen zu bezeichnen). Bald wurden andere Arten, die der etwas vagen ursprünglichen Beschreibung von Migula entsprachen, aus vielen natürlichen Nischen isoliert und zu dieser Zeit wurden viele der Gattung zugeordnet. Viele Stämme wurden jedoch seitdem neu klassifiziert, basierend auf neueren Methoden und der Verwendung von Ansätzen, die Studien an konservativen Makromolekülen beinhalten. [8]

Vor kurzem hat die 16S-rRNA-Sequenzanalyse die Taxonomie vieler Bakterienarten neu definiert. [9] Als Ergebnis ist die Gattung Pseudomonas umfasst Stämme, die früher in die Gattungen eingeordnet wurden Chryseomonas und Flavimonas. [10] Andere Stämme, die zuvor in die Gattung eingeordnet wurden Pseudomonas werden jetzt in die Gattungen eingeordnet Burkholderia und Ralstonien. [11] [12]

Im Jahr 2020 wird eine phylogenomische Analyse von 494 abgeschlossen Pseudomonas Genome identifizierten zwei gut definierte Arten (P. aeruginosa und P. chlororaphis) und vier weitere phylogenetische Gruppen (P. fluorescens, P. stutzeri, P. syringae, P. putida) mit einer ausreichenden Anzahl verfügbarer Proteome. [13] Die vier breiteren evolutionären Gruppen umfassen mehr als eine Spezies, basierend auf der Speziesdefinition durch die durchschnittliche Nukleotididentität. [14] Darüber hinaus identifizierte die phylogenomische Analyse mehrere Stämme, die fälschlicherweise der falschen Spezies oder evolutionären Gruppe zugeordnet wurden. [13] Dieses Problem der falschen Annotation wurde auch von anderen Analysen berichtet. [fünfzehn]

Im Jahr 2000 wurde die komplette Genomsequenz von a Pseudomonas Art wurde in jüngerer Zeit bestimmt, die Abfolge anderer Stämme wurde bestimmt, einschließlich P. aeruginosa Stämme PAO1 (2000), P. putida KT2440 (2002), P.-Proteine Pf-5 (2005), P. spritzen Pathovar-Tomate DC3000 (2003), P. spritzen Pathovar-Spritzen B728a (2005), P. spritzen Pathovar phaseolica 1448A (2005), P. fluoreszenz Pf0-1, und P. entomophila L48. [8]

Bis 2016 wurden mehr als 400 Stämme von Pseudomonas sequenziert worden war. [16] Die Sequenzierung der Genome von Hunderten von Stämmen ergab stark unterschiedliche Arten innerhalb der Gattung. Tatsächlich sind viele Genome von Pseudomonas teilen nur 50-60% ihrer Gene, z.B. P. aeruginosa und P. putida teilen sich nur 2971 Proteine ​​von 5350 (oder

Bis 2020 mehr als 500 fertig Pseudomonas Genome waren in der Genbank verfügbar. Eine phylogenomische Analyse verwendete 494 vollständige Proteome und identifizierte 297 Kern-Orthologe, die von allen Stämmen geteilt werden. [13] This set of core orthologues at the genus level was enriched for proteins involved in metabolism, translation, and transcription and was utilized for generating a phylogenomic tree of the entire genus, to delineate the relationships among the Pseudomonas major evolutionary groups. [13] In addition, group-specific core proteins were identified for most evolutionary groups, meaning that they were present in all members of the specific group, but absent in other Pseudomonaden. For example, several P. aeruginosa-specific core proteins were identified that are known to play an important role in this species' pathogenicity, such as CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, und EsrC. [13]

Members of the genus display these defining characteristics: [17]

Other characteristics that tend to be associated with Pseudomonas species (with some exceptions) include secretion of pyoverdine, a fluorescent yellow-green siderophore [18] under iron-limiting conditions. Certain Pseudomonas species may also produce additional types of siderophore, such as pyocyanin by Pseudomonas aeruginosa [19] and thioquinolobactin by Pseudomonas fluorescens,. [20] Pseudomonas species also typically give a positive result to the oxidase test, the absence of gas formation from glucose, glucose is oxidised in oxidation/fermentation test using Hugh and Leifson O/F test, beta hemolytic (on blood agar), indole negative, methyl red negative, Voges–Proskauer test negative, and citrate positive.

