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Vorherrschendes großes (>=90kDa) Erhaltungsprotein/Beladungskontrolle

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Ich habe mich gefragt, ob jemand Empfehlungen für gute, große (hoffentlich 100 kDa+) Kontrollproteine ​​hat, die in den meisten Säugerzellen vorhanden sein würden. Ich arbeite hauptsächlich mit Gewebeproben von Menschen und Mäusen und insbesondere mit Atemwegsepithel, wenn es darauf ankommt. Bisher ist HSP90 das Beste, an das ich gedacht habe, aber das ist aus einer Reihe von Gründen alles andere als ideal. Meine Zielproteine ​​liegen zwischen 125 und 210 kDa. Um die Auflösung zu verbessern, haben wir so ziemlich alles unter 90 kDa vom Gel laufen lassen.

Das entfernt die alten Standbys wie Actin oder GAPDH. Ich verstehe, dass die Proteinkonzentrationen zwischen Zelltypen variieren können, um ein gutes Ziel für die Ladungskontrolle zu erreichen. Bonuspunkte, wenn Sie einen guten Antikörperklon dafür kennen.


Vinculin! Ich liebe unsere Doktoranden, ich kann nicht glauben, dass ich gestern Abend nicht daran gedacht habe.

Außerdem ein tolles Diagramm, auch wenn es von einer Firma stammt.


ROS-regulierte reversible Proteinphasentrennung synchronisiert die Pflanzenblüte

Wie aerobe Organismen unvermeidlich erzeugte, aber potenziell gefährliche reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zum Nutzen des normalen Lebens nutzen, ist eine grundlegende biologische Frage. Es wurde berichtet, dass lokal akkumulierte ROS die Stammzelldifferenzierung anregen. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus ist jedoch unklar. Hier zeigen wir, dass entwicklungsbedingt erzeugtes H2Ö2 im Pflanzenspross apikales Meristem (SAM) löst eine reversible Proteinphasentrennung von TERMINATING FLOWER (TMF) aus, einem Transkriptionsfaktor, der den Blüteübergang in der Tomate durch Unterdrückung der vorzeitigen Reifung von SAM steuert. Cysteinreste in TMF spüren zelluläres Redox, um Disulfidbindungen zu bilden, die mehrere TMF-Moleküle verketten und die Menge an intrinsisch ungeordneten Regionen erhöhen, um die Phasentrennung voranzutreiben. Durch Oxidation ausgelöste Phasentrennung ermöglicht es TMF, den Promotor eines Blütenidentitätsgens zu binden und zu sequestrieren ANANTHA seinen Ausdruck zu unterdrücken. Die reversible transkriptionelle Kondensation über Redox-regulierte Phasentrennung verleiht aeroben Organismen die Flexibilität der Genkontrolle im Umgang mit Entwicklungssignalen.


Abstrakt

Ein vorwärts gerichteter genetischer Screening-Ansatz identifizierte orf19.2500 als Genkontrolle Candida albicans Biofilmausbreitung und Biofilmablösung. Dreidimensionale (3D) Proteinmodellierung und Bioinformatik zeigten, dass orf19.2500 ein konserviertes mitochondriales Protein ist, das strukturell der Squalen/Phytoen-Synthasen-Familie ähnlich ist, sich aber funktionell von dieser unterscheidet. Die C. Albicans orf19.2500 zeichnet sich durch 3 evolutionär erworbene Abschnitte von Aminosäureinserts aus, die bei allen anderen Eukaryoten mit Ausnahme einer kleinen Anzahl von Ascomyceten-Pilzen fehlen. Biochemische Assays zeigten, dass orf19.2500 für den Aufbau und die Aktivität des N A D H u Bichinon-Oxidoreduktase-Komplexes I (CI) der respiratorischen Elektronentransportkette (ETC) erforderlich ist und wurde daher benannt NDU1. NDU1 ist essentiell für Atmung und Wachstum auf alternativen Kohlenstoffquellen, wichtig für die Immunevasion, für die Virulenz in einem Mausmodell der hämatogen disseminierten Candidose und für die Potenzierung der Resistenz gegen Antimykotika erforderlich. Unsere Studie ist der erste Bericht über ein Protein, das die Kandidat-ähnlich Pilzen phylogenetisch abgesehen von allen anderen Eukaryoten, allein aufgrund des evolutionären „Gewinns“ von neuen Aminosäure-Inserts, die auch die funktionelle Drehscheibe des Proteins sind.

