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5.15: Stickstofffixierung - Biologie

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5.15: Stickstofffixierung

N2 Fixierung und Radfahren in Alnus glutinosa, Betula Pendel und Fagus sylvatica Wald, der freier Luft CO . ausgesetzt ist2 Anreicherung

Wir haben die Wirkung von erhöhtem atmosphärischem CO . gemessen2 auf atmosphärischem Stickstoff (N2) Fixierung in der Baumart Alnus glutinosa Anbau in Monokultur oder in Mischung mit Nicht-N2- Baumarten fixieren Betula Pendel und Fagus sylvatica. Wir adressierten die Hypothesen, dass (1) N2 Fixierung in A. glutinosa wird als Reaktion auf erhöhtes atmosphärisches CO . zunehmen2 Konzentrationen beim Anbau in Monokultur, (2) die Auswirkung von erhöhtem CO2 auf N2 Fixierung in A. glutinosa in Mischung und in Monokultur gleich ist und (3) die Auswirkungen von erhöhtem CO2 auf den N-Zyklus wird durch eine Abnahme des Blattes δ 15 N und durch den Boden-Blatt-Anreicherungsfaktor (EF) deutlich, und dass sich diese Auswirkungen nicht zwischen Misch- und Einzelartenbeständen unterscheiden. In einer Forstplantage auf ehemaligen landwirtschaftlichen Flächen wurden vier Vegetationsperioden lang Bäume kultiviert, danach waren die Bäume im Durchschnitt 3,8 m hoch und die Baumkronen waren geschlossen. Atmosphärisches CO2 Die Konzentrationen wurden entweder bei Umgebungskonzentrationen oder erhöhten (um 200 ppm) Konzentrationen unter Verwendung einer CO .-Freiluft-2 Anreicherungssystem (FACE). Blatt δ 15 N wurde gemessen und zur Schätzung der Menge (Ndfa) und Anteil (%Ndfa) von N, abgeleitet von der atmosphärischen Fixierung. Im Durchschnitt 62 % der N in A. glutinosa Blätter war von der Fixierung. Danndfa und Ndfa zum A. glutinosa Bäume in Monokultur nahmen unter erhöhtem CO . nicht zu2, trotz höherer Wachstumsraten. Jedoch N2 Bei gemischt wachsenden Bäumen nahm die Fixierung zu, trotz des Fehlens einer signifikanten Wachstumsstimulation. Es gab Hinweise darauf, dass festes N2 wurde übertragen von A. glutinosa zu F. sylvatica und B. Pendel, aber keine Hinweise darauf, dass sich dies auf ihr CO . auswirkte2 Antwort. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass N2 Fixierung in A. glutinosa kann in Zukunft höher sein erhöhter CO2 Welt, sondern dass dieser Effekt nur dort auftritt, wo die Bäume in Mischbeständen wachsen.

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STICKSTOFF-BIOGEOCHEMIE IN DER OLIGOHALIN-ZONE EINER NEUEN ENGLAND-Mündung.

Abstrakt. Wir untersuchten den Stickstoffkreislauf in der oligohalinen Zone (der Region mit niedrigem Salzgehalt, in der Flusswasser zuerst in die Mündung eintritt) der Parker River-Mündung im Nordosten von Massachusetts. Im August 1996 führten wir einen Isotopen-Tracer ([N15]-[[NO3]-]) für 27 Tage ein, um zu bestimmen, wie sich von Wasserscheiden abgeleiteter Stickstoff durch die obere Mündung bewegt. Die zugesetzte Tracermenge war ausreichend, um Nitrat isotopisch um [tilde]100% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] in der Nähe der Zugabe anzureichern, beeinflusste jedoch die Nitratkonzentration nicht merklich. Während der typischen sommerlichen Niedrigflussbedingungen, wie sie während der Zugabeperiode auftraten, wurde im Wesentlichen das gesamte Flussnitrat (einschließlich des Nitrat-Tracers) durch die planktonische Kieselalge Actinocyclus normanii schnell aus der Wassersäule entfernt. Der Export von Tracer flussabwärts war während der Isotopenzugabezeit gering, teilweise wegen des geringen Flussabflusses. Stattdessen wurde der größte Teil des ursprünglich von A. normanii aufgenommenen Stickstoffs in Sedimente in der oligohalinen Zone überführt. Der Stickstoffbedarf des Phytoplanktons im Sommer überstieg das Angebot der Flüsse um eine Größenordnung. Der zusätzliche Stickstoff stammte hauptsächlich aus der Regeneration von benthischem Stickstoff, obwohl ein Teil aus Grundwasser stammen könnte. Der hier angewandte ökosystemare Isotopen-Tracer-Ansatz war ein wirksames Mittel, um das Schicksal von aus Wasserscheiden stammendem Stickstoff im oberen Ästuar zu untersuchen.

Schlüsselwörter: Actinocyclus normanii Diatomeen Ästuar Landrand-Ökosystem Massachusetts (USA) [N 15] Stickstoffkreislauf Oligohalinzone Phytoptankton Silica stabiles Isotop terrestrisch-aquatische Bindung.

Der Stickstoffeintrag in die Wassereinzugsgebiete im Nordosten der Vereinigten Staaten hat seit der europäischen Besiedlung Anfang des 17. Jahrhunderts stark zugenommen. Primäre Quellen des zugesetzten Stickstoffs sind atmosphärische Deposition, landwirtschaftliche Düngemittel und Abwasser (Nixon und Pilson 1983, Lee und Olsen 1985, Valiela et al. 1997). Ein Großteil dieses zusätzlichen Stickstoffs wird in der Wasserscheide zurückgehalten oder denitrifiziert, aber eine beträchtliche Menge gelangt in das Grundwasser und in Flüsse und wird schließlich in Flussmündungen und den Ozean abgegeben (Galloway et al. 1995, Howarth et al. 1996).

Der Einfluss erhöhter Stickstoffeinträge kann in Ästuaren besonders groß sein. Da aus Wassereinzugsgebieten stammende Nährstoffe zu diesen Ökosystemen transportiert und auf diese konzentriert werden, gehören Ästuare zu den am stärksten gedüngten Ökosystemen der Erde (Nixon et al. 1986, Valiela et al. 1997). Die Produktivität in Ästuaren wird oft durch Stickstoff begrenzt, so dass ein erhöhter Stickstoffeintrag das Algenwachstum stimulieren und wiederum andere Aspekte der Ökosystemfunktion beeinflussen kann (Hopkinson und Vallino 1995). Beispielsweise unterstützt eine hohe Stickstoffbelastung im Zusammenhang mit dem Frühjahrsabfluss in der Chesapeake Bay eine Phytoplanktonblüte, und die Wiederverwendung des in der Blüte zurückgehaltenen Stickstoffs führt zu einem verzögerten Produktivitätsmaximum im Sommer (Malone et al. 1988, Harding 1994). Obwohl eine erhöhte Algenproduktion aufgrund einer anthropogenen Stickstoffbelastung positive Folgen haben kann, wie eine erhöhte Fischproduktion (Keller et al. 1992, Justic ua 1993, Breitburg ua 1994, Justic ua 1995).

Da Wechselwirkungen von Hydrologie, Geomorphologie und Biologie den Stickstoffkreislauf in Ästuaren stark erschweren, fehlt ein vollständiges Verständnis der Biogeochemie von Stickstoff in Ästuaren. Obwohl viele Fortschritte erzielt wurden, erschweren Unsicherheiten in den Details der Stickstoffverarbeitung unsere Fähigkeit, die Auswirkungen einer erhöhten Stickstoffbelastung vorherzusagen. Diese Unsicherheiten unterstreichen die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der Stickstoffdynamik in Küstenökosystemen und legen nahe, dass möglicherweise neue Ansätze erforderlich sind.

Das Ziel dieser Studie war es, den Stickstoffkreislauf im oberen Ästuar oder der oligohalinen Zone der Parker River-Mündung im Nordosten von Massachusetts zu untersuchen (Abb. 1). Die Studie bestand aus einer Zugabe des gesamten Ökosystems [N15]-[[NO3]-]-Tracer, die entwickelt wurde, um (1) den biogeochemischen Stickstoffkreislauf und (2) trophische Pfade in den oberen Mündung. Dieser Artikel konzentriert sich auf biogeochemische Aspekte der Studie und ein begleitender Artikel betont die Struktur von Nahrungsnetzen (Hughes et al. 2000). Wir konzentrierten uns auf das obere Ästuar, da es die Region ist, die am engsten mit der Wasserscheide verbunden ist und daher die erste Region ist, die Stickstoffeinträge aus Flüssen verarbeitet. Im Vergleich zu weiter seewärts gelegenen Ästuaren wurde der oligohalinen Zone relativ wenig Aufmerksamkeit geschenkt (Anderson 1986, Schuchardt et al. 1993). Neben der biogeochemischen Bedeutung der oligohalinen Zone als Puffer oder Ökoton zwischen der Wasserscheide und der unteren Mündung und dem Ozean sind die Gewässer mit niedrigem Salzgehalt der oberen Mündung von entscheidender Bedeutung für die Lebensgeschichte vieler Mündungsorganismen (Odum 1988, Deegan and Garritt 1997). Eine verstärkte Untersuchung des oberen Ästuars wird zu einem besseren Verständnis der Funktionsweise des Ästuars als Ganzes führen und eine effektive Bewirtschaftung dieser Gewässer erleichtern.

Die Parker River Mündung (Abb. 1) ist Teil des Plum Island Sound Mündungssystems (42 [Grad]44' N, 70[Grad]50' W) im Nordosten von Massachusetts. Die Wasserscheide der Parker-River-Mündung, 65 [km²] oberhalb des Damms an der Spitze der Mündung, ist überwiegend bewaldet und weist eine mäßige Wohnbebauung auf. Die Gesamtlänge der Mündung beträgt [tilde]24 km, wobei die Oligohaline-Zone nominell die ersten 5 km einnimmt. Unsere Definition der oligohalinen Zone oder des oberen Ästuars basiert auf Überlegungen wie der Salzgehaltsverteilung und der Artenzusammensetzung. Der Salzgehalt im oberen Ästuar beträgt im Allgemeinen [weniger als]10 (Salzgehalt als Verhältnis angegeben [UNESCO 1985], Leitfähigkeit [Tilde]15 mS/cm) und die Biota umfassen typischerweise Süßwasserorganismen sowie Ästuar- und Meeresarten. Die mittlere Gezeitenamplitude im oberen Ästuar beträgt [Tilde]2,7 m und der Gezeitenausschlag 2-4 km. Der durchschnittliche jährliche Süßwassereintrag aus dem Parker River beträgt 1,2 [m³]/s, während des Sommers ist er jedoch geringer (im Allgemeinen 0,1-0,5 [m³/s) .

Das obere Ästuar hat einen einzigen Hauptkanal, der sich durch ausgedehnte Süß- und Salzwiesen schlängelt (Abb. 1). Die Oberfläche der oberen 5 km des Mündungskanals beträgt [tilde]223 650 [m²] (J. Vallino, persönliche Mitteilung). Die Sumpfvegetation besteht hauptsächlich aus Rohrkolben (Typha latifolia) und Seggen (Scirpus americana und Carex sp.), mit Salzmarschenkorngras (Spartina alterniflora) kommt entlang der Bachufer vor. Die Primärproduktion im Kanal erfolgt hauptsächlich durch Phytoplankton, wobei die pelagische Kieselalge Actinocyclus normanii die Primärproduktion während der Sommerblüte dominiert, und sekundär durch Mikrophytobenthos. Das am häufigsten vorkommende Zooplankton sind Eurytemora affinis und Acartia tonsa, und gewöhnliche Fische sind Mummichog (Fundulus heteroclitus), Weißer Saugnapf (Catostomus commersoni), Weißbarsch (Morone americana) und Atlantischer Silberfisch (Menidia menidia). Eine vollständigere Beschreibung der Biota der oligohalinen Zone der Parker River-Mündung findet sich in Hughes et al. (2000) und Deegan und Garritt (1997).

Ein erster Versuch des Experiments begann am 10. Juli 1996, wurde aber nach 4 d wegen eines großen Sturms abgebrochen. Die erfolgreiche Zugabe von [N15]-[[NO3]-] begann am 6. August 1996 und dauerte bis zum 1. September 1996. Das Isotop wurde bis auf eine [tilde]24 . kontinuierlich über eine Schlauchpumpe zugegeben -h Unterbrechung (26.-27. August), wenn die Pumpe ausgefallen ist. Der Isotopen-Tracer lag in Form von [N 15 ]-angereichertem [KNO 3 ] vor und wurde in einer Menge von 4,8 g [N 15]/d (128 g [N 15 ]/Tag) zugegeben. 15] insgesamt). Rhodamin WT, ein Fluoreszenzfarbstoff, wurde dem Isotop zugesetzt, um das Verhalten relativ konservativer (Rhodamin) und reaktiver (Nitrat) gelöster Stoffe vergleichen zu können. Die Rhodamin/Isotopen-Lösung wurde 2 km seewärts von einem kleinen Damm, der die Mündungsmündung definiert, zugegeben (Abb. 1). Das Wasservolumen, in das das Isotop hinzugefügt wurde, d. h. das "Gezeitenprisma" an der Isotopenadditionsstelle, beträgt [tilde] 130 000 [m³]. Die Probenahme begann vor der Isotopenzugabe, um Basislinien-Stickstoffvorräte und Isotopenwerte zu ermitteln, und dauerte [tilde] 1 Monat nach Beendigung der [N15]-Zugabe.

Die Flusseinträge in die obere Mündung wurden anhand von Daten des United States Geological Survey (USGS) von einer Messstation am Parker River [tilde] 2 km flussaufwärts vom Ende der Mündung (USGS-Stationsnummer 01101000) bestimmt. Wir berücksichtigten die Eingaben aus dem nicht vermessenen Teil der Wasserscheide zwischen dem Damm und dem Pegel, indem wir ein konstantes Verhältnis von Fläche zu Abfluss unterstellten. Die Nitrat-, Ammonium- und Kieselsäureeinträge in die obere Mündung wurden durch periodische Probenahmen von Flusswasser, das über den Damm fließt, bewertet. Wenn die Ammonium- und Nitratkonzentrationen nicht gleichzeitig gemessen wurden, wurde der Fluss von gelöstem anorganischem Stickstoff (DIN) berechnet, indem die Ammoniumkonzentrationen zwischen aufeinanderfolgenden Proben interpoliert wurden oder angenommen wurde, dass die Ammoniumkonzentration nach dem 19. September konstant bei 1,2 [Mikro]mol/L lag.

Probenahme und analytische Verfahren

Die Wassersäulenbestandteile wurden in Abständen von 1 km entlang eines 10 km langen Längstransekts, beginnend am Ende der Mündung, beprobt. Die Probenstandorte werden nach Entfernung in Kilometern entlang des Flusslaufs bezeichnet, beginnend knapp unterhalb des Damms (0 km) und zunehmend in Richtung Mündungsabwärts. Über den Zeitraum von 2 Monaten der Studie wurden 15 Probenahme-Transekte durchgeführt. An jeder Probenahmestation wurden Proben für Nährstoffkonzentrationen, Partikelkonzentrationen von organischem Stickstoff (PON) und Isotopenanreicherung sowie Chlorophyll a (chla) gesammelt, während andere Arten von Proben (Phytoplankton, [N15]-[[NO.sub .3]–] und [N15]-[[NH.4]+] wurden weniger häufig gesammelt.Zusätzlich zu diesen Proben Temperatur und Leitfähigkeit und periodisch Rhodaminkonzentration , wurden an jeder Probenahmestation aufgezeichnet und die hydrologische Verweilzeit in den oberen 5 km des Ästuars wurde aus dem Flussabfluss berechnet (Vallino und Hopkinson 1998).

Gelöster Sauerstoff (DO), Tiefe, Leitfähigkeit und Temperatur wurden in 15-Minuten-Intervallen an der Isotopenadditionsstelle unter Verwendung eines ISCO/YSI-Autosamplers/Datenloggers gemessen und protokolliert. Diese Variablen wurden während des 2-monatigen Studienzeitraums aufgezeichnet, mit Ausnahme eines 19-Stunden-Zeitraums vom 2. bis 3. August und eines 4-Tage-Zeitraums vom 23. bis 27. August, in dem die Datenprotokollierung fehlschlug.

Transect-Wasserproben wurden mit einer batteriebetriebenen peristaltischen Pumpe gesammelt, die mit einem Inline-GF/F-Filter ausgestattet war. Die Proben wurden auf Eis gelagert, bis sie ins Labor zurückgebracht wurden. Chlorophyll und PON wurden auf Glasfaserfiltern (Whatman GF/F, 47 bzw. 25 mm Durchmesser) gesammelt. Phytoplankton wurde gesammelt, indem ein Netz (25-cm-Durchmesser, 20-[micro]m Maschenöffnung) für 2 min hinter einem kleinen Boot geschleppt wurde.

Die Nährstoffe wurden in einem temporären Labor an der Governor Dummer Academy, Byfield, Massachusetts, 1 km vom Untersuchungsort entfernt, analysiert. Alle Nährstoffproben wurden auf Nitrat analysiert und ausgewählte Proben wurden auch auf Ammonium, DON und Kieselsäure analysiert. Nitrat wurde durch Chemilumineszenzdetektion nach Reduktion von Nitrat zu NO unter Verwendung von Vanadiumchlorid analysiert (Garside 1982, Braman und Hendrix 1989). Ammonium wurde manuell gemessen (Solorzano 1969), DON wurde nach UV-Oxidation bestimmt (Walsh 1989) und Chla wurde kolorimetrisch analysiert (Strickland und Parsons 1972). Gelöste Kieselsäure wurde im Horn Point Environmental Laboratory der University of Maryland unter Verwendung der Molybdatblau-Methode (Strickland und Parsons 1972), die für die Verwendung mit einem Autoanalysator modifiziert wurde, analysiert. Die PON-Konzentration wurde durch massenspektrometrische Bestimmung des Stickstoffgehalts auf GFIF-Filtern berechnet.

