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Warum sind viele Anti-Malaria-Medikamente Gap-Junction-Antagonisten?

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Warum sind viele Anti-Malaria-Medikamente Gap-Junction-Antagonisten?

Mein Professor hat kürzlich erwähnt, dass viele der Anti-Malaria-Medikamente Gap Junctions blockieren. Ich frage mich, ob diese Blockierung wichtig ist, um Malaria zu stoppen, und wie das Blockieren von Gap Junctions gegen Malaria wirkt. Wie hängt dieser Effekt mit dem Mechanismus der Malaria zusammen?


Ich war mir nicht sicher, als ich das zum ersten Mal gelesen habe, aber das ist eigentlich eine sehr interessante Frage.

Im Moment scheint es zwei völlig getrennte Forschungsrichtungen zu geben, die Forscher in Bezug auf die Malariamedikamente verfolgen.

Eine Forschergruppe arbeitet daran, den Mechanismus zu erarbeiten, durch den beispielsweise Chloroquin und seinesgleichen Hämazoin (eine parasitenfreundliche Form von Proteinen der roten Blutkörperchen) in den Vakuolen des Plasmodiums (dem Parasiten, der verursacht Malaria). Einige Leute haben kürzlich einige ziemlich vernünftige Chloroquin-Kristalle bekommen, die direkt mit Hämazoin interagieren. Dies alles liefert starke Beweise für die Ansicht, dass die bedeutendste Wechselwirkung für ein Malariamittel hinsichtlich der Abtötung von Plasmodium die zwischen ihm und Hämazoin ist.

In (wahrscheinlich) unabhängigen Nachrichten wurde entdeckt, dass viele dieser Antimalariamittel auch wirksame Kanalblocker verschiedener Art sind. Ich habe mich noch nicht allzu tief damit befasst, aber die meisten Antimalaria-Leute scheinen die Kanalblockierungsaktivität als Nebenwirkung zu betrachten. Es gibt derzeit eine Reihe anderer Studien, die die psychologische Wirkung der kanalblockierenden Aktivität der Antimalariamittel untersuchen. Es gibt eine aus dem Iran, die besagt, dass die blockierende Wirkung von Mefloquin verwendet werden kann, um die Symptome des Morphin-Entzugs zu lindern.

Eine andere Sache, die Sie beachten sollten, ist, dass Mefloquin nicht aufgrund einer Abnahme der Wirksamkeit in Ungnade gefallen ist, sondern aufgrund seines (berechtigten) Rufs, bei Patienten psychotische Episoden zu verursachen, größtenteils aus dem Verkehr gezogen wurde. Vielleicht könnte dieses Zeug zum Blockieren von Lücken verwendet werden, um die psychologischen Nebenwirkungen von Mefloquin zu erklären. Das wäre ordentlich!


Anti-Malaria-Medikament Mefloquin induziert motorische Lerndefizite beim Menschen


Die Prophylaxe mit Mefloquin (einem auf dem Markt erhältlichen Anti-Malaria-Medikament) hat ein hohes Risiko, unerwünschte Ereignisse zu verursachen. Interessanterweise haben Tierstudien gezeigt, dass Mefloquin ein großes Defizit in den motorischen Lernfähigkeiten verursacht, indem es die Gap Junctions von Connexin 36 der unteren Olive beeinflusst. Wir waren daher daran interessiert zu beurteilen, ob Mefloquin ähnliche Wirkungen beim Menschen hervorrufen könnte. Das Hauptziel dieser Studie war es, die Wirkung von Mefloquin auf die motorische Leistung und motorische Lernaufgaben des Menschen zu untersuchen. Wir unterwarfen neun Teilnehmer vor und 24 h nach der Einnahme von Mefloquin einem freiwilligen motorischen Timing (Dartwurf-Aufgabe), Wahrnehmungs-Timing (Rhythmus-Wahrnehmungs-Aufgabe) und Reflex-Timing-Aufgaben (Auge-Blinzel-Aufgabe). Der Einfluss von Mefloquin auf das motorische Lernen wurde bewertet, indem Teilnehmer mit und ohne Mefloquin-Einnahme untersucht wurden (Kontrollen: n = 11 vs Mefloquin: n = 8) zu einer Konditionsaufgabe mit Augenzwinkern. Die willkürliche motorische Leistung, das Wahrnehmungstiming und das Reflexblinzeln wurden durch die Anwendung von Mefloquin nicht beeinflusst. Der Einfluss von Mefloquin auf das motorische Lernen war jedoch erheblich, sowohl die Lerngeschwindigkeit als auch die Lernfähigkeit wurden durch die Verwendung von Mefloquin beeinträchtigt. Unsere Daten legen nahe, dass Mefloquin die motorischen Lernfähigkeiten stört. Diese nachteilige Wirkung kann sowohl klinische als auch sozialklinische Auswirkungen für Mefloquin-Anwender haben. Daher sollte diese Nebenwirkung von Mefloquin von Klinikern weiter untersucht und anerkannt werden.


Materialen und Methoden

Tierschutz.

Die Verwendung von Tierversuchen in diesen Experimenten wurde vom Animal Care and Use Committee des University of Kansas Medical Center genehmigt. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Wir verwendeten Wildtyp-Mäuse (C57BL/6) und Cx36-Knock-out-Mäuse (C57BL/6-Hintergrundstamm). Der Cx36 Knock-out wurde ursprünglich von Dr. David Paul (Harvard Medical School, Cambridge, MA) entwickelt. Mäuse wurden wie zuvor beschrieben genotypisiert (de Rivero Vaccari et al., 2007).

Kulturvorbereitung, Induktion von Verletzungen und Kulturbehandlungen.

Die meisten Experimente wurden in neuronalen Kulturen und einige in gereinigten Gliakulturen durchgeführt. Neuronale Kulturen wurden wie zuvor berichtet (Park et al., 2011) aus dem somatosensorischen Kortex hergestellt, der aus Embryonen von Tag 16 gewonnen wurde. Schwangere Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert, bevor die Embryonen entnommen wurden. Nach der Disaggregation mit Papain wurden die Neuronen auf Deckgläsern ausgestrichen und in Neurobasal-Medium (Invitrogen-Katalog Nr. 21103) aufgezogen, in dem der Prozentsatz der Neuronen �% erreicht. Das Medium wurde mit B-27 (Invitrogen-Katalog #17504) und 0,5 ml -Glutamin ergänzt. Das Kulturmedium wurde zweimal wöchentlich gewechselt. Die meisten Experimente wurden am Tag in Kulturen durchgeführt in vitro 25 ± 1 d (d. h. zu dem Zeitpunkt, zu dem die entwicklungsbedingte Entkopplung der neuronalen Gap Junctions und die Herunterregulierung von Cx36 bereits stattgefunden haben) (siehe Abb. 1 EIN) (Arumugam et al., 2005) wurden am Tag . nur kleine interferierende RNA (siRNA)-Transfektionen durchgeführt in vitro 7 und Neuronen wurden am Tag . zu den Experimenten mitgenommen in vitro 9, was durchgeführt wurde, weil die Transfektionen in reifen Kulturen Neurodegeneration induzierten. Gereinigte kortikale Gliakulturen wurden wie berichtet hergestellt und gepflegt (Park et al., 2011).

Veränderungen der Cx36-Proteinexpression während der Entwicklung und nach Ischämie in vitro. Es werden Daten aus Western-Blot-Experimenten in neuronalen somatosensorischen kortikalen Kulturen präsentiert. EIN, Entwicklungsänderungen in der Cx36-Expression. B, OGD-induzierte Veränderungen der Cx36-Expression in reifen Kulturen [Tag in vitro 25 (DIV25)]. Die Dauer der OGD betrug 30 min. Ein repräsentativer Blot (oben) und statistische Daten (unten) werden gezeigt. In beiden Diagrammen werden die Signale der optischen Dichte relativ zu Tubulin normalisiert und mit der Kontrolle (Tag .) verglichen in vitro 1 in EIN Zustand vor OGD in B auf 1,0 setzen). Die statistische Analyse war wie folgt: ANOVA mit post hoc Tukey relativ zur Kontrolle n = 6 (EIN) und 5� (B) Daten pro Gruppe werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. NS, nicht signifikant.

Um einen Sauerstoffmangel (OGD) zu induzieren, wurden die Kulturen für 30 Minuten unter normalen Bedingungen (95% Luft plus 5% CO .) übertragen2 10 mm Glucose) zu OGD-Bedingungen (95% N2 plus 5% CO2 keine Glukose). Um einen hypoosmotischen Schock zu induzieren, wurde die Osmolarität des Kulturmediums 60 min lang um 30% reduziert (von 290 auf 203 mOsm). Um eine hydrostatische Druckverletzung zu induzieren, wurden die Kulturen in eine modulare Kammer gegeben, in der ein erhöhter Druck (103 mmHg) durch Füllen der Kammer mit 95 % Luft plus 5 % CO . erzeugt wurde2 für 60min. Um epileptische Entladungen zu induzieren, wurde 4-Aminopyridin (spannungsabhängiger K + -Kanalblocker 100 μ m ) für 60 min zum Kulturmedium gegeben und dann ausgewaschen. Scheinwerte für alle Verletzungen beinhalteten eine Veränderung des Kulturmediums (mit oder ohne Arzneimittel darin), aber keine Verletzung.

In Kulturen wurden die folgenden Medikamente und Konzentrationen verwendet: (RS)-1-Aminoindan-1,5-dicarbonsäure (AIDA) (100 μ m ), Gruppe-I-mGluR-Antagonist AMPA (25 μ m ), AMPA-Rezeptor-Agonist d , l -2-Amino-5-phosphonovalerat (AP5) (100 μ m ), NMDAR-Antagonist (±)-β-(Aminomethyl)-4-chlorbenzolpropansäure (Baclofen) (20 μ m ), GABAB Rezeptor (GABABR) Agonist Bicucullinmethodid (20 μ m ), GABAEIN Rezeptor (GABAEINR) Antagonist Biphenyl-Indanon A (BINA) (3 μ m ), positiver allosterischer Modulator von mGluR2 8-Brom-cAMP, Natriumsalz (8-Br-cAMP) (100 μ m ), ein zelldurchlässiges Analog von cAMP, das die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) aktiviert Carbenoxolon (25 μ m ), unspezifischer Blocker von Gap Junctions 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) (10 μ m ) , AMPA-Rezeptor-Antagonist (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) (10 μ m ), Gruppe-I-mGluR-Agonist Glutamat (2 μ m ), Glutamatrezeptor-Agonist 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (50 μ m ), unspezifischer Phosphodiesterase-Inhibitor, der die intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht (9S,10S,12R)-2,3,9,10,11,12-Hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-9,12-epoxy-1h-diindolo<1,2,3-fg:3′,2′,1′-kl>pyrrolo<3,4-ich><1,6>Benzodiazocin-10-carbonsäurehexylester (KT5720) (0,5 μ m ), Blocker der Aktivität von PKA (2S)-2-Amino-2-<(1S,2S)-2-Carboxycycloprop-1-yl>-3-(xanth-9-yl)propansäure ( <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"LY341495","term_id" :"1257705759","term_text":"LY341495">> LY341495) (2 μ m ), Gruppe II mGluR-Antagonist (1R,4R,5S,6R)-4-amino-2-oxabicyclo<3.1.0>hexan-4,6-dicarbonsäure ( <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"LY379268","term_id" :"1257807854","term_text":"LY379268">> LY379268) (2 μ m ), Gruppe II mGluR-Agonist (RS)-α-Methylserin-Ö-Phosphat (MSOP) (100 μ m ), Gruppe-III-mGluR-Antagonist Muscimol (25 μ m ), GABAEINR-Agonist Nimodipin (20 μ m ), Blocker der spannungsgesteuerten Ca 2+ -Kanäle vom L-Typ NMDA (50 μ m ), NMDAR-Agonist 3-Amino-2-(4-chlorphenyl)propanphosphonsäure (Phaclofen) (100 μ m), GABABR-Antagonist (RS)-α-Cyclopropyl-4-phosphonophenylglycin (PPG) (10 μ m ), Gruppe-III-mGluR-Agonist Tetrodotoxin (TTX) (2 μ m ), Blocker spannungsgesteuerter Natriumkanäle. Alle Medikamente wurden von Sigma-Aldrich oder Tocris bezogen. In Western-Blot- und elektrotonischen Kopplungsexperimenten in Kulturen wurden alle Wirkstoffe (zB <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"LY379268","term_id":"1257807854","term_text" :"LY379268">> LY379268, <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"LY341495","term_id":"1257705759","term_text":"LY341495">> LY341495 , etc.) waren 10 min vor, während (30 oder 60 min) und 10 min nach der Verletzung oder Scheinverletzung im Kulturmedium vorhanden und wurden dann ausgewaschen.

Photothrombotische fokale zerebrale Ischämie.

Ischämie wurde wie zuvor beschrieben induziert (Wang et al., 2010). Erwachsene (2 bis 2,5 Monate alte) Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert und in einen stereotaktischen Rahmen gelegt. Der Schädel wurde durch Einschneiden der Haut freigelegt. Bengalrosa (1 mg in 100 µl steriler Kochsalzlösung) wurde intraperitoneal injiziert. Ein faseroptisches Bündel einer Kaltlichtquelle (Zeiss 1500 1,5 mm Apertur 3000 K Lichtintensität) wurde in der rechten Hemisphäre anteroposterior 𢄡,7 mm und lateral zur Mittellinie +2,0 mm vom Bregma platziert. Um Rose Bengal zu aktivieren, wurde das Gehirn 15 Minuten nach seiner Injektion durch den intakten Schädel für die folgenden 30 Minuten beleuchtet. Sterile Kochsalzlösung oder Arzneimittel (in Kochsalzlösung gelöst) wurden Tieren intraperitoneal in Dosen injiziert, wie unten in der Veröffentlichung beschrieben. Bei allen medikamentösen Behandlungen und ischämischen Experimenten wurde ein Analgetikum verwendet, um mögliche Schmerzreaktionen zu reduzieren (Buprenex 2 mg/kg).

Elektrotonische Kopplung.

Die Experimente wurden wie zuvor ausführlich beschrieben durchgeführt (Park et al., 2011). Kurz gesagt enthielt die Pipettenlösung folgendes (in m m ): 145 KMeSO&sub4;4, 10 HEPES, 2 MgCl2, 0,1 CaCl2, 1,1 EGTA, 2 Na-ATP und 0,3 Na-GTP, pH 7,2, 3𠄷 MΩ Elektrodenwiderstand. Die Zellen wurden unter Verwendung des Multiclamp 700-B-Verstärkers und der pCLAMP10-Software (Molecular Devices) gepatcht. Um die elektrotonische Kopplung zu bestimmen, wurden duale Ganzzellstromklemmen-Aufzeichnungen in Kulturen von Neuronenpaaren durchgeführt. Da in Zellkulturen verschiedene Zelltypen morphologisch nicht unterscheidbar sind und eine elektrophysiologische Charakterisierung der Zelltypen nicht ausgearbeitet wird, wurden die Neuronen zufällig ausgewählt. Teststromschritte (500 ms, � pA) wurden an Zelle 2 (injizierte Zelle) angelegt und elektrotonische Antworten wurden in Zelle 1 (nicht injizierte Zelle) detektiert. Die Aufnahmen wurden bei einem Haltepotential von � mV durchgeführt. Die Daten wurden offline mit Clampfit 10 (Molecular Devices) analysiert. Der Kopplungskoeffizient wurde als Antwortamplitude in der nicht injizierten Zelle (Zelle 1) geteilt durch die Amplitude in der injizierten Zelle (Zelle 2) berechnet. Die Häufigkeit der elektrotonischen Kopplung wurde als Prozentsatz der neuronalen Paare berechnet, die die Kopplung zeigten. Zellen wurden als gekoppelt betrachtet, wenn der Kopplungskoeffizient ϡ,6% betrug. Es wurde nur ein Neuronenpaar pro Deckglas getestet.

Western-Blots.

Die Experimente wurden wie zuvor ausführlich beschrieben durchgeführt (Arumugam et al., 2005 Park et al., 2011). Kurz gesagt wurden der primäre somatosensorische Cortex (erhalten aus der rechten ischämischen Region, rechten Scheinregion oder linken kontralateralen Region) oder kortikale Kulturen in einem Lysepuffer homogenisiert und das Gesamtprotein wurde unter Verwendung des Bio-Rad DC Proteinassay-Verfahrens bestimmt. Fünfzig Mikrogramm Protein wurden in jede Spur geladen, auf eine 0,45 μm Polyvinylidendifluoridmembran übertragen und mit einer Blockierungslösung und Antikörpern verarbeitet. Kaninchen-Anti-Cx36 (0,5 μg/ml Zymed Katalog Nr. 51-6300), Kaninchen Anti-Connexin 43 (Cx43) (0,2 μg/ml Zymed Katalog Nr. 71-0700), Kaninchen Anti-mGluR2 (0,5 μg/ml x003bcg/ml Millipore Katalog-Nr. AB9209), Kaninchen-Anti-mGluR3 (0,5 μg/ml Sigma-Aldrich-Katalog-Nr. G1545) und Maus-Antitubulin (1:10.000 Sigma-Aldrich-Katalog Nr. T6793) wurden als Primärantikörper verwendet , und sie wurden mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Kaninchen-Antikörper (1:10.000 Zymed Katalog-Nr.) visualisiert. <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"G21234","term_id":" 1341560","term_text":"G21234">> G21234) oder Anti-Maus-IgG-Antikörper (1:10.000 Sigma-Aldrich Katalog #M5899). Die Signale wurden mit ECL-Nachweisreagenzien (GE Healthcare) verstärkt. Die optische Banddichte wurde unter Verwendung der quantitativen Analysesoftware 4.5.2 (Bio-Rad) von Quantity One bestimmt. Alle Signale der optischen Dichte wurden relativ zu Tubulin normalisiert und experimentelle Proben wurden mit Kontrollen (eingestellt auf 1,0) verglichen. Die Tubulinspiegel pro Einheit des Gesamtproteins variierten zwischen den in dieser Studie verwendeten Proben nicht signifikant.

SiRNA.