Pseudomonas may be the most common nucleator of ice crystals in clouds, thereby being of utmost importance to the formation of snow and rain around the world. [21]

Biofilm formation Edit

All species and strains of Pseudomonas have historically been classified as strict aerobes. Exceptions to this classification have recently been discovered in Pseudomonas Biofilme. [22] A significant number of cells can produce exopolysaccharides associated with biofilm formation. Secretion of exopolysaccharides such as alginate makes it difficult for pseudomonads to be phagocytosed by mammalian white blood cells. [23] Exopolysaccharide production also contributes to surface-colonising biofilms that are difficult to remove from food preparation surfaces. Growth of pseudomonads on spoiling foods can generate a "fruity" odor.

Antibiotic resistance Edit

Die meisten Pseudomonas spp. are naturally resistant to penicillin and the majority of related beta-lactam antibiotics, but a number are sensitive to piperacillin, imipenem, ticarcillin, or ciprofloxacin. [23] Aminoglycosides such as tobramycin, gentamicin, and amikacin are other choices for therapy.

This ability to thrive in harsh conditions is a result of their hardy cell walls that contain porins. Their resistance to most antibiotics is attributed to efflux pumps, which pump out some antibiotics before they are able to act.

Pseudomonas aeruginosa is increasingly recognized as an emerging opportunistic pathogen of clinical relevance. One of its most worrying characteristics is its low antibiotic susceptibility. [24] This low susceptibility is attributable to a concerted action of multidrug efflux pumps with chromosomally encoded antibiotic resistance genes (e.g., mexAB-oprM, mexXY, etc., [25] ) and the low permeability of the bacterial cellular envelopes. Besides intrinsic resistance, P. aeruginosa easily develops acquired resistance either by mutation in chromosomally encoded genes or by the horizontal gene transfer of antibiotic resistance determinants. Development of multidrug resistance by P. aeruginosa isolates requires several different genetic events that include acquisition of different mutations and/or horizontal transfer of antibiotic resistance genes. Hypermutation favours the selection of mutation-driven antibiotic resistance in P. aeruginosa strains producing chronic infections, whereas the clustering of several different antibiotic resistance genes in integrons favours the concerted acquisition of antibiotic resistance determinants. Some recent studies have shown phenotypic resistance associated to biofilm formation or to the emergence of small-colony-variants, which may be important in the response of P. aeruginosa populations to antibiotic treatment. [8]

Sensitivity to gallium Edit

Although gallium has no natural function in biology, gallium ions interact with cellular processes in a manner similar to iron(III). When gallium ions are mistakenly taken up in place of iron(III) by bacteria such as Pseudomonas, the ions interfere with respiration, and the bacteria die. This happens because iron is redox-active, allowing the transfer of electrons during respiration, while gallium is redox-inactive. [26] [27]

Animal pathogens Edit

Infectious species include P. aeruginosa, P. oryzihabitans, und P. plecoglossicida. P. aeruginosa flourishes in hospital environments, and is a particular problem in this environment, since it is the second-most common infection in hospitalized patients (nosocomial infections) [ Zitat benötigt ] . This pathogenesis may in part be due to the proteins secreted by P. aeruginosa. The bacterium possesses a wide range of secretion systems, which export numerous proteins relevant to the pathogenesis of clinical strains. [28] Intriguingly, several genes involved in the pathogenesis of P.aeruginosa, wie zum Beispiel CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, und EsrC are core group-specific, [13] meaning that they are shared by the vast majority of P. aeruginosa strains, but they are not present in other Pseudomonaden.