Die Stickstoffisotopenzusammensetzungen von Ammonium und Nitrat wurden unter Verwendung von Modifikationen des Ammoniakdiffusionsverfahrens gemessen (Sigman et al. 1997, Holmes et al. 1998). Um die Isotopenzusammensetzung von DON abzuschätzen, haben wir [delta][N15]-TDN gemessen und [delta][N15]-DON anhand von Messwerten (siehe nächster Absatz) und Konzentrationen von Nitrat und Ammonium . berechnet . Die PON-Isotopenzusammensetzung wurde durch Verbrennung des gesamten 25-mm-Filters bestimmt. Phytoplankton wurde vor der Isotopenanalyse von Detritus getrennt, wobei eine Kombination von Verfahren einschließlich Differentialfiltration, Zentrifugation und manuelle Entfernung von Detritus verwendet wurde.

Die Stickstoffisotopenzusammensetzungen wurden im Stable Isotope Laboratory des Marine Biological Laboratory gemessen. Isotopenzusammensetzungen werden in der Standard-&dgr;-Notation ausgedrückt, wobei &dgr; 3], R = [N 15]/[N 14], und die Ergebnisse werden ausgedrückt als %[MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] Abweichung der Probe (SA) vom Standard (ST), [ N 2 in atmosphärischer Luft ([delta][[N 15] AIR] = 0% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII]). In dieser Veröffentlichung wurden die &dgr;-Werte durch Subtrahieren des natürlichen Häufigkeits &dgr; [N 15 ]-Wertes ähnlicher Proben, die vor der Isotopenzugabe gesammelt wurden, standardisiert, sofern nicht anders angegeben. Daher spiegeln die standardisierten Werte (&dgr;][[N15]t] mit dem tiefgestellten "t" in Bezug auf "Tracer") den Tracer-Inhalt wieder.

Um das Schicksal des hinzugefügten Tracers zu bewerten, haben wir die stehenden Bestände an Tracer-Stickstoff in den oberen 5 km des Ästuars für die Hauptkomponenten des Ökosystems, die mit [N 15] angereichert wurden, geschätzt. Es wurden Schätzungen für Nitrat, PON, Zooplankton, Fische (Alewife, Weißer Sauger, Mummichog), Grasgarnelen, benthische Verbraucher (gruppierte Klasse einschließlich Schlammkrabben, Flohkrebse, Oligochaeten, Polychaeten, Ostrakoden und andere benthische Organismen) und benthische Sedimente vorgenommen. Schätzungen der Isotopenanreicherung von Biota wurden während des Zeitraums der maximalen Anreicherung vorgenommen und sind Durchschnittswerte (0-5 kin). Die Tracer-Anreicherung in Sedimenten wurde aus oberflächlichen Sedimentkratzern und der isotopischen Anreicherung von Sedimentkernen geschätzt. Oberflächensedimentproben wurden durch Abkratzen der oberen 2-3 mm Sediment von 50-100 [cm²] von intertidalen Schlammbänken oder subtidalen Greifproben unter Verwendung eines Spatels erhalten. Vor und am Ende der Tracerzugabe wurden Sedimentabschürfungen erhalten.

Der Bestand an Tracer-Stickstoff in PON wurde im Detail untersucht, um das Schicksal der Tracer zu erkennen, die einst von Phytoplankton assimiliert wurden. Wir verwenden die Isotopenanreicherung von PON als Proxy für Phytoplankton (unter Verwendung geeigneter Skalierungsfunktionen), da unser Datensatz für [[N 15] t]-PON viel umfangreicher ist als für [[N + . 15]t]-Phytoplankton. Der Vergleich des Bestands an Tracer N in PON mit der kumulierten Menge an Tracer, die in PON eingedrungen ist, ermöglicht es uns, durch Massenbilanz die Verlustrate von [[N15]-PON aus . zu berechnen das Plankton.

Um den advektiven Fluss des Tracers mündungsabwärts abzuschätzen, berechneten wir die mittlere Konzentration und [[N 15] t] der verschiedenen Komponenten der Wassersäule an der Reichweitengrenze (5 km) und multiplizierten die Produkt dieser Werte durch Flussabfluss. Wir haben den advektiven Fluss verdoppelt, um den Gesamtfluss (advektiv plus dispersiv) abzuschätzen. Im Allgemeinen überschätzt dieses Protokoll den Transport von Tracer flussabwärts etwas, da bei Flussabflüssen von mehr als 0,1 [m³/s der advektive Fluss den dispersiven Fluss an der 5 km langen Stelle der oberen Mündung übersteigt (J. Vallino, persönliche Kommunikation).

Der Abfluss des Süßwassers Parker River variierte zwischen dem 1. August und dem 1. Oktober 1996 von [weniger als] 0,1 [m³/s bis [mehr als]2,5 [m³/s]/s (Abb. 2A). Im Verlauf der Isotopenaddition (6. August-1. September) nahm der Flussabfluss sukzessive von 0,26 auf 0,03 [m 3 ]/s ab. Die Nitratkonzentration im Süßwasser Parker River war umgekehrt proportional zum Flussabfluss und reichte von [Tilde]4 bis 16 [Mikro]mol/L, während die Ammoniumkonzentration immer [weniger als]4 [Mikro]mol/L betrug (Abb. 2B). . Ein umfangreicherer, mehrjähriger Datensatz, der im Rahmen des Projekts Parker River/Plum Island Sound Land Margin Ecosystem Research (LMER, jetzt LTER) [5] gesammelt wurde, ergab auch, dass Ammonium durchweg [weniger als] 4 [Mikro]mol/l beträgt. Der Riverine-DIN-Fluss über den Zeitraum von 2 Monaten lag im Bereich von 86 bis 1262 mol/d (Fig. 2C). Die Konzentrationen von gelöster Kieselsäure im Flusswasser lagen im Sommer 1996 zwischen 107 und 196 [micro]mol/l (n = 4, Mittelwert = 129,5 [micro]mol/l). Unter der Annahme einer mittleren DIN-Konzentration von 13,9 [micro]mol/L betrug das durchschnittliche Si:DIN-Verhältnis im Flusswasser 9,3:1.

Verweilzeit, Tiefe, Leitfähigkeit und gelöster Sauerstoff an der Tracer-Zugabestelle

Die hydrologische Verweilzeit im oberen Ästuar variierte zwischen 1 und 16 d während des 2-monatigen Untersuchungszeitraums und betrug im Durchschnitt [tilde] 12 d während der Isotopenzugabe (Abb. 3A). Die hydrologische Verweilzeit erreichte ihren Höhepunkt Ende August, als der Flussabfluss am niedrigsten war, fiel aber nach einem Sturm Mitte September schnell auf 1 Tag.

Die Aufzeichnung der Wassersäulentiefe zeigt, dass während der Isotopenadditionsperiode selten Sumpfflutungen auftraten (Abb. 3B). Die Wassersäulentiefe veranschaulicht auch die Asymmetrie der Gezeiten im oberen Ästuar, sowohl in Bezug auf die Höhe als auch auf den Zeitpunkt der Gezeiten. Aufeinanderfolgende Gezeiten variierten in der Höhe, oft um 20-30 cm. Vom 1. August bis 1. September 1996 betrug die mittlere Zeit von Ebbe zu Ebbe 6 h 52 min, während Hochwasser im Durchschnitt 5 h 33 min betrug. Im gleichen Zeitraum betrug die mittlere Gezeitenamplitude 2,68 m, der Bereich 2,08-3,13 m. Die kleine Gezeitenamplitude von 2,08 m am 18. September war mit einem großen Sturm verbunden (Abb. 3B).

Flussabfluss und Gezeitenstadium und -amplitude kontrollieren den Salzgehalt (elektrische Leitfähigkeit) des Wassers an der Isotopenadditionsstelle (Abb. 3C). Während des größten Teils des Augusts war das Wasser an der Isotopenadditionsstelle bei Ebbe im Wesentlichen Süßwasser, während die Leitfähigkeit bei Flut variabler war. Anfang August erreichte die Hochwasserleitfähigkeit [tilde]10 mS/cm, fiel jedoch für die nächsten Tage ab, da die Gezeitenamplituden abnahmen und weniger Meerwasser in Richtung Mündungsrichtung transportiert wurde. Die Kombination aus großen Gezeiten und geringen Süßwassereinträgen (lange hydrologische Verweilzeit) führte Ende August zur höchsten Leitfähigkeit des Untersuchungszeitraums, [tilde]22 mS/cm (fast 50 % Meerwasser). Ein kleiner Sturm in der ersten Septemberwoche verkürzte die Verweilzeit etwas und drückte etwas Salz aus der oberen Mündung, und der große Sturm vom 18. September ersetzte die obere Mündungswassermasse fast vollständig durch Süßwasser.

Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in Wasser an der Isotopenadditionsstelle variierte von [Tilde]4 bis 11 mg/L (Fig. 3D). Während des größten Teils des Zeitraums der [N 15 ]-Zugabe gab es jeden Nachmittag einen einzigen großen DO-Peak, der dem Zeitraum der maximalen photosynthetischen Sauerstoffproduktion entsprach. Vom 1. bis 4. August, 27. August bis [tilde] 7. September und 18. September bis zum Ende der Studie waren jedoch die DO-Schwankungen stark abgeschwächt und anstelle eines großen Maximums am Nachmittag gab es zwei kleinere DO-Peaks pro Tag. Diese Spitzen waren unabhängig von der Tageszeit, wurden aber stattdessen mit Ebbe in Verbindung gebracht. Die reduzierten Diel-DO-Schwankungen Anfang August und Ende September waren mit hydrologischen Verweilzeiten im oberen Ästuar von [weniger als]6 d verbunden. Von Ende August bis Anfang September korrelierten abgeschwächte Diel-DO-Schwingungen mit Sumpfüberschwemmungen und der schweren Wolkenbedeckung des Hurrikans Eduardo.

Räumliche Verteilung von Nährstoffen, Chlorophyll und PON im oberen Ästuar

Transektproben werden unter Verwendung von Daten aus vier repräsentativen Zeiträumen zusammengefasst: Vor-Zugabe (30. Juli bis 4. August), Mitte-Zugabe (13. August), Spät-Zugabe (1. September) und Nach-Zugabe (12. September). Nitrat gelangte im Allgemeinen in Konzentrationen von 5-15 [micro]mol/l in das Ästuar, sank aber innerhalb der ersten Kilometer des Ästuars auf [weniger als]1 [micro]mol/l (Abb. 4). Weiter unten im Ästuar, in der Regel 5-7 km vom Damm entfernt, stieg die Nitratkonzentration häufig auf 3-5 [micro]mol/L an, wie am 13. August und 12. September zu sehen ist. Im Verlauf des Experiments betrug die Nitratkonzentration an der Isotopenadditionsstelle [weniger als] 1 [micro]mol/l (Abb. 5). Die Ammoniumkonzentration betrug im Allgemeinen [weniger als]2 [micro]mol/l in den oberen paar Kilometern des Ästuars, stieg jedoch flussabwärts an (Abb. 4). Ammoniumdaten sind für den 1. und 12. September nicht verfügbar, aber die Daten für vier zusätzliche Transekte, die während der Aufnahme aufgenommen wurden, zeigen ein ähnliches Muster wie am 13. August.

Die PON-Konzentration war im Allgemeinen am höchsten (maximale [tilde]50 [micro]mol/l am oberen Ende der Mündung und räumlich und zeitlich dicht gefolgt von Chla (Abb. 4). Chlorophyll a erreichte im Allgemeinen bei 20-100 [micro]g /L und sank auf [tilde]5 [micro]g/L am stromabwärts gelegenen Ende der Studienreichweite (Abb. 4).

Isotopenzusammensetzung von Nitrat, Ammonium, PON und Phytoplankton

In Nitrat wurde eine erhebliche Tracer-Anreicherung gemessen, jedoch nicht in Ammonium. Die natürlichen Häufigkeitsniveaus waren für Ammonium und Nitrat vor der experimentellen Zugabe ähnlich ASCII]. %[MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] (4. August, n = 3 Stichproben). Um zu vermeiden, dass eine "ungemischte" Probe der Isotopen/Rhodamin-Lösung in der Nähe des Tracer-Zugabepunktes entnommen wird, wurden Proben, die in 2 km Entfernung gesammelt wurden, immer auf der "aufwärts gerichteten" Seite des Tracer-Zugabepunkts gesammelt. Folglich beobachteten wir an der 2 km-Station keine extrem hohen &dgr; sofortiger Abstrom des Tropfers. Bei Ebbe (6. und 19. August) war an der Probenahmestation unmittelbar seewärts des Isotops eine hohe [[N15]-[[NO3]-]-Konzentration zu beobachten Additionsstelle (Fig. 6A). Außerdem wurde am 19. August an der obersten Probenahmestation eine schwache Tracer-Anreicherung von [tilde]6% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] gefunden. Während der Flut vom 13. August konnten wir den Isotopengehalt von Nitrat nur in Proben seewärts der Isotopenadditionsstelle analysieren, da die verbleibenden Proben zu niedrige Nitratkonzentrationen für eine Analyse aufwiesen und keine der Proben, die wir analysieren konnten wies eine erhebliche [[N 15] t]-[[NO 3 -]-Anreicherung auf. Für die Flut vom 21. August wurde [[N15]-[[NO3]-] an allen drei Standorten angereichert, an denen die Nitratkonzentrationen für die Analyse ausreichend waren. [N15]-[[NH4]+]-Proben, die fast 2 Wochen nach Beginn der Tracer-Zugabe gesammelt wurden, zeigten in den oberen 4 km des Ästuars nur eine geringe oder keine Anreicherung, aber eine scheinbare Tracer-Anreicherung erreichte 9,5% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] bei 5 km und blieben in den unteren 5 km des Untersuchungsgebiets erhöht (Abb. 6B). Wir sind uns jedoch nicht sicher, ob diese Anreicherung unsere Tracer-Zugabe widerspiegelt oder ob natürliche Prozesse wie die Fraktionierung bei der Nitrifikation dafür verantwortlich sind.

Die natürliche [delta][N15]-PON-Häufigkeit vor der Zugabe des Tracers (Proben gesammelt am 4. August) verringerte sich von 5,4% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] am Ende der Mündung auf 2,3% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NOT REPRODUZIERBAR IN ASCII] 10 km unterhalb des Damms. Um die Anreicherung durch Tracer (&dgr;][[N15]t]-PON) zu bestimmen, nehmen wir für &dgr;][N eine natürliche Häufigkeit von 2,3% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] an. sup.15]-PON. Dies kann zu einer 2-3%igen [MATHEMATISCHEN AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] Überschätzung von [delta][[N15]t]-PON am Ende des Ästuars führen, dies hat jedoch keinen Einfluss auf die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in hohem Maße angesichts des relativ großen Labels in PON.

Das zugesetzte [[N15]t]-[[NO3]-] wurde schnell in PON eingebaut (Fig. 7). 10 h nach Beginn der Zugabe hatte [[[N15]t]-PON 11 % [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] erreicht und stieg auf 19 % [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR] an IN ASCII] nach weiteren 10 h. Innerhalb von 54 h nach Beginn der Zugabe erreichte [[[N15]t]-PON einen Spitzenwert von 61 % [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII]. Im Allgemeinen betrug in den nächsten drei Wochen [Delta] [[N 15] t]-PON [größer als] 30 % [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] in den oberen 3-4 km von der Mündung und fiel unter 15% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] Anreicherung um 5 km. Nach Beendigung der Tracerzugabe am 1. September nahm [[[N15]t]-PON rasch ab, obwohl bis mindestens 20. September eine gewisse Anreicherung im oberen Ästuar erkennbar war.

Unser umfangreichstes Set an Transektproben wurde am 19. August 1996 gesammelt, und wir präsentieren diese Daten, um den Vergleich zwischen den verschiedenen gleichzeitig gesammelten Proben zu erleichtern. Die Probenahme begann an der 10-km-Station während der letzten Stunde der Flut und wurde [tilde]2 h nach Ebbe abgeschlossen. Die Wassertemperatur war in der gesamten Reichweite relativ konstant ([Tilde]25[Grad]C), aber die Leitfähigkeit reichte von der des Süßwassers an der obersten Probenahmestelle bis [Tilde]75% Meerwassergehalt bei 10 km (Abb. 8A). Eine Blüte (vorwiegend A. normanii) war im oberen Ästuar vorhanden und Chla erreichte am 1-km-Probenahmeort einen Höchstwert von [tilde]30 [micro]g/l (Abb. 8B). Gelöste Kieselsäure trat mit 196 [micro]mol/L in die Mündung ein. aber seine Konzentration fiel im ersten Kilometer des Ästuars auf [weniger als]2 [micro]mol/L, wobei die Position des Siliziumdioxid-Minimums dem Chla-Maximum entsprach. Der Großteil des Gesamtstickstoffs im oberen Ästuar war DON, wobei PON im Allgemeinen die zweithäufigste Form ist (Abb. 8C). Die Gesamtstickstoffkonzentration (PON, DON, DIN) sank von [tilde]70 [micro]mol/l im Süßwasser Parker River auf [weniger als]25 [micro]mol/l bei 10 km. Die Konzentrationen an anorganischem Stickstoff waren in der Nähe der Phytoplanktonblüte sehr gering, nahmen jedoch an den 5 bis 10 km langen Stationen zu.