Zitat: Mamouei Z, Singh S, Lemire B, Gu Y, Alqarihi A, Nabeela S, et al. (2021)Ein evolutionär divergiertes mitochondriales Protein kontrolliert das Biofilmwachstum und die Virulenz in Candida albicans. PLoS Biol 19(3): e3000957. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000957

Wissenschaftlicher Redakteur: Anita Sil, University of California, San Francisco, VEREINIGTE STAATEN

Empfangen: 11. September 2020 Akzeptiert: 29. Januar 2021 Veröffentlicht: 15. März 2021

Urheberrechte ©: © 2021 Mamouei et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Datenverfügbarkeit: Die Daten sind im Manuskript zu finden.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium R01AI141794-01A1 an PU und 1R01AI141202-01 an AI unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Abkürzungen: 3D, dreidimensionale BN-PAGE, Blue native PAGE BSA, Rinderserumalbumin CFU, koloniebildende Einheit CI, Komplex I CII, Komplex II DOX, Doxycyclin ETC, Elektronentransportkette FDA, Fluoresceindiacetat FGSC, Fungal Genetics Stock Center FPS , Farnesylthiopyrophosphat HUVEC, humane Nabelschnurendothelzellen LDH, Lactatdehydrogenase mNDU1, reife NDU1 MOPS, Morpholinpropansulfonsäure OCR, Sauerstoffverbrauchsrate OPK, opsonophagozytäre Abtötung OPM, Orientierungen von Proteinen in Membranen PHYS, Phytoene-Synthase PMSF . reaktiver Sauerstoff Spezies SE, Silikonelastomer SQS, Squalensynthase TCA, Tricarbonsäure WT, Wildtyp


ERGEBNISSE

Sec1 interagiert mit der Exozysten-Untereinheit Sec6

Zur direkten Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Exocysten-Untereinheiten und Sec1 haben wir Sec1-V5-His . gereinigt6 (im Folgenden als Sec1 bezeichnet) aus Hefe und immobilisiert sie mit einem α-V5-Antikörper auf Protein G-Harz (wie in Togneri et al., 2006). Gereinigte rekombinante Exocysten-Untereinheiten wurden einzeln auf ihre Fähigkeit getestet, Sec1 zu binden. Von den acht Exozysten-Untereinheiten ist Sec6 (Sivaram et al., 2005), Sec8 (Sivaram et al., 2006), Sec10 (Aminosäuren 145–827 Croteau et al., 2009), Exo70 (63–623 Dong et al., 2005) und die C-terminale Region von Exo84 (523–753 Dong et al., 2005) waren löslich, die anderen Untereinheiten wurden nicht getestet. Gereinigtes Sec6 war die einzige Untereinheit, die robust und spezifisch mit Sec1 interagierte (Abbildung 1, A–C). Die scheinbare Dissoziationskonstante (KD) zwischen Sec1 und Sec6, basierend auf dem Pull-down-Assay, betrug ∼1.7 ± 0.4 μM (Abbildung 1D). Diese Affinität ist etwas schwächer als die scheinbare KD für die Sec6-Sec9-Wechselwirkung, ∼0.5 μM (Sivaram et al., 2005) und für die Sec1-SNARE-Komplex-Wechselwirkung ∼0.3 μM (Togneri et al., 2006). Die Sec6-Sec1-Bindungsinteraktion war reziprokes Sec6, das unter Verwendung eines C-terminalen Strep-Affinitäts-Tags immobilisiert wurde, das an gereinigtes Sec1 gebunden war (Abbildung 1E). Frühere Kartierungen zeigten, dass die N-terminale Domäne von Sec6 für die Dimerisierung und für die Bindung sowohl an Sec9 als auch an die Exozysten-Untereinheit Sec8 (Sivaram et al., 2005, 2006). Umgekehrt reicht die C-terminale Domäne von Sec6 (411–805) aus, um die Exozysten-Untereinheiten Sec10 und Exo70 (Sivaram et al., 2006). Hier zeigen wir, dass die C-terminale Domäne von Sec6 für die Sec1-Bindung nicht ausreicht (Abbildung 1B), was darauf hindeutet, dass die N-terminale Domäne von Sec6 auch für den Sec6-Sec1-Komplex erforderlich ist. Die Unlöslichkeit der N-terminalen Domäne von Sec6 allein hat bisher ein direktes Testen dieser Region ausgeschlossen.

