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14.3: 7-TM-Rezeptoren (G-Protein-gekoppelt) - Biologie

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Die 7-Transmembran-Rezeptoren oder G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind nicht überraschend eine Familie von Proteinen, die die Zellmembran 7-mal passieren. Der Aminoterminus ist extrazellulär und der Carboxylterminus intrazellulär. Abbildung (PageIndex{2}) zeigt die Transmembranregionen zur Verdeutlichung verteilt, aber die Transmembrandomänen bilden zusammen eher eine zylindrische Form.

7-TM-Proteine ​​werden als Rezeptoren für Neurotransmitter wie Epinephrin (β-adrenerger Rezeptor), Acetylcholin (Muskarinrezeptor) und Serotonin sowie für Hormone wie Glucagon oder Schilddrüsen-stimulierendes Hormon und sogar nichtmolekulare Liganden wie Licht verwendet ! Rhodopsine sind eine Klasse von 7-TM-Rezeptoren, die aktiviert werden, wenn sie ein Photon absorbieren (Abbildung (PageIndex{5})). Die Aktivierung dieser Rezeptorfamilie, sei es durch Photonen oder durch konventionellere Ligandenbindung, induziert eine Konformationsänderung in der zytoplasmatischen Domäne, die die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und einem als heterotrimeres G-Protein bekannten Proteinkomplex verändert.

Das heterotrimere G-Protein besteht aus einer a-, b- und g-Untereinheit, von denen die a-Untereinheit entweder GTP oder GDP binden und GTP zu GDP hydrolysieren kann. Wenn der 7-TM-Rezeptor inaktiv ist, ist der G-Proteinkomplex normalerweise durch Myristoylierung oder Palmitoylierung der a-Untereinheit und Farnesylierung oder Geranylgeranylierung der g-Untereinheit in der Nähe mit der Membran assoziiert. Sobald der 7-TM-Rezeptor aktiviert ist, assoziiert er mit dem heterotrimeren G-Protein, was bewirkt, dass das Ga das GDP loslässt und an ein GTP bindet. Dies dissoziiert dann das Ga von den anderen beiden Untereinheiten. Es kann dann mit einem Enzym assoziieren und es aktivieren, um die Signalkaskade zu erweitern. Einer der beiden klassischen Wege beginnt mit der Ga-Aktivierung der Adenylat(Adenylyl)cyclase. Adenylatcyclase (AC) wandelt ATP in cAMP um. Da ATP reichlich vorhanden ist und AC ein relativ schnelles Enzym ist, erfolgt die erste Amplifikation des Signals mit der Bildung des „Second Messenger“-Moleküls cAMP. Jedes cAMP-Molekül kann dann andere Enzyme aktivieren, wobei das primäre Proteinkinase A ist. PKA kann dann eine Vielzahl von Substraten phosphorylieren, um die zelluläre Aktivität durch Genexpression, molekulare Motoren oder metabolische Veränderungen zu verändern.

Der andere klassische Weg für 7-TM-Rezeptoren ist die Aktivierung der Phosphlipase Cb, ebenfalls durch Ga. PLCb produziert tatsächlich zwei Second-Messenger-Moleküle: Es hydrolysiert Phosphatidylinositol zu Diacylgylcerol (DAG) und Inositoltriphosphat (IP .).3). IP3 induziert hauptsächlich die Freisetzung von Ca2+ aus dem endoplasmatischen Retikulum. Das DAG kann Proteinkinase C aktivieren. PKC wird auch durch Ca . aktiviert2+ und beide Ca2+ und DAG können PKC synergistisch aktivieren. Proteinkinase C ist eine wichtige zentrale Kinase, die nachweislich phosphoryliert und die Aktivität zahlreicher anderer Enzyme von Zytoskelettelementen bis hin zu Transkriptionsfaktoren kontrolliert.

Eine interessante Variation der klassischen 7-TM-Wege beginnt mit den Rhodopsin-Rezeptoren in Stäbchenzellen. Diese Rezeptoren binden Photonen zur Aktivierung und binden ein heterotrimeres G-Protein. Das Ga-GTP bindet dann an die g-Untereinheit der Phosphodiesterase (PDE), aktiviert diese und katalysiert die Umwandlung von cGMP zu GMP. Wenn cGMP abnimmt, schließen sich Ionenkanäle, polarisieren die Membran und ändern das Signal von der Stäbchenzelle zum Gehirn (über die Verbindung von Neuronen).