Drei räumliche Muster der Tracer-Anreicherung waren offensichtlich, beispielhaft dargestellt durch (1) Nitrat, (2) Phytoplankton und PON und (3) Ammonium (Abb. 8). Die Verteilung von Rhodamin zeigt, wie sich [[N15]t]-[[NO3]-] verteilen würde, wenn keine biologische Aufnahme oder Regeneration stattfindet. [Delta] [[N15]t]-[[NO33]-] zeigte einen scharfen Peak an der 3 km entfernten Probenahmestelle, aber relativ wenig oder keine Anreicherung an anderer Stelle (Abb .8D). Ein Vergleich mit Rhodamin zeigt, dass sich [[N15]t]-[[NO3]-] nicht konservativ verhielt (Fig. 8D). Eine ähnliche Schlussfolgerung wird durch den schnellen Rückgang angezeigt in der Nitratkonzentration im obersten Kilometer des Ästuars (Abb. 8C). Die Tracer-Anreicherung sowohl von Phytoplankton als auch von PON erreichte bei 1 km ihren Höhepunkt und nahm sowohl mündungsaufwärts als auch mündungsabwärts schnell ab (Abb. 8E). Am 19. August erreichten gereinigte Phytoplanktonproben eine maximale Tracer-Anreicherung von [tilde] 43% höher als die von PON. Ammonium zeigt in den oberen 4 km des Ästuars nur eine geringe oder keine Anreicherung, obwohl im Unterlauf des Ästuars möglicherweise eine gewisse Anreicherung vorhanden war (Abb. 8D). &dgr;[N 15 ]-TDN erreichte 11,2% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] bei 3 km (Daten nicht gezeigt), aber die Berechnung von &dgr; t]-DON, das Ammonium- und Nitrat-Delta-Werte und -Konzentrationen berücksichtigt, zeigte, dass [delta][[N15].

Am Ende der Isotopenzugabeperiode war der größte Teil des Tracers in oligohalinen Sedimenten vorhanden (Tabelle 1, Abb. 9). Der größte Tracervorrat in Wassersäulen war PON, und der ständige Tracervorrat bei benthischen Verbrauchern war ungefähr der gleiche wie in PON. Zooplankton, Garnelen und Fische waren für die Tracer-Lagerung relativ unwichtig.

Während des Isotopenzugabezeitraums betrug die PON-Konzentration im Allgemeinen 20–30 [Mikro]mol/l (Fig. 10A) und der mittlere Reichweiten-gemittelte [Delta][[N15]t]-PON (ausschließlich der erste 2 Tage der Zugabe) betrug 29,3% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] (Fig. 10B). Zum Vergleich: Das mittlere reichweitengemittelte [delta][[N15]t]-Phytoplankton betrug 49,3% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII]. An allen Probenahmeterminen außer einem war die Tracermasse in PON kleiner oder gleich der Menge an hinzugefügtem [[N15]t]-[[NO3]-] jeden Tag (Abb. 10C). Die Ausnahme war der 8. August, als die Tracermasse in PON [größer als] 9 g erreichte. Außer in den ersten Tagen der Zugabe war nur ein kleiner Bruchteil der kumulativen Masse des zugesetzten Tracers [N 15] in PON vorhanden (Fig. 10D). Der Export von [[N 15] t]-PON mündungsabwärts betrug [weniger als] 6 g während der Isotopenaddition, was darauf hindeutet, dass PON im oberen Mündungsbereich rasch sedimentierte.

Die experimentelle Zugabe von [N15]-[[NO33]-] in die Parker River-Mündung ergab mehrere neue Erkenntnisse über die Funktionsweise des Ökosystems. Zunächst konnten wir zeigen, dass der Großteil des in das Ästuar gelangenden Flussnitrats zunächst von den planktonischen Kieselalgen (hauptsächlich Actinocyclus normanii) verarbeitet wurde, die die Basis des produktiven oligohalinen Nahrungsnetzes bilden. Darüber hinaus zeigte die Größe und räumliche Verteilung des isotopenangereicherten Nitrats, dass der Nitratumsatz sehr schnell war, selbst nachdem das Nitrat aus den Flüssen ursprünglich entnommen worden war. Die Stickstoffnachfrage von Phytoplankton überstieg das Angebot von Flüssen bei weitem, und die benthischen Stickstoffflüsse machten den größten Unterschied aus. Ohne die nachfolgend aufgeführten Nachweise, dass der zusätzliche Stickstoff nicht isotopenangereichert war, hätten wir die Bedeutung des Recyclings in der Wassersäule überschätzt. Außerdem konnten wir die Herkunft des aus dem oberen Ästuar exportierten Stickstoffs als DIN, DON und PON untersuchen. Obwohl das meiste Flussnitrat (und der Nitrat-Tracer) im Sommer im oberen Ästuar zurückgehalten wurde, wurde der Großteil des Tracers in Form von PON exportiert. Das Isotopenadditionsexperiment half uns bei der Einschätzung, welche Kompartimente im oberen Ästuar für die Speicherung von Flussnitrat-N am wichtigsten waren und benthische Sedimente die primäre Speicherzone waren. Schließlich wurde unser Verständnis der trophischen Struktur des Ökosystems erheblich verbessert, indem wir dem Tracer durch das Nahrungsnetz folgten (Hughes et al. 2000).

Erstverarbeitung des Tracers

Obwohl Flussnitrat zahlreichen Pfaden durch das Mündungsökosystem folgen könnte, war sein ursprüngliches Schicksal und das des [N 15 ]-Tracers unter typischen sommerlichen Niedrigflussbedingungen in der oberen Parker-Flussmündung die Assimilation durch Phytoplankton. Andere Pfade, einschließlich der Assimilation durch benthische Kieselalgen, Makroalgen, Bakterien und Sumpfvegetation, und der Verlust durch Denitrifikation und den Export in den Unterlauf der Mündung, waren über den Zeitraum dieses Experiments relativ gering.

Die Isotopenanreicherung von Phytoplankton (Abb. 4) und Bulk-PON (Abb. 7) weist darauf hin, dass die pelagischen Kieselalgen den Nitrat-Tracer schnell aufgenommen haben. Drei Tage nach der Isotopenzugabe konnten wir [tilde]75% des hinzugefügten Tracers in PON erklären (Fig. 10D). Im Gegensatz dazu wiesen andere gemessene Pools kurz nach Beginn der Tracerzugabe eine unbedeutende Tracer-Akkumulation auf. Da die Umsatzzeit der Kieselalgen [tilde] 1 d betrug, hätte Phytoplankton bereits am dritten Tag der Zugabe eine erhebliche Menge an Tracer verloren. Daher müssen sogar mehr als 75 % des [N15]-[[NO3]-]-Tracers ursprünglich von Phytoplankton assimiliert worden sein.

Der rasche Rückgang der Kieselsäurekonzentration (Abb. 8B) weist auf eine starke Nachfrage nach Kieselsäure hin (die mittlere Abnahme der Kieselsäurekonzentration im oberen 1 km des Ästuars betrug am 19. August und 27. August 182 [micro]mol/l). Unter Verwendung der Leitfähigkeit zur Bewertung der Vermischung zwischen Fluss- und Meerwasser stellen wir fest, dass nur [tilde]10-20 [micro]mol/l der Abnahme auf die Vermischung mit silikatischem Meerwasser zurückzuführen ist. Da die DIN-Konzentration im Süßwasser Parker River bei der Entnahme der Kieselsäureproben [tilde]16 [micro]mol/l betrug und die Kieselalgen ein molares Si:N-Verhältnis von 1:1 haben (Redfield et al. 1963), at Diatomeen benötigten mindestens 146 [micro]mol/LN zusätzlich zu den DIN-Einträgen aus Flüssen, um die beobachtete Siliziumdioxid-Verarmung zu berücksichtigen. Somit wären nur [tilde]10% des planktonischen Stickstoffbedarfs durch die direkte Nutzung von flussindischen DIN-Einträgen gedeckt worden.

Die stöchiometrische Bewertung des Stickstoffbedarfs von Phytoplankton, basierend auf der Chla-Konzentration, weist ebenfalls auf einen DIN-Bedarf hin, der weit über der Flusslieferung liegt. Während der Isotopenzugabe betrug die mittlere Chla-Konzentration im Wasser, das bei jeder Flut an der Zugabestelle vorbeiströmte, 34,8 [Mikro]g/L. Unter der Annahme einer Umsatzzeit von Stickstoff in Phytoplankton von 1 d (Eppley 1972), einem C-zu-Chla-Massenverhältnis von 50:1 (Antia et al. 1963, Eppley 1972) und einem C:N-Molverhältnis in Phytoplankton von 7: 1 (Redfield 1958) betrug der Stickstoffbedarf des Phytoplanktons im 130 000 [m³] Tidalvolumen 2693 mol/d. Der mittlere DIN-Fluss über den Damm während der Isotopenzugabe betrug 240 mol/d (Abb. 2C), was darauf hindeutet, dass nur [tilde]9% des Phytoplankton-N-Bedarfs durch die direkte Aufnahme von aus dem Wassereinzugsgebiet abgeleitetem DIN gedeckt wurden.

Eine endgültige Schätzung des DIN-Bedarfs durch Phytoplankton basiert auf GPP. Während der Blüte von A. normanii im oberen Ästuar beträgt der GPP durchschnittlich [tilde]2 g C [m-2]*[d-1] (J. Vallino, persönliche Mitteilung). Wenn wir davon ausgehen, dass die Nettoprimärproduktion (NPP) die Hälfte des GPP beträgt (Peterson 1980) und das C:N-Molverhältnis in Phytoplankton 7:1 beträgt, berechnen wir den DIN-Bedarf nach Phytoplankton zu nur 2282 mol/d [tilde]10% davon könnten durch direkte Nutzung von Fluss-DIN gedeckt werden.

Obwohl die vorstehenden Schätzungen darauf hindeuten, dass die direkte Aufnahme von DIN-Einträgen aus Flüssen nur [tilde]10% des Stickstoffbedarfs durch Phytoplankton deckt, könnten die DIN-Einträge aus Flüssen im Sommer ausreichen, um den Phytoplanktonbedarf zu decken, wenn Diatomeen-N schnell in die Wassersäule zurückgeführt wird unabhängig von Kieselsäure. Wenn sich die Kieselsäuretests der Kieselalgen nur langsam auflösten, während der Stickstoff schnell recycelt wurde, könnte die Kieselsäurekonzentration in einem größeren Ausmaß gesenkt werden, als dies möglich wäre, wenn Stickstoff und Kieselsäure mit den gleichen Geschwindigkeiten zirkulieren (Schelske und Stoermer 1971, Schelske et al. 1983 , Doering et al., 1989, Conley et al., 1993). Viele solcher Zyklen könnten innerhalb der typischen Verweilzeit von Kieselalgen im oberen Ästuar abgeschlossen werden, und Kieselsäure könnte durch das schnelle Recycling von Fluss-DIN abgereichert werden. Ohne den Isotopen-Tracer wäre es schwierig gewesen, diese Hypothese zu widerlegen. Wenn diese Hypothese wahr wäre, würden wir jedoch vorhersagen, dass die isotopische Anreicherung von Ammonium und/oder Nitrat die Anreicherung von Phytoplankton sehr gut nachahmen würde. Jedes in der Nähe der Kieselalgenblüte vorhandene DIN wäre aus den isotopenangereicherten Kieselalgen recycelt worden. Die Isotopendaten unterstützen diese Hypothese nicht (Abb. 5 und 8D, E). Stattdessen zeigte Ammonium im oberen Ästuar nur eine geringe oder keine Anreicherung, und Nitrat war nur an den Probenahmestellen, die kürzlich die Isotopenadditionsstelle passiert hatten, wesentlich angereichert.Der scharfe Peak in &dgr; isotopen angereichert. Daher erklären schnelles Recyclen von Diatomeen-N und langsamere Auflösung von Silica-Tests nicht die große Silica-Verarmung. Stattdessen muss Diatomeen-N zusammen mit Tracer-N effizient und schnell aus der Wassersäule entfernt worden sein.

Ein weiterer Hinweis darauf, dass planktonische Kieselalgen den Hauptbeitrag zum Stoffwechsel des gesamten Ökosystems und zur Stickstoffaufnahme im oberen Ästuar leisteten, ist die Aufzeichnung der gelösten Sauerstoffkonzentration an der Isotopenadditionsstelle, die mit der Häufigkeit von Phytoplankton in Zusammenhang zu stehen scheint. Wenn Chla nach dem 5. August hoch war, war die Variation des Diel-DO ausgeprägt (Fig. 3D). Im Gegensatz dazu waren vor dem 4. August und nach dem 18. September die Chla-Konzentrationen im oberen Ästuar niedrig ([weniger als] 10 [Mikro]g/l) und die Diel-Variationen des Sauerstoffgehalts waren stark abgeschwächt. Wenn die Kieselalgenblüte früher im Sommer während eines hohen Abflussereignisses aus dem oberen Ästuar gespült wurde, wurden außerdem die Sauerstoff-Schwankungen und der Nitratabbau im oberen Ästuar stark reduziert (R. M. Holmes, unveröffentlichte Daten).

Trotz der offensichtlichen Korrelation zwischen Phytoplankton-Abundanz und Wassersäulen-DO ist es möglich, dass andere Primärproduzenten als Phytoplankton eine wichtige Rolle im Gesamtsystem-Metabolismus und der DIN-Aufnahme gespielt haben. Zum Beispiel waren benthische Kieselalgen auf Schlammbänken zwischen den Gezeiten vorhanden. Allerdings hinkte die Isotopenanreicherung benthischer Kieselalgen dem Phytoplankton um 2 Wochen hinterher (Hughes et al. 2000). Angesichts dieser erheblichen Verzögerung können sie bei der anfänglichen Entfernung des [N15]-[[NO3]-]-Tracers aus der Wassersäule keine Rolle gespielt haben und erhielten stattdessen wahrscheinlich ihre Markierung nach Remineralisierung von angereicherter, abgelagerter organischer Substanz, die [[N 15] t]-[[NH 4 + +] in oberflächliche Sedimentporenwässer freigesetzt wird. Diese Schlussfolgerung stimmt mit der nahezu vollständigen Aufnahme des Tracers durch PON (Phytoplankton) in die Wassersäule überein. Andere Primärproduzenten im Ökosystem können ausgeschlossen werden, weil sie entweder nicht in signifikanten Mengen vorhanden waren (z. B. Makroalgen) oder dem Isotop erst nach Überschwemmung des Sumpfes am Ende des Experiments ausgesetzt waren (z. B. Typha).

Die verbleibenden Prozesse, die für den schnellen Abbau von Flussnitrat verantwortlich sein könnten, sind die Denitrifikation und die mikrobielle Assimilation. Die Denitrifikation entfernt in vielen Ästuaren einen erheblichen Teil des einströmenden Stickstoffs (Seitzinger 1988), wobei der entfernte Prozentsatz auf die hydrologische Verweilzeit bezogen ist (Nixon et al. 1996). Zwei Faktoren sprechen jedoch dagegen, dass die Denitrifikation für die schnelle anfängliche Erschöpfung von Nitrat aus Wassereinzugsgebieten in der oberen Parker-River-Mündung verantwortlich ist. Erstens ist die Nitratkonzentration in der darüber liegenden Wassersäule im Allgemeinen niedrig, so dass auch der diffusive Nitratfluss in anoxische Sedimente, dem wahrscheinlichen Ort der Denitrifikation, ebenfalls gering ist. Zweitens begrenzt die kleine Fläche und kurze Zeit, über die angereichertes [[N15]t]-[[NO3]-] in der Wassersäule vorhanden ist, die Kontaktzeit zwischen [ [N15]t]-[[NO33]-] und Sedimente. Diese Argumente stimmen mit der beobachteten Aufnahme des Großteils des Tracers durch Phytoplankton in den ersten Tagen der Zugabe überein. Daher schließen wir, dass die direkte Entfernung von Wassersäulennitrat und Tracernitrat durch Sedimentdenitrifikation gering war. Obwohl es für die anfängliche Entfernung von [[N 15] t]-[[NO 3 -] nicht relevant ist, ist es dennoch möglich, dass das endgültige Schicksal eines Großteils des Labels Denitrifikation nach Assimilation durch Phytoplankton, Sedimentation, Remineralisation und Nitrifikation.

Die maximale beobachtete Tracer-Anreicherung in planktonischen Bakterien betrug [tilde]15% [MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] (M. Hullar und D. Pakulski, persönliche Mitteilung), viel weniger als für Phytoplankton. Basierend auf Schätzungen der Bakterienproduktion in der Parker River-Mündung (Wright et al. 1987) berechnen wir, dass die Nitrataufnahme durch Bakterien [weniger als] 5 % der Aufnahme durch Phytoplankton betrug. Daher waren Bakterien keine Hauptsenke für den Nitrattracer.

Kontrolle der Phytoplanktonblüte

Im oberen Mündungsgebiet des Parker River unterstreicht die enge Beziehung zwischen Flussabfluss und hydrologischer Verweilzeit die allgemeine Bedeutung der Hydrologie bei der Kontrolle der Phytoplanktondynamik in der oligohalinen Zone. Der Einfluss des Flussabflusses auf das Phytoplankton wird über den zweimonatigen Untersuchungszeitraum am deutlichsten durch den Sturm vom 18. September veranschaulicht. Vor dem Sturm war der Flussabfluss gering ([weniger als]0,25 [m.sup.3]/s) und die hydrologische Verweilzeit im oberen Ästuar überstieg 10 Tage. Die Verdopplungszeit für planktonische Diatomeen beträgt typischerweise 1-2 d (Eppley 1972), sodass die Diatomeen während ihrer Verweilzeit in der oligohalinen Zone genügend Zeit hatten, um mehrere Generationen zu vervollständigen, was mit dem beobachteten Vorhandensein des Chlorophyllmaximums übereinstimmt. Der Sturm Mitte September erhöhte jedoch den Flussabfluss auf [tilde]2,5 [m³/s und die hydrologische Verweilzeit sank auf [weniger]2 d (Abb. 2A und 3A). Der DO-Datensatz (Abb. 3D) und die Nitrat- und Chlorophyllkonzentrationen im oberen Ästuar am 20. September (Daten nicht gezeigt) weisen darauf hin, dass die Kieselalgenblüte das Ästuar hinuntergespült wurde. Zusätzliche Daten von früher im Sommer deuten darauf hin, dass sich die Kieselalgenblüte nur entwickelte, wenn der Süßwassereintrag weniger als [tilde]0,5 [m.sup.3]/s betrug, was einer hydrologischen Verweilzeit von [größer oder gleich]5 . entspricht D. Langfristige Abflussdaten zeigen, dass diese Bedingungen erfüllt sind [tilde]150 d/Jahr, ungefähr Mitte Juni bis Oktober. Daher ist eine Blütenbildung im Durchschnitt im Sommer und Frühherbst möglich, jedoch nicht in anderen Jahreszeiten, und daher ist nicht zu erwarten, dass Phytoplankton im oberen Ästuar Flussnitrat während der Abflusssaison im Frühjahr umwandelt.