Die Experimente wurden wie zuvor ausführlich beschrieben durchgeführt (Park et al., 2011). Die mGluR2- und mGluR3-siRNAs wurden von Dharmacon RNAi Technology (Katalog #M-080176-00 bzw. L-094437-01) erworben. Jede siRNA bestand aus vier gepoolten 19 nt-Duplexen und wurde in einer Endkonzentration von 50 nm verwendet. Zellen wurden 48 h vor der Induktion von OGD mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfiziert und 2 h nach OGD für die Western-Blot-Analyse verarbeitet. Beide Transfektionen reduzierten effektiv die Proteinspiegel. Verwürfelte siRNAs wurden als Kontrollen verwendet und waren unwirksam.

Reverse Transkription–quantitative Echtzeit-PCR.

Die Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Park et al., 2011). Gesamt-RNA wurde aus Kulturen unter Verwendung des Trizol-Verfahrens (Invitrogen) isoliert. Gesamt-RNA (1 μg) wurde mit Oligo-dT-Primern und dem SuperScript II-Kit (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. Ein Mikroliter des Reverse-Transkriptions-Reaktionsmaterials wurde als Matrize für die reverse Transkription –quantitative real-time PCR (RT-qPCR) unter Verwendung eines Bio-Rad iCycler in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) verwendet ) und für 40 Zyklen für 15 s bei 95ଌ und für 20 s bei 60ଌ verstärkt. Folgende Primerpaare wurden verwendet: Maus Cx36, 5′-CCAGTAAGGAGACAGAACCAGAT-3′ (Sense) und 5′-GATGATGTAGAAGCGGGAGATAC-3′ (Antisense) Maus β-actin, 5′-GATGGTAAGG-3ATGGGTCAG x02032 (Sense) und 5′-CTCATTGTAGAAGGTGTGGTGC-3′ (Antisense). In allen Experimenten wurden die Cx36-mRNA-Signale auf β-Actin-mRNA-Signale normalisiert und die normalisierten Werte wurden mit Kontrollen (eingestellt auf 1,0) verglichen. β-Aktinspiegel variierten zwischen den in dieser Studie verwendeten Proben nicht signifikant.

Methylthiazolyltetrazolium-Assay.

Die neuronale Lebensfähigkeit in Kulturen wurde quantitativ durch den Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium-(MTT)-Assay bewertet, wie zuvor berichtet (Park et al., 2011). Die Kulturen wurden in 24-Well-Platten gezüchtet. In allen Tests wurden <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"LY341495","term_id":"1257705759","term_text":"LY341495">> LY341495 und Carbenoxolon hinzugefügt auf das Kulturmedium vor der Induktion der Verletzung und verblieb im Medium während und für 24 h nach der Induktion der Verletzung, wonach die Zellen zur Analyse entnommen wurden. Neuronen wurden mit MTT (MTT Cell Viability Assay kit Biotium 40 μ m , 400 μl pro Well) bei 37ଌ für 4 h inkubiert. Dann wurde das Medium vorsichtig abgesaugt und 400 µl DMSO pro Vertiefung zugegeben, um das blaue Formazanprodukt aufzulösen. Um die Extinktion zu messen, wurden 200 µl des Mediums aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte in eine unabhängige Vertiefung einer 96-Well-Platte überführt. Die Absorptionswerte bei 570 nm wurden mit einem Mikroplatten-Lesegerät (μQuant Bio-Tek) gemessen. Darüber hinaus haben wir, wie oben angegeben, die Kulturen verwendet, die überwiegend neuronal waren (bis zu 95 %). Um jedoch den neuronalen Zelltod spezifisch zu kontrollieren, wurde eine separate Gruppe von Kulturen 24 h einer hohen Konzentration von Glutamat (500 μ m ) ausgesetzt, die alle Neuronen tötete, aber das Überleben der Gliazellen nicht beeinflusste. Die Extinktion in diesen gereinigten Gliakulturen wurde gemessen, gemittelt und das Ergebnis wurde von den individuellen Extinktionsdaten in neuronalen Kulturgruppen abgezogen, so dass das Endergebnis nur neuronalen Tod/Überleben darstellen würde. Schließlich wurden die Extinktionsergebnisse in experimentellen Gruppen auf Kontrollgruppen normalisiert.

Fluoro-Jade B-Färbung.

Diese Färbung ist selektiv und hochempfindlich für die Identifizierung degenerierender Neuronen (für Details siehe Wang et al., 2010). Die Färbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Wang et al., 2010). Die Tiere wurden anästhesiert und mit PBS (0,01 mol/l 100 ml) transkardial perfundiert, gefolgt von einer Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (gelöst in 50 ml PBS pH 7,4). Die Gehirne wurden entfernt. 50 Mikrometer dicke koronale Schnitte wurden mit einem Leica VT1000S Vibratom geschnitten und auf gelatinebeschichteten Objektträgern aufgezogen. Die Schnitte wurden in Alkohol hydratisiert, mit Kaliumpermanganat (0,006% 10 min) inkubiert, mit Fluoro-Jade B (0,001% 30 min) inkubiert, gespült und luftgetrocknet. Die Färbung wurde unter Verwendung eines Nikon Eclipse 80i Fluoreszenzmikroskops, eines FITC-Filters und einer Photometrics ES2-Digitalkamera sichtbar gemacht. Die ischämische kortikale Region wurde umrissen und die Gesamtzahl der gefärbten Pixel wurde in der umrissenen Region unter Verwendung einer densitometrischen Schwellenwerttechnik gemessen, die mit der NIH ImageJ-Software implementiert wurde.Der Schwellenwert wurde auf ein Niveau knapp über dem eingestellt, das Hintergrund und unspezifische Färbung in Bereichen außerhalb des umrissenen Bereichs gezählt hätte. Die Analyse wurde in fünf kortikalen Abschnitten durchgeführt (einschließlich 𢄡.5, 𢄡.6, 𢄡.7, 𢄡.8 und 𢄡.9 mm von Bregma) und die Daten wurden gemittelt für fünf Abschnitte. Die Färbungsanalyse wurde von einer gegenüber experimentellen Gruppen verblindeten Person durchgeführt. Da Fluoro-Jade B eine ausgezeichnete Sensitivität und Selektivität zur Identifizierung von degenerierenden Neuronen aufweist, war keine zusätzliche Costaining mit neuronalen Markern erforderlich.

Statistische Analyse.

Die Daten wurden mit dem zweiseitigen Student's . analysiert T Test (wenn möglich gepaart), ANOVA mit post hoc Exakter Wahrscheinlichkeitstest nach Tukey oder Fisher und InStat-Software (GraphPad-Software). Die Anzahl der Proben angegeben für in vitro Experimente (einschließlich Western Blot, siRNA, RT-qPCR und MTT) stellt die Anzahl der Plattenwells/Deckgläser mit Zellen dar, die aus mindestens drei unabhängigen Zellkulturpräparationen gewonnen wurden. Die für Tierversuche angegebene Anzahl Proben entspricht der Anzahl der Tiere. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM gemeldet.


METHODEN

Da Pn-Neuronen sowohl oberhalb als auch unterhalb der Spike-Schwelle eine wichtige Spannungsaktivität zeigten (Moortgat et al. 2000), verwendeten wir Modellneuronen, die durch die Hodgkin-Huxley-Gleichungen beschrieben wurden (Hodgkin und Huxley 1952). Das neuronale Simulationspaket NEURON (Hines 1993) wurde verwendet, um zwei Pn-Neuronentypen zu modellieren: die Schrittmacher- und Relaiszellen und ihre elektrotonischen Verbindungen, wie sie im Pn des schwach elektrischen Fisches zu sehen sindApteronotus leptorhynchus. Jede Modellzelle hatte zwei Kompartimente: ein somatisches und ein axonisches. Dendritische Kompartimente wurden trotz anatomischer Beweise für ausgedehnte Relaiszelldendriten (Dye 1991, Elekes und Szabo 1985) mit Gap Junctions (Moortgat et al. 2000) nicht berücksichtigt, da angenommen wird, dass die Dendriten hauptsächlich an der synaptischen Integration beteiligt sind, da sie mit chemischen Synaptika bedeckt sind Boutons aus höheren Gehirnzentren (Elekes und Szabo 1985). Diese höheren Mitten modulieren die Spitzenfrequenz, werden aber für die kontinuierlichen, phasenstarren Schwingungen im Pn nicht benötigt.

Die beiden Modellzelltypen unterscheiden sich teilweise durch ihre Morphologie, wie sie in fixiertem und lebendem Pn-Gewebe zu sehen ist (Dye 1991 Elekes und Szabo 1985 Moortgat et al. 2000). Modell-Schrittmacherzellen haben Somata von 30 µm Durchmesser und zylindrische Axone von 8 µm Durchmesser und 45 µm Länge, während die größeren Modell-Relaiszellen Somata von 65 µm Durchmesser und zylindrische Axone von 7 µm Durchmesser und 40 µm Länge haben. Die Länge des Axons der Modellzelle wurde so gewählt, dass sie ungefähr der Länge des Axon-Anfangssegments der biologischen Zelle entspricht. Unser Ziel war es nicht, die vollständige, verzweigte Axon- oder Aktionspotentialausbreitung durch es zu modellieren.

Die in jedem Kompartiment für jeden Zelltyp verwendeten Modellparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt. Somatische Leckströme wurden so eingestellt, dass Eingangswiderstände von 20 bzw intaktes Pn (Dye 1991Juranek und Metzner 1998). Die Strom- und Spannungsdynamik der beiden im Modell enthaltenen aktiven Leitfähigkeiten, Natrium und Kalium, wurden mit den Hodgkin-Huxley-Gleichungen berechnet (Hodgkin und Huxley 1952).

Tabelle 1. Modellparameter für Schrittmacher- und Relaiszellen und ihre beiden Kompartimente

Die 2 Zelltypen wurden mit den gleichen Differentialgleichungen modelliert, jedoch mit unterschiedlichen Parameterwerten für jedes Kompartiment jedes Modellzelltyps. Einheiten sind μm für den Durchmesser, Ω-cm für den axialen Widerstand Reinund S/cm 2 für Leitfähigkeiten.

Tabelle 2. Vorwärts- und Rückwärtsratenfunktionen für Ionenkanäle

Abb. 1.Isolierte Modellschrittmacherzellen feuern periodisch, wohingegen Relaiszellen eine Netzwerkeingabe benötigen, um zu feuern. EIN: in einem entkoppelten Netz (gLücke = 0), zündete eine Modellschrittmacherzelle mit einer Periode von ∼612 Hz, während eine Relaiszelle bei einer konstanten Spannung nicht weit von der Spitzenschwelle blieb. Wenn das Netzwerk ausreichend stark gekoppelt war (in diesem BeispielgLücke = 5 nS), stieg die Relaiszelle periodisch an. Das Aktionspotential der Relaiszelle wurde im Axon (B), was zu einer großen Spannungsänderung mit einer kleinen Verzögerung im passiven Soma der Relaiszelle (C). Da die Relaiszelle nur im Axon aktive Leitfähigkeiten aufwies, war die Amplitude der axonalen Wellenform signifikant größer als die ihres Somas. Beachten Sie, dass das Membranpotential der Schrittmacherzelle vor dem Zünden langsam anstieg, während die Relaiszelle von der Grundlinienspannung aus schnell zündete.

Um jeder Schrittmacherzelle eine „intrinsische“ Spiking-Frequenz zu geben, bei der sie zündete, ohne mit anderen Zellen gekoppelt zu sein, wurde in jedes Soma ein konstanter Strom von 1 nA injiziert. Der injizierte Strom trat an die Stelle eines Schrittmacherstroms, der ein Schrittmacherpotential erzeugen würde, wie in den Pn-Schrittmacherzellen beobachtet. Größere oder kleinere injizierte Ströme führten zu höheren oder niedrigeren Spiking-Frequenzen für diese isolierten Zellen. Der 1-nA-Wert wurde so gewählt, dass die Spitzenfrequenz (∼612 Hz) in den biologischen Bereich der untersuchten Spezies (500–900 Hz) fällt. Die Relaiszellen erhielten auch eine Konstantstrominjektion von 0,5 nA, die sie depolarisierte, aber nicht auf die Spitzenschwelle brachte. Nur bei Eingaben von Schrittmacherzellen stiegen die Relaiszellen mit der Schrittmacherfrequenz an. Größere Strominjektionen in Relaiszellen depolarisierten das Membranpotential weiter, verursachten jedoch kein wiederholtes Spiking, das Membranpotential resonierte aber nicht vollständig, vermutlich wegen einer geringen K + -Kanaldichte. In einigen Simulationen wurde der injizierte Strom zwischen den Zellen randomisiert (wobei jeder Zelle eine andere, aber feste Eigenfrequenz oder ein Interspike-Intervall gegeben wurde) und/oder über die Zeit randomisiert (wodurch das Interspike-Intervall für jedes Intervall leicht unterschiedlich wurde).


Abstrakt

Abstrakt– Eine verlängerte Ischämie erhöht die zytosolische Ca 2+ -Konzentration in Kardiomyozyten. Zellen mit stark erhöhtem zytosolischem Ca 2+ können auf Reperfusion ansprechen, Hyperkontraktur, Sarkolemmal-Disruption und Tod entwickeln. Kardiomyozyten werden effizient durch Gap Junctions (GJs) verbunden, um ein funktionelles Syncytium zu bilden, und es wurde gezeigt, dass Hyperkontraktur durch einen GJ-vermittelten Mechanismus auf benachbarte Myozyten übertragen werden kann. Diese Studie untersuchte den Mechanismus der Ausbreitung von Zellverletzungen, die mit einer Sarkolemmalruptur in durchgängig verbundenen Paaren von isolierten Ratten-Kardiomyozyten verbunden sind. Mikroinjektion von extrazellulärem Medium in eine der Zellen, um eine Sarkolemmal-Disruption zu simulieren, induzierte einen deutlichen Anstieg von zytosolischem Ca 2+ (Fura-2) und Na + (SBFI) in der benachbarten Zelle und deren Hyperkontraktur in <30 Sekunden (22 von 22 Zellpaaren) . Dieser Prozess wurde nicht modifiziert, wenn die Ca 2+ -Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum mit 10 μmol/L Ryanodin (5 von 5 Zellpaaren) blockiert wurde, aber er war vollständig abhängig von der Anwesenheit von Ca 2+ im extrazellulären Puffer. Die Blockade von Ca 2+ -Kanälen vom L-Typ mit 10 μmol/l Nifedipin veränderte die Ausbreitung der Hyperkontraktur nicht. Die Anwesenheit von 15 bis 20 μmol/l KB-R7943, einem hochselektiven Blocker des umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austauschs, verhinderte jedoch die Ausbreitung der Hyperkontraktur in 16 von 20 Zellpaaren (P<0,01) ohne die GJ-Permeabilität zu beeinträchtigen, wie durch das Lucifer-Gelb-Transferverfahren bewertet. Die Zugabe des Ca 2+ Chelators EGTA (2 mmol/L) zur Injektionslösung verhinderte eine Hyperkontraktur in der injizierten Zelle, aber nicht in der benachbarten (n=5). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Passage von Na + durch GJ von hyperkontrahierenden Myozyten mit rupturiertem Sarkolemma zu benachbarten Zellen und einem sekundären Eintritt von [Ca 2+ ]Ö über den umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austausch kann zur Ausbreitung von Hyperkontraktur von Zelle zu Zelle beitragen. Dieser bisher unbekannte Mechanismus könnte die Myokardnekrose während der Ischämie-Reperfusion in vivo verstärken und das Ziel neuer Behandlungen sein, die darauf abzielen, diese zu begrenzen.

Gap Junctions (GJs) spielen eine wesentliche Rolle für die normale Funktion des Herz-Kreislauf-Systems. Sie vermitteln die Ausbreitung elektrischer Impulse, die eine synchronisierte Kontraktion des Herzmuskels stimulieren und die Funktion von Endothel- und glatten Muskelzellen in Arterienwänden koordinieren. 1 2 GJ-vermittelte Kommunikation ist auch für die normale Embryonalentwicklung sowie für die Funktion vieler anderer erwachsener Organe, einschließlich Lunge, Netzhaut, Linse, Leber und Zentralnervensystem, unerlässlich. 3 4 5 Jüngste Studien haben gezeigt, dass Neuronen-GJs während einer Hirnischämie offen bleiben und daher sterbende Zellen mit potenziell lebensfähigen Zellen verbinden und dass sich Hirninfarkte im Laufe der Zeit durch einen GJ-vermittelten Mechanismus ausdehnen können. 6 Das Ausmaß der ischämischen Schädigung kann signifikant verringert werden, wenn die GJ-Permeabilität mit Octanol reduziert wird. 7

Die Rolle von GJs bei der chemischen Kommunikation von Herzmuskelzellen und insbesondere ihre mögliche Beteiligung am Zelltod infolge einer Ischämie-Reperfusion ist jedoch kaum verstanden. Nach einer ischämischen Episode können Kardiomyozyten auf eine erneute Energiezufuhr reagieren, indem sie eine abrupte und extreme Verzerrung ihrer Architektur entwickeln, die aus der Entwicklung einer übermäßigen Kontraktionskraft resultiert. 8 Dieses Phänomen, das als Hyperkontraktur bezeichnet wird, verursacht eine extreme Zellverkürzung und kann während der ersten Minuten des Reflows als Folge der ATP-Verfügbarkeit in Gegenwart von ungewöhnlich hohem [Ca 2+ ] auftreten.ich Konzentration und Zerbrechlichkeit des Zytoskeletts durch Ischämie. 9 10

Reperfundierte Myokardinfarkte bestehen fast ausschließlich aus Bereichen von Kontraktionsbandnekrose, die von hyperkontrahierten toten Myozyten gebildet werden. 11 Auffallend an diesen Nekrosen ist, dass sie in der Regel hyperkontrahierte Kardiomyozyten in kompakten Anhäufungen mit stark eingerückten und unregelmäßigen Rändern oder sogar fleckig enthalten, während hyperkontrahierte Kardiomyozyten in verstreuter Verteilung praktisch fehlen. 12 Gradienten der Wandspannung, Kollateralfluss und Konzentration von Kataboliten und Diffusion von O2 von endokardialen und epikardialen Oberflächen oder nichtischämischem Myokard können die regionale Verteilung der Nekrosebereiche beeinflussen, können jedoch nicht die Kontinuität dieser Bereiche und das Fehlen verstreuter hyperkontrahierter Myozyten erklären. Studien mit Computersimulation der Infarktmorphologie zeigen, dass eine Art von Zell-Zell-Interaktion berücksichtigt werden muss, um diese Merkmale der Infarktgeometrie zu reproduzieren. 13 In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir festgestellt, dass der GJ-Blocker Heptanol, der nur zum Zeitpunkt der Wiedererregung angewendet wird, in der Lage war, das endgültige Ausmaß der Myokardnekrose zu reduzieren und die Infarktgeometrie in intakten Ratten- und Schweineherzen zu verändern. Auf zellulärer Ebene beobachteten wir, dass sich die Hyperkontraktur eines Myozyten konsequent auf die benachbarte Zelle ausbreitete und dass die chemische Entkopplung mit Heptanol diese Ausbreitung der Zellschädigung verhinderte. Darüber hinaus wurden diese Wirkungen von Heptanol bei Konzentrationen beobachtet, die keinen Schutz gegen durch Reoxygenierung induzierte Hyperkontraktur in Einzelzellen boten. 14 Diese Studien unterstützen stark die Hypothese, dass das Schicksal eines Kardiomyozyten nach einer ischämischen Periode nicht nur durch seine eigenen biochemischen Störungen bestimmt wird, sondern auch durch das Überleben oder den Tod benachbarter Zellen beeinflusst werden kann.

Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass im Gegensatz zu dem, was bei isolierten Kardiomyozyten passiert, eine Hyperkontraktur im Myokardgewebe mit einer Sarkolemmalruptur und Enzymfreisetzung einhergeht. 15 Eine Sarkolemmal-Disruption verursacht dramatische Veränderungen in der zytosolischen Zusammensetzung, die durch GJs auf benachbarte Zellen übertragen werden können und zu einer Zell-zu-Zell-Ausbreitung der Hyperkontraktur führen. Ziel der vorliegenden Studie war es, den chemischen Botenstoff zu identifizieren, der für diese Zell-zu-Zell-Ausbreitung der Hyperkontraktur durch GJs verantwortlich ist. Hyperkontraktur frisch isolierter adulter Rattenkardiomyozyten wurde durch Mikroinjektion von extrazellulärem Medium mit 1 mmol/L Ca 2+ induziert, um eine sarkolemmale Störung zu simulieren, und ihre Ausbreitung zwischen Ende-zu-Ende verbundenen Zellpaaren wurde unter verschiedenen Interventionen analysiert.

Materialen und Methoden

Verfahren zur Isolierung von Kardiomyozyten

Die Tiere wurden gemäß der Deklaration von Helsinki behandelt und die experimentellen Verfahren wurden von der Forschungskommission des Krankenhauses Vall d’Hebron genehmigt. Ventrikuläre Herzmuskelzellen wurden aus erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten (300 g) wie zuvor beschrieben isoliert. 16 Kurz gesagt wurden ganze Herzen in einem Langendorff-System mit einem modifizierten Krebs-Puffer (in mmol/L, NaCl 110, KCl 2,6, KH2Bestellung4 1.2, MgSO4 1.2, NaHCO3 25 und Glucose 11) mit 45 μmol/L CaCl2 und 0,03% Collagenase (Typ II, Serva). Zellen aus dissoziiertem Gewebe wurden einer fortschreitenden Normalisierung der Ca 2+ -Spiegel auf eine Endkonzentration von 1 mmol/l unterzogen. Stäbchenförmige Zellen wurden durch Schwerkraftsedimentation in einem 4% BSA-Gradienten (Fraktion V, Boehringer Mannheim) selektiert und in Glasbodenschalen mit Medium 199/HEPES (Sigma) und 4% FCS (Gibco) ausplattiert. Zwei Stunden nach dem Plattieren wurden aufgebrochene, nicht anhaftende Zellen durch Wechseln des Mediums verworfen. In jeder Kulturschale wurden fünf bis zehn End-to-End-verbundene Myozyten gefunden, und die Ausbreitung von Hyperkontrakturen zwischen benachbarten Zellen, die GJ-Permeabilität und Veränderungen der intrazellulären Na + - und Ca 2+ -Konzentrationen wurden in diesen Zellpaaren untersucht.

Mikroinjektion und experimentelle Bedingungen

Einer der Zellen jedes Paares wurde extrazelluläres Medium mikroinjiziert, um eine sarkolemmale Störung zu simulieren, die während einer durch Reoxygenierung induzierten Hyperkontraktur auftritt. Es wurde ein hydraulischer Mikromanipulator mit digitaler Steuerung (digitaler Mikromanipulator Modell 5171 und Transjektor Modell 5246, Eppendorf) verwendet. Die Mikroinjektion wurde durch eine sterile Mikropipette mit 0,2 bis 0,5 µm Spitze (Sterile Femtotips, Eppendorf) mit einem Pulsdruck von 400 hPa und einer Dauer von 0,1 Sekunden durchgeführt. Die Axial- und Tiefengrenzen wurden so eingestellt, dass die Mikropipette 3 bis 5 µm unter der Zelloberfläche in einem Winkel von 45° eindringen konnte. Frühere Studien mit denselben Mikropipetten und ähnlichen Lösungen zeigten, dass diese Mikroinjektionsparameter eine effektive Injektion ohne erkennbare mechanische Verletzung ermöglichen. 17 In Kontrollexperimenten war das extrazelluläre Medium ein Puffer mit (in mmol/l) NaCl 140, KCl 3,6, MgSO4 1.2, CaCl&sub2;2 1 und HEPES 20. Die Modifikationen des extrazellulären Puffers umfassten die Zugabe von (1) 10 μmol/l Ryanodin, (2) 10 μmol/l Nifedipin oder (3) 15 μmol/l und 20 μmol/l KB-R7943 , oder der Ersatz von Ca 2+ durch 2 mmol/L EGTA. Die mikroinjizierte Lösung wurde in einigen Experimenten modifiziert, indem Ca 2+ durch 2 mmol/L EGTA ersetzt wurde. Um die GJ-Permeabilität zu beurteilen, wurde der Mikroinjektionslösung in einer Reihe von Experimenten 2% Lucifer Yellow zugesetzt. Alle Experimente wurden bei 37 °C (Digital Warm Stage Controller, Linkam) auf dem Tisch eines inversen Mikroskops (Olympus IMT-2) durchgeführt. Zellbilder wurden kontinuierlich mit 400-facher Vergrößerung auf Video aufgezeichnet. Die relativen Veränderungen der Zelllänge wurden an den videoaufgezeichneten Bildern gemessen. Die Messungen wurden in beiden Zellen alle 2 Sekunden während der ersten 30 Sekunden nach der Mikroinjektion durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Der Farbstofftransfer durch GJs wurde unter Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines 420-nm-Anregungslichts mit einer Bandbreite von 15 nm überwacht.

Messung von [Ca 2+ ]ich und Na + Konzentrationen

Verhältnisfluoreszenzstudien wurden in einer separaten Versuchsreihe unter den zuvor beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Veränderungen von [Ca 2+ ]ich und Na + -Konzentrationen wurden in Myozyten, die mit Fura-2 bzw. SBFI (Molecular Probes) beladen waren, analysiert. Zur Beladung wurden die Zellen 30 Minuten bei 37 °C in Medium 199 mit dem Acetoxymethylester von Fura-2 (5 μmol/l) oder SBFI (10 μmol/l) inkubiert. Myozyten wurden dann zweimal gewaschen und 20 Minuten in Medium 199 nachinkubiert, um eine Hydrolyse der Acetoxymethylester innerhalb der Zellen zu ermöglichen. Petrischalen mit Fura-2- oder SBFI-beladenen Myozyten wurden auf dem temperaturkontrollierten Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops (Olympus IX70) mit einem Fluorit-Objektiv (UplaFL ×200 oder ×400, Olympus) positioniert. Verhältnisfluoreszenzmessungen wurden mit einem kommerziell erhältlichen Bildgebungssystem (QuantiCell 900, Applied Imaging) durchgeführt. Zellen wurden alternativ bei 340 und 380 nm mit einer Bandbreite von 15 nm mittels eines schnellen Monochromators angeregt. Die Belichtungszeit wurde für jede Anregungswellenlänge entsprechend der Fluoreszenzintensität eingestellt und betrug typischerweise 40 bis 80 ms. Das emittierte Licht wurde von einer luftgekühlten intensivierten Digitalkamera mit einer Auflösung von 640 × 640 Pixeln gesammelt. Zählungen aus Clustern von 2 × 2 oder 4 × 4 Pixeln wurden gepoolt, um kürzere Belichtungszeiten zu verwenden und das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern. Für jeden Pixelcluster wurden Verhältnisse von 340/380 aus Signalintensitäten in diesem Cluster in Paaren von Bildern berechnet, die nacheinander bei den 2 Wellenlängen erhalten wurden, und farbcodierte Bilder mit einem Verhältnis von 340/380 wurden erzeugt. Das durchschnittliche Verhältnis wurde für in diesen Bildern definierte interessierende Bereiche berechnet, und die Veränderungen dieser durchschnittlichen Verhältniswerte im Laufe der Zeit wurden analysiert.

Feldstimulation von Kardiomyozyten

Um die potentiellen Wirkungen von KB-R7943 auf zytosolische Ca 2+ -Transienten und Kontraktilität zu bewerten, wurden Veränderungen der Zelllänge und des Fluoreszenzverhältnisses in Kardiomyozyten analysiert, die einer Feldstimulation bei 1 Hz unterzogen wurden, wie zuvor beschrieben. 18 Zweiphasige elektrische Stimulation, bestehend aus 2 gleichen, aber entgegengesetzten rechteckigen 40-V-Stimuli von 0,5 ms Dauer, wurde zwischen 2 in die Flüssigkeit eingetauchten Silberelektroden angewendet. Die Messungen wurden vor der Zugabe eines Arzneimittels zur extrazellulären Flüssigkeit und nach der Zugabe von KB-R7943 mit 15 μmol/l durchgeführt.

Ergebnisse

Rolle von [Ca 2+ ]Ö bei der Ausbreitung von Hyperkontraktur

Unter Kontrollbedingungen (extrazelluläre und mikroinjizierte Lösungen bestehend aus HEPES-Puffer mit einer ionischen Zusammensetzung, die physiologische extrazelluläre Medien nachahmt) induzierte die Mikroinjektion von extrazellulärem Puffer durchweg eine Hyperkontraktur des injizierten Myozyten, und der schnelle Anstieg der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration in der mikroinjizierten Zelle wurde innerhalb von einige Sekunden durch einen ähnlichen Anstieg in der benachbarten Zelle und durch ihre Hyperkontraktur (Abbildung 1). Wenn jedoch Ca 2+ im extrazellulären Medium durch den Ca 2+ -Chelatbildner EGTA ersetzt wurde, aber nicht im injizierten Puffer, wurden der Anstieg der Ca 2+ -Konzentration und die Hyperkontraktur, die in den injizierten Myozyten beobachtet wurden, in 16 . nicht auf die benachbarte Zelle übertragen von 18 Zellpaaren (Abbildung 2). Versagen der Ausbreitung der Hyperkontraktur in Abwesenheit von [Ca 2+ ]Ö war nicht auf eine reduzierte GJ-Permeabilität zurückzuführen, da die Übertragung des GJ-permeanten Farbstoffs Lucifer Yellow von der Mikroinjektion in die benachbarte Zelle in Abwesenheit von [Ca 2+ ] nicht verändert wurde.Ö (Figur 2 ).

Aufgrund der beobachteten Rolle von [Ca 2+ ]Ö bei der Ausbreitung der Hyperkontraktur untersuchten wir Ca 2+ -Kanäle vom L-Typ als wahrscheinlichen Weg des Ca 2+ -Eintritts in die benachbarte Zelle.Diese Möglichkeit wurde jedoch ausgeschlossen, indem die Mikroinjektion in Gegenwart von 10 µmol/L des Kanalblockers Nifedipin wiederholt wurde. Die Blockade von Ca 2+ -Kanälen vom L-Typ veränderte weder den Ca 2+ -Anstieg in der benachbarten Zelle noch die Ausbreitung der Hyperkontraktur ( 2 ).

Die Ca 2+ -Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) hatte keinen Einfluss auf die Zellvermehrung der Hyperkontraktur. Die Zugabe von Ryanodin zum extrazellulären Medium (10 μmol/l für 15 Minuten) verhinderte nicht den Ca 2+ -Anstieg oder die Hyperkontraktur in der angrenzenden Zelle (Abbildung 2).

Passage von Na + und Rolle des umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austauschs

Wir verwendeten die Ratiofluoreszenz-Bildgebung von Zellen, die mit dem Na + -Indikator SBFI beladen waren, um einen schnellen und fast gleichzeitigen Anstieg der zytosolischen Na + -Konzentration in der mikroinjizierten und der benachbarten Zelle zu zeigen (Abbildung 3). Um die Rolle des umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austauschs bei der Zunahme von [Ca 2+ ] zu bestimmenich Konzentration und Hyperkontraktur der angrenzenden Zelle wurde eine Mikroinjektion von extrazellulärem Medium in Gegenwart des neuen Isothioharnstoff-Derivats KB-R7943, einem hochselektiven Blocker des Na + /Ca 2+ -Austauschs in seinem umgekehrten Modus, durchgeführt. 19 20 Die Zugabe von 20 μmol/l KB-R7943 zum extrazellulären Medium verhinderte die Ausbreitung der Hyperkontraktur bei 12 von 15 Zellpaaren und verzögerte sie bei den verbleibenden 3 deutlich (Abbildung 3). Ein ähnlicher Effekt wurde bei 15 μmol/L beobachtet (Vermehrung wurde nur in 1 von 5 Zellpaaren beobachtet). Bei 10 μmol/l KB-R7943 wurde jedoch eine Vermehrung in 12 von 13 Zellpaaren beobachtet, obwohl sie signifikant verzögert war (nach 30 Sekunden Mikroinjektion wurde Hyperkontraktur nur in 6 von 13 Zellpaaren propagiert). KB-R7943 hatte bei 15 μmol/l weder einen Einfluss auf die Zellverkürzung (10,3 ± 0,4 % bzw. 10,0 ± 0,5 % in An- und Abwesenheit des Arzneimittels) noch auf Ca 2+ -Transienten, die durch Feldstimulation induzierten (Abbildung 4 ). Trotz des Fehlens einer Hyperkontrakturausbreitung veränderte KB-R7943 bei 20 μmol/l die GJ-Permeabilität nicht, wie anhand der Zell-Zell-Diffusion von Lucifer Yellow bewertet wurde (Abbildung 3).

Die Rolle der Passage von Na + durch GJ und der anschließende Austausch mit [Ca 2+ ]Ö in der Zell-zu-Zell-Vermehrung von Hyperkontraktur wurde in einer Reihe von Experimenten weiter getestet, in denen Ca 2+ durch 2 mmol/L EGTA im Mikroinjektionspuffer ersetzt wurde. Dies führte trotz fehlender Längenänderung in der mikroinjizierten Zelle durchweg zu einer Hyperkontraktur der benachbarten Zelle ( 3 ) und schloss die mechanische Verzerrung der GJs als Hauptursache für die Ausbreitung der Hyperkontraktur eindeutig aus. Die Tatsache, dass die Hyperkontraktur in der angrenzenden Zelle in diesen Experimenten verzögert ist, kann darauf hinweisen, dass die Passage von Ca 2+ aus der primär verletzten Zelle zur Hyperkontraktur der angrenzenden Zelle beitragen kann.

Diskussion

Diese Studie untersuchte den chemischen Botenstoff, der für die Zell-zu-Zell-Vermehrung der Hyperkontraktur in Paaren von isolierten Ratten-Kardiomyozyten verantwortlich ist, in denen die Sarkolemmalruptur einer der Zellen durch Injektion von extrazellulärem Medium nachgeahmt wurde. Zuerst untersuchten wir, ob die Ausbreitung der Hyperkontraktur auf die direkte Passage von Ca 2+ durch GJs oder auf die Passage eines anderen Botenstoffes zurückzuführen ist, der entweder den Eintritt von Ca 2+ aus dem extrazellulären Raum oder die Freisetzung von Ca 2+ aus den intrazellulären Speichern induziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Ausbreitung der durch Mikroinjektionen induzierten Hyperkontraktur auf benachbarte Zellen vollständig von [Ca 2+ ] abhängt.Ö und wird durch den Durchgang von Na + durch GJs verursacht, die wiederum in der Lage sind, den Eintritt von Ca 2+ durch den umgekehrten Modus des Na + /Ca 2+ -Austauschers zu induzieren. Ca 2+ -Kanäle vom L-Typ stellen keinen additiven Weg des Ca 2+ -Eintritts aus dem extrazellulären Medium in die benachbarte Zelle dar, da die Blockade der Kanäle mit 10 μmol/l Nifedipin den Ca 2+ -Anstieg in der benachbarten Zelle nicht veränderte Zelle noch Ausbreitung von Hyperkontraktur (Abbildung 2). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem anorganischen Ca 2+ -Kanalblocker Ni + erhalten (Daten nicht gezeigt). Die potenzielle Rolle der Ca 2+ -Freisetzung aus dem SR beim Anstieg von [Ca 2+ ]ich Konzentration und Hyperkontraktur der Nachbarzelle wurde in Experimenten ausgeschlossen, in denen Hyperkontraktur in extrazellulärem Kontrollpuffer mit 10 μmol/L Ryanodin induziert wurde. Dieser Blocker der Ca 2+ -Freisetzung aus dem SR hatte keine Wirkung auf den Ca 2+ -Anstieg oder die Hyperkontraktur ( 2 ). Diese Ergebnisse zeigen auch, dass schnelle und wichtige Erhöhungen der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration, die mit einer Sarkolemmalruptur verbunden sind, nicht schnell genug zu einem GJ-Verschluss führen, um die Ausbreitung von Zellverletzungen zu verhindern.