Second Messenger müssen zwei Eigenschaften haben. Sie müssen klein genug sein, um effektiv zu diffundieren, und die Zelle muss sie schnell erzeugen können. Ca2+ und cAMP fallen in diese Kategorie. Außerdem können beide recht schnell aus dem Verkehr gezogen werden: erstere durch Ca2+ Pumpen im ER und Golgi, und letztere durch Phosphodiesterase-Aktivität. Als der G-Protein-Weg entdeckt wurde, war die Verwendung von Lipid Second Messengers überraschend. Membranphospholipide wurden damals als einfache statische Bestandteile von Membranen weitgehend vernachlässigt. Es ist nun klar, dass einige der Phospholipide biochemisch aktiv sind, mit mehreren Enzymen, die sie modifizieren, einschließlich Phospholipasen, Phospholipidkinasen und Phospholipidphosphatasen. Einige dieser Enzyme haben eine Vielzahl von Funktionen, da ihr Produktsubstrat ein wichtiger Botenstoff sein kann. Beispielsweise ist PI3K (Phosphatidylinositol-3-Kinase) eine zentrale Signalkinase, da ihr Produkt PIP3 (Phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphat) ein Aktivator für Akt/PKB und andere Enzyme ist, die mehrere Signalwege aktivieren können.

Die Aktivierung muss schließlich enden, und dies geschieht, wenn Ga das daran gebundene GTP hydrolysiert. Auf diese Weise fungiert der Ga als eine Art Zeitgeber für die Signalisierungskaskade. Dies ist wichtig, denn damit die Signalisierung wirksam ist, muss sie streng kontrolliert werden. Sehr früh in diesem Kurs wurde darauf hingewiesen, dass Ca2+ wird im Zytoplasma der Zelle in einer sehr niedrigen Konzentration gehalten, weil wir Ca2+-sensible Mechanismen, um schnell auf einen Kalziumeinstrom reagieren zu können, aber wir wollen auch in der Lage sein, das Signal bei Bedarf schnell abzuschalten, und das ist offensichtlich viel einfacher, indem man eine kleine Menge Ca . bindet2+ als vieles davon. In ähnlicher Weise wird, wenn eine anhaltende Aktivität einer Empfängerzelle erforderlich ist, dies durch eine kontinuierliche Aktivierung des Rezeptors und nicht durch eine lang anhaltende Wirkung einer einzelnen Aktivierung erreicht. Dies stellt sicher, dass, wenn ein zellulärer Effekt abrupt und schnell abgeschnitten werden muss, dies ohne eine signifikante Verzögerungszeit zwischen dem Aufhören der Hormonsekretion und dem Aufhören der intrazellulären Signalübertragung erreicht werden kann.

Der Rezeptor ist auch Teil eines anderen Abschaltmechanismus: Um eine Überstimulation zu verhindern, werden die Rezeptoren nach ihrer Aktivierung für kurze Zeit desensibilisiert. G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase (GRK) phosphoryliert den 7-TM-Rezeptor. Die Phosphorylierung erzeugt Erkennungsstellen für Arrestine. Die Arrestine haben eine Vielzahl von Funktionen, von denen die einfachste darin besteht, als kompetitiver Inhibitor der G-Protein-Bindung durch den Rezeptor zu wirken. Dies ist eine relativ kurzlebige Desensibilisierung.

Für eine längere Desensibilisierung bindet Arrestin an AP2 und Clathrin, wodurch die Bildung eines Clathrin-beschichteten endozytischen Vesikels nukleiert wird. Dadurch wird der Rezeptor von der Zelloberfläche entfernt, wodurch die Zelle für einen viel längeren Zeitraum desensibilisiert wird als die einfache Konkurrenz zwischen Arrestin und G-Protein.

Die Arrestine haben eine weitere potentielle Funktion. Sie können als Gerüstproteine ​​fungieren, die einen völlig anderen Signalkomplex zum 7-TM-Rezeptor bringen. Abbildung (PageIndex{8}) zeigt ein Beispiel, in dem der 7-TM-Rezeptor verwendet wird, um einen Jun-Transkriptionsfaktor zu aktivieren.

Das b-Arrestin bringt AJK-1, MKKY und JNK-1 zur Aktivierung von JNK-1, das dann Jun phosphorylieren kann. Dies ermöglicht die Translokation von Phospho-Jun in den Zellkern und die anschließende Dimerisierung, wodurch es in einen aktiven Transkriptionsfaktor umgewandelt wird.

Welche zellulären Aktionen können durch die Aktivierung des 7-TM-Rezeptors hervorgerufen werden? Ca2+ Dynamik wird in einem gesonderten Abschnitt behandelt. IP3 Es hat sich gezeigt, dass es eine Kontraktion der glatten und skelettalen Muskulatur, Aktinpolymerisation und Zellformänderungen, Calciumfreisetzung aus intrazellulären Speichern, Öffnung von Kaliumkanälen und Membrandepolarisation hervorruft. cAMP wurde mit der Kontrolle des Glykogenabbaus und der Gluconeogenese, des Triacyglycerolmetabolismus, der Sekretion von Östrogenen durch Eierstockzellen, der Sekretion von Glukokortikoiden und der erhöhten Permeabilität von Nierenzellen für Wasser in Verbindung gebracht.