Was schränkt die Kieselalgenblüte ein, wenn die hydrologische Verweilzeit im oberen Ästuar 5 Tage überschreitet? Zu den Möglichkeiten gehören biotische Kontrolle durch Weidetiere, Lichtlimitierung, Nährstofflimitierung und Ansiedlung von Zellen in benthischen Sedimenten. Die wahrscheinlichste Möglichkeit scheint eine Nährstoffbeschränkung zu sein, entweder durch Stickstoff oder Kieselsäure. Eine Einschränkung des Phytoplanktonwachstums durch Phosphor ist eine weitere Möglichkeit, aber gelöstes anorganisches N:P (Molverhältnis) im oberen Ästuar beträgt im Sommer im Allgemeinen [weniger als]5 (siehe Parker River/Plum Island Sound Land Margin Ecosystem Research [LMER, jetzt LTER ]. Da Kieselsäure nur Kieselalgen begrenzen kann, könnten andere Formen von Phytoplankton dominieren, wenn Stickstoff schneller regeneriert wird.

Da eine höhere DIN als die vom Süßwasser des Parker River gelieferte benötigt wird, um den großen Siliziumdioxidrückgang zu berücksichtigen, muss die Regeneration von benthischem Stickstoff, Grundwassereinträge oder Dispersion aus dem Ozean oder der unteren Mündung den zusätzlichen Stickstoff liefern, der von Phytoplankton benötigt wird. Die Grundwassereinträge sind, obwohl sie in diesem System nicht gut charakterisiert sind, wahrscheinlich nicht wesentlich, da die Süßwassereinträge über den Damm ausreichend sind, um den Transport gelöster Stoffe im oberen Ästuar zu modellieren (Vallino und Hopkinson 1998). Benthische Sedimente sind reich an N, und gemessene Flüsse sind zwar variabel, aber oft groß (Hopkinson et al., im Druck). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Regeneration des in Sedimenten der oberen Ästuaren enthaltenen Stickstoffs die Hauptquelle für zusätzliche DIN ist, die von oligohalinen Kieselalgen benötigt wird, dass jedoch das Grundwasser einen gewissen Beitrag leisten kann. Die Summe dieser Quellen ist ungefähr eine Größenordnung größer als der Fluss von DIN, der über den Damm kommt, wenn die Blüte vorhanden ist. Während wir die Oligohalin-Region als relativ offenes Ökosystem betrachten, wird der größte Teil des Stickstoffbedarfs der Primärproduzenten im Sommer und Frühherbst durch das Recycling aus benthischen Sedimenten gedeckt.

Der Export von Tracer-Stickstoff könnte in alle stickstoffhaltigen Komponenten der Wassersäule oder über die Migration von Biota mündungsabwärts erfolgen. Da der Bestand an Tracer in Biota gering war (Tabelle 1), ist es unwahrscheinlich, dass die Migration oder Advektion von Tracern in der Fauna signifikant war. Darüber hinaus wurde im Wesentlichen kein isotopenangereichertes Nitrat aus dem oberen Ästuar exportiert, da Nitrat an der 5 km-Station nicht messbar mit Tracer angereichert war (Abb. 6). PON und DON waren die verbleibenden Vektoren des Tracer-Exports flussabwärts. Der advektive plus dispersive Transport von [[N15]t]-PON aus dem oberen Ästuar während des Untersuchungszeitraums betrug [weniger]6 g (von 128 g [N15] [[ N 3 – –] hinzugefügt). Da die DON-Konzentration ähnlich der von PON war, aber seine Isotopenanreicherung viel geringer war ([weniger als]3%[MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII] vs. 30%[MATHEMATISCHER AUSDRUCK NICHT REPRODUZIERBAR IN ASCII]), eine unbedeutende Menge an Tracer wurde als DON aus der Reichweite exportiert. Folglich scheint es, dass die relativ lange hydrologische Verweilzeit im oberen Ästuar während der Isotopenzugabe zu einem geringen Transport von Tracern in jeglicher Form nach unten führte, vermutlich wegen des Niederschlags von PON (einschließlich Kieselalgen) in die Sedimente, wo die meisten Tracer gefunden wurden (Tabelle 1).

Der Vergleich des Tracerbestands in PON in der Wassersäule mit dem Tracer-Fluss in PON unterstützt die Hypothese, dass das meiste [[N 15] t]-PON in Sedimente transportiert wurde. In den ersten Tagen der Zugabe können wir den größten Teil des [N 15]-Tracers in PON erklären (Fig. 10D). Der stehende Tracerbestand im Tidalvolumen erreicht jedoch schnell ein Plateau und ist relativ niedrig, im Allgemeinen [weniger als] 5 g [[N 15] t] (Fig. 10C), was darauf hindeutet, dass die Die Umsatzzeit von PON ist kurz ([weniger als] 1 d). Da relativ wenig Tracer-Stickstoff von Verbrauchern sequestriert (Tabelle 1) oder flussabwärts exportiert wird, scheint der meiste Stickstoff in PON in benthische Sedimente überführt zu werden (Abb. 11).

Oligohaline Zonen von Ästuaren sind Regionen mit raschem Wandel in vielen physikalischen, chemischen und biologischen Variablen (Morris et al. 1978, Anderson 1986, Schuchardt und Schirmer 1991, Fichez et al. 1992, Rehbehn et al. 1993, Schuchardt et al. 1993 ). Prozesse, die an dieser Schnittstelle von Fluss und Mündung stattfinden, beeinflussen den Zeitpunkt, die Größe und die Form von Material und Energie, die die Mündung hinunter und in den Ozean transportiert werden. In der Mündung des Parker River finden im Sommer viele wichtige Umwandlungen von Nährstoffen und organischer Substanz in den oberen 2-4 km der Mündung statt. Ähnliche Beobachtungen wurden für andere Flussmündungen berichtet, darunter die San Francisco Bay (Alpine und Cloern 1992, Cloern 1996), die Untermündungen der Chesapeake Bay (Anderson 1986), die North River-Mündung in Massachusetts (Bowden et al, 1991) und mehrere europäische Systeme ( Schuchardt und Schirmer 1991, Rehbehn ua 1993, Schuchardt ua 1993, Sanders ua 1997). Die in dieser Studie verwendete Tracer-Zugabetechnik ergänzt andere Ansätze zur Untersuchung des Stickstoffkreislaufs in Ästuaren und erleichtert ein detailliertes Verständnis des Stickstoffkreislaufs in diesen komplexen Ökosystemen. Eine besondere Stärke des Whole-Ecosystem-Tracer-Ansatzes besteht darin, dass er eine gleichzeitige Untersuchung des Transports und der Verarbeitung von Stickstoff in einem intakten Ökosystem ermöglicht, was in herkömmlichen Flaschen- oder Mesokosmenexperimenten nicht möglich ist.

Von den 128 g [N 15 ], die dem Ästuar über 27 d zugeführt wurden, waren zu einem bestimmten Zeitpunkt nur [tilde] 5 g im Phytoplankton vorhanden (Abb. 11A). Eine ähnliche Menge an Tracer wurde bei benthischen Verbrauchern sequestriert. Andere Biota enthielten weit weniger Tracer (Tabelle 1), obwohl sie aufgrund ihres schnellen N-Umsatzes durch Prozesse wie die Zooplankton-Beweidung möglicherweise eine signifikante Menge des Tracers verarbeitet haben. Sowohl das Fluss-DIN als auch der Nitrat-Tracer wurden zunächst von Phytoplankton assimiliert und dann als Phytoplankton und Fäkalienpellets aus der Wassersäule in Sedimente transportiert (Abb. 11). Da der stehende Tracerbestand in PON schnell ein Plateau erreichte (Abb. 10C), war der Tracer-Fluss in die Sedimente fast so groß wie der in PON (Abb. 11A), da der Transport durch das Ästuar minimal war. Angesichts des großen Stickstoffpools und der langen Verweilzeit von Stickstoff in benthischen Sedimenten scheint es, dass im Laufe der Studie nach der Ablagerung von Phytoplankton nur wenige Tracer aus den Sedimenten entwichen sind. Obwohl unsere Schätzung der Menge an Tracer, die in benthischen Sedimenten gespeichert ist, mit Unsicherheit behaftet ist, ist klar, dass Sedimente die primäre [[N15]t]-Speicherzone waren (Tabelle 1). Ein Teil dieses Stickstoffs könnte als [N2 über gekoppelte Assimilation-Mineralisierung-Nitrifikation-Denitrifikation in die Atmosphäre geleitet worden sein, aber wir konnten diesen Fluss aufgrund des hohen Bestands an [N2 . nicht quantifizieren ] in der Wassersäule und deren rascher Austausch mit der Atmosphäre, wodurch die [[N15]t]-Anreicherung des [N2]-Pools unterhalb unserer Nachweisgrenze lag. Somit ist der Stickstofffluss aus der oligohalinen Zone durch Denitrifikation eine große Unbekannte, die weiterer Untersuchungen bedarf.

Der Tracerfluss innerhalb des Ökosystems der oberen Ästuaren (Abb. 11A) beleuchtete die Massenbewegung von Stickstoff durch das System (Abb. 11B). Wir stellten fest, dass der Stickstoffbedarf des Phytoplanktons im Sommer das direkte Angebot aus dem Einzugsgebiet bei weitem überwog und die Wiederverwendung von Stickstoff in der Wassersäule relativ unbedeutend war. Stattdessen stammte der Großteil der von Phytoplankton benötigten DIN aus der Regeneration in benthischen Sedimenten. Ein Teil des Phytoplankton-N wurde auf pelagische Verbraucher übertragen, der größte Teil jedoch sedimentierte in das Benthos. Während der Sommerblüte wurde der Fluss der N-Deposition aus der Wassersäule in das Benthos durch den DIN-Fluss aus den Sedimenten in die Wassersäule in etwa ausgeglichen.

Obwohl das Angebot an DIN in Flüssen im Sommer viel geringer ist als der Bedarf an Phytoplankton, übersteigt das Angebot in Flüssen im Jahresmaßstab die Nachfrage der Primärproduzenten im oberen Ästuar bei weitem. Die meiste jährliche N-Lieferung aus den Flüssen erfolgt jedoch während des Abflusses, der die Entwicklung von Phytoplankton verhindert, und daher wird DIN die Mündung hinunter zum Plum Island Sound und in den Golf von Maine transportiert. Während für einige Fragen wie die prozentuale Stickstoffretention auf Jahresbasis eine Jahresperspektive relevant ist, ist es der Stickstoff, der im Sommer verarbeitet wird, der das produktive oligohaline Nahrungsnetz antreibt. Die Verarbeitung aller von Wassereinzugsgebieten abgeleiteten DIN im oberen Ästuar während des Sommers unterstreicht die Bedeutung dieser Zone für den Stickstoffkreislauf des gesamten Ästuars. Folglich erfordert ein gründliches Verständnis der Biogeochemie von Mündungsökosystemen die Einbeziehung von Prozessen und Transformationen, die in der relativ wenig erforschten oligohalinen Zone stattfinden.

Die Forschung wurde von NSF-DEB-9407829, EPAR824767010 und NSF-OCE-921446l unterstützt. Wir danken Susan Oleszko-Szuts und der Governor Dummer Academy für die Nutzung der Laboreinrichtungen auf dem Gelände, Bill Morrison für die Nutzung seines Docks und Gene Stoermer für die Identifizierung von Kieselalgenarten. Wir danken auch Kris Tholke für die Durchführung der Isotopenproben im Ecosystems Center und für die Unterstützung vor Ort sowie Joe Vallino, Chuck Hopkinson, Jim McClelland, Hap Garritt, Anne Giblin, Chris Neill, Meredith Hullar, Dean Pakulski, Deana Erdner , Charlie Vörösmarty, Bobbie Sichol, Matt Distler, Raquel Machas, Mike Buchalski und Claire Peterson für die Hilfe bei der Probenahme und wichtige Erkenntnisse während vieler Diskussionen über das Projekt. Schließlich danken wir Thermo Environmental Instruments für die Bereitstellung eines [NOx]-Analysators für die Nitratanalyse und zwei anonymen Gutachtern für konstruktive Kommentare zum Manuskript.

(1.) Ecosystems Center, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts 02543 USA

(2.) Biologie-Fakultät, Florida International University, Miami, Florida 33199 USA

(4.) Derzeitige Anschrift: Coastal Ecology Institute, Louisiana State University, Baton Rouge, Louisiana 70803-7503 USA.

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Einführung

Die Wurzelentwicklung bei Pflanzen ist ein komplexer Prozess mit einem hohen Maß an morphologischer Plastizität, der inhärente Anpassungsmechanismen an stark variable Umweltbedingungen widerspiegelt. Obwohl die molekularen Determinanten der Wurzelmorphologie und -funktion erst am Anfang verstanden werden, haben klassische physiologische Experimente eindeutig sowohl lokale als auch systemische Regelkreise in die Bestimmung der Wurzelplastizität impliziert. Neben ihrer Rolle bei der selektiven Nutzung spezifischer Bodendomänen für verfügbare Nährstoff- und Wasserquellen besteht eine wichtige Rolle der Wurzelentwicklungsplastizität darin, Pflanzen die Fähigkeit zu verleihen, verschiedene biotische Signale von Bodenmikroorganismen zu erkennen und darauf zu reagieren. Die diskriminierende Erkennung und angemessene Reaktion auf diese biotischen Hinweise sind für das Überleben der Pflanzen unerlässlich und bieten im Fall von symbiotischen Pflanzen-Mikroben-Interaktionen ein zusätzliches Mittel zur selektiven Nutzung ansonsten unzugänglicher Nährstoffquellen. Stickstofffixierende Symbiosen von Hülsenfrüchten liefern ein interessantes Beispiel für das letztere Phänomen (Vance, 1998). Bei einer Infektion mit bestimmten Rhizobienstämmen werden kortikale Wurzelzellen von Hülsenfrüchten dedifferenziert, initiieren Zellteilungen und lenken ihr Entwicklungsschicksal in Richtung der Bildung von Knöllchenprimordien. Danach entwickeln sich die Knöllchenprimordien durch eine hoch organisierte und kontrollierte Reihe von Veranstaltungen zu voll funktionsfähigen, stickstofffixierenden Organen, Wurzelknöllchen (für aktuelle Übersichten siehe Hadri et al. 1998 Hirsh, 1992). Die Knötchen-Organogenese wird als Reaktion auf spezifische Lipo-Chitooligosacharid-Signalmoleküle (Nod-Faktoren) aktiviert, die von kompatiblen Rhizobienstämmen synthetisiert werden (Hadri & Bisseling, 1998, Spaink, 1996). Strukturelle und funktionelle Anpassungen der Wurzel an Nod-Faktoren und Rhizobieninfektion werden von der Wirtspflanze kontrolliert und werden nachweislich durch verschiedene Umweltfaktoren moduliert, einschließlich der Verfügbarkeit von kombiniertem Stickstoff sowie Entwicklungshinweisen im Zusammenhang mit dem Pflanzenwachstum ( Caetano- Anolles & Gresshoff, 1991 Francisco & Harper, 1995 Nutman, 1952 Parsons et al. 1993 Streeter, 1988). Ein wichtiger Aspekt dieses Kontrollverfahrens ist die pflanzenvermittelte Regulierung des Ausmaßes der Knotenbildung als Reaktion auf eine Rhizobieninfektion. Der Pflanzenwirt steuert aktiv die Anzahl erfolgreicher Knotenbildungsereignisse auf mindestens zwei verschiedenen Ebenen. Eine Stufe beinhaltet einen vorzeitigen Stillstand der meisten Rhizobieninfektionen, so dass nur eine begrenzte Anzahl von Knötchen innerhalb einer hochspezifischen anfälligen Zone gebildet wird, die sich direkt hinter der wachsenden Wurzelspitze befindet ( Vasse et al. 1993). In Medicago Truncatula, das Sichel Es wurde gezeigt, dass eine Mutation einen dramatischen Anstieg der Zahl der anhaltenden Rhizobieninfektionen verursacht, was zu einer Hypernodulation der anfälligen Zone der mutierten Wurzel führt (Penmetsa & Cook, 1997). Der letztere Phänotyp wurde einem zweiten Effekt derselben Mutation zugeschrieben, nämlich der allgemeinen Unempfindlichkeit der mutierten Pflanze gegenüber dem Hormon Ethylen (Penmetsa & Cook, 1997). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ethylen zusätzlich zu seinen gut charakterisierten Funktionen in der Pflanzenentwicklung auch am Signalweg beteiligt ist, der die rhizobiale Nodulation von Hülsenfrüchten steuert. Eine Rolle des Pflanzenhormons Ethylen in mehreren anderen Aspekten der symbiotischen Entwicklung ist für zumindest einige Hülsenfrüchte-Pflanzenarten gut dokumentiert (Fernandez-Lopez et al. 1998 Grobbelaar et al. 1970 Heidstraße et al. 1997 für eine neuere Übersicht siehe Hirsch & Fang, 1994). Es wurde jedoch gezeigt, dass ethylenunempfindliche Mutanten von Sojabohnen ein Wildtyp-Knötchenmuster aufweisen ( Schmidt et al. 1999). Es ist derzeit unklar, ob der Unterschied zwischen den Wirkungen von Ethylen und/oder Ethylenempfindlichkeit auf die Knöllchenbildung bei Sojabohnen und anderen Hülsenfrüchten eine unterschiedliche Rolle dieses Hormons bei der Regulierung der Knöllchenentwicklung widerspiegelt.