ABBILDUNG 1: Sec1 interagiert mit der Exozysten-Untereinheit Sec6. (A) Gereinigtes Sec1-V5-His6 wurde mit α-V5-Antikörper immobilisiert und mit gereinigten Exozysten-Untereinheiten gemischt: Sec6, Exo70 (63–623) und Sec10 (145–827). Eingegebene und gebundene Proben wurden auf einem 8% SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. (B) Ähnliche Experimente wurden unter Verwendung der C-terminalen Domäne (411–805) von Sec6 und Exo84 (523–753) durchgeführt. Eingegebene und gebundene Proben wurden auf einem 12% SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. Nur Sec6 voller Länge an Sec1 gebunden. (C) Sec1-V5-His6 wurde immobilisiert und mit Ni NTA-gereinigtem His . inkubiert6-Sek8. In diesem Fall sind die eingegebenen und gebundenen Proteine ​​(die alle His6 markiert) wurden durch Western-Blotting unter Verwendung von α-His5-Antikörper analysiert. (D) Repräsentative Bindungskurve für Sec6–Sec1. Sec1 wurde auf Kügelchen immobilisiert und mit steigenden Konzentrationen von Sec6 inkubiert. Die scheinbare Bindungskonstante betrug 1,7 ± 0,4 μM (Mittelwert ± SEM) aus Anpassungen an drei verschiedene Experimente. (E) Die Sec6-Sec1-Bindungswechselwirkung ist reziprok. Gereinigtes Strep-markiertes Sec6 wurde auf Strep-Tactin-Harz immobilisiert und mit gereinigtem Sec1 inkubiert. Eingegebene und gebundene Proben wurden auf einem 8% SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. Für alle Experimente beziehen sich Hc und Lc auf die schweren bzw. leichten Ketten des α-V5-Antikörpers. Um das Auslaufen von Proteinen zwischen verschiedenen Bahnen zu vermeiden, wurden Gele oft mit leeren Bahnen zwischen den Eingaben betrieben und gebundene leere Bahnen aus demselben Gel wurden mit Photoshop herausgeschnitten. Für alle Experimente werden repräsentative Gele für mindestens drei Wiederholungen gezeigt.

Als Positivkontrolle wurde gereinigtes Sec1 analysiert, um die spezifische Bindung von Sec1 an ternäre SNARE-Komplexe sicherzustellen, die Sec9, seinen Partner t-SNARE Sso1 (das exozytische Syntaxin der Hefe) und v-SNARE Snc2 (Togneri et al., 2006 Abbildung 2A). Wir fanden auch, dass sowohl Sec9 als auch Sso1 bei hohen Konzentrationen (≥10 bzw. ≥20 μM, Abbildung 2, B und C) schwach an Sec1 binden können. Diese Wechselwirkungen waren zuvor nicht beobachtet worden, wahrscheinlich aufgrund der niedrigeren Proteinkonzentrationen, die in diesen Experimenten verwendet wurden (≤10 μM Scott et al., 2004 Togneri et al., 2006). Diese Wechselwirkungen sind jedoch nicht völlig unerwartet, da die Bindung von Nicht-Syntaxin-SNAREs für andere SM-Proteine ​​beobachtet wurde (Peng und Gallwitz, 2004 Carpp et al., 2006 Xu et al., 2010).

ABBILDUNG 2: Sec1-SNARE-Wechselwirkungen. (A) Gereinigte binäre und ternäre SNARE-Komplexe wurden mit immobilisiertem Sec1-V5-His . inkubiert6. Eingegebene und gebundene Proben wurden auf einem 15% SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. (B, C). Titration steigender Konzentrationen von Sso1 oder Sec9 auf immobilisiertes Sec1-V5-His6. Gebundene Proben wurden auf 12% SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. Bei hohen Konzentrationen von Sec9 (30 &mgr;M) wird eine gewisse Hintergrundbindung von Sec9 an Sec1 beobachtet.

Analytische Gelfiltrationsanalysen bestätigten die Sec6-Sec1-Wechselwirkung in Lösung (Abbildung 3). Sec1 wandert als Monomer, während Sec6 überwiegend als Dimer läuft, mit einer Schulter im Gelfiltrationspeak, die mit einer kleinen Menge an monomerem Sec6 kompatibel ist (einschließlich der Affinitäts-Tags, Sec1 ist 89 kDa und Sec6 ist 95 kDa). Die Dimerisierung von Sec6 wurde zuvor berichtet (Sivaram et al., 2005) wurde die Anwesenheit des Sec6-Monomers jedoch nicht nachgewiesen, da die für die Analysen verwendete Nachweismethode weniger sensitiv war (Coomassie-gefärbte Gele vs. Western-Blots, analysiert mit einem spezifischen α-Sec6-Antikörper). Der Sec6-Sec1-Komplex wandert, wie aus dem erhöhten scheinbaren Molekulargewicht von Sec1 abgeleitet wird, mit einem scheinbaren Molekulargewicht, das mit dem des Sec6-Dimers vergleichbar ist (scheinbares Molekulargewicht ∼180 kDa), was darauf hindeutet, dass der Sec6-Sec1-Komplex eine 1: 1 Stöchiometrie, wobei Sec1 an die monomere Form von Sec6 bindet. Dies steht im Gegensatz zu der zuvor charakterisierten 2:2-Stöchiometrie für den Sec6-Sec9-Komplex (Abbildung 3 Sivaram et al., 2005), aber stimmt mit der Stöchiometrie überein, die für den zusammengesetzten Exozystenkomplex mit je einer Untereinheit pro Komplex bestimmt wurde (TerBush et al., 1996).