Strukturelle Einblicke in die Unterschiede zwischen Lactisolderivaten in den Hemmmechanismen gegen den menschlichen Süßgeschmacksrezeptor

Lactisol, ein Inhibitor des menschlichen Süßgeschmacksrezeptors, besitzt ein 2-Phenoxypropionsäure-Skelett und interagiert nachweislich mit der Transmembrandomäne der T1R3-Untereinheit (T1R3-TMD) des Rezeptors. Ein anderer Inhibitor, 2,4-DP, der das gleiche molekulare Skelett wie Lactisol aufweist, wurde als ungefähr 10-fach stärker in seiner inhibitorischen Aktivität als Lactisol bestätigt, jedoch müssen die strukturellen Grundlagen ihrer inhibitorischen Mechanismen gegen den Rezeptor noch aufgeklärt werden. Kristallstrukturen der TMD metabotroper Glutamatrezeptoren, die zusammen mit T1Rs als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der Klasse C kategorisiert werden, wurden kürzlich beschrieben und ermöglichten die Erstellung eines genauen Strukturmodells für T1R3-TMD. In dieser Studie wurde der detaillierte strukturelle Mechanismus, der der Hemmung des süßen Geschmacks zugrunde liegt, charakterisiert, indem die Wirkung von Lactisol auf T1R3-TMD mit der von 2,4-DP verglichen wurde. Wir führten zunächst eine Reihe von Experimenten mit kultivierten Zellen durch, die den süßen Geschmacksrezeptor mit Mutationen exprimieren, und untersuchten die Wechselwirkungen mit diesen Inhibitoren. Basierend auf den Ergebnissen führten wir als nächstes Docking-Simulationen durch und wendeten dann eine molekulardynamikbasierte Energieminimierung an. Unsere Analysen zeigten eindeutig, dass die (S)-Isomere von Lactisol und 2,4-DP mit denselben sieben Resten in T1R3-TMD wechselwirkten und dass die inhibitorischen Potenzen dieser Inhibitoren hauptsächlich auf stabilisierende Wechselwirkungen zurückzuführen waren, die über ihre Carboxylgruppen vermittelt wurden in der vertikalen Dimension der Ligandentasche von T1R3-TMD. Darüber hinaus ist 2,4-DP an einer hydrophoben Wechselwirkung beteiligt, die durch seine o-Cl-Gruppe vermittelt wird, und diese Wechselwirkung könnte hauptsächlich für die höhere Hemmwirkung von 2,4-DP verantwortlich sein.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Figuren

Abb. 1. Lactisol und 2,4-DP als süße…

Abb. 1. Lactisol und 2,4-DP als Süßstoffhemmer.

(A) Strukturformeln von (±)-Lactisol und…

Abb. 2. MD-Simulationen und ihre Vorsimulationen…

Abb. 2. MD-Simulationen und ihre Vorsimulationen für Lactisol und 2,4-DP.

Abb. 3. Vergleich der Ergebnisse von…

Abb. 3. Vergleich der Ergebnisse der MD-Minimierung für ( S )-Lactisol und (…

Abb. 4. Süßgeschmack hemmende Aktivität von…

Abb. 4. Süßgeschmack hemmende Aktivität von ( S )-, ( R )-Lactisol und (…


Abstrakt

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind von zentraler Bedeutung für viele grundlegende zelluläre Signalwege. Sie übertragen Signale von außen ins Innere der Zellen in physiologischen Prozessen, die vom Sehen bis zur Immunantwort reichen. Es ist äußerst anspruchsvoll, sie mit herkömmlichen experimentellen Techniken einzeln zu betrachten. Kürzlich hat sich ein pseudoatomistisches Molekülmodell als wertvolles Werkzeug herauskristallisiert, um Informationen über GPCRs zu erhalten, genauer gesagt über ihre Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung in ihrer nativen Zellmembran und die Konsequenzen für ihre supramolekulare Organisation. Dieser Ansatz verwendet das Martini-Grobkorn-(CG)-Modell, um die Rezeptoren, Lipide und Lösungsmittel in Molekulardynamik (MD)-Simulationen zu beschreiben, und zwar so detailliert, dass die chemische Spezifität der verschiedenen Moleküle erhalten bleibt. Die Eliminierung unnötiger Freiheitsgrade hat groß angelegte Simulationen der lipidvermittelten supramolekularen Organisation von GPCRs ermöglicht. Nach der Einführung der Martini-CGMD-Methode überprüfen wir hier diese Studien, die an verschiedenen Mitgliedern der GPCR-Familie durchgeführt wurden, darunter Rhodopsin (visueller Rezeptor), Opioidrezeptoren, adrenerge Rezeptoren, Adenosinrezeptoren, Dopaminrezeptor und Sphingosin-1-Phosphatrezeptor. Diese Studien haben eine interessante Reihe neuer biophysikalischer Prinzipien ans Licht gebracht. Die Erkenntnisse reichen von der Aufdeckung lokalisierter und heterogener Verformungen der Membrandoppelschicht an der Oberfläche des Proteins, über spezifische Wechselwirkungen von Lipidmolekülen mit einzelnen GPCRs bis hin zum Einfluss der Membranmatrix auf die globale GPCR-Selbstorganisation. Die Übersicht schließt mit einem Überblick über die Lehren aus der Anwendung der CGMD-Methode, die biophysikalisch-chemischen Erkenntnisse zum Lipid-Protein-Wechselspiel.