Neben der Begrenzung der Anzahl persistierender Rhizobieninfektionen innerhalb der wurzelanfälligen Zone übt die Pflanze auch eine räumliche und zeitliche Kontrolle der Wurzelanfälligkeit für Knötchenbildung aus. Dieser Mechanismus wird als Autoregulation oder Rückkopplungsregulation der Nodulation bezeichnet und beinhaltet die Hemmung der Nodulationsbildung auf jüngeren Wurzelgeweben durch vorherige Nodulationsereignisse in älteren Wurzelregionen (Kosslak & Bohlool, 1984 Nutman, 1952 Pierce & Bauer, 1983). Die Autoregulation macht die Wurzelzellen nur vorübergehend anfällig für eine Rhizobieninfektion, was zu einer engen Infektionszone und Knötchendifferenzierung führt (Anfälligkeitszone Bhuvaneswari et al. 1981). Pflanzen, die in diesem Mechanismus defekt sind, knötchen weiter auf neu entstehenden Wurzeln und bilden eine große Anzahl von Knöllchen über das gesamte Wurzelsystem (Hypernodulation oder Supernodulation Phänotyp). Basierend auf Experimenten mit geteiltem Wurzelsystem und Verpflanzung zwischen Wildtyp- und Supernodulationsmutantenpflanzen wurde ein Zusammenspiel zwischen lokalen und systemischen Signalereignissen bei der Etablierung der autoregulatorischen Kontrolle der Nodulation postuliert ( Caetano-Anolles et al. 1991 Sheng & Harper, 1997). Ähnliche Experimente haben Blattgewebe als die Hauptquelle der systemischen Signale identifiziert, was eine Fernkommunikation zwischen der Wurzel und dem Spross bei der Autoregulation der Knötchenzahl impliziert. Eine lokale, nicht-systemische Kontrolle durch vollreife Knötchen über das Auswachsen jüngerer Knötchenereignisse wurde ebenfalls postuliert ( Caetano-Anolles et al. 1991 Nutman, 1952). Die genaue Natur der an der Autoregulation beteiligten Mechanismen ist nicht bekannt und die Identität der postulierten systemischen und lokalen Signalverbindungen bleibt unbekannt. Es ist jedoch verlockend zu spekulieren, dass die autoregulatorische Reaktion zumindest teilweise auf dem Mechanismus des Erfassens und Regulierens von Zellteilungen beruht und somit einen Teil eines allgemeineren Mechanismus darstellen könnte, der das Pflanzenwachstum reguliert. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass andere Pflanzenentwicklungsprozesse als die Knötchenbildung, wie z et al. 1989 Nutman, 1952). Umgekehrt haben Mutationen, die die autoregulatorische Reaktion beeinträchtigen, verschiedene pleiotrope Effekte auf das Pflanzenwachstum und führen fast immer zu einer hoch nitrattoleranten Symbiose (effiziente Nodulation in Gegenwart von hohem Nitrat nts Phänotyp). Nitrat (NO3 – ) moduliert das Pflanzenwachstum und übt komplexe Auswirkungen auf die Wurzelentwicklung, Symbiontenerkennung und Nodulation aus ( Dazzo & Brill, 1978 Gresshoff, 1993 Zhang et al. 1999). Gemeinsame Faktoren können an den Mechanismen beteiligt sein, die das Ausmaß der Knötchenbildung, der Nitrathemmung und anderer verwandter Pflanzenwachstumsreaktionen (z. B. Seitenwurzelbildung) regulieren. Alternativ können enge Interaktionen zwischen spezifischen Regulationswegen (z. B. autoregulatorische und Nitrat-Hemmwege) ausreichend sein, um die pleiotropen Wirkungen einer einzelnen Mutation in einem der Kontrollelemente zu erklären. Das Verständnis der Natur der regulatorischen Prozesse, die die Knöllchendifferenzierung und Knöllchenzahl steuern, und ihre Integration in die Gesamtmechanismen, die das Wurzelwachstum und die Wurzelentwicklung steuern, sind wichtige Elemente unserer Suche nach einem Verständnis der symbiotischen Stickstofffixierung in Hülsenfrüchten.

Wir haben bereits Pflanzenmutanten aus der diploiden Hülsenfrucht identifiziert Lotus Japonicus die einen Ort definieren, der die normale Wurzelentwicklung kontrolliert. Es wurde festgestellt, dass dieselben Mutationen der mutierten Pflanze eine abweichende Reaktion auf die Herausforderung durch symbiotische Rhizobien verleihen, was zu Hypernodulation und abnormalen Pflanzenwachstumsphänotypen führt ( de Bruijn et al. 1998 Schauser et al. 1998 Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b). Hier präsentieren wir eine detaillierte Charakterisierung dieser mutierten Linien und zeigen, dass die zugrunde liegenden Mutationen die Pflanzenentwicklung beeinflussen, indem sie die Position und Dauer des Wurzelzellwachstums verändern.


Ergebnisse

Isolierung und genetische Analyse von hypernodulierten aberranten Wurzelbildungsmutanten (Har) von L. japonicus

Wir haben zuvor die Isolierung von zwei allelischen EMS-induzierten Mutantenlinien von . beschrieben L. japonicus Ökotyp Gifu (Ljsym34-1 und Ljsym34-2), die sowohl ungewöhnliche symbiotische (hypernodulierte) als auch drastisch veränderte Phänotypen der Wurzelentwicklung (aberrante Wurzel) aufweisen ( de Bruijn et al. 1998 Szczyglowski et al. 1998a siehe Abb. 1). Darüber hinaus identifizierten wir eine unabhängige mutierte Linie aus einem T-DNA-Mutagenese-Experiment (sym16) mit einem sehr ähnlichen Phänotyp, aber es wurde festgestellt, dass der mutierte Phänotyp genetisch nicht mit der T-DNA-Insertion verbunden ist ( Schauser et al. 1998). Das Allel Ljsym34-1 und Ljsym34-2 Mutationen wurden im Hinblick auf den aberranten Wurzel-Phänotyp als monogen-rezessiv und im Hinblick auf den symbiotischen Hypernodulations-Phänotyp als unvollständig dominant festgestellt ( Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b, Daten nicht gezeigt). Die sym16 Mutation war für alle Phänotypen monogen-rezessiv ( Schauser et al. 1998). Gegenseitige Kreuze ergaben, dass die Ljsym34-1/2 und sym16 Mutanten gehören zur gleichen Komplementierungsgruppe (Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit den kürzlich vorgeschlagenen Leitlinien für die genetische Nomenklatur für L. japonicus ( Stougaard et al. 1999 ) wurden die entsprechenden Allele umbenannt har1-1 (ehemals Ljsym34-1), har1-2 (früher Ljsym34-2), und har1-3 (früher sym16) und das entsprechende Wildtyp-Gen wurde benannt Har1. Basierend auf seinem etwas stärkeren mutierten Phänotyp, der har1-1 Allel wurde für eine weitere detaillierte Analyse ausgewählt.

Wurzel- und Nodulationsphänotypen von Wildtyp und har1 Mutant L. japonicus Pflanzen.

Die Pflanzen wurden 21 Tage lang in Gegenwart (ein Wildtyp und b har1-1) oder Abwesenheit (c har1-1) von Mezorhizobium loti NZP2235, mit 0,5 mm KNO3 in der Gießlösung. Die Felder (d) und (e) zeigen eine Nahaufnahme der knötchenförmigen Wurzeln, die in (a) bzw. (b) gezeigt sind. Panel (f) zeigt har1-3 3 Wochen in Gegenwart von Rhizobien und weitere 8 Wochen in stickstoffreichem Hornum-Wachstumsmedium mit 8 m m KNO . gezüchtet3 und 5 mm NH4 + ( Thykjaer et al. 1998 ).

Der symbiotische (hypernodulierte) Phänotyp der har1-1 Mutant

Impfung von L. japonicus har1-1 Pflanzen mit Mesorhizobium loti Stamm NZP2235 führte zu einer fast vollständigen Hemmung des Pflanzenwachstums und dem zuvor beschriebenen ungewöhnlichen Hypernodulationsphänotyp (Szczyglowski et al. 1998a siehe Abb. 1). Knötchenartige Strukturen, die fast das gesamte Kurzwurzelsystem bedeckten, entwickelten sich gleichzeitig mit der Hemmung des Pflanzenwachstums und der Verschlechterung der allgemeinen Pflanzenvitalität (Hypernodulationsreaktion, HNR, Phänotyp Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b). Um diesen neuartigen Hypernodulationsphänotyp weiter zu untersuchen, wurde ein Derivat von M. loti Stamm NZP2235, der ein konstitutiv exprimiertes hemA::lacZ Reportergenfusion, wurde verwendet, um frühe Ereignisse während der Infektion von Wildtyp- und har1-1 mutierte Pflanzen. Mikroskopische Analysen zeigten, dass die Art des primären Eintritts von Rhizobien in har1-1 mutierte Wurzeln wurden durch Infektionsfäden in deformierten Wurzelhaaren initiiert, wie bei Wildtyp-Pflanzen. Andere frühe Infektionsereignisse wie Wurzelhaardeformation (Had), Haarlocken (Hac) und Infektionsfadenbildung (Inf) waren ebenfalls ähnlich in har1-1 Mutanten- und Wildtyp-Pflanzen (Daten nicht gezeigt). Es wurde jedoch festgestellt, dass sich die nachfolgenden Stadien der symbiotischen Entwicklung signifikant unterscheiden. Bei Wildtyp-Pflanzen wurde festgestellt, dass die Mehrheit der Primärinfektionsereignisse früh während der symbiotischen Entwicklung gestoppt wurden, ohne das Stadium einiger kortikaler Zellteilungen zu überschreiten, was zu 9–15 stickstofffixierenden Knötchen auf dem oberen Teil der vollständig verlängerten 21 Tage alt L. japonicus Wildtyp-Wurzeln (siehe Abb. 1a,d). Im Gegensatz dazu Wurzeln von har1-1 mutierte Pflanzen hatten 11 Tage nach der Inokulation mit Rhizobien viel häufigere Herde kortikaler Zellteilungen als Wildtyp-Wurzeln, die sich fast über die gesamte Länge der Wurzel erstreckten ( 2 und 3a , b). Diese anfänglichen kortikalen Zellteilungen führten zu Knötchenprimordien und anschließend zu einer Masse von Knötchen, die fast die gesamte Wurzel bedeckt (Abb. 1e,f und 3c,d). Darüber hinaus Knötchen-Morphogenese auf har1-1 Es wurde festgestellt, dass mutierte Pflanzen gegenüber normalerweise hemmenden Konzentrationen von kombiniertem Stickstoff unempfindlich sind (5–15 m·m NO3 – ). Sechs Wochen nach der Impfung mit Rhizobien, har1-1 mutierte Pflanzen entwickelten in Gegenwart hoher Konzentrationen von Nitrat (5–15 m m ) oder Ammoniak (1–3 m m ) ungefähr 40–60 Knötchen. Im Gegensatz dazu ist die Knötchenentwicklung bei Kontrollwildtyp L. japonicus Pflanzen wurden durch kombinierte Stickstoffquellen stark gehemmt. Zum Beispiel in Gegenwart von 15 m m KNO3 nur wenige kleine knötchenartige Strukturen (Bumps) wurden beobachtet. Bei Kultivierung in Gegenwart einer geringen Konzentration von KNO3 (0,5 mm ), 21 Tage alte Knötchen auf har1-1 mutierte Pflanzen waren signifikant kleiner als Wildtyp-Knötchen gleichen Alters (Daten nicht gezeigt). Trotz des Größenunterschieds licht- und Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung der infizierten Zone der gebildeten Knötchen auf har1-1 Pflanzen zeigten eine normale (Wildtyp-ähnliche) Zytologie und Histologie (Abb. 3e,f). Außerdem bildeten sich Knötchen auf har1-1 Mutantenwurzeln hatten die Fähigkeit, Stickstoff zu fixieren (Acetylen zu reduzieren) auf Niveaus, die mit Wildtyp-Knötchen vergleichbar waren, wenn auf Pflanzenbasis berechnet (Daten nicht gezeigt).

Infektions- und Nodulationsereignisse bei Wildtyp und har1-1 Pflanzen nach der Impfung mit M. loti-Stamm NZP2235 trägt a hemA:lacZ Reportergen-Fusion.

Die Wurzeln wurden auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt und unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie untersucht. Offene Balken bezeichnen die Anzahl der Wurzelhaare mit sichtbaren Infektionsfäden, durchgezogene Balken zeigen die Anzahl der Knötchen und Knötchenprimordien an. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von Messungen von 7 bis 15 Pflanzen. Fehlerbalken repräsentieren 95 % Konfidenzintervalle.

Mikroskopische Analyse der symbiotischen Entwicklung in Wildtyp und har1-1 Pflanzen.

(a,b) Hellfeldmikroskopische Aufnahmen von geklärtem Wildtyp und har1-1 mutierte Wurzeln 11 Tage nach Infektion mit M. loti NZP2235. Knötchenprimordien sind durch Pfeile gekennzeichnet. (c,d) Montagen der Nodulationsphänotypen von Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen 14 Tage nach Inokulation mit M. loti NZP2235 trägt a hemA:lacZ Reportergen-Fusion. Die Wurzeln wurden auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt und unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie untersucht. (e,f) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der zentralen Zone von Wildtyp und har1-1 mutierte Knötchen, die infizierte Wirtszellen zeigen, die mit bakteriellen Endosymbionten gefüllt sind, und ein Teil benachbarter, stark vakuolisierter, nicht infizierter Zellen.

Der nicht-symbiotische (aberrante Wurzelbildung) Phänotyp der har1-1 Mutant

Ungeimpft L. japonicus har1-1 mutierte Pflanzen entwickeln im Vergleich zu Wildtyppflanzen ein deutlich verkürztes Wurzelsystem und eine erhöhte Anzahl von Seitenwurzeln ( Szczyglowski et al. 1998a). Um diesen Phänotyp weiter zu analysieren, untersuchten wir die seitliche Wurzelbildung bei ungeimpften har1-1 und Wildtyp-Primärwurzeln und fanden keine signifikanten Unterschiede in ihrer Position relativ zur Wurzelspitze, da fast alle LRPs in einer Region von 0,75–4,5 cm von der Wurzelspitze gefunden wurden. Allerdings war die Dichte der Seitenwurzelprimordien und der entstandenen Seitenwurzeln (Anzahl pro Längeneinheit der Wurzel) in der mindestens dreimal höher har1-1 mutant als in Wildtyp-Pflanzen (Daten nicht gezeigt). Detaillierte Untersuchung der mittleren Längsschnitte von ungeimpften har1-1 Wurzelproben ca. 2 cm über der Wurzelspitze zeigten eine signifikant höhere mitotische Aktivität in der Wurzelperizykelschicht von har1-1 gegen Wildtyp-Wurzeln ( Fig. 4a,b). In 9 Tage alten Wurzeln der har1-1 In allen untersuchten Schnitten wurden mutante, periklinale Zellteilungen im Pericyclus sowie die Entwicklung von zwei oder drei neuen Zellschichten nachgewiesen. Auch in Abschnitten von har1-1 mutierte Wurzeln, und in einigen Fällen wurden gut entwickelte Seitenwurzelprimordien beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten Wildtyp-Wurzeln ähnlichen Alters nur eine begrenzte mitotische Aktivität im Perizyklus, der meist aus einer einzelnen Zellschicht bestand ( Abb. 4a,b). Laterale Wurzelprimordien wurden nur selten in Abschnitten von Wildtypwurzeln beobachtet.

Mitotische Aktivität des Wurzel-Pericyclus bei Wildtyp und har1-1 mutierte Wurzeln.

(a,b) Median-Längsschnitt von Segmenten von 9 Tage alten ungeimpften Wurzeln des Wildtyps (a) und har1-1 (b) mutierte Pflanzen ungefähr 2 cm über der Wurzelspitze. Pfeile zeigen die perizyklische Zellschicht an.

Wurzel- und Spross-Phänotyp der har1-1 Mutant

Der Kurzwurzel-Phänotyp von L. japonicus har1-1 Pflanzen wurde bereits dokumentiert ( de Bruijn et al. 1998 Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b). Um diesen Phänotyp quantitativ weiter zu beurteilen, wurde das Längswachstum von ungeimpften und geimpften har1-1 und Wildtyp-Wurzeln wurde gemessen. Für ungeimpftes . wurde eine durchschnittliche Wurzellänge von 61,3 ± 0,2 mm beobachtet har1-1 Pflanzen 21 Tage nach der Aussaat versus 131,9 ± 1,0 mm für ungeimpfte Wildtyp-Kontrollpflanzen ( Fig. 5a). Außerdem ist die Wurzelmasse von ungeimpften har1-1 Pflanzen 21 Tage nach der Aussaat (26 ± 2 mg Frischgewicht) war signifikant kleiner als die der Wildtyp-Pflanzen (45 ± 6 mg). Das Abweichende har1-1 Der Phänotyp des Wurzelwachstums war noch extremer, wenn die Pflanzen mit geimpft wurden M. loti Stamm NZP2235. Wurzelwachstum von har1-1 die Pflanzen hörten innerhalb der ersten Tage nach der Inokulation vollständig auf und die Wurzeln überstiegen eine durchschnittliche Länge von 20 ± 1,5 mm nicht (Abb. 5b). Die Sprossmasse der beimpften har1-1 Pflanzen war auch bei infizierten Pflanzen signifikant reduziert, während sie bei ungeimpften . vergleichbar war har1-1 gegen Wildtyp-Sprossen ( Fig. 5c, d).

Wachstumskinetik von Wurzeln und Trieben von Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen in Gegenwart oder Abwesenheit von M. loti.

(a,b) Wurzelwachstumskinetik von nicht beimpften (a) und beimpften (b) Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen. (c,d) Triebwachstumskinetik von ungeimpftem (c) und geimpftem (d) Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen. Alle Pflanzen wurden in der Gegenwart von 0,5 mm KNO . gezüchtet3. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von Messungen von mindestens 30 Pflanzen. Fehlerbalken repräsentieren 95 % Konfidenzintervalle.