Übertragung von cAMP, IP3, oder Ca 2+ ist in vielen Zelltypen, einschließlich Kardiomyozyten, an der Signalübertragung von Zelle zu Zelle beteiligt. 21 22 23 24 25 Es könnte erwartet werden, dass eine direkte Passage von Ca 2+ durch GJs ohne die Notwendigkeit eines Ca 2+ -Zutritts aus dem extrazellulären Raum für die Zell-zu-Zell-Vermehrung der Hyperkontraktur ausreichen könnte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass dies nicht der Fall ist. Eine mögliche Erklärung ist, dass die GJ-Permeabilität eng durch [Ca 2+ ] reguliert wird.ich Konzentration. 26 Frühere Studien haben gezeigt, dass GJs eine geringe Fähigkeit haben, Ca 2+ zu übertragen, 27 28 und der GJ-Verschluss, der durch die Exposition gegenüber extrazellulären Ca 2+ -Spiegeln verursacht wird, könnte den Durchgang von ausreichend Ca 2+ -Ionen verhindern, um eine Hyperkontraktur in der benachbarten Zelle zu induzieren. Der Transfer von Na + -Ionen kann aufgrund des großen Gradienten der zytosolischen Na + -Konzentration zwischen der mikroinjizierten und der benachbarten Zelle einen Ca 2+ -Einstrom in die zweite Zelle durch den umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austausch nach GJ-Verschluss ermöglichen. Es wurde gezeigt, dass GJs einen effizienten Ausgleich der zytosolischen Na + -Konzentration in anderen Zelltypen ermöglichen. 29

Die Beobachtung, dass die Passage von Na + durch GJs eine Hyperkontraktur auf benachbarte Kardiomyozyten ausbreiten kann, kann wichtige Auswirkungen haben. Es gibt starke Hinweise darauf, dass während der myokardialen Reperfusion eine Hyperkontraktur oft mit einer Sarkolemmstörung 8 einhergeht, da eine übermäßige mechanische Belastung auf eine Membran mit verringertem mechanischen Widerstand einwirkt. 16 Die Membranzerstörung ermöglicht das Einströmen von extrazellulärem Medium mit hoher Na + -Konzentration in die hyperkontrahierende Zelle, eine Situation, die durch Mikroinjektion von extrazellulärem Medium nachgeahmt wird. Obwohl GJs während einer Ischämie geschlossen werden können, wird erwartet, dass sie sich als Reaktion auf den oxidativen Stoffwechsel schnell wieder öffnen. Der vorgeschlagene Mechanismus der Zell-zu-Zell-Vermehrung der Hyperkontraktur kann somit während der myokardialen Reperfusion in vivo wirksam sein. Die Tatsache, dass die Ausbreitung der Hyperkontraktur von Zelle zu Zelle von einer Sarkolemmruptur abhängt, könnte eine Grenze darstellen und erklären, warum sie nicht das ganze Herz erfasst. Zellen, die einer weniger schweren Ischämie ausgesetzt waren, wie diejenigen, die einen Kollateralfluss erhielten, konnten einer Hyperkontraktur standhalten, ohne eine Sarkolemmalruptur und eine Na + -Überladung zu entwickeln. Wenn die Menge an Na + nicht ausreicht, um den Austausch im umgekehrten Modus zu fördern, würde die Ausbreitung unterbrochen.

Der sarkolemmale Na + /Ca 2+ -Austauscher ist ein wichtiger Regulator von [Ca 2+ ]ich Homöostase in erregbaren Zellen. 30 In den meisten Herzmuskelzellen von Säugetieren arbeitet der Austauscher hauptsächlich im Vorwärtsmodus, dh als schneller Extruder für Ca 2+, das über die sarkolemmalen L-Typ-Ca 2+ -Kanäle in die Kardiomyozyten gelangt ist, um die Freisetzung von Ca 2+ aus auszulösen der SR. Verfügbare Beweise legen nahe, dass der Austauscher im Herzen um Ca 2+ mit der SR Ca-ATPase konkurriert, um eine Relaxation in einem von Spezies, Entwicklungsstadium und/oder physiologischem Zustand des Herzens abhängigen Grad zu bewirken. Jedoch kann unter pathologischen Bedingungen, wie einer Ischämie-Reperfusions-Verletzung, die Richtung seines elektrogenen Austauschs geändert werden, und es wird angenommen, dass der Austauscher aufgrund eines Ischämie-abhängigen Anstiegs von Na + eine Ca 2+ -Überladung verursacht. 31 Ca 2+ -Einstrom durch umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austausch kann ausreichen, um eine Kontraktion zu induzieren, wenn er absichtlich in diesen Wirkmodus getrieben wird. 32 In unserer Studie verhinderte die Zugabe des reversen Na + /Ca 2+ -Austauschinhibitors KB-R7943 in den meisten Fällen bei Konzentrationen von 15 µmol/L oder mehr die Ausbreitung der Hyperkontraktur. KB-R7943 wirkt als potenter Blocker des reversen Na + /Ca 2+ -Austauschs in Rattenkardiomyozyten (90 % Hemmung bei 10 µmol/l) ohne signifikante Auswirkungen auf andere Ionentransporter oder Kanäle bei Konzentrationen <30 µmol/l. Bei 30 μmol/L hemmte KB-R7943 die Dihydropyridin-sensitive Ca 2+ -Aufnahme um 35 % und den Vorwärts-Na + /Ca 2+ -Austausch um 38 % ohne signifikanten Einfluss auf den Na + /H + -Austausch, Sarkolemmal oder SR Ca 2+ ATPase- oder Na + /K + -ATPase-Aktivitäten. 19 20 In unserer Studie hatte die Konzentration von KB-R7943, die die Ausbreitung der Hyperkontraktur effektiv verhinderte, keine signifikante Wirkung auf Ca 2+ -Transienten oder die systolische Zellverkürzung von isolierten Myozyten, die einer Feldstimulation unterzogen wurden. KB-R7943 verlangsamte auch die Hyperkontraktur der mikroinjizierten Zelle, was darauf hindeutet, dass der umgekehrte Modus des Na + /Ca 2+ -Austauschs einen der Wege des Ca 2+ -Eintrags in Myozyten darstellt, die hauptsächlich durch Mikroinjektion verletzt wurden.

Die Rolle der Passage von Na + durch GJs und der anschließende Austausch mit [Ca 2+ ]Ö bei der Zell-zu-Zell-Vermehrung von Hyperkontraktur wurde weiter bestätigt, wenn Ca 2+ durch EGTA im Mikroinjektionspuffer ersetzt wurde. Dies führte durchweg zu einer Hyperkontraktur der angrenzenden Zelle, mit einer langsameren Rate als unter Kontrollbedingungen, trotz der Abwesenheit jeglicher Längenänderung in der mikroinjizierten Zelle (Abbildung 3). Dieses Ergebnis stellt einen direkten Beweis dafür dar, dass die Ausbreitung einer Hyperkontraktur unabhängig von einer physischen Verzerrung der GJs infolge mechanischer Kräfte erfolgen kann, die durch die Hyperkontraktur auf interkalierte Bandscheiben ausgeübt werden. Allerdings kann eine mögliche Rolle der mechanischen Interaktion bei der während einer Hyperkontraktur auftretenden Sarkolemmal-Disruption nicht ausgeschlossen werden, wie zuvor vorgeschlagen wurde. 33 34 In früheren Studien wurde nicht festgestellt, dass die Injektion von EGTA in eine Zelle die zytosolische Ca 2+ -Konzentration in benachbarten, GJ-verbundenen Zellen reduziert, was darauf hindeutet, dass EGTA nicht signifikant durch GJs diffundiert. 27 Die langsamere Hyperkontraktur in der zweiten Zelle in diesen Experimenten könnte darauf hindeuten, dass eine direkte Passage von Ca 2+ durch GJs, obwohl sie nicht ausreicht, um eine Hyperkontraktur der zweiten Zelle zu induzieren, zu ihrer Entwicklung beitragen kann.

Die hier präsentierten Ergebnisse ermutigen zur Untersuchung anderer potenzieller schädlicher Wirkungen der GJ-vermittelten chemischen Kommunikation in anderen multizellulären Systemen. Ein schädlicher chemischer Austausch in Geweben mit gut entwickelter Zell-zu-Zell-Kommunikation, wie Leber oder Zentralnervensystem, könnte einen allgemeineren Mechanismus darstellen, der mit Ischämie oder Hypoxie verbunden ist. Im Myokardgewebe könnte die Zell-zu-Zell-Ausbreitung von Hyperkontraktur aufgrund der Passage von Na + durch GJs einen zuvor nicht erkannten Mechanismus des Zelltods als Folge einer Ischämie-Reperfusion darstellen. Dieser Mechanismus könnte die Ausbreitung der Hyperkontraktur von schwer verletzten Zellen auf andere Zellen mit leichterer ischämischer Verletzung ermöglichen, die ansonsten überlebt hätten. In Anbetracht der Tatsache, dass Myozyten durch GJs mit mehreren Zellen verbunden sind, könnte selbst eine geringe Wahrscheinlichkeit des Fortschreitens der Hyperkontraktur von Zelle zu Zelle einen großen Einfluss auf die Infarktgröße haben. Unter experimentellen Bedingungen haben Medikamente, die die GJ-Permeabilität verringern, wie Heptanol oder Octanol, erfolgreich die Übertragung potenziell schädlicher Stoffwechselsignale in verschiedenen Zelltypen reduziert. 7 14 35 Ihre klinische Anwendung wird jedoch durch ihre Auswirkungen auf die kontraktile Funktion des Myokards und ihre arrhythmogenen Eigenschaften eingeschränkt. Diese Studie beschreibt einen Mechanismus der Ausbreitung von Zellverletzungen durch GJs, der das Ziel einer sehr selektiven Intervention ohne größere Auswirkungen auf die GJ-Permeabilität oder Ionenhomöostase in normalen Zellen sein könnte.

Abbildung 1. Durch Mikroinjektion von extrazellulärem Medium induzierter Hyperkontraktur in Paaren von isolierten Kardiomyozyten. A, Sequenzielle 340/380-Verhältnis-Fluoreszenzbilder eines Fura-2-beladenen Zellpaars, erhalten nach Mikroinjektion (Pfeil). *Position der interkalierten Bandscheibe zwischen den 2 Zellen, wie durch direkte Beobachtung bei ×400 identifiziert. Es wird nur das erste von jeweils 6 nacheinander aufgenommenen Bildern angezeigt. Das erste Bild (oben links) und das letzte Bild (unten rechts) werden durch 30 Sekunden getrennt. Beachten Sie, dass auf die Mikroinjektion eine Farbänderung in beiden Zellen folgt, die eine Ca 2+ -Überladung widerspiegelt. B, Durchschnittliche Veränderungen der Zelllänge in 12 Fällen, die durch Mikroinjektion in den injizierten Myozyten (○) und den benachbarten (•) induziert wurden. In <30 Sekunden waren beide Zellen vollständig hyperkontrahiert. C, Durchschnittliche Veränderungen des Fura-2-Verhältnisses in 4 Experimenten, die den schnellen Anstieg von [Ca 2+ ] demonstrierenich durch Mikroinjektion in beide Zellen induziert. Die Änderung des Verhältnisses (▵) zu einem gegebenen Zeitpunkt ist als der zu diesem Zeitpunkt gemessene Wert dividiert durch den vor der Mikroinjektion gemessenen Anfangswert definiert. Die Daten sind Mittelwert ± SEM.

Figur 2. A, Fehlende Ausbreitung der Hyperkontraktur bei [Ca 2+ ]Ö-freie Bedingungen wird in der folgenden Sequenz von 3 Bildern veranschaulicht. A1, Das Bild wurde unmittelbar nach der Injektion des Kontrollpuffers in eine der Zellen eines Paares erhalten. A2, 30 Sekunden nach der Mikroinjektion war die injizierte Zelle vollständig hyperkontrahiert, aber die Hyperkontraktur schritt nicht auf die benachbarte Zelle fort. A3, Fluoreszenzbild des gleichen Zellpaars zeigt den Durchgang von Lucifer Yellow von der Mikroinjektion zur benachbarten Zelle trotz des Fehlens einer Hyperkontrakturausbreitung, was zeigt, dass GJs durchlässig waren. *Die Position des interkalierten Scheibenpfeils zeigt die Mikropipette an. B, Durchschnittliche Veränderungen der Zelllänge in 16 Experimenten, die unter [Ca 2+ ] durchgeführt wurdenÖ-freie Bedingungen. C, mit normalem [Ca 2+ ]Ö, die Zugabe von 10 μmol/l Nifedipin verhinderte oder veränderte die Ausbreitung der Hyperkontraktur nicht. D, Blockade der Ca 2+ -Freisetzung aus dem SR mit 10 μmol/l Ryanodin hatte keinen Einfluss auf die Ausbreitung der Hyperkontraktur von der Mikroinjektion in die benachbarte Zelle. In allen Fällen steht ○ für mikroinjizierte Myozyten und • für benachbarte Zellen. Die Daten sind Mittelwert ± SEM.

Figur 3. Rolle der Passage von Na + durch GJs bei der Ausbreitung von Hyperkontraktur. A, Sequenzielle SBFI-Verhältnis-Fluoreszenzbilder von einem Paar von Myozyten, erhalten nach Mikroinjektion eines von ihnen (Pfeil), die einen schnellen Anstieg der intrazellulären Na + -Konzentration in beiden Zellen zeigen. Das letzte Bild (unten rechts) ist 60 Sekunden vom ersten (oben links) getrennt. *Die Position des eingeschobenen Scheibenpfeils zeigt die Mikropipette an. Auch das Ende einer dritten Zelle, ganz in der Nähe der injizierten Zelle, aber ohne physischen Kontakt mit dieser, ist ebenfalls zu erkennen (gestrichelte Linie). B, Durchschnittliche Änderungen des SBFI-Verhältnisses in der mikroinjizierten Zelle (○) und der benachbarten (•) in 6 Experimenten, die unter Kontrollbedingungen durchgeführt wurden. Die Änderung des Verhältnisses (▵) zu einem gegebenen Zeitpunkt ist als der zu diesem Zeitpunkt gemessene Wert dividiert durch den Anfangswert vor der Mikroinjektion definiert. C, Wirkung der Blockade des umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austauschs auf die Ausbreitung von Hyperkontraktur in Gegenwart von KB-R7943 im extrazellulären Medium, unmittelbar vor (links) und 240 Sekunden nach der Mikroinjektion (rechts). *Position der eingelegten Scheibe. Beachten Sie, dass trotz chemischer Kopplung (Übergang von Lucifer Yellow aus Mikroinjektion in benachbarte Zellen) die Blockade des umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austauschs die Ausbreitung der Hyperkontraktur verhinderte. D, Durchschnittliche Veränderungen der Zelllänge in 15 Experimenten, die in Gegenwart von KB-R7943 durchgeführt wurden. In 12 von 15 Fällen verhinderte die Blockade des umgekehrten Na + /Ca 2+ -Austausches die Ausbreitung der Hyperkontraktur. In den anderen 3 Zellpaaren wurde Hyperkontraktur vermehrt, wenn auch mit einiger Verzögerung. E, Mikroinjektion von Ca 2+ -freiem Puffer mit 2 mmol/L EGTA mit normalem [Ca 2+ ]Ö Konzentration (1 mmol/L). Bilder eines Zellpaares, die vor der Mikroinjektion (links) und 60 Sekunden nach der Mikroinjektion (rechts) aufgenommen wurden, zeigen eine Hyperkontraktur der benachbarten Zelle, aber nicht der mikroinjizierten. F, Durchschnittliche Veränderungen der Zelllänge in 5 Zellpaaren, denen extrazellulärer Puffer mikroinjiziert wurde, in dem Ca 2+ durch EGTA ersetzt wurde. In allen Fällen bedeutet ○ injizierten Myozyten •, benachbarte Zelle. Die Daten sind Mittelwert ± SEM.

Figur 4. Repräsentative Spuren von Veränderungen der Zelllänge (links) und des Fura-Verhältnisses von 340/380 (rechts) in Zellen, die einer Feldstimulation bei 1 Hz in Abwesenheit (Kontrolle) und in Gegenwart von KB-R7943 mit 15 μmol/L unterzogen wurden. Verhältnisse von 340/380 repräsentieren die Durchschnittswerte einzelner Pixel innerhalb des Zellenbildes (64 × 60 Pixel), die alle 17 ms erhalten werden. Die Zelllänge wurde aus hochauflösenden Bildern (256 × 240 Pixel) abgeleitet, die unter sichtbarem Licht (400 nm) alle 10 ms aufgenommen wurden. Die unteren Felder zeigen die zeitlich gemittelten Spuren. KB-R7943 bei 15 μmol/L hatte weder auf die Zellverkürzung noch auf die durch elektrische Stimulation induzierten Ca 2+ -Transienten nachweisbaren Einfluss.

Diese Arbeit wurde durch das Programm PL-951254 BIOMED-2 der Europäischen Union und durch Grant 97/0948 des Fondo de Investigaciones Sanitarias (Spanien) unterstützt. Wir danken Y. Puigfel für ihre technische Unterstützung und A. Garcia-Dorado, J. Inserte, L. Agulló, J. Sagristà und J. Cinca für ihre hilfreichen Diskussionen und Vorschläge.