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Die 7 TM G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Target-Familie †

Diese Rezension wird später als Kapitel im Buch erscheinen Chemische Biologie – von kleinen Molekülen zu Systembiologie und Wirkstoffdesign (Hrsg.: S. Schreiber, T. Kapoor, G. Wess), Wiley-VCH, Weinheim, die im November 2006 erscheinen soll.

Abstrakt

Chemische Biologieansätze haben eine lange Geschichte in der Erforschung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)-Familie, die die größte und wichtigste Zielgruppe für Therapeutika darstellt. Die Analyse des menschlichen Genoms ergab eine signifikante Anzahl neuer Mitglieder mit unbekannter physiologischer Funktion, die heute im Mittelpunkt vieler Programme zur Entdeckung von Arzneimitteln der reversen Pharmakologie stehen. Da die sieben hydrophoben Transmembransegmente ein definierendes gemeinsames Strukturmerkmal dieser Rezeptoren sind und die Signalübertragung durch heterotrimere G-Proteine ​​nicht in allen Fällen nachgewiesen wird, werden diese Proteine ​​auch als sieben Transmembran-(7 TM) oder Serpentin-Rezeptoren bezeichnet. Dieser Review fasst wichtige historische Meilensteine ​​der GPCR-Forschung zusammen, von den Anfängen, als die Pharmakologie hauptsächlich deskriptiv war, bis zum Zeitalter der modernen Molekularbiologie mit der Klonierung des ersten Rezeptors und nun der Verfügbarkeit des gesamten humanen GPCR-Repertoires an Sequenz und Protein Niveau. Es zeigt, wie die GPCR-gesteuerte Wirkstoffforschung ursprünglich auf dem sorgfältigen Testen einiger weniger speziell hergestellter chemischer Verbindungen beruhte und heute mit modernen Ansätzen zur Wirkstoffsuche verfolgt wird, darunter kombinatorisches Bibliotheksdesign, Strukturbiologie, Molekularinformatik und fortschrittliche Screening-Technologien für die Identifizierung neuer Verbindungen, die GPCRs spezifisch aktivieren oder hemmen. Solche Verbindungen ermöglichen es uns in Verbindung mit anderen neuen Technologien, die Rolle von Rezeptoren in Physiologie und Medizin zu untersuchen und werden hoffentlich zu neuen Therapien führen. Wir skizzieren auch, wie die Grundlagenforschung zu den Signal- und Regulationsmechanismen von GPCRs voranschreitet, die zur Entdeckung neuer GPCR-wechselwirkender Proteine ​​führt und damit neue Perspektiven für die Wirkstoffentwicklung eröffnet. Praktische Beispiele aus GPCR-Expressionsstudien, HTS (High-Throughput-Screening) und dem Design von monoaminbezogenen GPCR-fokussierten kombinatorischen Bibliotheken veranschaulichen die laufende GPCR-Forschung in der chemischen Biologie. Schließlich skizzieren wir zukünftige Fortschritte, die die heutigen Entdeckungen mit der Entwicklung neuer Medikamente in Verbindung bringen können.


Insekten-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Signaltransduktion

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind sieben-Transmembran-Proteine ​​(7-TM), die extrazelluläre Signale durch die Aktivierung von heterotrimeren Guaninnukleotid-bindenden Proteinen (αβγ-Untereinheiten) in zelluläre physiologische Antworten umwandeln. Ihre allgemeinen Eigenschaften sind während der Evolution bemerkenswert gut erhalten. Trotz dieser allgemeinen Ähnlichkeit werden über diese Rezeptorkategorie eine Vielzahl unterschiedlicher Signale vermittelt. Several GPCR-(sub)families have an ancient origin that is situated before the divergence of Protostomian and Deuterostomian animals. Nevertheless, an enormous diversification has occurred since then. The availability of novel sequence information is growing very rapidly as a result of molecular cloning experiments and of metazoan genome (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Homo sapiens) and EST (expressed sequence tags) sequencing projects. The Drosophila Genome Sequencing Project will certainly have an important impact on insect signal transduction and receptor research. In parallel, convenient expression systems and functional assay procedures will be needed to investigate insect receptor properties and to monitor the effects of natural and artificial ligands. The study of the evolutionary aspects of G protein–coupled receptors and of their signaling pathways will probably reveal insect-specific features. More insight into these features may result in novel methods and practical applications. Bogen. Insekten Biochem. Physiol. 48:1–12, 2001. © 2001 Wiley-Liss, Inc.