Zytologie von har1-1 mutierte Wurzeln

Nachdem festgestellt wurde, dass mehrere Wurzelentwicklungsparameter (Wurzellänge/-dehnung, Seitenwurzelbildung und Gesamtwurzelmassenakkumulation) im har1-1 mutierte Linie, der Phänotyp der har1-1 mutierte Wurzeln wurde weiter analysiert. Erstens, die zelluläre Organisation von Wildtyp L. japonicus Wurzeln untersucht. Primär L. japonicus Es wurde festgestellt, dass die Wurzeln eine äußere einzelne Schicht epidermaler Zellen, 3–5 unregelmäßig geformte kortikale Zellschichten, die eine einzelne Schicht endodermaler Zellen umgeben, eine innerste Region, die aus einer einzelnen Schicht perizyklischer Zellen besteht, die den Gefäßzylinder umschließt, und einen distal gelegenen Bereich enthalten von Wurzelkappenzellen. Die gleiche allgemeine Organisation der Wurzelzellschichten wurde in gefunden har1-1 mutierte Wurzeln ( Fig. 6). Es wurden jedoch mehrere signifikante Unterschiede beobachtet. Die Vakuolisierung, die typischerweise mit der Zellexpansion einhergeht, trat näher an der Wurzelspitze auf har1-1 gegen Wildtyp-Wurzeln ( Fig. 6a, b). Außerdem ist der Durchmesser der Mutante har1-1 Wurzeln (0,23 ± 0,03 mm), gemessen anhand digitalisierter Aufnahmen lebender Wurzeln in 3–6 mm Entfernung von der Wurzelspitze, war signifikant kleiner als der durchschnittliche Durchmesser der entsprechenden Region des Wildtyps L. japonicus Wurzeln (0,31 ± 0,02 mm siehe auch Abb. 6c,d). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die folgenden zwei Hypothesen formuliert und getestet: (1) die har1-1 Mutation beeinflusst die radiale Organisation der L. japonicus Wurzel, und/oder (2) die verringerte Wurzellänge und -durchmesser ist das Ergebnis einer abnormalen (reduzierten) Zellexpansion.

Histologie der nicht-symbiotischen Wurzelentwicklung.

(a,b) Mediane Längsschnitte der Wurzelspitzenregionen von 9 Tage alten Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen, die die Gesamtanatomie der meristematischen Region und die Position der Zellverlängerungs-/Vakuolationszone zeigen. (c,d) Wurzelquerschnitte von 22 Tage alten Pflanzen etwa 600 µm über der Wurzelspitze, die Unterschiede im Ausmaß der Zellvakuolation und im Wurzeldurchmesser zeigen. (e,f) Querschnitte von reifen Wurzelregionen von 6 Tage alten Pflanzen ca. 1 cm über der Wurzelspitze.

Die har1-1 Mutation führt zu einer verminderten radialen Expansion der Wurzelzellen

Um die erste Hypothese (ein Defekt in der radialen Organisation der Wurzeln) zu überprüfen, wurde eine große Anzahl von Wurzelabschnitten mikroskopisch untersucht. Kein eindeutiger Beweis für eine oder mehrere fehlende Zellschichten oder eine verminderte Anzahl von Wurzelzellen in har1-1 mutierte Wurzeln wurden gefunden ( Fig. 6). Daher haben wir die zweite Hypothese (Änderungen der Wurzelzellexpansion) getestet, indem wir Abschnitte der vollständig differenzierten Region der Primärwurzeln analysierten ( Abb. 6e,f). Die durchschnittliche Gesamtquerschnittsfläche von har1-1 mutierte Wurzeln war fast zweimal kleiner als die der Wildtyp-Wurzel (Tabelle 1). Einzelne Zellschichten (Epidermis, Cortex, Endodermis und Wurzelstele) von har1-1 Mutantenwurzeln zeigten eine ähnliche Größenreduktion und trugen fast gleichermaßen zur Gesamtverringerung des Wurzeldurchmessers bei (Tabelle 1). Anschließend wurde die projizierte Querschnittsfläche einzelner Wurzelzellen analysiert, um zu bestimmen, ob die radiale Zellexpansion verändert war har1-1 mutierte Wurzeln. Die radialen Oberflächenbereiche einzelner Zellen der Epidermis, des Kortex und der Endodermis von Wurzeln hatten eine Häufigkeitsverteilung, die für die auf einen viel kleineren Größenbereich beschränkt war har1-1 Mutante ( Abb. 7), was darauf hindeutet, dass die har1-1 Mutation schränkt die Fähigkeit der Wurzelzellen ein, sich auszudehnen.

Gewebe Wildtyp (a) har1-1 (B) b/a-Verhältnis
Gesamtabschnitt 62357 ± 14772 33786 ± 4845 0.54
Epidermis 10073 ± 2250 5626 ± 760 0.56
Kortex 45228 ± 11283 24433 ± 3820 0.54
Endodermis 2097 ± 373 1387 ± 175 0.66
Stele 5070 ± 1033 2655 ± 513 0.52

Radiale Expansion der Wurzelzellen in Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen.

Dargestellt ist die Häufigkeitsverteilung der Querschnittsfläche von epidermalen (a), kortikalen (b) und endodermalen (c) Zellen von 6 Tage alten Pflanzen, gemessen an einer Stelle von etwa 1 cm über der Wurzelspitze. Zehn Wildtyp- und Mutantenpflanzen wurden analysiert und jeder Punkt repräsentiert einen Häufigkeitswert für Zellgrößenbereichsinkremente von 35 µm (Epidermis), 200 µm (Kortex) und 20 µm (Endodermis). n, steht für die Anzahl der gemessenen Zellen.

Die Länge der meristematischen Region wird verkürzt um har1-1 mutierte Wurzeln

Um zu untersuchen, ob der Kurzwurzel-Phänotyp von har1-1 mutierte Pflanzen wurde durch eine Änderung der primären Richtung der Zellexpansion entlang der apikal-basalen Achse verursacht, die Länge von har1-1 Wurzelepidermiszellen wurden gemessen. Die durchschnittliche Länge der vollständig expandierten Epidermiszellen von har1-1 mutierte Wurzeln (138 ± 30 µm) waren fast gleich denen von Wildtyp-Wurzeln (132 ± 30 µm), was darauf hindeutet, dass die har1-1 Mutation hatte keinen Einfluss auf die longitudinale Zellexpansion der Epidermis ( Fig. 8a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass es unwahrscheinlich ist, dass der Kurzwurzel-Phänotyp der mutierten Pflanze auf eine abnormale Längenausdehnung der Wurzelzellen zurückzuführen ist. In Übereinstimmung mit unseren früheren Beobachtungen (siehe oben) sind jedoch epidermale Zellen der har1-1 mutierte Wurzeln zeigten Anzeichen einer Verlängerung entlang der Längsachse, die signifikant näher an der Wurzelspitze lag (daher früher in der Entwicklung) als Wildtyp-Wurzeln ( 8a ). Transmissions-Hellfeld-Mikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie ganzer geklärter Wurzeln, die mit Acetocarmin gefärbt wurden, ergaben einen Bereich dichter zytoplasmatischer Zellen, der die meristematische Wurzelregion bildete, deren Grenzen durch interaktive Schwellenwerttechniken unter Verwendung digitaler Bildverarbeitung definiert werden konnten. In unabhängigen Experimenten mit beiden Mikroskopiearten wurde eine ca. 2,6-fache Verkleinerung der projizierten Fläche des har1-1 Mutante versus Wildtyp-Wurzel-meristematische Regionen wurden nachgewiesen (45082 ± 4373 μm 2 n = 11 gegenüber 121635 ± 12545 μm 2 , n = 19 siehe auch Abb. 8b). Diese Verkleinerung der meristematischen Wurzelregion war unweigerlich mit einer akropetalen Verschiebung der Wurzelzelldehnungs-/Vakuolations- und Vaskularisierungszonen verbunden (Abb. 8b). har1-1 mutierte Wurzeln zeigten im Vergleich zum Wildtyp ebenfalls eine unterlegene Wurzelkappenstruktur, blieben jedoch gravitrop (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich wurde der Mitoseindex gemessen, um den Anteil mitotischer Zellen in den meristematischen Wurzelregionen von . abzuschätzen har1-1 gegen gleichaltrige Wildtyp-Pflanzen, es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede gefunden (har1-1 Mutanten-MI = 3,8 ± 0,8 gegenüber Wildtyp-MI = 3,96 ± 0,7).

Wurzelzell-Elongation und Größe der meristematischen Region in Wildtyp- und har1-1 mutierte Pflanzen.

(a) Epidermiszelllänge entlang der Wurzelachse. Jeder Punkt stellt den mittleren Zelllängenwert für Bereichsinkremente von 250 µm (für die ersten 4 mm von der Wurzelspitze) und 500 µm (zwischen 4 und 11 mm von der Wurzelspitze) entlang der Wurzelachse dar. Einzel- und Doppelpfeile zeigen signifikante Unterschiede zwischen der mittleren epidermalen Zelllänge an zwei aufeinanderfolgenden und äquivalenten Positionen in Wildtyp- und har1-1 mutierte Wurzeln. (b) Intakte Wurzeln von 14 Tage alten Pflanzen, gefärbt mit Acetocarmin. Die rot gefärbten meristematischen Regionen des Wildtyps und har1-1 Mutantenwurzeln erscheinen als dunkle Bereiche, und ihre Ausdehnung wird durch die Klammern angezeigt.

Wirkung von Hormonen auf har1-1 mutierte Wurzelverlängerung

Die groben Veränderungen in har1-1 Wurzelmorphologie deutete darauf hin, dass die hormonelle Regulation der mutierten Wurzelentwicklung gestört sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Auswirkungen exogener Hormonapplikationen auf die Wurzelverlängerung von Wildtyp- und har1-1 mutierte Wurzeln wurden mit einem eigens dafür entwickelten Plattenbioassay untersucht. Es wurde festgestellt, dass Saccharose in einer relativ hohen Konzentration (4,5 %) erforderlich ist, um die maximale und gleichmäßige Wurzelverlängerung von Wildtyp und . zu unterstützen har1-1 mutierte Wurzeln. Die Wurzeln von Wildtyppflanzen verlängerten sich im Dunkeln schneller als im Licht, insbesondere in den ersten 2-3 Tagen des Wachstums, danach verschwand der Unterschied in der Wachstumsrate ( Abb. 9a). har1-1 mutierte Pflanzen bildeten kurze Wurzeln, wenn sie im Dunkeln unter Bedingungen kultiviert wurden, die ein maximales Wildtyp-Wurzelwachstum ermöglichten. Eine dramatische Hemmung oder Verzögerung der Wurzelverlängerung wurde nach 2 Tagen Inkubation im Dunkeln beobachtet. Interessanterweise wurde der Kurzwurzel-Phänotyp teilweise unterdrückt, wenn har1-1 mutierte Pflanzen wurden im Licht gezüchtet ( Fig. 9b).

Einfluss von Licht auf die Elongationsraten von Wildtyp und har1-1 mutierte Wurzeln.

(a) Die Raten der Wildtyp-Wurzelverlängerung. (b) Die Raten von har1-1 mutierte Wurzelverlängerung. Jeder Wert ist der Mittelwert von Messungen an 20 Pflanzen. Fehlerbalken repräsentieren 95 % Konfidenzintervalle.

Schon seit har1-1 Wurzeln zeigten ein abnormales Muster der radialen Expansion der Wurzelzellen sowie eine Hypernodulationsreaktion (siehe Abb. 1, 3d und 6), und da der Hypernodulations-Phänotyp von a Medicago Truncatula mutant (Sichel) mit einer Änderung der Ethylensensitivität (Penmetsa & Cook, 1997), der Sensitivität von Wildtyp- und har1-1 Keimlinge des Ethylenvorläufers 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure (ACC) untersucht. Bei vertikaler Kultivierung im Dunkeln auf Agarplatten mit steigenden Konzentrationen von ACC, sowohl Wildtyp als auch har1-1 mutierte Sämlinge zeigten das gleiche allgemeine Empfindlichkeitsmuster gegenüber Ethylenhemmung des Wurzelwachstums ( Fig. 10a). In zwei unabhängigen Experimenten wurde jedoch har1-1 Mutantenwurzeln zeigten eine leicht erhöhte Resistenz gegenüber bestimmten Konzentrationen von ACC im Vergleich zu Wildtyp-Wurzeln (z. B. 1 × 10 –7 bis 1 × 10 –6 M ACC in Abb. 10a). Um die beobachtete Abnahme der Sensitivität des har1-1 mutierten Linie von ACC untersuchten wir die Reaktionen ganzer Sämlinge auf exogen appliziertes ACC. Bei der Kultivierung im Dunkeln in Gegenwart von ACC werden sowohl Wildtyp als auch har1-1 Sämlinge zeigten eine typische Dreifachantwort (Guzman & Ecker, 1990), bestehend aus einer Verkürzung des Hypokotyls, einer Hemmung der Wurzelverlängerung und einer Übertreibung der apikalen Hakenkrümmung (Abb. 11). Beide Genotypen zeigten hinsichtlich der Hypokotyllänge ein ähnliches Maß an Sensitivität gegenüber ACC (Daten nicht gezeigt).

Wildtyp und har1-1 Wurzelwachstum in Gegenwart steigender Konzentrationen von exogen applizierten Pflanzenhormonen.

Die relative Elongation von Wildtyp und har1-1 mutierte Wurzeln in Gegenwart von (a) 1-Aminocyclopropan-1-carboxilsäure (ACC) (b) α-Naphthalin-Essigsäure (NAA) oder 6-Benzylaminopurin (BA) gezeigt. Jeder Wert ist der Mittelwert von Messungen an 20 Pflanzen. Fehlerbalken repräsentieren 95 % Konfidenzintervalle. Der Mittelwert von 100 % Wurzelwachstum in (a) Wildtyp, 44,5 ± 3,4 mm har1-1 21,8 ± 1,2 mm in (b) Wildtyp, 56,9 ± 2,4 mm har1-1, 25,8 ± 1,6 mm (c) Wildtyp 37,1 ± 1,9 har1-1, 21,6 ± 1,1 mm.

Dreifache Reaktion auf ACC von Wildtyp und har1-1 mutierte Pflanzen.

Wildtyp und har1-1 mutierte Samen wurden auf MS-Medium im Dunkeln bei 28°C in Abwesenheit (0) oder Anwesenheit von steigenden Konzentrationen (1–100 mm) von ACC keimen lassen. Das Foto wurde 6 Tage nach der Inkubation im Dunkeln aufgenommen. Die Dreifachantwort ist gekennzeichnet durch verkürzte Hypokotyle, Wurzeln und übertriebene apikale Hakenbildung.

Anschließend wurde die Wirkung des Auxins α-Naphthalin-Essigsäure (NAA) auf das Wurzelwachstum untersucht. Wildtyp und har1-1 mutierte Wurzeln zeigten ein ähnliches allgemeines NAA-Empfindlichkeitsmuster, aber, wie bei ACC beobachtet, Wurzeln von har1-1 mutierte Pflanzen zeigten bei höheren Konzentrationen von NAA einen leichten NAA-unempfindlichen Phänotyp ( Fig. 10b).

In Arabidopsis, Cytokinin hemmt die Wurzelverlängerung bei hell und dunkel gewachsenen Sämlingen aufgrund der Stimulation der endogenen Ethylenproduktion ( Cary et al. 1995). Daher ist die Empfindlichkeit von Wildtyp- und har1-1 mutierte Wurzeln zu exogen appliziertem Cytokinin (also endogen produziertes Ethylen) wurden ebenfalls untersucht. Das synthetische Cytokinin 6-Benzylaminopurin (BA) schon in sehr geringen Konzentrationen (10–50 nm ) reduzierte das Wurzelwachstum in beiden Genotypen signifikant. Jedoch wieder die har1-1 mutierte Wurzeln zeigten eine mäßig höhere Resistenz gegenüber einem breiten Bereich von BAP-Konzentrationen als Wildtyp-Wurzeln ( Fig. 10c). Dieser leicht erhöhte Widerstand von har1-1 mutierte Wurzel könnte entweder auf eine veränderte Ethylen-unabhängige Reaktion auf Cytokinin, eine verminderte Cytokinin-stimulierte Ethylenproduktion und/oder eine abgeschwächte Reaktion auf endogen produziertes Ethylen zurückzuführen sein. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde der Einfluss von exogen zugesetztem Cytokinin auf die Hemmung des Wurzelwachstums in Gegenwart von Silberionen untersucht, die als Silberthiosulfat zur Hemmung der Ethylenbindung (Beyer, 1979) oder Aminoetoxyvinylglycin (AVG, Yang & Hoffman, 1984) angewendet wurden ) zur Hemmung der Ethylenbiosynthese. Da 50 nanomolare BA die Wurzelverlängerung in beiden Genotypen fast maximal hemmten, verwendeten wir diese Cytokininkonzentration in Kombination mit variablen Inhibitorkonzentrationen.

In Abwesenheit von BA hatte Ag + nur eine begrenzte stimulierende Wirkung auf das Wachstum/die Verlängerung von Wildtyp- und har1-1 mutierte Wurzeln ( Fig. 12a). Fünf μM Ag + reichten aus, um alle hemmenden Wirkungen von Cytokinin auf zu überwinden har1-1 mutierte Wurzeln, wohingegen 5 µm Ag + das Wurzelwachstum des Wildtyps auf ein Niveau von etwa 60 % des von unbehandelten Kontrollwurzeln wiederherstellten ( Fig. 12b).

Wirkung von BA auf die Verlängerung des Wildtyps und har1-1 mutierte Wurzeln in Gegenwart von Ethylen-Wahrnehmungs-/Synthesehemmern.

Die relative Elongation von Wildtyp und har1-1 Mutantenwurzeln in Gegenwart von (a) Ag + (b) BA plus Ag + (c) AVG und (d) BA plus AVG sind gezeigt. Mittelwert von 100 % Wurzelwachstum in (a) und (b) Wildtyp, 41,6 ± 3,0 mm har1-1, 23,3 ± 1,2 mm in (c) und (d) Wildtyp, 47,5 ± 4,0 mm har1-1, 23,2 ± 1,6 mm. Weitere Details siehe Legende zu Abb. 10.