Schlussfolgerungen

Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass die Gap-Junction-Internalisierung, die zur Bildung von ringförmigen Gap-Junction-Vesikeln führt, ein wichtiger zellulärer Weg ist, der signifikant zum Gap-Junction-Turnover beiträgt und dass dieser Prozess die Clathrin-vermittelte Endozytose-Maschinerie nutzt. Mutationen in Gap-Junction-Connexinen können eine Reihe verheerender menschlicher Krankheiten verursachen, darunter erblichen nicht-syndromalen Hörverlust, X-chromosomale Charcot-Marie-Tooth-Neuropathie, angeborene Katarakte der Augenlinse, Herzerkrankungen wie Hypertrophie, Ischämie und Herzinsuffizienz, eine Reihe von akuten Hauterkrankungen sowie kraniofaziale Knochen und andere Entwicklungsdefekte (zuletzt besprochen in Lit. [198]–[202]). Es wird angenommen, dass eine fehlregulierte Gap Junction-Plaque-Internalisierung, -Degradation und -Stabilisierung auf der Plasmamembran, die alle zu abweichenden GJIC-Spiegeln führen, zum Krankheitsphänotyp beiträgt. Tatsächlich wurde kürzlich berichtet, dass veränderte, nicht-physiologische Abbauraten verschiedener Connexine Krankheiten verursachen können ([203] [204], Übersicht in [200] [205]). Solche Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Veränderungen im Gap Junction Turnover direkt mit der Entwicklung vieler Krankheiten zusammenhängen. Daher wird es von entscheidender Bedeutung sein, die Turnover-Eigenschaften von Connexion 43 und anderer Connexionen und ihrer krankheitsrelevanten Mutanten zu erforschen und zu entschlüsseln, da Mutationen in den meisten, wenn nicht in allen Connexinen vermutet werden, dass sie verwandt sind oder kranke Phänotypen verursachen [205] . Dies ist von besonderem Interesse für Connexin-Typen, die keine konservierten, bekannten, kanonischen AP-2-Clathrin-Adapter-Bindungsstellen kodieren (wie Cx26, Cx31, Cx31.1, Cx40 und Cx46) (Fisher und Falk, unveröffentlicht), da es Es ist nicht klar, ob aus diesen Connexinen zusammengesetzte Gap Junctions in der Lage sind, sich selbst umzudrehen und ob sie auch die endozytische Clathrin-Maschinerie implementieren.Da Gap Junctions außerdem zur physikalischen Zell-Zell-Adhäsion beitragen, können viele patho-/physiologische Prozesse, die Zellmigration und Zell-Zell-Trennung beinhalten (wie Zellmigration in der Entwicklung und Wundheilung, Mitose, Apoptose, Leukozytenextravasation, Ischämie, Blutung, Ödeme, Krebsmetastasen und andere) [92] erfordern die Entfernung von Gap Junctions von der Plasmamembran, und eine Fehlregulation dieses Prozesses kann weiter zur Krankheit beitragen. Dies gilt insbesondere während der Entwicklung, wenn die Notwendigkeit für Migration, Differenzierung und Zell-Zell-Trennung kritisch ist.

Die Erforschung von Abbauprozessen von ringförmigen Gap-Junctions über autophagosomale versus endo-lysosomale Mechanismen scheint ebenfalls wichtig zu sein, da der Abbau von ringförmigen Gap-Junctions durch verschiedene zelluläre Mechanismen das Potenzial für unterschiedliche Ergebnisse birgt eine interessante Hypothese, insbesondere wenn man eine mögliche Wiederverwendung von Connexin-Polypeptiden betrachtet, Gap Junction Halbkanäle oder sogar ganze Gap-Junction-Kanäle, anstatt ihre Degradation. Da die Gap-Junction-Biosynthese ein komplexer, zeitaufwendiger und energetisch kostspieliger Prozess ist, ist schließlich das kürzlich vorgeschlagene Konzept, dass internalisierte Gap-Junctions wiederverwendet werden könnten, indem sie wieder in die Plasmamembran eingefügt werden [158], ein provokatives, aber dennoch faszinierendes Konzept . Die Forschung in den kommenden Jahren verspricht zumindest einige dieser spannenden offenen Fragen zu beantworten.


Abstrakt

Hintergrund- Eine veränderte Reizleitung ist mit einer erhöhten Anfälligkeit für Vorhofflimmern (AF) in Hundemodellen für chronische Mitralinsuffizienz (MR) und Herzinsuffizienz (HF) verbunden. Rotigaptid (ZP123) erhöht die Gap-Junction-Leitfähigkeit und verbessert die Zell-Zell-Kopplung. Wir untersuchten die Auswirkungen von Rotigaptid auf die Vorhofleitung und die Vulnerabilität des Vorhofflimmerns in den MR- und HF-Modellen des Hundes.

Methoden und Ergebnisse— Einundzwanzig Hunde in 3 Gruppen wurden untersucht: Kontrolle (n=7), chronische MR durch Mitralausriss (n=7) und HF induziert durch ventrikuläres Tachypacing (n=7). Die epikardiale Kartierung beider Vorhöfe wurde mit einem 512-Elektroden-Array zu Studienbeginn und bei steigenden Rotigaptid-Dosen (10, 50 und 200 nmol/l) durchgeführt. Die Leitungsgeschwindigkeit erhöhte sich sowohl in den Vorhöfen bei Kontrolltieren als auch bei MR-Tieren (maximaler prozentualer Anstieg: 24 ± 5 ​​%, 38 ± 6 % [P<0,001, <0,001] im linken Vorhof und 19±9 %, 18±3 % [P<0,001, <0,001] im rechten Vorhof). Die Leitungsgeschwindigkeit änderte sich im linken Vorhof der HF-Gruppe nicht und erhöhte sich im rechten Vorhof minimal (3±3%, 17±5% [P=NS, P=0,001]). Die AF-Dauer war bei MR- und HF-Tieren zu Studienbeginn verlängert (Kontrolle: 16 ± 25 Sekunden, MR: 786 ± 764 Sekunden, HF: 883 ± 684 Sekunden P= 0,013). Bei 50 nmol/l Rotigaptid verringerte sich die Dauer des Vorhofflimmerns bei den MR-Tieren deutlich (96%ige Reduktion, P<0,001), wodurch die AF-Dauer auf die der Kontrolltiere reduziert wird (Kontrolle: 9 ± 11 Sekunden, MR: 14 ± 16 Sekunden, HF: 1622 ± 355 Sekunden P=0.04).

Schlussfolgerungen— Die Gap-Junction-Modulation mit Rotigaptid reduziert die Vulnerabilität des Vorhofflimmerns in einem Hunde-MR-Modell von Vorhofflimmern auf ein ähnliches Niveau wie bei Kontrolltieren, beeinflusst die Vorhofflimmer-Anfälligkeit im Hunde-HF-Modell jedoch nicht. Dies kann ein neues therapeutisches Ziel bei einigen Formen von AF sein.

Vorhofflimmern (AF) ist eine häufige klinische Arrhythmie, die normalerweise mit Bluthochdruck, Herzinsuffizienz oder Mitralklappenerkrankung verbunden ist, aber auch ohne diese Erkrankungen auftreten kann. 1 Es wurde gezeigt, dass mehrere elektrophysiologische Substrate die Anfälligkeit für VHF erhöhen. 2,3 Obwohl die Verkürzung der atrialen Refraktärität als elektrophysiologisches Substrat der Vulnerabilität des Vorhofflimmerns bei Vorhoftachykardie- und Methacholin-Modellen des Vorhofflimmerns impliziert wurde, 4,5 sind Anomalien der Erregungsleitung in Modellen der Herzinsuffizienz (HF) 6 und der chronischen Mitralinsuffizienz (MR ). 3,7

Klinische Perspektive S. 118

Die Myozyten-Zell-zu-Zell-Kopplung durch Gap Junctions ist ein Schlüsselfaktor bei der Arrhythmogenese unter einer Vielzahl von Bedingungen. 8–10 Rotigaptid (ZP123) ist ein Hexapeptid, das spezifisch die Gap Junction-Leitfähigkeit erhöht und die Zell-Zell-Kopplung verbessert 11–14 ohne atriale oder ventrikuläre proarrhythmische Effekte. 11,15,16

Die vorliegende Studie untersucht die Auswirkungen von Rotigaptid auf die atriale Elektrophysiologie in normalen und erkrankten Vorhöfen in Modellen von Vorhofflimmern, bei denen Überleitungsstörungen vorliegen (HF und MR). Die Studie testet die Hypothese, dass eine Verbesserung der atrialen Erregungsleitung die Anfälligkeit für Vorhofflimmern verringert.

Methoden

Alle Tierstudien wurden gemäß den Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee des Laboratory Animal Resource Center der University of California San Francisco genehmigt und überwacht. Einundzwanzig Hunde (25 bis 30 kg) wurden in 3 Gruppen eingeteilt: Kontrolle (n=7), MR (n=7) und HF (n=7). Für alle Verfahren wurde eine Isofluran-Anästhesie verwendet, und die Tiere wurden nach der Intubation mechanisch beatmet.

Chirurgisches Verfahren für das MR-Modell

Das MR-Modell von AF wurde zuvor ausführlich beschrieben. 7 Kurz gesagt wurden die Mitralchordae tendineae durch einen transvenösen Zugang ausgerissen, bis bei der transösophagealen Echokardiographie eine mittelschwere bis schwere MR erreicht wurde. Sechs Wochen nach der Erzeugung von MR wurden die Tiere einer Kartierungs- und Elektrophysiologie-(EP)-Studie am offenen Brustkorb unterzogen (siehe unten).

Chirurgisches Verfahren für das HF-Modell

HF wurde durch ventrikuläres Tachypacing erzeugt, wie zuvor beschrieben. 6 Ein permanenter Herzschrittmacher wurde implantiert und so programmiert, dass er mit einer Frequenz von 240 Schlägen pro Minute bei einer Leistung von dem Vierfachen des Schwellenwerts stimuliert wurde. Tiere in dieser Gruppe durchliefen nach 4 Wochen Stimulation eine Follow-up-Studie mit offenem Brustkorb.

Überwachung der MR- und HF-Modelle

Alle Hunde wurden wöchentlichen körperlichen Untersuchungen und einer transthorakalen Echokardiographie im 4-Kammer-Blick unterzogen, um die Größe des linken Vorhofs (LA) und die linksventrikuläre (LV) Funktion zu messen. HF wurde durch klinische Zeichen (Lethargie, Ödem und Schleimhautfarbe) und die LV-Funktion durch Echokardiographie bestimmt. Bei den Kontroll- und MR-Hunden wurden zu keinem Zeitpunkt Anzeichen von HF oder Depression der LV-Funktion beobachtet.

Nachuntersuchungen am offenen Brustkorb

Bei der Nachuntersuchung wurden die Hunde mit Isofluran anästhesiert und der Brustkorb wurde mit einer Sternotomie in der Mittellinie geöffnet. Eine Perikardwiege wurde geschaffen, und epikardiale Multielektrodenplaques wurden an der freien Wand des rechten Vorhofs (RA) und LA mit insgesamt 512 Elektroden (Zwischenelektrodenabstand = 3,5 mm) wie zuvor beschrieben platziert. 17 unipolare Elektrodensignale wurden simultan bei 2-kHz-Abtastung mit dem UnEmap-System (Auckland Uniservices Ltd, Auckland, Neuseeland) digitalisiert. Benachbarte Elektrodenpaare auf den Plaques wurden auch für die bipolare Stimulation mit einer Amplitude des doppelten diastolischen Schwellenwerts verwendet. Effektive Refraktärzeiten (ERP) wurden an 6 LA- und 6 RA-Stellen mit dem S . gemessen1-S2 Methode, wobei S2 wurde in 2-ms-Schritten nach 8-Beat-Antriebssträngen mit Basiszykluslängen (BCLs) von 200, 300 und 400 ms inkrementiert. Die Streuung der Repolarisation an jedem Vorhof wurde als Variationskoeffizient des ERP (SD/Mittelwert) ausgedrückt. Am gleichen BCL wurden während der Stimulation des kontralateralen Atriums an jeder Aufnahmestelle auf der Grundlage von Aktivierungsdaten unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Algorithmus Leitungsvektoren und Leitungsgeschwindigkeiten (CVs) berechnet. 18 Phasenunterschiede, berechnet als durchschnittliche Differenz mit benachbarten Aktivierungszeiten an jeder Stelle, wurden ebenfalls gemessen, um die räumliche Heterogenität der Leitung zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben. 6,19 Frequenzhistogramme wurden für die Phasendifferenzen innerhalb eines aufgezeichneten Bereichs erstellt. Diese Histogramme wurden als mediane Phasenzeit P50 und das 5. und 95. Perzentil, P5 und P95, der Verteilung zusammengefasst. Der absolute Heterogenitätsgrad wurde als Breite der Verteilung, P95–P5, quantifiziert. Die AF-Induzierbarkeit wurde durch Burst-Stimulation bei 50 ms BCL an 1 LA- und 1 RA-Stelle getestet, wobei sechs 6-Sekunden- und sechs 12-Sekunden-Bursts an jeder Stelle appliziert wurden. Bei jedem Tier wurde die Dauer jeder AF-Episode gemessen. AF wurde als anhaltend angesehen, wenn eine Episode >30 Minuten dauerte.

Zusätzlich wurden 2 Tauchelektroden zur programmierten Stimulation an der Vorderwand des linken Ventrikels platziert. Die Stimulation wurde bei der doppelten diastolischen Schwelle durchgeführt. ERPs wurden unter Verwendung der für das Atrium beschriebenen Methode bei 3 BCLs (250, 300 und 350 ms) berechnet. Am Ende der Studie (höchste Rotigaptid-Dosis) wurde eine ventrikuläre programmierte Stimulation mit 2 BCLs (300 und 350 ms) und bis zu 3 Extrastimuli durchgeführt, um die Induzierbarkeit ventrikulärer Arrhythmien zu bewerten.

Alle Messungen wurden zu Studienbeginn durchgeführt und mit 3 ansteigenden Dosen von Rotigaptid wiederholt, die berechnet wurden, um geschätzte Serumkonzentrationen von 10, 50 und 200 nmol/l basierend auf der Pharmakokinetik der Verbindung zu liefern. Auf der Grundlage dieser Berechnungen wurde die Verbindung mit einem Bolus von 1,5, 15 bzw. 45 µg/kg intravenös infundiert, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion von 1,4, 14 und 42 µg/kg pro Stunde. Da erwartet wird, dass die Verbindung innerhalb von 15 Minuten den Steady-State erreicht, wurden alle Messungen 20 Minuten nach Beginn der Infusion bei jeder Dosis durchgeführt.

Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen

Vor Beginn des EP-Tests wurden in jeder Phase Plasmaproben aus der Oberschenkelvene zur Bestimmung der Arzneimittelkonzentration entnommen. Die Rotigaptid-Konzentration wurde in Plasmaproben durch Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie bestimmt, 20 mit einer unteren Bestimmungsgrenze von 1 ng/ml.

Histologie und Immunhistochemie

Transmurale Gewebeproben aus dem LA- und RA-Anhängsel und der freien Wand wurden in 10 % neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert. Das Gewebe wurde verarbeitet, in Paraffin eingebettet und in 4 bis 5 µm dicke Schnitte geschnitten. Serienschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin, Massons Trichrom oder Siriusrot gefärbt.

Eine immunohistochemische Analyse für Connexin 40 und Connexin 43 wurde auch in Gewebeproben aus dem LA- und RA-Anhängsel und der freien Wand durchgeführt, wie zuvor beschrieben, 21 unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-Anti-Cx40 (Alpha Diagnostics Int, San Antonio, Tex) oder Anti-Cx43 (Chemicon®). Int, Temecula, Kalifornien), monoklonaler Maus-Antidesmin-Antikörper (DAKO Denmark A/S, Glostrup, Dänemark). Um die Verteilungen von Cx40 und Cx43 zu vergleichen, wurden Schnitte mit einer Kombination aus polyklonalem Kaninchen-Anti-Cx40-Antikörper und monoklonalem Maus-Anti-Cx43 (BD ​​Biosciences, San Jose, Kalifornien) markiert. Zur Quantifizierung der Fibrose wurden Schnitte mit einer Kombination aus Antikollagen-Antikörper und Antidesmin-Antikörper markiert. Der Grünpixelgehalt digitalisierter Bilder (Kollagenmarkierung) relativ zur gesamten Gewebefläche wurde unter Verwendung des Adobe Photoshop 7.0 Softwarepakets, wie zuvor beschrieben, gezählt. 7

Statistische Analyse

Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben (außer bei den Zahlen, die Mittelwert ± SEM zeigen), sofern nicht anders angegeben. ANOVA mit wiederholten Messungen, gegebenenfalls mit Huynh-Feldt-Korrektur, wurde durchgeführt, um die Wirkung der steigenden Dosen von Rotigaptid in jeder Gruppe zu bewerten. Der gruppeninterne Effekt wurde mit der Methode der geschätzten marginalen Mittelwerte mit der Bonferroni-Korrektur für Mehrfachvergleiche berechnet. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer 1-Weg-ANOVA durchgeführt. Sobald der statistische Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt wurde, wurden die Unterschiede zwischen den Gruppen mit dem Scheffé-Test getestet. Für die Vulnerabilität des Vorhofflimmerns wurden nichtparametrische Tests verwendet: der Friedman-Test, um die Wirkung steigender Konzentrationen von Rotigaptid auf jede Gruppe zu bewerten, und der Kruskal-Wallis-Test h Testen Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen bei jeder Dosis. Statistische Signifikanz wurde definiert als P<0.05.

Die Autoren hatten vollen Zugriff auf die Daten und übernehmen die volle Verantwortung für deren Integrität. Alle Autoren haben das Manuskript wie geschrieben gelesen und stimmen ihm zu.

Ergebnisse

Alle Tiere befanden sich zu Beginn der letzten Follow-up-Studie im normalen Sinusrhythmus. Zwei HF-Hunde starben während der Narkoseeinleitung zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung vor der Verabreichung von Rotigaptid und dem Beginn jeglicher EP-Datenmessungen aufgrund hämodynamischer Instabilität. Alle anderen Tiere waren während des gesamten Verfahrens hämodynamisch stabil mit normaler Sauerstoff-Blutsättigung. Die Zentraltemperatur wurde bei 35 °C stabil gehalten. Die Herzfrequenz stieg unter Rotigaptid (nicht dosisabhängig) in allen Gruppen leicht an, ohne signifikante Veränderungen des Blutdrucks in jeder Gruppe oder bei jeder Dosis (siehe Tabelle).

Hämodynamische Parameter für jede Gruppe bei jeder Rotigaptid-Dosis während der Nachuntersuchung

Atriale Refraktärität

Die durchschnittliche ERP für den linken und rechten Vorhof ist für jede Dosis Rotigaptid bei den 3 getesteten BCLs in Abbildung 1 aufgetragen. In der LA der Kontrolltiere führte die Verabreichung von Rotigaptid zu einer geringfügigen Verkürzung der ERP von 105 ± 1 auf 98 ± 2 ms bei 200 ms BCL (P=0,093), von 113±1 bis 102±2 ms bei 300 ms BCL (P<0,001) und von 115±2 bis 101±2 ms bei 400 ms BCL (P= 0,012). Ein ähnliches Muster wurde bei HF-Hunden beobachtet, mit einer Abnahme der ERP von 111 ± 5 auf 106 ± 4 ms bei 200 ms BCL (P=0,02), von 118±4 bis 106±4 ms bei 300 ms BCL (P<0,001) und von 120±5 bis 105±6 ms bei 400 ms BCL (P<0,001). Das Ansprechen der MR-Gruppe war ähnlich, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz. Der Grad der Verkürzung des ERP war für alle 3 Gruppen bei jeder Dosis und BCL gleich. Im Gegensatz dazu änderte sich die RA-ERP bei keiner Gruppe mit der Verabreichung von Rotigaptid.