Abstrakt

Prostaglandins play a critical physiological role in both cardiovascular and immune systems, acting through their interactions with 9 prostanoid G protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are important therapeutic targets for a variety of diseases including arthritis, allergies, type 2 diabetes, and cancer. The DP prostaglandin receptor is of interest because it has unique structural and physiological properties. Most notably, DP does not have the 3–6 ionic lock common to Class A GPCRs. However, the lack of X-ray structures for any of the 9 prostaglandin GPCRs hampers the application of structure-based drug design methods to develop more selective and active medications to specific receptors. We predict here 3D structures for the DP prostaglandin GPCR, based on the GEnSeMBLE complete sampling with hierarchical scoring (CS-HS) methodology. This involves evaluating the energy of 13 trillion packings to finally select the best 20 that are stable enough to be relevant for binding to antagonists, agonists, and modulators. To validate the predicted structures, we predict the binding site for the Merck cyclopentanoindole (CPI) selective antagonist docked to DP. We find that the CPI binds vertically in the 1–2–7 binding pocket, interacting favorably with residues R310 7.40 and K76 2.54 with additional interactions with S313 7.43 , S316 7.46 , S19 1.35 , etc. This binding site differs significantly from that of antagonists to known Class A GPCRs where the ligand binds in the 3–4–5–6 region. We find that the predicted binding site leads to reasonable agreement with experimental Structure–Activity Relationship (SAR). We suggest additional mutation experiments including K76 2.54 , E129 3.49 , L123 3.43 , M270 6.40 , F274 6.44 to further validate the structure, function, and activation mechanism of receptors in the prostaglandin family. Our structures and binding sites are largely consistent and improve upon the predictions by Li et al. ( Marmelade. Chem.-Nr. Soz. 2007 , 129 (35), 10720) that used our earlier MembStruk prediction methodology.


Death Receptor Signaling Pathway

Death receptors are cell surface receptors that transmit apoptotic signals initiated by specific ligands and play a central role in instructive apoptosis. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) gene superfamily. Eight members of the death receptor family have been characterized so far: TNFR1 (also known as DR1, CD120a, p55 and p60), CD95 (also known as DR2, APO-1 and Fas), DR3 (also known as APO-3, LARD, TRAMP and WSL1), TRAILR1 (also known as DR4 and APO-2), TRAILR2 (also known as DR5, KILLER and TRICK2), DR6, ectodysplasin A receptor (EDAR) and nerve growth factor receptor (NGFR). These death receptors are distinguished by a cytoplasmic region of

80 residues termed the death domain (DD). When these receptors are triggered by corresponding ligands, a number of molecules are recruited to the death domain and subsequently a signaling cascade is activated. Two types of death receptor signaling complex can be distinguished. The first group comprises the death-inducing signaling complexes (DISCs) that result in the activation of caspase-8, which plays the central role in transduction of the apoptotic signal. DISC is formed at the CD95 receptor, TRAILR1 or TRAILR2. The second group comprises the TNFR1, DR3, DR6 and EDAR. These recruit a different set of molecules, which transduce both apoptotic and survival signals.


The Molecular Basis of G Protein𠄼oupled Receptor Activation

G protein–coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to external stimuli. Upon activation by a ligand, the receptor binds to a partner heterotrimeric G protein and promotes exchange of GTP for GDP, leading to dissociation of the G protein into α and βγ subunits that mediate downstream signals. GPCRs can also activate distinct signaling pathways through arrestins. Active states of GPCRs form by small rearrangements of the ligand-binding, or orthosteric, site that are amplified into larger conformational changes. Molecular understanding of the allosteric coupling between ligand binding and G protein or arrestin interaction is emerging from structures of several GPCRs crystallized in inactive and active states, spectroscopic data, and computer simulations. The coupling is loose, rather than concerted, and agonist binding does not fully stabilize the receptor in an active conformation. Distinct intermediates whose populations are shifted by ligands of different efficacies underlie the complex pharmacology of GPCRs.


ERGEBNISSE

Β1AR Disrupts Kv11.1/14-3-3ε Association

Figure 1A shows that Kv11.1 coimmunoprecipitated with cotransfected 14-3-3ε, a result that is consistent with the report of Kagan et al. (2002). Interestingly, coexpression of β1ARwt disrupts the interaction, both in basal and Iso stimulated conditions. A detailed electrophysiological analysis of Kv11.1 currents upon Iso β1AR stimulation was performed in CHO cells stably expressing Kv11.1 channels cotransfected or not with the cDNA encoding β1ARwt. Figure 1, B and E, shows families of current traces for control conditions and after 10-min exposure to 1 nM Iso, obtained by applying 5-s pulses, imposed in 20-mV increments between −80 and +60 mV. The holding potential was fixed at −80 mV, and tail currents were recorded upon repolarization to −60 mV. In nontransfected cells (which express low levels of endogenous βAR, unpublished data), Iso accelerated the time course of activation but did not modify the maximum outward current and the time course of deactivation (n = 6 Figure 1B, Table 1). In cells expressing β1ARwt, Iso decreased both the outward and the tail current and accelerated the time course of the initial phase of deactivation, without modifying the time course of activation (n = 6 Figure 1E, Table 1). Panels C, F and D, G show the current-voltage plots of steady-state current at the end of the depolarizing step and the activation curves obtained in the presence and the absence of Iso in nontransfected (C and D) and in β1ARwt-transfected (F and G) cells. In nontransfected cells, Iso did not significantly modify either the steady state current or the slope of the activation curve (Figure 1, C and D), whereas it slightly shifted the midpoint of the activation curve to more negative potentials (Table 1). Such minor Iso-induced changes in channel activity in the absence of transfected β1AR appear to be not receptor-mediated, because it was also observed in the presence of 1 μM propranolol (unpublished data). In cells expressing β1ARwt Iso significantly decreased the current amplitude at −20 and −10 mV (Figure 1F) and the tail current amplitude after pulses between −20 and +60 mV (Figure 1G), without modifying the voltage dependence of activation (n = 6, p > 0.05 Table 1).