Plant pathogens Edit

P. spritzen is a prolific plant pathogen. It exists as over 50 different pathovars, many of which demonstrate a high degree of host-plant specificity. Numerous other Pseudomonas species can act as plant pathogens, notably all of the other members of the P. spritzen subgroup, but P. spritzen is the most widespread and best-studied.

Although not strictly a plant pathogen, P. tolaasii can be a major agricultural problem, as it can cause bacterial blotch of cultivated mushrooms. [29] Similarly, P. agarici can cause drippy gill in cultivated mushrooms. [30]

Since the mid-1980s, certain members of the genus Pseudomonas have been applied to cereal seeds or applied directly to soils as a way of preventing the growth or establishment of crop pathogens. This practice is generically referred to as biocontrol. The biocontrol properties of P. fluoreszenz und P. protegens strains (CHA0 or Pf-5 for example) are currently best-understood, although it is not clear exactly how the plant growth-promoting properties of P. fluoreszenz are achieved. Theories include: the bacteria might induce systemic resistance in the host plant, so it can better resist attack by a true pathogen the bacteria might outcompete other (pathogenic) soil microbes, e.g. by siderophores giving a competitive advantage at scavenging for iron the bacteria might produce compounds antagonistic to other soil microbes, such as phenazine-type antibiotics or hydrogen cyanide. Experimental evidence supports all of these theories. [31]

Other notable Pseudomonas species with biocontrol properties include P. chlororaphis, which produces a phenazine-type antibiotic active agent against certain fungal plant pathogens, [32] and the closely related species P. aurantiaca, which produces di-2,4-diacetylfluoroglucylmethane, a compound antibiotically active against Gram-positive organisms. [33]

Some members of the genus are able to metabolise chemical pollutants in the environment, and as a result, can be used for bioremediation. Notable species demonstrated as suitable for use as bioremediation agents include:

  • P. alcaligenes, which can degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. [34]
  • P. mendocina, which is able to degrade toluene. [35]
  • P. pseudoalcaligenes, which is able to use cyanide as a nitrogen source. [36]
  • P. resinovorans, which can degrade carbazole. [37]
  • P. veronii, which has been shown to degrade a variety of simple aromaticorganic compounds. [38][39]
  • P. putida, which has the ability to degrade organic solvents such as toluene. [40] At least one strain of this bacterium is able to convert morphine in aqueous solution into the stronger and somewhat expensive to manufacture drug hydromorphone (Dilaudid).
  • Strain KC of P. stutzeri, which is able to degrade carbon tetrachloride. [41]

One way of identifying and categorizing multiple bacterial organisms in a sample is to use ribotyping. [42] In ribotyping, differing lengths of chromosomal DNA are isolated from samples containing bacterial species, and digested into fragments. [42] Similar types of fragments from differing organisms are visualized and their lengths compared to each other by Southern blotting or by the much faster method of polymerase chain reaction (PCR). [42] Fragments can then be matched with sequences found on bacterial species. [42] Ribotyping is shown to be a method to isolate bacteria capable of spoilage. [43] Around 51% of Pseudomonas bacteria found in dairy processing plants are P. fluoreszenz, with 69% of these isolates possessing proteases, lipases, and lecithinases which contribute to degradation of milk components and subsequent spoilage. [43] Other Pseudomonas species can possess any one of the proteases, lipases, or lecithinases, or none at all. [43] Similar enzymatic activity is performed by Pseudomonas of the same ribotype, with each ribotype showing various degrees of milk spoilage and effects on flavour. [43] The number of bacteria affects the intensity of spoilage, with non-enzymatic Pseudomonas species contributing to spoilage in high number. [43]