Abbildung 1. Wirkung steigender Konzentrationen von Rotigaptid auf die atriale Refraktärität in Studien am offenen Brustkorb. Durchschnittliches ERP für jede Gruppe und getriebenen BCL. Con zeigt Kontrolle an. Con, n=7 MR, n=7 HF, n=5 Daten sind Mittelwerte ± SEM. *,**Signifikante Reduktion des ERP mit steigender Konzentration von Rotigaptid. *P<0,001 **P<0.05.

Die Verabreichung von Rotigaptid hatte keinen Einfluss auf die Geschwindigkeitsadaptivität des ERP, das in jeder Gruppe und bei jeder Dosis von Rotigaptid erhalten blieb, wie in Abbildung 1 zu sehen ist.

Die Streuung der Repolarisation wurde als Variationskoeffizient (COV) des ERP (SD/Mittelwert) quantifiziert. Zu Studienbeginn gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den Modellen, wobei die MR- und HF-Gruppen einen höheren COV von ERPs aufwiesen als die Kontrollgruppe in der LA. Obwohl die Kontrollgruppe immer noch einen niedrigeren COV von ERPs mit Rotigaptid aufwies, war der Unterschied zwischen den anderen Gruppen bei jeder Dosis nicht signifikant (Abbildung 2).

Figur 2. Wirkung steigender Konzentrationen von Rotigaptid auf die Dispersion der Repolarisation, ausgedrückt als Variationskoeffizient des ERP (C.o.V. ERP) für jeden getriebenen BCL. Die Daten sind Mittelwert ± SEM. #Erheblicher Unterschied von MR-Hunden im Vergleich zu Kontrollhunden (P<0.04).

Vorhofleitungsgeschwindigkeit

Zu Studienbeginn (vor Rotigaptid) war der CV zwischen den Gruppen bei keiner stimulierten Zykluslänge statistisch unterschiedlich (Abbildung 3). Allerdings war die CV in den MR- und HF-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe tendenziell langsamer.

Figur 3. Atriale CV als Funktion der Rotigaptid-Konzentration bei jedem getriebenen BCL in LA und RA. In jedem Panel: oben, absolute Leitungsgeschwindigkeit in mm/s unten, Prozentsatz der Änderung der Leitungsgeschwindigkeit in Bezug auf die Grundlinie für jede Gruppe. Die Daten sind Mittelwert ± SEM. *Signifikanter Anstieg der Leitungsgeschwindigkeit mit steigenden Konzentrationen von Rotigaptid (P<0.01) #signifikanter Unterschied von HF-Hunden im Vergleich zu Kontrollhunden und zu MR-Hunden (P<0.02) ##signifikanter Unterschied von HF-Hunden im Vergleich zu MR-Hunden (P<0.03).

In der Kontrollgruppe erhöhte sich die CV in der LA im Vergleich zum Ausgangswert signifikant um 28 ± 3 % bei einem 200-ms-BCL, 24 ± 5 ​​% bei einem 300-ms-BCL und 24 ± 7 % bei einem 400-ms-BCL mit die Verabreichung von Rotigaptid (P= 0,001, <0,001 und 0,015 bei 200-, 300- bzw. 400-ms-BCLs) (Abbildung 3). Bei der RA stieg die CV auch unter Rotigaptid um 25 ± 7 % bei einer BCL von 200 ms, 19 ± 9 % bei einer BCL von 300 ms und 15 ± 7 % bei einer BCL von 400 ms (P= 0,007, <0,001 und 0,121 bei 200-, 300- bzw. 400-ms-BCLs).

Die Leitungsgeschwindigkeit in der MR-Gruppe erhöhte sich auch im Vergleich zum Ausgangswert mit Rotigaptid in der LA um 35 ± 7 % bei 200 ms BCL, 38 ± 6 % bei 300 ms BCL und 31 ± 6 % bei 400 ms BCL (P<0,001, <0,001 und <0,001). In ähnlicher Weise stieg die CV bei der RA um 18 ± 4 % bei einem BCL von 200 ms, 18 ± 3 % bei einem BCL von 300 ms und 21 ± 5 % bei einem BCL von 400 ms (P<0,001, <0,001 und 0,006), wenn auch in geringerem Maße als in LA.

In der HF-Gruppe stieg die CV mit Rotigaptid in der LA nicht an und hatte nur eine mäßige Zunahme der RA mit einer Zunahme von 17 ± 5 % bei einer 300-ms-BCL und 20 ± 8 % bei einer 400-ms-BCL (P=0,001 und P= 0,055 bzw.). Dieser Anstieg war signifikant geringer als der der Kontroll- und MR-Gruppen. Als Ergebnis war LA CV in der HF-Gruppe bei der maximalen Rotigaptid-Dosis bei allen stimulierten Zykluslängen signifikant langsamer als in der Kontroll- oder MR-Gruppe (P=0,003, 0,005 und 0,015 bei 200-, 300- bzw. 400-ms-BCLs).

Phasenkarten wurden erstellt, um die Heterogenität der Leitungsgeschwindigkeiten zu messen. Der absolute Grad der Heterogenität ist in Abbildung 4 dargestellt. Zu Studienbeginn war die CV in der Kontrollgruppe weniger heterogen (0,38 ± 0,05 cm/s für LA, 0,88 ± 0,05 cm/s für RA) im Vergleich zur MR (0,66 ± .). 0,14 cm/s für LA, 1,05 ± 0,09 cm/s für RA) und HF (0,66 ± 0,06 für LA, 1,11 ± 0,12 für RA) in beiden Vorhöfen bei 200 ms BCL. Ähnliche Befunde waren bei 300- und 400-ms-BCLs vorhanden. In LA änderte sich die CV-Heterogenität mit Rotigaptid in der Kontrollgruppe nicht wesentlich. In der HF-Gruppe gab es nur eine geringe Abnahme von P95-P5 bei 300 ms BCL (P= 0,017) alle anderen BCLs zeigten keine Veränderung von P95–P5 mit Rotigaptid. Die MR-Gruppe hatte die größte Abnahme von P95-P5 und erreichte eine statistische Signifikanz bei 300- und 400-ms-BCLs (P=0,006 und P= 0,048 bzw.). Daher gab es bei 50 nmol/l Rotigaptid bei keinem stimulierten BCL einen Unterschied in LA P95–P5 zwischen der MR- und der Kontrollgruppe. In keiner Gruppe der RA wurden signifikante Veränderungen der CV-Heterogenität beobachtet.

Figur 4. Leitungsheterogenität. Absolute Phasenheterogenität (P95–P5) als Funktion der Rotigaptid-Konzentration für jedes untersuchte getriebene BCL in LA und RA. Die Daten sind Mittelwert ± SEM. *Erhebliche Abnahme der Leitungsheterogenität mit steigenden Konzentrationen von Rotigaptid (P<0.05) #signifikanter Unterschied der Kontrollgruppe im Vergleich zu den MR- und HF-Gruppen (P<0.01) ##signifikanter Unterschied der Kontrollgruppe im Vergleich zur HF-Gruppe (P<0.04).

Anfälligkeit für Vorhofflimmern

Die Anfälligkeit für Vorhofflimmern wurde auf der Grundlage der längsten induzierten Vorhofflimmerepisode gemessen. Abbildung 5 zeigt die durchschnittlich längste induzierte AF-Episode für jede Gruppe und Dosis. Wie erwartet, wurden in der Kontrollgruppe zu Studienbeginn nur kurze Episoden von VHF induziert. In der Kontrollgruppe gab es bei keiner Konzentration von Rotigaptid eine Veränderung der Vulnerabilität. Somit konnte keine AF-Proarrhythmie bei Verwendung der Verbindung in irgendeiner Dosis nachgewiesen werden.Wie bereits berichtet, 6,7 gab es bei den MR- und HF-Modellen im Ausgangszustand (Kontrolle: 16 ± 25 Sekunden MR: 786 ± 764 Sekunden HF: 883 ± 684 Sekunden) eine Zunahme der Vulnerabilität des Vorhofflimmerns P= 0,013). Es gab keinen Unterschied in der Vulnerabilität des Vorhofflimmerns im Ausgangszustand (Prädrug) zwischen den MR- und HF-Gruppen. Bei einer Rotigaptid-Dosierung von 10 nmol/l wurde in keiner Gruppe eine Wirkung auf die Vulnerabilität von VHF beobachtet. Bei 50 nmol/l war die Vulnerabilität des Vorhofflimmerns bei den MR-Hunden jedoch signifikant reduziert (Kontrolle: 9 ± 11 Sekunden MR: 14 ± 16 Sekunden HF: 1622 ± 355 Sekunden) auf ähnliche Werte wie bei den Kontrolltieren und nicht anhaltend AF-Episoden wurden beobachtet. In dieser Gruppe kam es zu einer 96 ± 1 %igen Verkürzung der AF-Dauer (P<0,001). In der MR-Gruppe nahm bei einer Dosierung von 200 nmol/l Rotigaptid die Vulnerabilität des Vorhofflimmerns im Vergleich zu 50 nmol/l (447 ± 538 Sekunden) zu. In der HF-Gruppe beeinflusste keine der Rotigaptid-Dosen die Vulnerabilität des VHF signifikant.

Abbildung 5. Wirkung steigender Konzentrationen von Rotigaptid auf die Vulnerabilität von VHF in der Kontrollgruppe, der Gruppe mit chronischer MR und HF, ausgedrückt als durchschnittliche Dauer der längsten induzierten VHF-Episoden. Die Daten sind Mittelwert ± SEM. #Erheblicher Unterschied zwischen den Gruppen bei jeder Dosis (P<0,05) *signifikante Verkürzung der AF-Dauer über die Dosierungen für die MR-Gruppe im Vergleich zu früheren Dosen (P<0,001).

LV-Stimulation

Begrenzte Studien im linken Ventrikel wurden durchgeführt, um festzustellen, ob eine signifikante ventrikuläre Proarrhythmie vorlag. Beim 300-ms-BCL änderten sich die LV-ERPs mit Rotigaptid in keiner der Gruppen (Kontrolle: 172±10, 170±6, 170±9 und 169±5 ms MR: 164±8, 163±7, 167 ±8 und 165±13 ms HF: 182±12, 182±13, 176±12 und 173±11 ms für Basislinie, 10, 50 bzw. 200 nmol/l). Die gleichen Befunde waren bei den 250- und 350-ms-BCLs vorhanden.

Die ventrikuläre programmierte Stimulation induzierte in der Kontroll- und MR-Gruppe keine ventrikulären Arrhythmien. Im Gegensatz dazu wurde bei einem der HF-Hunde eine anhaltende monomorphe ventrikuläre Tachykardie mit einer Zykluslänge von 200 ms mit einem 300 ms BCL und 2 Extrastimuli induziert, was eine ventrikuläre Burst-Stimulation zur Beendigung erforderte.

Plasmaspiegel der Verbindung

Plasmaproben wurden bei jedem Dosisniveau bei jedem Tier entnommen. Die Plasmakonzentrationen für jede Dosierung waren wie folgt: Ausgangswert, <1 ng/ml niedrig, 5,6±6,0 nmol/l mittel, 56,2±10,3 nmol/l und hoch, 181,4±39,6 nmol/l – nahe den Zielkonzentrationen von 10, 50 , und 200 nmol/l.

Histologie und Immunhistochemie-Studien

Transmurale Gewebeschnitte aus der RA und LA wurden mit Hämatoxylin und Eosin, Siriusrot oder Massons Trichrom-Färbung gefärbt, um die Gewebestruktur und die Verteilung des Fasergewebes in den 3 Gruppen zu vergleichen. Die Schnitte wurden auch zur Quantifizierung der Fibrose immunmarkiert (Abbildung 6). Beide Vorhöfe der Kontrollgruppe zeigten eine normale histologische Struktur. LA-Schnitte von MR-Hunden wiesen eine leichte Zunahme der Fasertrennung mit etwas entzündlicher Infiltration auf. Die Morphologie der Myozyten war jedoch der der Kontrollhunde ähnlich, ohne Anzeichen einer zellulären Nekrose. Die RA-Schnitte der MR-Gruppe zeigten keinen Unterschied im Vergleich zur RA der Kontrollhunde. In der LA der HF-Gruppe lag eine ausgeprägte interstitielle Fibrose vor. Diese histologischen Veränderungen wurden auch bei der RA beobachtet, obwohl sie weniger auffällig waren. Die Quantifizierung der Fibrose zeigte einen signifikanten Anstieg der prozentualen LA-Fibrose bei HF-Hunden im Vergleich zu den Kontroll- und MR-Modellen (7,7 ± 1,1%, 8,0 ± 2,8% bzw. 24,6 ± 5,9% für die Kontroll-, MR- und HF-Gruppen). P<0,001).

Abbildung 6. Gewebestruktur in Kontroll-, MR- und HF-linken Vorhöfen. Erste Spalte: Sirius-Rotfärbung mittlere Spalte: Antikollagen (grün) und Antidesmin (rot) Immunfluoreszenz letzte Spalte: Antikollagen (grün) und Anti-Cx43 (rot) Immunfluoreszenz (repräsentative Bilder bei 400-facher Vergrößerung). In der HF-Gruppe ist die Fibrose im Vergleich zu Kontrolltieren oder MR-Tieren prominent.

Die räumliche Verteilung von immunmarkiertem Cx43 und Cx40 in den Vorhöfen von Kontroll-, MR- und HF-Hunden ( 7A ) schien sich zwischen den Modellen nicht merklich zu unterscheiden. Mit dem kontraktilen Apparat, der unter Verwendung von Anti-Desmin-Antikörper sichtbar gemacht wurde, waren sowohl Cx40 als auch Cx43 überwiegend an einer End-zu-End-Verbindung zwischen Myozyten vorhanden, jedoch in geringerem Maße an einer Seite-zu-Seite-Verbindung. Dies war bei allen Modellen ähnlich. Cx40 und Cx43 wurden in interkalierten Scheiben kolokalisiert (Abbildung 7B).

Abbildung 7. Connexin-Expression im linken Vorhof von Kontrollhunden, MR-Hunden und HF-Hunden. A, Anti-Cx40 (grün) und Antidesmin (rot) Immunfluoreszenz und Anti-Cx43 (grün) und Antidesmin (rot) Immunfluoreszenz (rot). B, Anti-Cx40 (grün) und Anti-Cx43 (rot) Immunfluoreszenz (repräsentative Bilder bei 400-facher Vergrößerung). Beide Connexine kolokalisierten und die Menge und räumliche Verteilung der Gap-Junction-Proteine ​​schienen sich zwischen den Gruppen nicht merklich zu unterscheiden.

Diskussion

Die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie sind, dass Rotigaptid die Vulnerabilität von Vorhofflimmern in einem Hundemodell der MR verringert, jedoch nicht bei HF. Die Verbindung erhöhte gleichzeitig den CV und verringerte die Leitungsheterogenität im LA der MR-Hunde. Die CV-Änderung in der HF-Gruppe war minimal.

Wir haben zuvor gezeigt, dass im MR-Modell des Hundes eine erhöhte Vulnerabilität des Vorhofflimmerns mit richtungsabhängigen atrialen Überleitungsstörungen mit verringerter räumlich-zeitlicher Organisation des Vorhofflimmerns verbunden ist. 3,7,22 Andererseits haben Li et al. 6,23 gezeigt, dass experimentelle HF Vorhofflimmern fördert, was Veränderungen der atrialen Ionenströme und ausgedehnte interstitielle Fibrose verursacht, die die lokale Reizleitung stört. Eine nachfolgende Studie zeigte, dass sich die ionischen Veränderungen nach der Erholung von experimenteller HF umkehren, aber Leitungsanomalien und AF-Anfälligkeit bleiben. 24 Histologische Studien und die Quantifizierung von Gewebestrukturveränderungen in diesen Hundemodellen wurden bereits veröffentlicht. 9,10 In Übereinstimmung mit früheren Studien zeigt die vorliegende Studie im MR-Modell nur eine minimale Zunahme der interstitiellen Fibrose gegenüber den Kontrolltieren, im HF-Modell jedoch eine deutliche Fibrose.

Chronisches VHF wurde beim Menschen und in Tiermodellen von VHF mit einer Störung der Verteilung und/oder Veränderung der Expression von Connexin 40- und/oder Connexin 43-Gap-Junction-Proteinen in Verbindung gebracht. 10,25–28 Allerdings wurden nur begrenzte Studien zu Situationen durchgeführt, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für VHF verbunden sind, 21,29 mit unterschiedlichen Ergebnissen. Es ist nicht bekannt, ob eine Beeinträchtigung der Anzahl oder Funktion von Gap Junctions eine Rolle als Substrat spielt, das für AF prädisponiert. Wir zeigen keine offensichtlichen Veränderungen in der Verteilung oder Menge von Connexinen zwischen diesen Modellen. Da eine gestörte Reizleitung ein Hauptmerkmal der MR- und HF-Modelle ist, deuten unsere Daten darauf hin, dass diese Veränderungen in der HF-Gruppe auf Fibrose zurückzuführen sind, aber in der MR-Gruppe funktioneller sein können, da Rotigaptid die Leitung und die VHF-Anfälligkeit in der MR-Gruppe verbessert. aber nicht in der HF-Gruppe.