Figure 1. β1AR disrupts Kv11.1/14-3-3ε association and Iso inhibits Kv11.1 currents. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of β1ARwt. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed by using specific channel antibodies. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Materialen und Methoden. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces obtained by applying 5-s pulses that were imposed in 20-mV increments between −80 mV and +60 mV. Deactivating Kv11.1 tail currents were recorded at −60 mV. Currents were obtained in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected (E) or not (B) with β1ARwt. (C and F) Mean Kv11.1 current-voltage relationship 5-s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated experimental conditions. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated conditions. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Table 1. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τF, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.

a p < 0.05 vs. data obtained in control conditions.

Β1AR Directly Interacts with 14-3-3ε

A possible explanation for the inhibition of Kv11.1/14-3-3ε interaction in the presence of β1AR may be a direct competition between Kv11.1 and β1AR for 14-3-3ε proteins. In this regard, in the third cytoplasmic loop and the C-terminal region of the β1AR there are PKA phosphorylation sites (Rapacciuolo et al., 2003 RRPSRLV and RPRASGCL, respectively) that exhibit certain homology with the consensus binding site of 14-3-3 proteins (Muslin et al., 1996 Yaffe et al., 1997). Therefore, we explored whether 14-3-3ε proteins bind to β1AR. To this end, HEK-293 cells were transiently transfected with tagged β1AR and 14-3-3ε constructs. Figure 2A shows that upon immunoprecipitation of β1AR, HA-tagged 14-3-3ε could be detected in the receptor complexes and that the presence of Iso promoted a marked increase in β1AR/14-3-3ε coimmunoprecipitation at 5 min of stimulation. These results suggest that activation of β1AR promotes conformational changes and/or triggers signaling pathways that facilitate the recruitment of 14-3-3 proteins to the receptor complex. The basal association of β1AR and 14-3-3ε in cotransfected cells is decreased upon incubation with the β-antagonist betaxolol (unpublished data), consistent with the idea that the reported basal β1AR activity associated with receptor overexpression (Engelhardt et al., 2001) also triggers to certain extent the mechanisms underlying the association. To more clearly visualize the modulation of β1AR/14-3-3 binding by different agents, cells were pretreated with betaxolol to lower such basal recruitment.

Figure 2. β1AR stimulation increases β1AR/14-3-3ε association in HEK-293 cells and guinea pig heart. (A) HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε and pretreated with betaxolol for 1 h were challenged with Iso, and the association between β1AR and 14-3-3 proteins was investigated by immunoprecipitation and Western blot analysis as detailed in Materialen und Methoden. Data indicate the amount of coprecipitated 14-3-3ε proteins, normalized by receptor immunoprecipitation and referred to association in basal (i.e., nonstimulated) conditions, and are mean ± SEM of four independent experiments. Representative gels are shown left. (B) Endogenous β1AR/14-3-3ε complexes are present in guinea pig heart extracts. After incubation of dissociated heart tissue with Iso 10 μM for the indicated periods of time, β1AR were partially purified from solubilized heart membrane extracts by affinity chromatography using alprenolol-Sepharose columns. After elution, fractions were assayed for the presence of receptor and 14-3-3ε proteins by Western blot using specific antibodies as detailed in Materialen und Methoden. In the case of the β1AR, two bands are apparent in some fractions likely due to different glycosylation patterns. Gels are representative of two independent experiments.

To validate this association in a more physiological setting, we searched for the occurrence of these molecular complexes in endogenous conditions. After exposure of guinea pig heart samples to Iso for different periods of time, β1AR were partially purified by affinity chromatography using the antagonist alprenolol. On elution of bound receptors and their associated proteins, fractions were analyzed for the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins by using specific antibodies. Figure 2B indicates that 14-3-3ε proteins coeluted with purified endogenous receptors and that such coelution is increased upon agonist stimulation. This result confirms that β1AR and 14-3-3ε proteins associate ”in situ“ in the heart in an agonist-dependent way.

Consistent with the idea that stimulation of the cAMP/PKA pathway is involved in triggering β1AR/14-3-3ε binding, their coimmunoprecipitation is rapidly promoted by incubating cells with forskolin, a well-known AC activator (Figure 3A). Conversely, both basal and agonist-induced association is blocked in the presence of the PKA inhibitor H-89 (Figure 3B), but not by protein kinase C or mitogen-activated protein kinase/ERK kinase (MEK) inhibitors (Ro-31-8220 and PD98059, respectively). Overall, these data clearly establish that PKA activity is directly or indirectly required for triggering the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins in the same molecular complex.