Food spoilage is detrimental to the food industry due to production of volatile compounds from organisms metabolizing the various nutrients found in the food product. [44] Contamination results in health hazards from toxic compound production as well as unpleasant odours and flavours. [44] Electronic nose technology allows fast and continuous measurement of microbial food spoilage by sensing odours produced by these volatile compounds. [44] Electronic nose technology can thus be applied to detect traces of Pseudomonas milk spoilage and isolate the responsible Pseudomonas Spezies. [45] The gas sensor consists of a nose portion made of 14 modifiable polymer sensors that can detect specific milk degradation products produced by microorganisms. [45] Sensor data is produced by changes in electric resistance of the 14 polymers when in contact with its target compound, while four sensor parameters can be adjusted to further specify the response. [45] The responses can then be pre-processed by a neural network which can then differentiate between milk spoilage microorganisms such as P. fluoreszenz und P. aureofaciens. [45]

Recently, 16S rRNA sequence analysis redefined the taxonomy of many bacterial species previously classified as being in the genus Pseudomonas. [9] Species removed from Pseudomonas are listed below clicking on a species will show its new classification. The term 'pseudomonad' does not apply strictly to just the genus Pseudomonas, and can be used to also include previous members such as the genera Burkholderia und Ralstonia.


Methoden

Mathematical modeling with piecewise-linear differential equations

Formalization of each of the regulatory components of the TOL system (Figure 1) as binary logic gates and the assembly of the complete network as a digital circuit has been described before [17]. The streamlined scheme of Figure 2c was used as a guide to the formulation of equations for each of the regulatory and metabolic steps of the network. To this end, we adopted piecewise-linear (PL) differential equations [45] for describing the circuit dynamics as described [21, 46]. The rationale of this approach is that production of metabolites in the model is determined by state equations, which define the metabolic reactions as the result of [i] the presence of substrates and [ii] the activation of a regulation function that encodes transcriptional and metabolic interactions. Under this scheme, a regulatory function accounts for the expression of a given gene and the production of the corresponding protein owing to the presence of an effector. Specific regulatory functions can thus be expressed as:

This equation indicates that the synthesis of product ich is a function of the presence of the effector J. In dieser Gleichung S+ is a step function, a Boolean operator that is set to a value 1 if the concentration of J (x J ) is above a particular threshold (θ J ), and to a value 0 if the concentration is below θ J . Die Synthese von ich occurs at a rate determined by k ich only when x J >θ J , and does not take place if x J <θ J . In this case, J is an activator of the synthesis of ich. By the same token, the effect of a repressor can be represented using a negative step function:

which is set to a value 1 when x J <θ J , and to a value 0 when x J >θ J . On this basis, the production of a given component of the network as a result of the combined influence of different effectors can be written as, e.g.:

where the appearance of product ich is regulated by the activator J and the repressor k. Such a component ich is synthesized only if J is present and k is absent. This is equivalent to a logic device (a logic gate) involving an AND/NOT operator (ANDN), taking J und k as inputs and producing ich as output. In this way, it is possible to model all possible transcriptional and metabolic interactions in the system as logic constructs, determining the production of particular compounds as a function of the presence or absence of some of the others [47]. Furthermore, it is possible to set different thresholds for the concentration of a particular compound when it controls different synthesis rates at different concentrations. For instance, if effector J regulates the synthesis of A and B, we can set the constraint θ J 1 <θ J 2 , to indicate that synthesis of A is regulated by a lower concentration of J than the synthesis of B. These constraints are known as threshold inequalities [21] and are described below for the TOL system. Eine solche threshold inequalities are related to the effective concentration of a given molecular species (e.g., a TF) above which it is able to have a regulatory effect on a target (e.g. promoter). In the case of TF-promoter pairs, inequalities are entered in the corresponding equations by means of a threshold value (θ J ) which represents the relative affinity of the TF under consideration for one or more target promoters. The active concentration of each of the components is then determined by its production rate (expressed by k ich ), and its degradation rate (g ich * x ich ), which is a strictly positive function, proportional to the concentration of the compound. These simple expressions of positive and negative step functions were adopted for representing all possible regulatory interactions in the system. The resulting set of equations was then implemented with the GNA (Genetic Network Analyzer) software [21]. GNA models describe the evolution of the regulatory circuit by specifying qualitative constraints on the parameters of the system. This allows the model to be reliably run even if the actual threshold concentrations and the reaction rates at stake are not known. One set of constraints thus includes such threshold inequalities. A second type of constraints consists of the so-called focal inequalities that set the possible steady-state concentrations of the components in the system with respect to their threshold values, for instance:

This inequality indicates that when component ich is produced at rate k ich and degraded with a rate constant g ich , so that its concentration converges towards the level k ich/g ich [45], it exceeds the threshold θ ich 1 , but not θ ich 2 . This allows an estimate of the concentration of the components in reference to their threshold values, even in absence of quantitative information on the parameters of the system. The inequalities for the TOL model were set as shown in Table 1.

It is possible to follow the dynamics of the regulatory network by computing a temporal progression of so-called qualitative states, each consisting of the levels of the concentration variables with respect to their thresholds. In each qualitative state the trend of the concentration variables (increasing/decreasing/steady) determines the possible transitions to successor states. The resulting directed graph of qualitative states and transitions between qualitative states is called a state transition graph (for a more detailed description, see [21, 46]. Note that the PL equations above and the associated transition graph describe the temporal order of signal propagation in the network when the first input signal is present and the system moves toward a steady state (where the concentrations of the components stop to change). The actual time interval during which the system remains in a state before reaching the next is not contained in these qualitative models. However, the representation reliably predicts the temporal ordering of states, and thus the consecutive changes in the levels of each of the components of the network.

Using the biological assumptions for known regulatory interactions (Figure 1) and the resulting logic operations (Figure 2c), we defined four PL equations describing XylR, XylS, Oberer, höher und Meta production (Table 1). The sole input for the system was m-xylene, which was defined as an input variable i.e. one having a constant concentration along the simulations, [21]. For implementation of in silico mutations, we changed threshold inequalities as follows. In one case Uhr activation was simulated in the absence of the XylSh loop by setting the parameter θ 2 XylSh to be higher than the maximal concentration reachable upon Ps activation (No XylS hyper-expression condition, Table 1). Similarly, simulation of the Uhr activation event in a scenario lacking XylSa, we set the Oberer, höher pathway not to produce enough concentrations of 3 MBz for creating XylSa (No XylSa condition, Table 1). Consideration of different threshold inequalities in the TOL model allowed us to simulate the specific conditions as discussed in the Results section.

Strains, chemicals and growth conditions

E coli CC118 strain [48] was used as the host for plasmid constructions and maintenance, while P. putida mt-2 [41] was employed for the analysis of promoter activity with reporter constructs (see below). E coli was grown in Luria-Bertani (LB) medium at 37°C. Unless indicated otherwise, P. putida was cultured in a minimal medium M9 supplemented with MgSO4 (2.0 mM), citrate or succinate (0.2%) as the only carbon source and grown at 30°C. Plasmids were conjugally transferred from E coli zu P. putida with a tripartite mating procedure [48] using E coli HB101 (RK600) as the helper strain. When required, growth media was supplemented with kanamycin (Km, 50 μg/ml) or chloramphenicol (Cm, 30 m/ml). All chemicals and substrates, including aromatic effectors (m-xylene, Ö-xylene, 3-methylbenzyl alcohol and 3-methyl benzoate) were purchased from Sigma-Aldrich.