Eine ähnliche Reihe von Experimenten wurde mit einem Inhibitor der Ethylensynthese, AVG, durchgeführt. In Kontrollexperimenten hatte eine AVG-Konzentration von 0,1 µm oder weniger keine messbare Wirkung auf das Wurzelwachstum in beiden Genotypen (Abb. 12c), während höhere Konzentrationen stark hemmend wirkten (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zur silbervermittelten phänotypischen Suppression wurde festgestellt, dass eine niedrige AVG-Konzentration (0,1 μm) die gesamte durch Cytokinin verursachte Hemmung aufhebt und bei Wildtyp-Pflanzen einen normalen Phänotyp mit langen Wurzeln wiederherstellt ( Abb. 12d ). Allerdings ist die har1-1 mutierte Pflanzen reagierten unterschiedlich auf dieselbe Behandlung, nicht nur durch die Wiederherstellung eines Phänotyps mit kurzen Wurzeln, sondern auch durch eine zusätzliche Stimulierung des Wurzelwachstums. Der letztere Effekt führte dazu, dass die mutierten Pflanzen lange Wurzeln entwickelten, die sich mit der gleichen Geschwindigkeit verlängerten wie Wildtyp-Wurzeln. Eine längere Inkubation (mehr als 10 Tage) von Wildtyp und Mutant har1-1 Pflanzen in Gegenwart von Cytokinin und AVG führten zu einem vollständigen Stopp ihres Wurzelwachstums. Es wurde festgestellt, dass dieser Effekt mit einer terminalen Differenzierung des Wurzelmeristems verbunden ist, wodurch Experimente mit längeren Behandlungszeiten ausgeschlossen wurden (Daten nicht gezeigt).


5.15: Stickstofffixierung - Biologie

Advanced A/AS Level Chemistry: Mehr über Formen anorganischer Moleküle und Ionen

Doc Browns Advanced A Level Chemistry

Revisionsnotizen zur theoretischen Physikalischen Chemie

Die Formen von Molekülen und Ionen und Bindungswinkel in Bezug auf ihre elektronische Struktur

Teil 2 Einige andere Moleküle und Ionen von Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Chlor

Eine Beschreibung, Erklärung, Formen und Bindungswinkel des Carbonation, Nitrat(III)-Ion (Nitrit-Ion), Nitrat(V)-Ion (Nitration), Stickstoff(IV)-Oxid (Stickstoffdioxid), Nitronium-Ion, Schwefel(IV ) Oxid (Schwefeldioxid), Schwefel(VI)-Oxid (Schwefeldioxid), Sulfat(IV)-Ion (Sulfat-Ion), Schwefel(VI)-Ion (Sulfat-Ion), Chlorat(III)-Ion, ClO2 - (Chlorition), Chlorat(V)-Ion, ClO3 - (Chloration) und das Chlorat(VII)-Ion, ClO4 - (Perchloration) werden alle beschrieben und besprochen. Alles ist beschrieben und erklärt!

Molekülformen, Punkt- und Kreuzdiagramme, Bindungswinkel für ausgewählte Moleküle und Ionen von Stickstoff, Schwefel und Chlor unter Verwendung des Valenzschalen-Elektronenpaar-Abstoßungsmodells (VSEPR) und der Punkt- und Kreuzdiagramme (ox) werden im "Lewis-Stil" dargestellt. Die 'Gekritzel' werden irgendwann durch ordentliche Diagramme ersetzt!

  • Carbonat-Ion, CO3 2- ist trigonal-planar mit einem O-C-O-Bindungswinkel von 120 o, da drei Gruppen von Bindungselektronen und keine einsamen Elektronenpaare vorhanden sind.
  • Die Form wird unten unter Verwendung von Punkt- und Kreuzdiagrammen und der VSEPR-Theorie abgeleitet und unten veranschaulicht.
  • Beachten Sie, dass alle C-O-Bindungen aufgrund der Delokalisierung einiger der Elektronen identisch sind ( σ Sigma und π Pi-Bindung)

Valenzbindungspunkt- und Kreuzdiagramm für das Carbonat-Ion

    Stickstoff(IV)-oxid, NO2 (Stickstoffdioxid) ist gebogen geformt (eckig), O-N-O-Bindungswinkel

Valenzbindungs-Punkt- und Kreuzdiagramme für Stickoxide und Stickstoffoxyanionen

  • Beachten Sie, dass alle N-O-Bindungen innerhalb des Moleküls oder Ions aufgrund der Delokalisierung einiger Elektronen identisch sind ( σ Sigma und π Pi-Bindung)

    Schwefel(IV)-oxid, SO2 (Schwefeldioxid/Schwefeldioxid) Molekül ist eine gebogene Form (eckig), O-S-O-Bindungswinkel

Valenzbindungs-Punkt- und Kreuzdiagramme für Schwefeloxide und Schwefeloxyanionen

  • Beachten Sie, dass alle S-O-Bindungen innerhalb des Moleküls oder Ions aufgrund der Delokalisierung einiger Elektronen identisch sind ( σ Sigma und π Pi-Bindung)

    Das Chlorat(III)-Ion, ClO2 - (Chlorition) , ist gebogen (eckig) , O-Cl-O-Bindungswinkel

Valenzbindungs-Punkt- und Kreuzdiagramme für ausgewählte Chlorationen

  • Beachten Sie, dass alle Cl-O-Bindungen innerhalb des Moleküls oder Ions aufgrund der Delokalisierung einiger Elektronen identisch sind ( σ Sigma und π Pi-Bindung)

Revisionshinweise für GCE Advanced Subsidiary Level AS Advanced Level A2 IB Revise AQA GCE Chemistry OCR GCE Chemistry Edexcel GCE Chemistry Salters Chemistry CIE Chemistry, WJEC GCE AS A2 Chemistry, CCEA/CEA GCE AS A2 Chemie-Revisionskurse für Voruniversitäre (gleich US-Klasse 11 und 12 und AP Honours/Honors-Level-Kurse)


1. Einleitung

Reaktiver Stickstoff (Nr), wie Nitrat, Nitrit und Ammonium, ist essentiell für die Funktionen, Prozesse und Dynamiken von Ökosystemen (Vitousek und Howarth 1991). Zusammen mit dem Aufkommen einer unbegrenzten industriellen Stickstofffixierung zu niedrigen Kosten durch den Haber-Bosch-Prozess haben anthropogene Aktivitäten die jährlichen globalen Nr-Einträge in Ökosysteme im Vergleich zu den Nr-Einträgen in vorindustriellen Zeiten mindestens verdoppelt (Galloway et al 2004). Erhöhte Nr unterstützt den Nahrungs- und Treibstoffbedarf einer wachsenden menschlichen Bevölkerung, verursacht jedoch auch zahlreiche negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und die ökologische Nachhaltigkeit, einschließlich der Eutrophierung aquatischer Ökosysteme und erhöhter N2O-Emissionen – ein starkes treibhaus- und ozonabbauendes Gas (Vitousek et al 1997, Galloway et al 2008, Sobota et al 2013). Erhöhte Nr ist jedoch auf räumlichen Skalen nicht gleichmäßig verteilt. In Afrika – einer Region mit zu wenig Nr – ist die Landwirtschaft nicht in der Lage, ausreichend Nahrung für die schnell wachsende Bevölkerung zu produzieren, und unzureichende Stickstoffeinträge können zum Abbau organischer Stickstoffvorräte im Boden führen (Davidson 2009). Daher stellt die Kompensation der negativen Auswirkungen anthropogener Nr-Einträge eine wichtige Herausforderung für Land- und Wasserbewirtschafter weltweit dar.

Ein besseres Verständnis der Inputs und Quellen von Nr ist entscheidend, um das Gleichgewicht zwischen ihren positiven und negativen Auswirkungen zu verbessern (Bouwman et al 2009, Hongkong et al 2011, Swaney et al 2012). Bisher wurden regionale anthropogene Nr-Bewertungen für die Europäische Union (Sutton et al 2011), Nordamerika (Sobota et al 2013) und China (Ti et al 2012). Die einzige existierende Synthese von Nr in Afrika wurde für Westafrika vor drei Jahrzehnten abgeschlossen (Robertson und Rosswall 1986). Wir glauben, dass die anthropogene Nr in Afrika in die globale Bewertung der durch den Menschen vermittelten Nr einbezogen werden sollte.

Der Viktoriasee in Ostafrika ist der zweitgrößte Süßwassersee der Welt und die Wasserscheide ist eine der am dichtesten besiedelten Regionen Afrikas. Die schnell wachsende Bevölkerung und Wirtschaft innerhalb des Beckens (Muyodi et al 2010), hat in den letzten 50 Jahren zu bemerkenswerten Veränderungen des physikalischen, chemischen und biologischen Regimes des Sees geführt (Juma et al 2014), inklusive Anreicherung von Nr (Lung'ayia et al 2001). Frühere Studien im Victoriasee-Becken konzentrierten sich hauptsächlich entweder auf die Wasser-N-Konzentrationen (Gikuma-Njuru und Hecky 2005) oder auf die Schätzung der Belastung auf relativ kleinem Maßstab (Lindenschmidt et al 1998). Es gibt jedoch keine Studien zum regionalen Stickstoffhaushalt des Einzugsgebiets, der für die Verbesserung des regionalen Nr-Managements und den Ausgleich seiner negativen und positiven Auswirkungen von entscheidender Bedeutung ist.

Hier synthetisieren wir die vorhandenen Daten, um ein regionales Nr-Budget im Victoriasee-Becken zu entwickeln anthropogener Netto-Stickstoffeintrag (NANI)-Ansatz. Der NANI-Ansatz ist eine effektive Methode, um vom Menschen verursachte Nr-Einträge in die Landschaft zu bewerten und ihre potenziellen Auswirkungen auf den Flussexport aus großen Einzugsgebieten (Hong et al 2013). Die Ziele dieses Papiers sind (1) die Bewertung des regionalen Nr-Budgets unter Hervorhebung der zugrunde liegenden Unsicherheiten und (2) die Identifizierung von Forschungslücken und Vorschläge zur Verbesserung zukünftiger Schätzungen.


Analytische Profile von Wirkstoffen und Hilfsstoffen

4. Analysemethoden

4.1 Identifizierung

Die Identität von Zileuton kann durch Vergleich des Infrarot-Absorptionsspektrums der Probe mit dem in Fig. 9 angegebenen bestätigt werden.

4.2 Elementaranalyse

Eine typische Elementaranalyse einer Zileutonprobe sieht wie folgt aus:

4.3 Chromatographische Analysemethoden

4.3.1 Dünnschichtchromatographie

Mehrere dünnschichtchromatographische Systeme wurden untersucht, um die Reinheit von Zileuton zu bewerten. Es hat sich herausgestellt, dass zwei davon die beste Trennung von Zileuton, seinen Verunreinigungen und Abbauprodukten ergeben.

System I verwendet Ethylacetat, um die analytische Trennung an Kieselgel 60 F . durchzuführen254, wobei die Detektion mit kurzwelliger UV-Bestrahlung erfolgt. N-(1-Benzo[b]thien-2-ylethyl)-harnstoff (RF, 0.12), (Z)-1-Benzo[b]thien-2-ylethanonoxim (RF, 0.59), (E)-1-Benzo[b]thien-2ylethanonoxim (RF, 0.65) und N-1benzo[b]thien-2-ylethyl)hydroxylamin von Zileuton (RF, 0.21).

System II verwendet eine mobile Phase bestehend aus 50:50 1 Chloroform / Methylenchlorid / Ammoniumhydroxid, die Trennung erfolgt an Kieselgel 60 F254, und die Detektion erfolgt mit kurzwelliger UV-Bestrahlung. Dieses System kann verwendet werden, um (Z)-1-Benzo[b]thien-2-ylethanonoxim (RF, 0.06) (E)-1-Benzo[b]thien-2-ylethanonoxim (RF, 0.17), 1-Benzo[b]thien-2-ylethanon (RF, 0.56), 1-Benzo[b]thien-2-ylethyamin (RF, 0.07) und 0-(1-Benzo[b]thien-2-ylethyl)-1-benzo[b]thien-2-ylethanonoxim (RF, 0,33) von Zileuton (RF, Ursprung).

4.3.2 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Mehrere HPLC-Methoden wurden entwickelt, um die Qualität von Zileuton-Wirkstoffsubstanzen zu bewerten. System I wird verwendet, um die Potenz der Bulk-Arzneimittelsubstanz zu quantifizieren, während die Systeme II und III verwendet werden, um die Verunreinigungen und Abbauprodukte in der Bulk-Substanz zu quantifizieren. Die Eigenschaften der Systeme II und III sind derart, dass sie den Polaritätenbereich abdecken, der mit den verschiedenen Verunreinigungen in Zileuton verbunden ist. System II wird verwendet, um die Abbauprodukte zu überwachen.

System I
Mobile Phase:0,1 M Ammoniumacetatlösung mit 0,025 % Acetohydroxamsäure (Lösung mit Perchlorsäure auf pH 2,0 einstellen)/Acetonitril (72:28)
Spalte:30 cm × 1/4″ (Außendurchmesser) × 4,6 mm (Innendurchmesser) verpackt mit Spherisorb S10 ODS
Fließrate:ca. 1,5 ml/Minute
Detektor:260 nm, 0,1 AUFS
System II
Mobile Phase:0,1 M Ammoniumacetatlösung mit 0,025 % Acetohydroxamsäure (Lösung mit Perchlorsäure auf pH 2,0 einstellen)/Acetonitril (82:18)
Spalte:30 cm × 1/4″ (Außendurchmesser) × 4,6 mm (Innendurchmesser) verpackt mit Spherisorb S10 ODS
Fließrate:2,2 ml/Minute
Detektor:260 nm, 0,01 AUFS
System III
Mobile Phase:1:1 Acetonitril/0,5% Perchlorsäure
Spalte:30 cm × 1/4″ (Außendurchmesser) × 4,6 mm (Innendurchmesser) verpackt mit Spherisorb S10 ODS
Fließrate:ca. 1,5 ml/Minute
Detektor:260 nm, 0,01 AUFS

Darüber hinaus wurde eine direkte chirale Chromatographie-Methode zur Trennung von Zileuton-Enantiomeren entwickelt, die folgende Bedingungen verwendet:

Mobile Phase:92:8:0,1 Hexan / 2-Propanol / Trifluwoessigsäure
Spalte:Daicel Chiralpak AD, 250 × 4,6 mm (i.d.) (Regis) - betrieben bei 25°C
Injektionsvolumen:10 μl (0,1 mg/ml)
Fließrate:1,0 ml/Minute
Detektor:260 nm, 0,02 AUFS

4.4 Bestimmung in pharmazeutischen Darreichungsformen

Die Wirksamkeit und die primären Abbauprodukte in Zileuton-Tablettenformulierungen können durch ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographieverfahren unter Verwendung von Methyl-4-hydroxybenzoat (Methylparaben) als internem Standard analysiert werden. Das Verfahren verwendet eine Spherisorb S10 ODS, 10 μm Säule, eine mobile Phase bestehend aus 72 Teilen einer 0,1 M Ammoniumacetatlösung mit 0,025% Acetohydroxamsäure (eingestellt mit Perchlorsäure auf pH 2,0) und 28n Teilen Acetonitril.

4.5 Bestimmung in Körperflüssigkeiten

Die simultane Bestimmung von Zileuton und seinem N-dehydroxylierten Metaboliten in unbehandeltem Rattenurin durch micellare Flüssigkeitschromatographie wurde von Thomas und Albazi [ 23 ] entwickelt. Die Trennung dieser Verbindungen erfolgt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) als mobiler Phase, einer CN-gebundenen Kieselsäuresäule und UV-Detektion bei 262 nm. Aufgrund der Löslichkeitskraft der mizellaren mobilen Phase wurden Urinproben ohne zeitaufwendige Proteinfällungs- und/oder Wirkstoffextraktionsschritte in das System injiziert.

Zur Bestimmung von Zileuton und seinem inaktiven N-dehydroxylierten Metaboliten im Plasma wurde auch eine HPLC-Methode entwickelt [ 24 ].


DISKUSSION

Blatt-Chlorophyll-Index und Maisblatt-Stickstoffkonzentration

Die angewendeten N-Raten wurden von Mais absorbiert, was durch eine erhöhte N-Blattkonzentration und LCI belegt wurde, sobald N eine der Komponenten des Chlorophyll-Moleküls ist ( Galindo et al., 2016 ). Es gab mehrere Studien, die eine positive lineare Korrelation mit dem NIK und steigenden N-Gehalten in Maiskulturen berichteten. Kappeset al. (2013a) applizierten bis zu 90 kg ha –1 N als Harnstoff und Kappes et al. (2014) verwendeten 0, 50, 100 und 150 kg ha −1 N als Harnstoff und beide berichteten über einen linearen Zusammenhang zwischen N-Gehalt und NIK-Messungen. Obwohl die NIK-Werte in unserer Studie selbst bei den Kontrollkulturen relativ hoch sind (von jeweils 61 bis fast 71), sind die Ergebnisse mit denen aus der Literatur vergleichbar. Kappeset al. (2013a) berichteten über NIK-Werte von 45,8 bis 62,9 und Kappes et al. (2014) berichteten NIK-Werte von 55,3 bis 62,1.

Bezüglich der N-Blattkonzentration wurden ähnliche Ergebnisse von Costa et al. (2012), die einen linearen und positiven Effekt der N-Raten auf die N-Konzentration im Blattgewebe beobachteten. Es ist erwähnenswert, dass die N-Blatt-Konzentration selbst in den Kontrollkulturen (27,21 g kg –1 ) im als ausreichend angesehenen Bereich lag (27–35 g kg –1 ) (Cantarella et al., 1997). Bemerkenswert ist jedoch der höhere N-Bedarf von Maishybriden früherer Zyklen und ein größeres Produktionspotenzial.