Figure 3. The association between β1AR and 14-3-3 proteins is direct and dependent on PKA activity. HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε were stimulated with forskolin (A) or Iso in the absence or presence of the indicated protein kinase inhibitors (B). The receptors were then immunoprecipitated and the presence of 14-3-3ε proteins analyzed and quantitated as in Figure 1. Gels representative of three independent experiments are shown. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, A and B. (C) Phosphorylation of β1AR cytoplasmic domain by PKA. The indicated GST fusion protein, encompassing the third intracellular loop of the β1AR, or GST as a control was incubated with PKA as detailed in Material and Methods, resolved by electrophoresis and analyzed by Coomassie blue staining or autoradiography ( 32 P). (D) The β1AR GST fusion protein (or GST as a control) was incubated in the absence or presence of PKA as in C. After washing, the GST proteins were incubated for 3 h in the presence of purified GST 14-3-3ε, and association to the latter protein was analyzed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies or a nonrelated IgG as a control. The immunoprecipitates were resolved by electrophoresis and blotted with 14-3-3ε or anti-GST antibodies to detect β1AR fusion protein, migration of which (including a GST-3il-β1AR proteolytic fragment) is shown with asterisks. Results are representative of two independent experiments.

To test if PKA phosphorylated β1AR would directly recruit 14-3-3 proteins, we next performed in vitro assays with purified 14-3-3ε and a β1AR cytoplasmic domain fusion protein. As shown in Figure 3C, a GST-fusion protein encompassing the third intracellular loop of the β1AR (GST-3il-β1AR) was readily phosphorylated in the presence of purified PKA. The GST-β1AR construct were subsequently incubated with purified GST-14-3-3ε, followed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies (or control nonrelated antibodies). Figure 3D shows a robust, specific interaction of 14-3-3ε with GST-3il-β1AR in a PKA phosphorylation–dependent way.

Mutation of PKA Phosphorylation Sites Renders β1AR Unable To Associate to 14-3-3ε and To Compete Its Interaction with Kv11.1

Overall, these results demonstrated a direct interaction between 14-3-3ε and PKA-phosphorylated β1AR. To further explore this point, we generated different β1AR mutants (β1ARS312A, β1ARS412A, and the double mutant β1ARS312,412A) in which serine residues 312 and 412 were substituted for alanines, a modification reported to prevent their phosphorylation by PKA upon receptor stimulation (Rapacciuolo et al., 2003). All these receptor constructs showed a similar pattern of adenylyl cyclase stimulation upon expression of comparable levels in HEK-293 cells and challenge with Iso (see Supplementary Figure S1). Despite such efficient activation of the cAMP signaling pathway, the ability of these mutants to associate to cotransfected 14-3-3ε isoforms, both in basal and agonist-stimulated conditions is completely lost in the double mutant β1ARS312,412A (Figure 4A) or markedly decreased for the individual mutants (Figure 4B), in comparison with β1ARwt. These results clearly indicate that PKA phosphorylation of the β1AR at these residues is required for the association of 14-3-3 proteins. In contrast, mutation of S312 to aspartate, which would mimic receptor phosphorylation, leads to an increased β1AR/14-3-3ε interaction even in basal conditions (Figure 4C).

Figure 4. Mutation of residues critical for PKA-mediated phosphorylation render β1AR unable to associate to 14-3-3ε proteins. HEK-293 cells were transiently transfected with HA-tagged 14-3-3ε and different Flag-tagged β1AR constructs. Cells were stimulated with Iso (10 μM) for the time indicated, and the association between the different receptors and 14-3-3ε proteins assessed as in previous figures. Gels are representative of 3–4 independent experiments. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to the wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, C–E.

Β1ARwt and Mutants Unable To Interact with 14-3-3ε Display a Different Pattern of Modulation of Kv11.1

Our data suggested that β1AR stimulation would sequentially lead to PKA activation, receptor phosphorylation, and recruitment of 14-3-3ε proteins to the complex, which would displace these molecules from their binding sites in Kv11.1 channels. To explore this hypothesis, we tested whether the presence of β1AR mutants, differing in their ability to recruit 14-3-3ε, had different effects on the interaction between Kv11.1 and 14-3-3ε.

In contrast to the disruption of binding observed with β1ARwt, the Kv11.1/14-3-3ε association is preserved upon expression of similar levels of β1ARS312,412A (Figure 5A). In this case the presence of Iso leads to an enhanced association, in agreement with the expected increase in PKA-phosphorylated Kv11.1. Consistently, the β1ARS312A mutant, which barely displays association with 14-3-3, is also unable to disrupt the Kv11.1/14-3-3 binding, whereas β1AR S312D markedly inhibits Kv11.1/14-3-3 coimmunoprecipitation, as the β1ARwt does (Figure 5A, right panel).