Construction of reporter gene fusions

The TOL promoters Pu, Ps und Uhr were separately cloned in pSEVA226, a Km R broad host range vector (RK2 origin of replication) bearing a promoterless luxCDABE [49] operon downstream of the multiple cloning site of pUC (Silva-Rocha et al., in preparation). To this end, each of the promoters of interest was amplified from P. putida mt-2 DNA through PCR reactions with Pfu DNA polymerase (Promega) using primer pairs PUF (5'-GCG GAA TTC TTG ATC AAA TC GA CA GG TG GT TAT G-3') and PUR (5'-GCG CGG ATC CGT CTC GTA TAG CTA GCA ACC GCC-3') for Pu, PSF (5'-GGC CGA ATT CAT TCC ATC TGC CAC TTT AG-3') and PSR (5'-CGG CCG GAT CCC GGT TCT CTT ATT TTA ATG TGG-3') for Ps, and PMF (5'-CGG CCG AAT TCG GTT TGA TAG GGA TAA GTC C-3') and PMR (5'-CGG CCG GAT CCT CTG TTG CAT AAA GCC TAA-3') for Uhr. These primers introduced in each case ÖkoRI und BamHI sequences in equivalent sites of the 5' and 3' regions of each promoter (underlined in the primer sequence). PCR products were purified, digested with ÖkoRI und BamHI (NewEngland BIolabs), ligated to pSEVA226 cleaved with the same enzymes and transformed in chemically competent E coli CC118 cells. The resulting clones were named pSEVA226-Pu, pSEVA226-Ps and pSEVA226-Uhr. Sequence fidelity of the cloned promoters was verified in all cases by DNA sequencing.

Promoter activity quantification and data processing

The activity of the TOL promoters in response to inducers was examined with different procedures depending on the nature of the specific chemical tested. In case of soluble inducers (3MBA and 3 MBz), overnight grown P. putida cells harboring the reporter plasmid under examination were diluted 1:20 in fresh minimal media with the inducer of interest at a final concentration of 1 mM. 200 μl aliquots (with four replicates) of the thereby diluted cells were placed in 96-well Microplates (Optilux™, BD Falcon) and incubated in a Wallac Víctor II 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) at 30°C, the optical density at 600 nm (OD600) and the bioluminescence being recorded every 30 min. Promoter activity was quantified by normalizing bioluminescence in respect to cell density (i.e. bioluminescence/OD600). For testing volatile inducers (m-xylene and Ö-xylene), single colonies of P. putida clones bearing the reporter plasmids indicated were patched on M9/citrate agar plates, grown overnight an exposed to saturating vapors of a 1 M inducer solution in DMSO. Non-disruptive monitoring of promoter output was carried out with a VersaDoc™ Imaging System (BioRad) and the results processed with the ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). In either case, graphic representations of promoter activities were generated with MATLAB software (MathWorks).


Diskussion

SQ is one of the most abundant organosulfur compounds in the biosphere, following glutathione, Cys, and Met, and the global production of SQ is estimated at 10 gigatons per year (2, 22). Although the biosynthesis of SQ and SQDG in plants, algae, cyanobacteria, and archaea has been studied in considerable detail (e.g., 23, 24), much less is known about the degradation reactions and the recycling of the carbon and sulfur bound in SQ and SQDG. The lipid can easily be hydrolyzed by plant acyl-hydrolases, which liberate SQ-glycerol (1), and glucosidases can liberate SQ in the next step (25) however, it is still unclear whether higher plants are capable of splitting the carbon/sulfur bond in SQ at significant rates. Indeed, inorganic sulfate is the predominant source of sulfur for growth of plants and algae, for example, and plant growth can become sulfur/sulfate-limited, for example, in soils that are sulfur-deficient due to intensive agriculture and to the effective measures to reduce sulfur emissions to the atmosphere in recent years (26, 27) phytoplankton growth in freshwater environments can also become sulfate/sulfur-limited (28). The recycling of the sulfur bound in SQ is catalyzed by heterotrophic bacteria, which can easily be enriched from soil (5, 7 ⇓ –9), and involves the degradation intermediates DHPS and SL, but no release of sulfate, if SQ-utilizing bacteria are grown in pure culture (10 ⇓ –12). Later work demonstrated that SQ can be degraded completely by two-member bacterial communities, that is, by a primary degrader with transient release of SL or DHPS and a secondary degrader with release of sulfate (11, 12). Pathways for the degradation of DHPS and SL, including desulfonation, have been described (13, 15, 29) where, briefly, DHPS is oxidized to SL and the SL is mineralized via one of three known pathways and desulfonative enzymes [i.e., SL sulfolyase (SuyAB EC 4.4.1.24), sulfoacetaldehyde acetyltransferase (Xsc EC 2.3.3.15), cysteate sulfolyase (CuyA EC 4.4.1.25)]. However, details on the pathways, enzymes, and genes for the conversion of SQ to DHPS and SL were missing. A first pathway, sulfoglycolysis leading to DHPS, was found in E coli K-12, and this pathway seems to be widespread in Enterobacteria (12). A second pathway, leading to SL, in a typical soil and freshwater bacterium, an isolate of P. putida, has been revealed in this study.