Von Rotigaptid wurde zuvor gezeigt, dass es die Leitfähigkeit der Gap-Junction erhöht, ohne die Membranströme zu beeinflussen. 11,14 Es wird angenommen, dass dieser Effekt der Mechanismus ist, der für die Verhinderung von reentry ventrikulären Tachykardien während einer akuten Ischämie 11 und einer durch Azidose induzierten ventrikulären Überleitungsverlangsamung bei Hunden verantwortlich ist. 12 Haugan et al. 13 haben gezeigt, dass Rotigaptid eine Verlangsamung der atrialen Überleitung verhindert und die CV bei einer Dosis von 100 nmol/l während metabolischem Stress bei isolierten normalen LA von Ratten erhöht. Diese Wirkungen werden offensichtlich auch durch eine selektive Wirkung auf die interzelluläre Gap Junction-Kommunikation ohne Wirkung auf bis zu 80 zelluläre Rezeptoren und Ionenkanäle vermittelt. 13 Eine kürzlich erschienene Veröffentlichung 30, die die Wirkungen von Rotigaptid auf verschiedene Isoformen von Connexin untersucht, zeigt, dass Rotigaptid gegenüber Cx43 selektiv ist. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass die Verstärkung der Gap Junctional-Kommunikation wahrscheinlich auf einem indirekten Weg ausgelöst wird, da Rotigaptid das Gesamtniveau der Cx43-Expression nicht veränderte und Veränderungen des Phosphorylierungsstatus des Proteins nicht beobachtet wurden. Unsere Studie ist die erste, die die In-vivo-Wirkung von Rotigaptid in normalen und umgebauten Hundevorhöfen und seine Fähigkeit, AF in diesen Tiermodellen zu verhindern, untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen einen Effekt auf die Verbesserung des CV auch in normalen Vorhöfen unter physiologischen Bedingungen. Dieser Unterschied, der in normalen Vorhöfen im Vergleich zu einem normalen Ventrikel (bei dem kein kardiovaskulärer Effekt mit Rotigaptid beobachtet wird) beobachtet wird, kann auf die ausgeprägte ungleichmäßige Anisotropie im normalen Vorhof und die ungleichmäßige Verteilung von Connexin im Vorhof (im Vergleich zum Ventrikel) zurückzuführen sein. . 31,32

Obwohl Rotigaptid auch die Leitung in den Vorhöfen des MR-Modells verbesserte, wurde kein Effekt im HF-Modell beobachtet. Dies unterstützt weiter die Idee einer anderen Art der Umgestaltung und damit des elektrischen Substrats in diesen beiden Modellen. 3,6,7,23 Interstitielle Fibrose tritt im HF-Modell tendenziell stärker auf. Dies führt wahrscheinlich zu einer tieferen und festeren Entkopplung der Zellen, und daher hat eine mäßige Erhöhung der Gap-Junction-Leitfähigkeit mit Rotigaptid möglicherweise keine bedeutende Wirkung auf die Leitung. Dies kann die fehlende Wirkung der Verbindung in der HF-Gruppe erklären. Wir haben zuvor gezeigt, dass das MR-Modell weniger Fibrose aufweist und dass Leitungsheterogenität und erhöhte Anisotropie funktioneller zu sein scheinen. 3 Dies wird in der vorliegenden Studie bestätigt, wobei die Histologie und Immunhistochemie signifikant mehr Kollagen-Immunmarkierung in der HF-Gruppe zeigt. Frühere Studien an Mensch und Tier 25 haben eine Umverteilung von Connexinen in beiden Modellen des chronischen Remodellings gezeigt, obwohl diese Veränderungen nicht in allen Studien konsistent sind. 26,28 Bisher konzentrierten sich Studien zu Gap Junctions bei VHF eher auf die Menge oder Verteilung von Connexinen als auf die Funktionalität. Unsere Daten stützen ferner das Vorhandensein einer schwerwiegenderen anatomischen Störung im HF-Modell als Substrat, das für das Vorhofflimmern verantwortlich ist, im Gegensatz zum MR-Modell, bei dem die Veränderungen wahrscheinlich funktioneller sind.

Unsere Ergebnisse zeigen eine konsistente Wirkung von Rotigaptid auf atriale ERPs bei allen getesteten BCLs und in allen Modellen. ERPs verkürzten sich in LA in allen Gruppen auf ähnliche Weise. In Übereinstimmung mit früheren Studien veränderte Rotigaptid die ventrikulären ERPs nicht. 12,16 Wie Rotigaptid ERPs beeinflusst und warum die Wirkung auf das Atrium beschränkt ist, ist nicht gut verstanden. Einzelzellstudien zeigten keine Wirkung von Rotigaptid auf die Dauer oder die Eigenschaften des Aktionspotentials 12,13 und keine Bindung der Verbindung an Ionenkanäle. 13 Die Stimulationsreizschwellen blieben während der Studie konstant und wurden durch Rotigaptid nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Es ist interessant zu spekulieren, dass eine Erhöhung der Gap-Junction-Leitfähigkeit die elektrotonischen Wechselwirkungen verstärkt, und da die Heterogenität der Aktionspotentialdauer im Vorhof größer ist als im Ventrikel, kann dies die ERP im Vorhof stärker beeinflussen als im Ventrikel oder in isolierten Zellen. Eine alternative Erklärung ist, dass in Gewebe mit heterogenerer Überleitung an der Basislinie (dh Atrium im Vergleich zum Ventrikel) eine zunehmende Kopplung den Sicherheitsfaktor für die Ausbreitung verbessern kann, was zu kürzeren gemessenen ERPs führt, ohne die Aktionspotentialdauer zu beeinträchtigen. Interessanterweise beobachteten wir einen unterschiedlichen Effekt von Rotigaptid zwischen LA und RA. Dieser unterschiedliche Effekt war sowohl in der Kontrollgruppe als auch in den MR- und HF-Gruppen vorhanden. Dieser Befund legt nahe, dass die unterschiedliche Wirkung von Rotigaptid auf LA- und RA-ERPs mit den intrinsischen strukturellen Eigenschaften jedes Vorhofs zusammenhängt, möglicherweise als Ergebnis der einzigartigen Anatomie der RA-Trabekeln. Da die ERPs hauptsächlich an der freien Wand von RA (trabekulierte Abschnitte) gemessen wurden, beeinflusst die Verbesserung der Kopplung das ERP möglicherweise nicht so stark wie in der LA, wo es keine Trabekulationen gibt, und somit hat eine Verbesserung der Gap Junction-Leitfähigkeit wahrscheinlich einen größeren Einfluss auf die ERP. Ein weiterer Beweis dafür ist die Tatsache, dass die CV in der RA mit Rotigaptid zwar anstieg, der Effekt jedoch signifikant bescheidener war als in der LA.

Obwohl Rotigaptid zu einer ERP-Verkürzung führte, beobachteten wir keine Proarrhythmie. Dies wurde durch keine signifikante Änderung der AF-Dauer oder der Leichtigkeit der Induzierbarkeit angezeigt. Wijffels et al. 5 haben in einem früheren Bericht über das schnelle atriale Stimulationsmodell gezeigt, dass eine ERP-Verkürzung einen direkten Einfluss auf die AF-Induzierbarkeit hat. Wijffels et al. zeigten diesen Effekt mit einer durchschnittlichen Verringerung der ERPs von 35 %. Bei gleichem BCL betrug die durchschnittliche Reduktion der ERPs in den 3 Gruppen der vorliegenden Studie nur 10 %. Insbesondere im Wijffels-Artikel und in nachfolgenden Studien dieser Gruppe blieb die Entwicklung von anhaltendem VHF hinter dem Rückgang des ERP zurück, was darauf hindeutet, dass neben ERP noch ein weiterer „Faktor“ zur VHF-Schwachstelle beiträgt. Andererseits verhindert eine Verbesserung der Leitung und Leitungsheterogenität wahrscheinlich eine fibrillatorische Leitung, Wellenbrüche und möglicherweise eine Rotorverankerung, wodurch die Anfälligkeit für Arrhythmien verringert wird. 33

Die Induzierbarkeit von Vorhofflimmern zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Gruppen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten war die Induzierbarkeit von 7,23 AF zu Studienbeginn in den MR- und HF-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Noch wichtiger ist, dass Rotigaptid in der HF-Gruppe nicht in der Lage war, die Vulnerabilität von Vorhofflimmern zu reduzieren, während die Induzierbarkeit von Vorhofflimmern bei den MR-Hunden bei einer Dosis von 50 nmol/l der Verbindung signifikant auf das Niveau der Kontrollhunde reduziert wurde. Bei der höchsten Dosis nahm die Vulnerabilität in dieser Gruppe wieder zu. Über eine glockenförmige Dosis-Wirkung von Rotigaptid wurde bereits berichtet, 13,20 und ihr Mechanismus ist nicht bekannt.

Einschränkungen

Die Studie vergleicht die Wirkungen von Rotigaptid bei normalen Hunden und in 2 verschiedenen Modellen der Vorhoferweiterung. Ob die Veränderungen der atrialen Elektrophysiologie, die in anderen Modellen wie atriale Tachykardie oder vagales VHF auftreten, und damit die Vulnerabilität des VHF durch Rotigaptid beeinflusst werden, ist nicht bekannt und stand nicht im Fokus dieser Studie. Es wurde nur die akute Wirkung der Verbindung getestet. Die Halbwertszeit von Rotigaptid ist sehr kurz und es liegen keine Daten zur chronischen Anwendung vor.

Eine weitere potenzielle Einschränkung besteht darin, dass die Studie an Tieren durchgeführt wurde, die mit Isofluran anästhesiert wurden, einer Verbindung, die bekanntermaßen ein partieller Gap Junction-Entkoppler ist. 34 Die Tatsache, dass Rotigaptid in der RA eines jeden Modells im Vergleich zur LA oder in einem der Vorhöfe der HF-Gruppe in der RA wenig oder gar keine Wirkung zu haben schien, deutet jedoch darauf hin, dass die potenzielle Wechselwirkung zwischen Isofluran und Rotigaptid, wenn überhaupt, nur gering war . Darüber hinaus wurde die Isofluran-Dosis im Verlauf der Studie konstant gehalten. Daher ist es unwahrscheinlich, dass Isofluran bei den Ergebnissen eine signifikante Rolle gespielt hat.

Viele der statistischen Tests erreichten keine Signifikanz, wahrscheinlich aufgrund der geringen Trennschärfe aufgrund der geringen Stichprobengröße.

Schlussfolgerungen

Die Modulation der Gap Junction mit Rotigaptid verbessert die atriale Überleitung bei normalen Hunden und im chronischen MR-Hundemodell des Vorhofflimmerns. Rotigaptid reduziert die AF-Vulnerabilität im MR-Modell auf das Niveau der Kontrolltiere, veränderte jedoch die AF-Vulnerabilität im HF-Modell nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Therapien, die auf Gap Junctions abzielen, bei einigen Formen von VHF ein wirksamer antiarrhythmischer Ansatz sein können, wenn funktionelle Reizleitungsstörungen vorliegen.

Wir danken Kathleen Connell für ihre Unterstützung bei der Durchführung der Plasmaassays zur Bestimmung der Wirkstoffkonzentration.

Finanzierungsquellen

Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute Grant RO1-HL072854 (Dr. Olgin) unterstützt.

Offenlegung

Fußnoten


C. Die reifen Fasern

Der Übergang von DF zu MF ist im Mikroskop nicht sichtbar, markiert jedoch tiefgreifende Veränderungen der Faserzelleigenschaften. Zu diesen Veränderungen zählen der Verlust aller Organellen (17), die Spaltung der COOH-Termini der Fiber-Cell-Gap-Junction-Proteine ​​Cx46 und Cx50 (96, 103), die Insertion von Lim2 (MP20) in die Plasmamembran (82), der Abbau bestimmter Membran Transportproteine ​​und Insertion anderer in die Plasmamembran (Übersicht in Lit. 130) und wahrscheinlich viele andere subtilere Veränderungen. Diese Veränderungen treten abrupt in nur wenigen Zellschichten auf, die sich 15 % der Entfernung in eine Linse befinden (96).

Wie im Abschnitt über DF beschrieben, sind die meisten O2 das Eindringen in die Linse wird von Mitochondrien verbraucht, die Zeitkonstante für O2 Der Verbrauch ist in MF und DF tatsächlich ungefähr gleich (139), obwohl dem MF Mitochondrien fehlen. Wenn die mitochondriale Atmung blockiert war, hörte der DF im Wesentlichen auf, O . zu verbrauchen2, aber der MF-Verbrauch verursachte immer noch einen steilen Gradienten zwischen der Oberfläche und der Mitte der Linse. Die Autoren testeten die Aktivität mehrerer nichtmitochondrialer O2 Verbraucher und konnten alle getesteten Stoffe außer Ascorbat ausschließen, das im Linsenkern kaum nennenswert abgebaut werden konnte. Sie blieben mit der Standardspekulation, dass Ascorbat, von dem bekannt ist, dass es in signifikanten Konzentrationen im Kern vorhanden ist, der beste Kandidat für MF O . sei2 Verbrauch.

1. Ionenkanäle

Die Ionenselektivität des MF scheint die gleiche zu sein wie die des DF: Es gibt eine geringe oder keine K + -Leitfähigkeit Es gibt eine kleine Na + -Leitfähigkeit, die auf nichtselektive Kationenkanäle zurückzuführen sein kann (166) und eine kleine Cl − Leitfähigkeit (132). Es gibt keine Informationen über die molekulare Basis der Kanäle und keine Möglichkeit, den MF zu isolieren, daher stammen die Daten aus Impedanzstudien intakter Linsen.

2. Gap Junctions

Die Kopplungsleitfähigkeit des Spaltübergangs der MF scheint ziemlich gleichförmig zu sein, im Gegensatz zu der der DF, die von den Polen zum Äquator dramatisch variiert (9, 133). Der Wert der Kopplungsleitfähigkeit im MF beträgt ∼ 0,5 S/cm 2 oder etwa die Hälfte des Durchschnittswertes im DF. Am Übergang von DF zu MF wird der COOH-Terminus von Cx46 und Cx50 durch Aktivierung von Calpain, einer Calcium-abhängigen Protease (118), gespalten. Dies ist die einzige bekannte posttranslationale Modifikation, die für die dramatischen Veränderungen der Kopplungseigenschaften verantwortlich sein könnte.

Gap Junctions im MF fehlen die im DF vorhandene Regulation, da sie bei Ansäuerung des Zytoplasmas nicht geschlossen werden (9, 134, 144, 176). Das Zytoplasma von zentralem MF ist normalerweise sauer (18, 134), was den Verlust der pH-Empfindlichkeit erklären könnte. In der MF kann die fehlende pH-Sensitivität der Gap Junction-Kanäle auch durch die Calpain-vermittelte Spaltung der COOH-Termini von Cx46 und Cx50 am Übergang von DF zu MF erklärt werden.

3. Wasserkanäle

AQP0 ist der wichtigste Wasserkanal der Faserzellen und wird in den Membranen aller Faserzellen einschließlich MF exprimiert. Es wird nicht, wie für die Connexine beschrieben, am Übergang von DF zu MF abrupt gespalten, sondern sein COOH-Terminus altersabhängig (tiefenabhängig) gespalten (10). Die Spaltung des COOH-Terminus an sich verringerte nicht seine Wasserdurchlässigkeit (11), aber gespaltenes AQPO bildete quadratische Zell-Zell-Verbindungen. In doppelschichtigen, zweidimensionalen Kristallen von AQP0 waren die Wasserkanäle von AQP0 ausgerichtet, aber geschlossen (75, 76).Elektronenmikroskopische Bilder der quadratischen Array-Übergänge zeigten jedoch die Wasserkanäle in einer versetzten Konfiguration, wobei das AQP0-Tetramer in einer Membran an die partikelfrei angrenzende Membran angrenzte und nicht Pore an Pore ausgerichtet war (121, 233). In beiden Systemen wurden die isolierten Verbindungen einer signifikanten biochemischen Verarbeitung unterzogen, bevor sie abgebildet werden konnten, so dass die tatsächliche Struktur der quadratischen Array-Übergänge noch eine offene Frage ist. Dennoch scheint AQP0 im MF zwei Funktionen zu haben: eine als transmembraner Wasserkanal und eine bei der Zell-zu-Zell-Adhäsion.

Es gibt einige Berichte über das Vorhandensein von AQP5 in den Faserzellmembranen (155, 207). Knockout von AQP0 reduzierte die Wasserdurchlässigkeit der Faserzellmembranen von ∼35 auf 8 μm/s, aber die Lipidmatrix der Faserzellmembranen hatte eine signifikant niedrigere Wasserdurchlässigkeit von ∼1 μm/s (196). Somit lag eine ungeklärte Wasserdurchlässigkeit von ∼ 7 μm/s vor, was auf das Vorhandensein von AQP5 zurückzuführen sein könnte.

4. Andere MF-Transporter

Die Glukoseaufnahme durch MF wird hauptsächlich durch den Na + -abhängigen Glukosetransporter SGLT2 vermittelt (130), obwohl es Hinweise auf eine Persistenz einiger der DF-unterstützten Glukosetransporter GLUT3 im äußeren MF gibt (141). Die Aufnahme von Cystin wird wie im DF durch Xc − vermittelt (116). Die Aufnahme von Glutamat durch MF erfolgt jedoch durch den Na + -abhängigen Transporter ASCT2 und nicht durch EAAT4/5, die von DF genutzt wurden (116). Die Na + -abhängige Aufnahme von Glycin wechselt von GLYT1 im DF zu GLYT2 im MF (115). Die Gründe für die Umstellung von E auf DF auf MF bei Transportern sind weitgehend unbekannt. Die Glucosetransporter werden jedoch in einer räumlichen Sequenz exprimiert, die ihrer bekannten Affinität für Glucose folgt, wobei der Transporter mit der höchsten Affinität, SGLT2, im Kern exprimiert wird. Da die Glukoseaufnahme aus dem extrazellulären Kompartiment im E und DF die an den MF abgegebene extrazelluläre Konzentration verringern sollte, kann der Konzentrationsabfall einen Transporter mit höherer Affinität erfordern (51). Dies kann auch ein Faktor bei der Umstellung von E auf DF auf MF in anderen Transportern sein.


Warum sind viele Anti-Malaria-Medikamente Gap-Junction-Antagonisten? - Biologie

Neurobiologie I (W3004) Schlüssel für Fragen und Antworten zur synaptischen Übertragung

1. (4 PTS) Was sind die 4 Kriterien, um eine Substanz als Neurotransmitter zu identifizieren?