Figure 5. Modulation of Kv11.1/14-3-3ε interaction and Kv11.1 currents by expression of different β1AR mutants. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of the indicated β1AR constructs. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed as in Figure 1A. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Materials and Methods. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces were obtained and analyzed as detailed in Figure 1 in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected with β1ARS312,412A or β1ARS312D as indicated. (C and F) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Interestingly, in cells expressing β1ARS312,412A (Figure 5B) Iso increased the maximum outward current and accelerated the time course of activation but did not modify the time course of deactivation (Table 1). In contrast to the results obtained with β1ARwt (see Figure 1, E–G), Iso significantly increased the maximum outward current amplitude at negative potentials (Figure 5C) and markedly shifted the voltage-dependence of activation (Figure 5D), which may explain the increase in the tail and maximum outward currents observed at negative potentials (n = 6–9 p < 0.05 vs. control Table 1). It should be stressed that in cells expressing β1ARS312A or β1AR S412A the effects produced by Iso on current amplitude, as well as on the time- and voltage-dependent properties of the channels, were almost identical to those produced in cell expressing β1ARS312,S412A (Table 1). On the contrary, in cells expressing the β1ARS312D mutant (Figure 5, E–G), Iso accelerated the time course of the initial phase of deactivation (Table 1) and decreased the maximum outward current at potentials between −20 and +20 mV and the tail current elicited by applying pulses positive to −30 mV, without modifying the voltage-dependence of the activation (Figure 5G and Table 1), a situation reminiscent of the effects observed in cells expressing β1ARwt (Figure 1, E–G).

To better compare the effects induced by Iso, in Figures 6, I–K the percentages of change in the maximum outward current that elicited at −20 mV and in the amplitude of tail currents elicited after pulses to +60 mV or to −20 mV are shown. In cells expressing β1ARWt or β1ARS312D, Iso decreased the current amplitude at −20 mV by 19.9 ± 5.4% (n = 6) and by 23.5 ± 1.8% (n = 7), respectively (panel I), whereas in cells not transfected with β1AR, Iso increased the current by 13.9 ± 3.2% (n = 6). In cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A, Iso markedly increased the current amplitude (n = 6–9, p < 0.05 vs. increase in nontransfected cells panel I). In cells expressing β1ARwt or β1ARS312D, Iso inhibited the tail current after pulses to + 60 mV (panel J) by 30.1 ± 5.3 and 32.1 ± 12.3%, respectively. In contrast, the reduction of the tail currents induced by Iso in nontransfected cells and in cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A was significantly lower (p < 0.01, n = 6–9 panel J). Moreover, in these mutants again in contrast to the ≈20% inhibition observed in cells expressing β1ARwt or S312D, Iso significantly increased the tail current amplitude after pulses to −20 mV (n = 6–9 Figure 6K).

Figure 6. The differential effect of Iso on Kv11.1 currents mediated by β1ARwt or β1AR S312,412A is abolished in the presence of 14-3-3 inhibitors. (A, C, E, and G) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1AR wt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (A and C) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (E and G). (B, D, F, and H) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1ARwt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (B and D) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (F and H). (I–K) Percentage of change induced by 1 nM Iso in the different conditions in the amplitude of Kv11.1 currents elicited after 5-s pulses to −20 mV (I) and tail currents elicited on repolarization to −60 mV after 5-s pulses to +60 mV (J) and −20 mV (K). In I *p < 0.05 versus Kv11.1. In J, *p <0.05 versus data obtained in β1ARwt transfected cells, # p < 0.05 versus data obtained in β1ARS312,S412A-transfected cells. Each point or bar represents the mean ± SEM of ≥6 experiments.

To confirm that 14-3-3 proteins are involved in these differential effects of the β1AR phosphorylation deficient mutants on Kv11.1 current modulation, we next performed similar experiments in conditions where endogenous 14-3-3 function was inhibited. We first studied the effects of Iso in the presence of R-18 (200 nM), an unphosphorylated peptide that binds to all 14-3-3 isoforms with equal affinities producing a competitive inhibition (Wang et al., 1999). Because it can be presumed that the membrane diffusion of R-18 would be limited, this inhibitor was added to the internal solution that dialyzed the cells when the patch seals were broken. Kv11.1 currents recorded in R-18 dialyzed cells were of similar amplitude to those recorded in not dialyzed cells (p > 0.05) and exhibited the same time- and voltage-dependent properties. Interestingly, under these conditions, the differential effects produced by Iso on Kv11.1 currents in β1ARwt- and β1ARS312,412A-transfected cells were not observed. Iso similarly inhibited the maximum outward current elicited in cells expressing either β1ARwt or β1ARS312,S412A (Figure 6, A and C), as well as the tail currents elicited on return to −60 mV (Figure 6, B and D). Furthermore, Iso did not modify either the time course of channel activation and deactivation, or the voltage-dependence of activation (Table 2). Similar results were obtained when a different strategy of inhibition of 14-3-3 function based on cotransfection with a DN14-3-3 mutant was used (Figure 6, E–H, and Table 2). The effects of Iso on Kv11.1 channels in cells expressing β1AR wt or β1ARS312,S412A in the presence of 14-3-3 inhibitors, were qualitatively identical and not quantitatively different to those produced in cells expressing β1ARwt in the absence of inhibitors.

Table 2. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage-dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τF, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.


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Bemerkungen:

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