Strain SQ1 is able to access half of the carbon atoms of SQ for its heterotrophic aerobic growth through abstraction of a nonsulfonated C3-unit in the form of pyruvate, whereas the C3-organosulfonate half of the substrate is not dissimilated but excreted in the form of SL (Fig. 1 EIN und B). Four organosulfonate intermediates were detected (SGL, SG, KDSG, and SLA), and five corresponding enzymes were identified [NAD + -dependent SQ dehydrogenase, SGL lactonase, SG dehydratase, KDSG aldolase, and NAD(P) + -dependent SLA dehydrogenase]. Hence, this primary degradation pathway for SQ in P. putida SQ1 follows a catabolic route that resembles an Entner–Doudoroff pathway for SQ (Fig. 1 EIN und B), as was obviously suspected previously (10).

It is striking that the enzymes that catalyze the analogous reactions in either the SQ or GP Entner–Doudoroff pathway in P. putida SQ1 are encoded and regulated in different gene clusters (operons), as is the case with sulfoglycolysis and classical glycolysis in E coli K-12 (12). It is even more surprising that most of these enzymes belong to different enzyme families. Only SG dehydratase and PG dehydratase belong to the same protein family [dihydroxy-acid/6-phosphogluconate dehydratases Cluster of Orthologous Groups (COG) 0129]. SQ dehydrogenase (0090) belongs to the NAD(P) + -dependent short-chain alcohol dehydrogenase family (COG1028), and thus to a different family than typical GP 1-dehydrogenases (COG0364). Further, the SGL lactonase (0091) is a sugar lactone hydrolase family protein (COG3386), whereas PGL lactonase is an archetypal glucosamine-6-phosphate isomerase/6-phosphogluconolactonase family protein (COG0363). The KDSG aldolase (0100) is a 2-keto-3-deoxyrhamnonate aldolase family protein (COG3836), and is most similar to 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acid/4-hydroxy-2-oxovalerate aldolases of aromatic-ring cleavage pathways, whereas the KDPG aldolase is an archetypal KDPG/4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase family protein (COG0800). These phylogenetic differences are reflected in the observed substrate specificities of the enzymes of the SQ pathway, as far as tested in this study. It remains unclear which factors are responsible for the enzymes’ specificity for 6-deoxy-6-sulfo- (monoanionic) over 6-phospho-substituted (dianionic) substrate analogs, and thus for their recruitment into the pathway, but these questions can now be addressed.