SYNTHESIERT IM NEURON

IM PRÄSYNAPTISCHEN TERMINAL VORHANDEN UND IN AUSREICHENDEN MENGEN FREIGEGEBEN, UM DIE VORHERGESEHENE ANTWORT ZU ERZIELEN

EXOGENE ANWENDUNG IMIMIERT DIE WIRKUNG VON ENDOGEN FREIGESETZTEN SENDERSPEZIFISCHEN AUFNAHME- ODER ENTFERNENMECHANISMEN

2. (2 PTS) Die Proteine, die die synaptische Übertragung durch Gap Junctions an elektrischen Synapsen vermitteln, sind bekannt als CONNEXINE . Sechs dieser Proteinuntereinheiten bilden a KONNEXON . Wenn zwei dieser Proteine, eines auf der prä- und eines auf der postsynaptischen Membran, zusammenpassen, wird der resultierende Kanal als a . bezeichnet KONTAKTSTELLE .

3. (10 PTS) Einige Skalenzahlen:

A. Amplitude des Miniaturendplattenpotentials (MEPP) in mV.

B. Dichte der ACh-Rezeptoren (pro um2 an den Gipfeln des NMJ)

C. Anzahl der ACh-Moleküle in einem synaptischen Vesikel

D. Intrazelluläre Konzentration (M) freier Ca++-Ionen

e. Breite des synaptischen Spalts am NMJ, in nm

F. Einzelkanalleitfähigkeit des ACh-Rezeptors, wenn geöffnet, in pS.

g. Umkehrpotential des Endplattenstroms in mV.

h. Anzahl der Untereinheiten, die einen ACh-aktivierten Kanal bilden.

ich. Anzahl der ACh-Bindungsstellen am ACh-Rezeptor-Kanal

J. Anzahl der Untereinheitstypen, die zum ACh-Rezeptorkanal beitragen

k. Anzahl der membranüberspannenden Regionen in jeder Untereinheit des

4. (5 PTS) Unter Verwendung einer Iontophorese-Pipette wird ACh direkt auf eine neuromuskuläre Verbindung aufgetragen.

a) Welche Reaktion würden Sie in der postsynaptischen Zelle erwarten? (Zeichne den postsynaptischen Strom)

EINE EINFACHE EPSP-ZEICHNUNG WURDE BENÖTIGT. KANN NICHT ANNEHMEN, DASS ALLES GENUG GIBT, UM EIN HANDLUNGSPOTENZIAL ZU VERURSACHEN, ABER WENN BEIDE GEZEICHNET WERDEN, WAR ES OK. ENTWEDER WERDEN SPANNUNGS- UND STROMSPUREN AKZEPTIERT.

b) Welche Wirkung würden die folgenden Medikamente auf diese Reaktion haben (Zeichnen und erklären).

(TTX BLOCKIERT SPANNUNGSABHÄNGIGE NATRIUMKANÄLE, ERINNERN?) ES WIRD KEIN HANDLUNGSPOTENZIAL ERZEUGT, SONDERN EINFACH EIN EPP.

CURARE BINDET ANTAGONISTISCH AN ACH-REZEPTOREN MIT EXTREM HOHER AFFINITÄT. DAHER GIBT ES KEINE POSTSYNAPTISCHE ANTWORT. DIE ZEICHNUNG DER PSP WÄRE EINE FLACHE LINIE - NICHTS PASSIEREN.

PROSTIGIMIN BLOCKIERT ACETYLCHOLIN-ESTERASE UND ERHÖHT DAHER DIE KONZENTRATION VON ACH IN DER SYNAPSE FÜR EINE LÄNGERE ZEIT. DER EFFEKT WÄRE DARAUF, DIE AMPLITUDE DER PSP ZU VERLÄNGERN UND ZU ERHÖHEN, SO MUSS DIE ZEICHNUNG EINE LÄNGERE, GRÖSSERE REAKTION HABEN. ACH WÜRDE NUR DURCH DIFFUSSION ENTFERNT WERDEN.

(TEA BLOCKIERT KALIUMKANÄLE.) VORAUSGESETZT, DASS GENÜGEND ACh AUSGEWENDET WIRD, UM EINEN AP ZU ERZEUGEN, FOLGT DER AP DEM VERLAUF EINES NA-STROMS. WENN DER ACh NICHT AUSREICHT, UM EINEN AP ZU ERZEUGEN, WIRD DIE ANTWORT KEINE AUSWIRKUNG HABEN.

5. (4 PTS) Die Übertragung an einer anderen Synapse wird durch den zweiten Messenger-cAMP-Weg vermittelt und beinhaltet ein G-Protein. Nach Stimulation mit den entsprechenden

Transmitter wird in der postsynaptischen Zelle ein langsames EPSP produziert. Welche Auswirkungen hätte die Zugabe der folgenden Substanzen zur postsynaptischen Zelle:

a.IBMX , ein Medikament, das PDE hemmt.

b. Cholera-Toxin, eine Substanz, die Gs ADP-Ribosylieren und seine GTPase-Aktivität hemmen kann.

G-ALPHA BLEIBT AN GTP GEBUNDEN.

c.GTP g s, eine Form von GTP, die nicht hydrolysiert werden kann.

IN ALLEN 3 FÄLLEN GIBT ES EINE ERHÖHUNG DER ANTWORT (LÄNGERE ANTWORT MIT GRÖSSERER Amplitude).

d.Zugabe von Überschüssen der regulatorischen Untereinheit der PKA.

EXOGENE PKA-R HEMMT PKA-C, DAMIT WENIGER PHOSPHORYLATION AUFTRETEN, DAMIT EINE KLEINERE REAKTION AMPLITUDE IST.

7. (12 Punkte) a) Die Stimulation eines GABAergen präsynaptischen Neurons erzeugt ein IPSP, das eine Verzögerung von hat

20 ms, wird von Barbituraten nicht beeinflusst und kann durch TEA blockiert werden. Beschreiben Sie den wahrscheinlichen Signalübertragungsweg (vom Rezeptor zum Kanal).

Antwort: Diese Reaktion wird durch metabotrope GABA-Rezeptoren vermittelt. GABAB Rezeptoren ® Aktivierung von G-Proteinen ® mit oder ohne 2nd messengers (über direkte Bindung der G-beta-gamma-Untereinheit) ® Öffnung von K + Kanälen ® IPSP.

b) In einem anderen Experiment erzeugt die Stimulation eines cholinergen präsynaptischen Neurons ein EPSP mit einer Verzögerung von

50 ms, wird nicht von curare, aber von TEA blockiert. Beschreiben Sie den wahrscheinlichen Signalübertragungsweg (wieder vom Rezeptor zum Kanal) und erklären Sie, wie das EPSP produziert wird.

Antwort: Diese Reaktion wird durch metabotrope ACh-Rezeptoren vermittelt. mACh-Rezeptoren ®-Aktivierung von G-Proteinen ®-Aktivierung von PLC ®-Abbau von PIP2 ®-Hemmung von konstitutiv aktiven K + -Kanälen.

Die kontinuierliche Öffnung von K + -Kanälen hält das Membranpotential nahe EK. Neben den K + -Kanälen gibt es aber auch durchgehend offene Leckkanäle, die ein Umkehrpotential nahe 0 mV aufweisen. Wenn die K + -Kanäle inhibiert sind, fließt ein Nettoeinwärtsstrom durch die Leckkanäle, was zu einer Membrandepolarisation führt und ein EPSP erzeugt.

8.( 5 PTS) Identifizieren Sie den wahrscheinlichen Sender

A. an der Synapse einer adrenergen Zelle.

B . an der Synapse einer für Tyrosinhydroxylase positiven Zelle

C . an einer Synapse, die Cholinesterase enthält

D . an einer Synapse, wo die Aktion von Kainate nachgeahmt werden kann

e. an einer Synapse, die aufgrund einer erhöhten postsynaptischen Cl-Leitfähigkeit mit einem IPSP antwortet

9.( 2 PTS) Die funktionelle Diversität zwischen G-Proteinen ergibt sich hauptsächlich aus Unterschieden in der Alpha-, Beta- oder Gamma-Untereinheit?

10. (4 PTS) Identifizieren Sie zwei Schritte im cAMP-Weg und zwei Schritte im IP3-Weg, in denen das Signal verstärkt wird.

cAMP: Ein einzelner gebundener Rezeptor kann viele G-Proteine ​​aktivieren, Adenylcyclase kann die Produktion vieler cAMP-Moleküle katalysieren, ein einzelnes cAMP kann viele PKA-Moleküle aktivieren, ein einzelnes PKA-Molekül kann viele Zielproteine ​​phosphorylieren.

IP3: Ein einzelner gebundener Rezeptor kann viele G-Proteine ​​aktivieren, PLC kann viele IP3-Moleküle erzeugen, PKC kann viele Zielproteine ​​phosphorylieren, IP3 kann viele Ca++-Ionen freisetzen, Ca++/DAG kann PKC aktivieren.

(HINWEIS: DIE BESCHREIBUNG DES GESAMTEN WEGES IST NICHT DIE RICHTIGE ANTWORT.)

11 .( 4 PTS) Zeichnen Sie die I-V-Kurve für den NMDA-Kanal in Gegenwart und Abwesenheit von Mg++. Beschriften Sie jede Kurve deutlich und identifizieren Sie den Bereich der Spannungsabhängigkeit in den Diagrammen.

WAS SIE WISSEN MÜSSEN, IST, DASS DER KANAL VON Mg++ BEI SPANNUNGEN UNTER -40 mV BLOCKIERT WIRD. DAS UMKEHRPOTENZIAL IST 0. DER BEREICH DER SPANNUNGSABHÄNGIGKEIT IST BEI VORHANDENSEIN VON Mg++ NEGATIVE POTENZIALE. OHNE Mg++ GIBT ES KEINE SPANNUNGSABHÄNGIGKEIT.

12. (4 PTS) Entwerfen Sie ein Experiment, um den Wert des Stroms aufgrund des NMDA-Rezeptors in einer Glutamat-stimulierten Zelle zu erhalten, die sowohl AMPA als auch . enthält

MESSEN SIE DEN STROM (UNTER SPANNUNGSKLEMME) MIT NORMALER BAD-LÖSUNG UND BLOCKIEREN SIE JEDEN EMPFÄNGERTYP SELEKTIV. WENN SIE DIE AMPA-REZEPTOREN MIT CNQX BLOCKIEREN, IST DIE AKTUELLE MESSUNG NUR DURCH NMDA Rs. WENN DIE NMDA Rs MIT APV BLOCKIERT SIND, DANN "N MDA CURRENT" = "CONTROL CURRENT" - "AMPA CURRENT".

13. (4 PTS) Beschreiben Sie den Unterschied zwischen ionotropen und metabotropen Rezeptoren und geben Sie jeweils ein Beispiel.

IONOTROPISCHE REZEPTOREN BILDEN SELBST IONENKANÄLE (DAHER DER ALTERNATIVE BEGRIFF "LIGAND-GATED ION CHANNELS"), WÄHREND METABOTROPISCHE REZEPTOREN INDIREKT DURCH DIE AKTIVIERUNG VON G-PROTEINEN BEEINFLUSSEN.

BEISPIELE FÜR IONOTROPISCHE REZEPTOREN: NICOTINISCHE ACh-Rs , Glu-Rs (NMDA, AMPA/KAINATE), GABA-R, GLYCIN-R.

BEISPIELE FÜR METABOTROPISCHE Rs : MUSKARINIC ACh-Rs , BETA-ADRENERGIC- Rs , HISTAMINE- Rs , DOPAMINE- Rs .

14 .( 4 PTS) Welche anderen (nicht Gedächtnis-) Beeinträchtigungen könnten zu einer schlechten Leistung beim Morris-Wasserlabyrinth-Test führen? Nennen Sie mindestens zwei und welche Tests könnten Sie durchführen?

verwenden, um diese Möglichkeiten auszuschließen.

MOTORBESCHÄDIGUNG(EN), PROBLEME MIT DER SICHT.

15.(3 PTS) In einer ruhenden Zelle beträgt die freie Ca2+-Konzentration etwa 0,1 uM , was ist die Ca2+-Konzentration in der Nähe der offenen Ca2+-Kanäle während des Transmitters

Mehrere hundert Mikromolar, 200-300 uM.

16 .( 4 PTS) Basierend auf den Abbildungen 1a und 1b von Nowak et al. (Natur, 1984, 307: 462-465):

Warum sehen sie nur bei negativen Potenzialen eine Wirkung?

(SIEHE AUCH Q. #11) BEI NEGATIVEN POTENZIALEN WIRD DER KANAL DURCH Mg++ BLOCKIERT.

Was sagt Ihnen die Form der 500 um Mg++ I/V-Kurve über die Aktivierung dieses Kanals?

BEI RELATIV DEPOLARISIERTEN POTENZIALEN, INSBESONDERE > » -40mV, WIRD Mg++ AUSGESCHLOSSEN. DER KANAL IST IN DIESER REGION SPANNUNGSABHÄNGIG.

Welche Beweise deuten darauf hin, dass es sich um einen nicht-selektiven Kationenkanal handelt?

UMKEHRPOTENZIAL = 0, DIE I-V-KURVE DURCHGEHT DURCH (0, 0).

Worauf achten sie bei ihrer Geräuschanalyse? Was sagt ihnen das?

WAS SIE BEI ​​DER LÄRMANALYSE TATSÄCHLICH BETRACHTEN, IST DAS ÖFFNEN UND SCHLIESSEN DER KANÄLE. DIES GIBT IHNEN DIE MITTLERE OFFENE ZEIT DES KANALS.

17.( 5 PTS) Schlagen Sie in ein oder zwei Sätzen EINEN molekularen Mechanismus vor, um das Kurzzeitgedächtnis in das Langzeitgedächtnis umzuwandeln.

KONSTITUTIV AKTIVE KINASE

NMDA REZEPTOR AKTIVIERUNG UND LTP

18 .( 2 PTS) Was ist klassische Konditionierung (CC) in einem Satz?

EIN ASSOZIATIVES LERNEN ZWISCHEN EINEM US UND EINEM CS.

19 .( 3 PTS) Beschreiben Sie den Unterschied zwischen assoziativem und nicht-assoziativem Lernen und geben Sie jeweils ein Beispiel.

UNTERSCHIED: EXPLIZIT (Z. B. ERINNERUNG VON FAKTEN) VS IMPLIZITE GEDÄCHTNIS (Z. B. FAHRRAD FAHREN).

Assoziatives Lernen: PAVLOV'S DOG EXP, KLASSISCHE KONDITIONIERUNG

NICHT-Assoziatives Lernen: Sensibilisierung, Gewöhnung

20 .( 3 PTS) Im Sandou et al. Papier über die Verhaltensweisen, die durch das 5-HT1B . vermittelt werden

-Rezeptor beschreiben die Autoren die Rolle des 5-HT1B-Rezeptors bei der Fortbewegung und Aggressivität. Was ist das experimentelle Modell / System, das sie für ihre Studie verwendet haben?

MÄUSE OHNE 5-HT1B REZEPTOR (5-HT1B KNOCKOUTS).

21. (2 PTS) Elektrische synaptische Übertragung ist

22. (4 PTS) Beschreiben Sie die Struktur der Proteinkinase A und wie diese Struktur zur langfristigen Sensibilisierung beitragen kann.

PKA BESTEHT AUS 2 IDENTISCHEN REGULATORISCHEN UNTEREINHEITEN, DIE ÜBER EINE DISULFID-BINDUNG VERBUNDEN SIND, UND 2 KATALYTISCHEN UNTEREINHEITEN. JEDE DER REGULATORISCHEN UNTEREINHEITEN ENTHÄLT 2 VERBINDLICHE SEITEN FÜR CAMP. PKA GILT ALS EINLEITUNGSSCHRITT IM MECHANISMUS DER LANGFRISTIGEN SENSIBILISIERUNG: WENN CAMP AN DIE REGULATORISCHEN UNTEREINHEITEN BINDET, WERDEN DIE KATALYTISCHEN UNTEREINHEITEN FREIGESETZT UND IN DEN NUKLEUS TRANSLOZIERT, WO SIE DIE CREB-TRANSKRIPTION PHOSPHORYLIEREN. SO WIRD DIE PROTEINSYNTHESE, DIE AN DER LANGFRISTIGEN SENSIBILISIERUNG BETEILIGT WIRD, INDUZIERT.

23.( 3 PTS) Was ist Aeqorin? Beschreiben Sie kurz ein Experiment, in dem Sie Aeqorin verwenden könnten, um zu zeigen, dass das spezifische Ion, an das es bindet, mit der Freisetzung von Neurotransmittern in der Riesenkalmar-Synapse verbunden ist.

AEQORIN IST EIN CALCIUM-ABHÄNGIGES PHOTOPROTEIN MIT GERINGER EMPFINDLICHKEIT, DAS (AUF ENGLISCH) BEDEUTET, DASS ES EIN PROTEIN IST, DAS

LEUCHTET LICHT (FLUORESZEN) IN GEGENWART VON FREIEM Ca++. ES KANN DAHER ALS DIREKTER "DETEKTOR" VON Ca++ VERWENDET WERDEN.

DIE VERWENDUNG VON AEQORIN ZUM NACHWEIS VON HOHEN CALCIUMKONZENTRATIONEN IN DER GIANT SQUID SYNAPSE WIRD IN DEN LLINAS ET AL. PAPIER. AEQORIN WIRD ZUERST IN DAS PRÄSYNAPTISCHE TERMINAL DER GIANT SQUID SYNAPSE INJIZIERT. DURCH EPIFLUORESCENCE MI KROSKOPIE KÖNNEN SIE DAS TERMINAL ABBILDEN. WENN SIE DIE PRÄSYNAPTISCHE FASER STIMULIEREN, WERDEN SIE WEISSE FLECKEN SEHEN, DIE DEN QUANTEN-EMISSIONSBEREICHEN ENTSPRECHEN. WENN SIE DIE BEIDEN FLUORESZIERENDEN BILDER ÜBERLAGERN (D. H. VOR UND NACH DER STIMULATION), SEHEN SIE, DASS DIE QEDs MIT DEM PRÄSYNAPTISCHEN TERMINAL ZUSAMMENPASSEN, DAS BEDEUTET, DASS Ca++-KANÄLE ÖFFNEN UND Ca++ IN DIESEM TEIL DES SYNS FREIGEGEBEN WERDEN. STIMULATIONSMITTEL

NEUROTRANSMITTER-FREIGABE, DAHER MUSS DIES MIT DER BEOBACHTENEN ERHÖHUNG DES CALCIUM-SPIEGELS VERBUNDEN WERDEN.



Bemerkungen:

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