Das ähnliche Ergebnis zwischen den N-Quellen für LCI kann den ähnlichen N-Konzentrationen von Blättern zugeschrieben werden, die mit Harnstoff und Harnstoff mit Urease-Inhibitor NBPT erhalten wurden. Dies könnte ein Ergebnis der schlechten Wirksamkeit von NBPT bei der Neutralisierung von Ureaseenzymen im Boden sein. Einige der Gründe für die Ineffizienz von NBPT zur Kontrolle der Ureaseaktivität könnten darin liegen, dass ein Teil des Strohs der Weizenernte des Vorjahres in der Bodenoberfläche verblieb und das Jahr außergewöhnlich heiß war (Abb. 1). In ähnlicher Weise haben andere Studien keine signifikanten Ausbeuteunterschiede zwischen Harnstoff und verbesserten N-Quellen mit langsam freisetzenden Polymeren in Mais berichtet (Queiroz et al., 2011, Valderrama et al., 2011, Galindo et al., 2016).

Bezüglich der positiven Ergebnisse der Impfung bei LCI haben Müller et al. (2016) und Galindo et al. (2016) fanden heraus, dass Maispflanzen, die mit A. brasilense hatten einen höheren LCI als nicht inokulierte Pflanzen. Positive Reaktionen auf die Inokulation mit diesen diazotrophen Bakterien wurden selbst dann erhalten, wenn die Feldfrüchte unter Bedingungen angebaut wurden, die ausreichende Mengen an N für ein optimales Wachstum lieferten (Galindo et al., 2017c). Dies deutet darauf hin, dass die positiven Pflanzenreaktionen auf die Impfung nicht ausschließlich auf BNF in Gräsern zurückzuführen sind, sondern auch auf die Produktion von Pflanzenwachstumshormonen, einschließlich Indolessigsäure, Gibberellin und Cytokinin ( Galindo et al., 2017c ), die eine wesentliche Rolle spielen können Rolle bei der Förderung des Pflanzenwachstums (Bashan und de-Bashan, 2010). Nach Pankievicz et al. (2015) , die Impfung mit A. brasilense kann die Entwicklung und das Wachstum des Wurzelsystems verbessern Setaria viridis Gras durch mehr CO2 Fixierung und geringere Ansammlung von photoassimiliertem Kohlenstoff in den Blättern, was zu einem stärkeren oberirdischen Wachstum, einem höheren Wassergehalt im Gewebe und weniger Stress führte. Darüber hinaus kann eine erhöhte Indolessigsäureproduktion die Aufnahme von Nährstoffen durch das stärkere Wachstum des Wurzelsystems verbessern (Hungria et al., 2010).

Biometrische Auswertungen und produktive Komponenten von Mais

Castroet al. (2008) berichteten, dass die Pflanzenhöhe durch die Verfügbarkeit von N im Boden beeinflusst wird, da dieser Nährstoff direkt am Photosyntheseprozess sowie an der Zellteilung und -expansion beteiligt ist. Grosset al. (2006) empfehlen aufgrund der positiven Auswirkungen auf die Pflanzenhöhe und den Maiskornertrag, N nur in einer oder zwei Anwendungen während der Saison auszubringen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die Pflanzenhöhe nicht immer mit der Produktivität korreliert, da moderne Hybriden mit hohem Produktionspotenzial meist eine geringere Höhe aufweisen (Cruz et al., 2008). In unserer Studie wurde beobachtet, dass steigende N-Raten zu einer erhöhten N-Verfügbarkeit führten, was möglicherweise die N-Korn-Akkumulation und in der Folge die Pflanzenhöhe, den Ährendurchmesser, die Anzahl der Körner pro Ähre, die Masse von 100 Körnern und den Maiskornertrag erhöht.

Bezogen auf die Masse von 100 Körnern ist die Körnermasse ein Merkmal, das vom Genotyp, den klimatischen Bedingungen und der Nährstoffverfügbarkeit während der Körnerfüllphasen beeinflusst wird ( Chen et al., 2012 ). Für Mello et al. (2017) ist diese produktive Komponente stark von der N-Aufnahme durch Mais abhängig, der den Aufnahmepeak im Zeitraum zwischen Blühbeginn und Beginn der Kornbildung erreicht. Stickstoffmangel in diesem Zeitraum kann zur Bildung von Körnern mit geringerer spezifischer Masse beitragen, da keine ausreichenden Nährstoffmengen verlagert werden, was die in der vorliegenden Studie beobachtete Zunahme der Masse von 100 Körnern mit der Erhöhung der angewendeten N-Raten rechtfertigt.

Zum Thema Saatbeimpfung mit A. brasilense, ist die Zunahme des Stängeldurchmessers bei der Inokulation interessant, da dieses morphologische Merkmal eher mit dem Prozentsatz des Lagerns oder des Pflanzenbruchs bei Mais zusammenhängt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass der Stammdurchmesser ein wichtiger Faktor für hohe Erträge ist, denn je größer der Durchmesser, desto größer ist die Kapazität der Pflanze, Photoassimilate zu speichern, die zur Kornfüllung beitragen (Cruz et al., 2008, Lana et al., 2009). was auch den in der vorliegenden Studie nachgewiesenen Anstieg von NIK, Ährenlänge und Kornertrag in Abhängigkeit von der Impfung mit . rechtfertigt A. brasilense. Impfung mit A. brasilense auch erhöhte Ohrlänge im Vergleich zu nicht geimpften Behandlungen. Es ist möglich, dass eine Impfung mit A. brasilense begünstigte die Entwicklung eines verbesserten Wurzelsystems, was zu einer höheren Aufnahme von Wasser und Nährstoffen führte und den Ernährungszustand der Pflanze positiv beeinflusste. Die Menge an Wasser und Nährstoffen, die an die Ähre abgegeben werden soll, hängt direkt mit dem Ernährungszustand der Pflanze zusammen, die besser ernährte Maispflanze neigt dazu, ihre Ähre besser zu entwickeln, was sich in der Länge zeigt.

Es ist möglich, dass die fehlende Reaktion auf N-Quellen darauf zurückzuführen ist, dass bei der Bewässerung des Gebiets eine erhebliche Reduzierung von N-NH3 Die Verflüchtigung erfolgte wahrscheinlich als Folge des verstärkten Kontakts zwischen Düngemittel und Bodenpartikeln, was zu einem höheren NH .-Wert führte4 + Adsorption durch den Boden (Silva et al., 1995) und die Wirkung von NBPT bei der Reduzierung von Verflüchtigungsverlusten wurde bei hohen N-Raten reduziert (Silva et al., 2017). Darüber hinaus variierte das Ausmaß der positiven Effekte, die mit der Verwendung von Harnstoff mit NBPT verbunden sind, stark mit den Bodeneigenschaften, dem Pflanzenmanagement und den klimatischen Bedingungen, die NH . verändern3 Verflüchtigung zum Zeitpunkt der Düngung und in den ersten Tagen nach dieser Praxis ( Cantarella et al., 2008 Tasca et al., 2011 ). Mehrere Studien berichten, dass die Zugabe von Ureasehemmern zu Harnstoff die NH .-Konzentration verlangsamt3 Verflüchtigungspeak, der sich bei konventionellem Harnstoff in der ersten Woche nach der Düngung auf die Bodenoberfläche konzentriert ( Cantarella et al., 2008 Rochette et al., 2009 Tasca et al., 2011 ). Auf diese Weise wird die Beregnung der Versuchsfläche kurz nach der Stickstoffdüngung in Verbindung mit den in der Woche der Düngung im ersten Jahr aufgetretenen Niederschlägen (45 mm Niederschlag zwischen 11.-16.01.2014, 3 d nach der Anwendung) Stickstoffdünger Abb. 1A) und im zweiten Jahr (19 mm Niederschlag am 14.01.2015 und 21 mm am 21.01.2015, 10 und 17 d nach Stickstoffdüngung bzw um die Verflüchtigungsverluste von Harnstoff zu minimieren, wodurch eine ähnliche Wirkung wie bei Harnstoff mit NBPT erzielt wird. Daher könnte die Verwendung von Harnstoff mit NBPT an heißen Tagen und in Wochen mit trockenen Bedingungen, eine zwischen April und September in der brasilianischen Savanne übliche klimatische Bedingung, sehr vorteilhaft sein, was neue Studien verdeutlichen.

Studien zur Verwendung von polymerbeschichtetem Harnstoff im Vergleich zu konventionellem Harnstoff haben eine ähnliche Wirkung gezeigt (Queiroz et al., 2011 Mello et al., 2017). Außerdem haben Valderrama et al. (2011) wurden beim Vergleich der Wirkung von konventionellem Harnstoff und löslichem polymerbeschichtetem Harnstoff keine Vorteile bei der Verkapselung von Harnstoff mit Polymeren für Mais aus dem brasilianischen Cerrado festgestellt. Da die Quellen keinen Einfluss auf die durchgeführten Hauptbewertungen hatten, wird Harnstoff aufgrund seines besseren Kosten-Nutzen-Verhältnisses vorteilhafter, in Übereinstimmung mit Queiroz et al. (2011) und Maestrelo et al. (2014) .

Andererseits haben Abalos et al. (2014) unterstützen die Hypothese, dass der Einsatz des Harnstoffinhibitors NBPT die geeignetste Option ist, wenn Verluste durch NH3 Es wird mit einer hohen Volatilität gerechnet. Gemäß Abalos et al. (2014) , unter Bedingungen, bei denen ein hoher Eintrag von N-Dünger ausgebracht wird und eine hohe Drainage begünstigt wird, kann bei bewässerten Systemen die Effizienz des Harnstoffs mit Inhibitor NBPT höher sein. Der Autor kam jedoch zu dem Schluss, dass neue Studien erforderlich sind, um unser Verständnis der Bedingungen, unter denen die Düngemittel mit verbesserter Effizienz wirtschaftlich rentabel sind, zu verbessern und ihre Effizienz mit der anderer Optionen zu vergleichen, wie beispielsweise einem verbesserten Wasser- und Stickstoffdüngermanagement.

Stickstoffnutzungseffizienz, Maiskornertrag und wirtschaftliche Analyse

Die Verringerung der NUE als Funktion der steigenden N-Raten kann auf den Verlust von N zurückgeführt werden, wie in der Literatur klar beschrieben. Höhere N-Raten führen zu größeren Verlusten und einer geringeren Nutzung durch die Pflanzen, da der Nährstoffbedarf der Pflanzen begrenzt ist ( Galindo et al., 2016 ). Pflanzen sind in der Lage, in einer bestimmten Zeit eine bestimmte Menge an Nährstoffen aufzunehmen, der zugeführte und nicht aufgenommene N kann verloren gehen, was die Düngungseffizienz mit höheren N-Gehalten verringert, wie in der Literatur als Gesetz des abnehmenden Ertrags angegeben.

Der Anstieg der NUE aufgrund der Impfung mit A. brasilense wurde akzentuiert. Im Durchschnitt war die durch die Impfung bereitgestellte NUE 3,5-mal höher als die NUE der nicht geimpften. Nach Cormier et al. (2013) können zwei Strategien zur NUE-Verbesserung entwickelt werden: Aufrechterhaltung eines hohen Ertrags bei Reduzierung des N-Angebots und/oder Ertragssteigerung bei konstantem N-Angebot. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen ist die Impfung mit Azospirillum brasilense ist eine sehr interessante Strategie zur Verbesserung der N-Effizienz und kann verwendet werden, um die ausgebrachte N-Düngemenge zu verringern, die gleiche NUE beizubehalten und ohne den Getreideertrag negativ zu beeinflussen.

In Bezug auf den Getreideertrag wurde in mehreren Studien über eine Erhöhung des Maiskornertrags bei Anwendung steigender N-Gehalte berichtet ( Kitchen et al., 2009 Holland und Schepers, 2010 Venterea et al., 2011 Kappes et al., 2014 Galindo et al. , 2016 ), die die in der aktuellen Studie beobachteten Ergebnisse unterstützen. Auch Galindo et al. (2016) bestätigten, dass der höchste Maiskornertrag erzielt wurde, wenn N in größeren Mengen zum Zeitpunkt der Nachdüngung zugeführt wurde und dass der NH .-Wert3 Verflüchtigungsverluste von Harnstoff, die in der bewässerten Maiskultur auftreten, verringerten den Kornertrag nicht. Nach Angaben der Autoren war N in der Bodenlösung in der Zeit vorhanden, in der die Pflanze einen höheren Nährstoffbedarf hatte. Eine Erklärung wäre wahrscheinlich, dass sich der bei der Aussaat aufgebrachte N bereits in der Bodenlösung befindet und die Pflanze bei der Zugabe von N eine größere Menge des Nährstoffs aufnehmen muss.

Es wurde eine Steigerung des Maiskornertrags in Abhängigkeit von der Beimpfung im Vergleich zu den in der vorliegenden Studie nachgewiesenen nicht beimpften Behandlungen von 1012,05 kg ha –1 (entspricht 14,3%) nachgewiesen. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen, auch bei Anwendung hoher N-Raten, die mit einer Impfung mit A. brasilense Der Maiskornertrag wurde nicht negativ beeinflusst, was darauf hindeutet, dass hohe N-Gehalte die Vorteile einer Impfung mit . nicht zunichte machen A. brasilense. Kappeset al. (2013b) berichteten, dass Mais mit A. brasilense hatte eine Ertragssteigerung von 9,4 %. Cavallet et al. (2000) berichteten von einer 17%igen Steigerung des Maisertrags, wenn das Saatgut mit . beimpft wurde Azospirillum spp. Galindoet al. (2018) eine 5,7%ige Steigerung des Maiskornertrags durch Saatbeimpfung mit A. brasilense, mit fünf N-Raten im Topdressing, mit einem durchschnittlichen Kornertrag von über 9826 kg ha −1 . Ähnliche Ergebnisse wurden von Müller et al. (2016) , wo die Maiserträge bei einer Saatbeimpfung von 3,8 % höher waren A. brasilense im Vergleich zur Kontrolle mit einem durchschnittlichen Kornertrag über 11.000 kg ha -1 . Ungarn et al. (2010) erzielten ebenfalls Ertragssteigerungen bei Mais in der Größenordnung von 27%, entsprechend 743 kg ha −1 .

Nach Hungria (2011) hängen die Auswirkungen der Maissaatgutimpfung auf den Kornertrag neben den Umweltbedingungen auch von den genetischen Eigenschaften der Pflanzen und Stämme (Bakterien) ab. In diesem Sinne ist die Wechselwirkung zwischen Genotypen mit effizienten Bakterienstämmen der Schlüsselfaktor für den Erfolg der biologischen N-Fixierung an Gräsern ( Lana et al., 2012 ) und kann die in der Literatur.

Der Maiskornertrag stieg durch die Beimpfung mit A. brasilense werden häufig mehreren Mechanismen zugeschrieben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Synthese von Phytohormonen (z Kontrolle einiger Krankheitserreger (Bashan und de-Bashan, 2010). In der vorliegenden Studie wurden die Hauptbewertungen, die durch die Beimpfung positiv beeinflusst wurden, LCI, Stängeldurchmesser, Ährenlänge und NUE, die sich positiv in der Steigerung des Maiskornertrags und folglich der Erhöhung der Rentabilität bei der Maisproduktion bei Beimpfung mit A. brasilense.

Zum Thema der wirtschaftlichen Analyse, die höchsten TOCs der Behandlungen mit Harnstoffapplikation mit NBPT und Impfung mit A. brasilense sind auf die Kosten dieser landwirtschaftlichen Betriebsmittel zurückzuführen. Der von den Landwirten gezahlte Durchschnittspreis betrug 599,33 USD bzw. 673,40 USD pro Tonne für Harnstoff bzw. Harnstoff mit NBPT. Für die Impfung mit A. brasilenselagen die Ausgaben bei etwa 3,37 USD pro Dosis, und es wurden in beiden Maiskulturen zwei Dosen pro Hektar verwendet, was insgesamt 6,74 USD entspricht. Da Harnstoff mit NBPT nicht zu einer Ertragssteigerung führte, wurde die OP aber auch nicht favorisiert, eine Beimpfung mit A. brasilense erhöhte den Getreideertrag um 15,7 % im Durchschnitt der 2 Anbaujahre und führte aufgrund der geringen Anschaffungs- und Anwendungskosten (nur 0,71 % des TOC USD 6,74 pro ha) zu einer Steigerung der OP mit Maisproduktion, unabhängig von der N-Quelle und Rate angewendet.

Unter Berücksichtigung der Kosten der angewandten N-Sätze und der von ihnen bereitgestellten OP ist die Anwendung von 100 kg ha −1 N als Harnstoffquelle verbunden mit A. brasilense führte zu einer höheren Rentabilität bei der Maisproduktion (360,84 US-Dollar), während ohne Impfung die höchste Rentabilität ohne Stickstoffdüngung (174,88 US-Dollar) erzielt wurde, Unterschied von 106,34% im OP, was die Bedeutung der Impfung mit bekräftigt A. brasilense Steigerung der NUE, des Kornertrags und der Rentabilität bei der Maisernte.

Brasilien ist mit rund 16,5 Millionen Hektar Anbaufläche der drittgrößte Produzent und zweitgrößte Exporteur von Mais der Welt ( CONAB, 2018 ). Basierend auf der Rentabilitätssteigerung, die durch die Impfung mit A. brasilense bei der Maisernte, die Einführung dieser Technologie durch die Landwirte und aufgrund des großen Produktionsvolumens und der großen Produktionsfläche ist es möglich, die mit dieser Aktivität erzielten Gewinne in der Größenordnung von Millionen Dollar pro Jahr zu steigern, was sich positiv auf die brasilianische Agrarproduktion auswirkt System. Dies kann in Zukunft auf tropische Bedingungen übertragen und in mehreren Ländern verbreitet werden, was der weltweiten Landwirtschaft zugute kommt.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen einen Vorteil im Maiskornertrag in Abhängigkeit von der Saatbeimpfung mit A. brasilense. Aufgrund der geringen wirtschaftlichen Kosten, der einfachen Anwendung, nicht toxisch für die Umwelt und mit einem hohen Reaktionspotential der Maiskultur, selbst bei der Anwendung von N-Gehalten, die für BNF als hoch angesehen werden, ist die Beimpfung mit A. brasilense wahrscheinlich eine Technologie, die zunehmend von Landwirten verwendet wird.


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Bemerkungen:

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