The newly identified SQ degradation gene cluster of P. putida SQ1 also contains other genes that are likely to be involved in SQ utilization. Gene 0097 is predicted to encode a sulfite/small organosulfonate exporter (TauE PF01925) (30, 31), and this gene was cotranscribed during growth with SQ (Fig. 3C). Hence, gene 0097 most likely encodes for an inducible SL exporter. Gene 0094 is predicted to encode an alpha-glucosidase (COG1501 family 31 glycosyl hydrolase), and this gene was also cotranscribed (Fig. 3C) and highly coexpressed (Fig. 3 EIN und B), specifically during growth with SQ. Hence, we predict that gene 0094 encodes for hydrolysis of SQ-glyceride (e.g., for utilization of the whole sulfolipid SQDG as a growth substrate). Further, gene 0092 was cotranscribed (Fig. 3C) and is predicted to encode an aldose epimerase (COG2017), most likely for catalysis of the equilibrium of alpha- and beta-anomers of SQ such function would imply that the SQ Entner–Doudoroff pathway is anomer-specific. Finally, SQ transport might be encoded by the cotranscribed (Fig. 3C) predicted sodium/solute symporter (SSS) family transporter gene (0094) or by the predicted galactonate major facilitator superfamily (MFS) transporter gene (0098) the outer membrane porin (OMP) gene (0093) may be involved in degradation of SQDG.

Thirty genome sequences of P. putida strains are available for genome-wide comparisons within the IMG search platform (as of April 2015), and in three of these genomes, syntenic SQ gene clusters were found, as illustrated in Fig. 5 (in P. putida strains H8234, OUS82, and SJ3). Putative SQ-degradation gene clusters with homologs for the core genes identified in P. putida SQ1 were found in other gamma-Proteobacteria, and in beta- and alpha-Proteobacteria, but as differently assembled (nonsyntenic) gene clusters, as illustrated in Fig. 5. For some of these clusters, a corresponding SLA dehydrogenase candidate gene (indicated in red in Fig. 5) was not found however, the predicted SL exporter (TauE gene 0097 in strain SQ1) and alpha-glucosidase gene (0094) appeared to be conserved in most of these candidate SQ-gene clusters (indicated in gray in Fig. 5). Such gene clusters were found in genomes of species of (gamma-Proteobacteria) Vibrio, Aeromonas, and Enterobacteria (Serratia, Plesiomonas, Hafnia, Leminorella, und Edwardsiella) of (beta-Proteobacteria) Burkholderia, Janthinobacterium, und Herbaspirillum and of (alpha-Proteobacteria) Rhizobium, Ensifer, Microvirga, Salinarimonas, und Acidocella (Fig. 5). Interestingly, some of these strains are isolated gut symbionts (e.g., the Enterobacteria strains Hafnia alvei ATCC51873, Leminorella grimontii DSM5078, Serratia sp. Ag2) and/or potential pathogens (e.g., Vibrio, Plesiomonas, Halomonas), whereas other strains represent typical marine- or saline-associated bacteria (e.g., Halomonas, Salinarimonas) and typical freshwater-, soil-, and plant rhizosphere-associated bacteria (e.g., Rhizobium, Ensifer, Herbaspirillum, Microvirga). Whether these isolated strains are indeed able to use SQ for growth, and whether utilization of SQ is indeed a relevant trait in the habitats from which these strains originated, needs to be addressed.

Illustration of the SQ-degradation gene cluster in P. putida SQ1 with its five identified core genes (EIN) and of homologous, predicted SQ-degradation gene clusters found in genomes of other P. putida, other gamma-Proteobacteria (B), and in beta- and alpha-Proteobacteria (C und D, respectively). Homologous gene clusters in bacterial genomes were retrieved from the Joint Genome Institute’s IMG database by the Gene Cassette Search tool and the Gene Neighborhood viewer. Shown are gene clusters that contain gene homologs for at least four of the five core enzymes of the SQ Entner–Doudoroff pathway (genes are indicated by color coding). Also, candidate genes for SL export and for a predicted SQ-glyceride (SQG) alpha-glucosidase (main text) were frequently found to be conserved within these homolog clusters (gene symbols in gray). Note that other candidate genes in the clusters are not specified in this figure (gene symbols in white) for example, more variable genes were predicted for outer membrane porins, other transporters, or regulation (Fig. 1C).



Bemerkungen:

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