ABBILDUNG 3: Sec9 konkurriert mit Sec1 um die Bindung von Sec6. Analytische Gelfiltrationsläufe (Superdex 200-Säule) von gereinigtem Sec1, Sec6, Sec9CT und den verschiedenen Kombinationen wurden durch die Extinktion bei 280 nm überwacht. Zum Vergleich sind die Retentionsvolumina von -Globulin (158 kDa) und Ovalbumin (44 kDa) gezeigt. Die Anwesenheit jedes Proteins in den Fraktionen wurde durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von &agr;-V5 für Sec1-, &agr;-Sec6- und &agr;-Sec9-Antikörper bestimmt. Beachten Sie, dass der molare Extinktionskoeffizient von Sec9 bei 280 nm etwa 30-mal kleiner ist als der von Sec6 und Sec1.

Interessanterweise führte die Zugabe äquimolarer Mengen von Sec1, Sec6 und Sec9 zusammen zu einem Sec6-Sec9-Komplex (scheinbares Molekulargewicht 235 kDa) und monomerem Sec1 (scheinbares Molekulargewicht 90 kDa). Ternäre Sec6-Sec9-Sec1-Komplexe wurden nicht beobachtet. Somit konkurriert Sec9 robust mit Sec1 um die Sec6-Bindung, was darauf hindeutet, dass entweder die Sec1- und Sec9-Bindungsstellen auf Sec6 ähnlich sind oder dass die Sec1-Bindung eine allosterische Konformationsänderung in Sec6 induziert, die mit der Sec9-Bindung inkompatibel ist. Darüber hinaus scheint die Sec1-Bindung mit der Sec6-Dimerisierung zu konkurrieren, wohingegen zwei Moleküle Sec9 pro Sec6-Dimer binden. Diese Daten werden durch unsere Ergebnisse gestützt, die zeigen, dass die N-terminale Domäne von Sec6 sowohl für die Bindung von Sec1 als auch für Sec9 und auch für die Dimerisierung benötigt wird (Abbildung 1B Sivaram et al., 2005). Da jedoch Sec1 mit der Sec6-Dimerisierung konkurriert, während Sec9 dies nicht tut, sind die Bindungsstellen für Sec1 und Sec9 auf Sec6 nicht identisch, sondern überlappen sich wahrscheinlich.

Sec6-Exocyst interagiert mit Sec1, während nicht-Exocyst-gebundenes Sec6 an Sec9 . bindet

Um die Sec6-Wechselwirkungen in vivo zu testen, wurde α-HA-Antikörper verwendet, um Sec6-HA . zu immunpräzipitieren3 aus Hefelysaten. Eine kleine Fraktion von Sec9 coimmunpräzipitierte mit Sec6, es sei denn, Sec9 wurde überexprimiert ( 4A ). Die unspezifische Bindung von Sec1 an den α-HA-Antikörper erzeugte hohe Hintergrundspiegel, daher exprimierten wir Sec1-V5 im Sec6-HA3 Stamm und immunpräzipitierten Sec1 mit dem α-V5-Antikörper. Mit Sec1-V5 coimmunpräzipitiertes Sec6 (Fig. 4B) lag die Menge an coimmunpräzipitiertem Sec6 durchweg über den Hintergrundwerten, obwohl die gebundene Menge nur ein Bruchteil (~1%) des gesamten Sec6 in der Zelle ausmachte. Dieser niedrige Prozentsatz entsprach der Menge, die wir für die Sec6-Sec9-Wechselwirkung beobachteten (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu koimmunpräzipitieren die anderen Exozysten-Untereinheiten leicht mit Sec6-HA .3 (Songer und Munson, 2009). Die Sec1-Sec6-Daten stimmen mit früheren Ergebnissen aus dem Novick-Labor überein, in denen eine vergleichbare Menge (∼0,2–0,4%) von Sec1 an den Exozystenkomplex band, wenn es mit Sec8-Myc oder Sec10-Myc koimmunpräzipitiert wurde (Wiederkehr et al., 2004). Zusammen legten diese Ergebnisse nahe, dass Sec1 mit Exocysten-gebundenem Sec6 interagieren kann.

ABBILDUNG 4: Sec6 interagiert mit Sec9 und Sec1 in vivo. (A) Immunpräzipitation von Sec6-HA3 aus Hefelysaten mit &agr;-HA-Antikörper zieht endogenes Sec9- und Sec9-Protein in voller Länge herunter, das von einem 2μ-Plasmid überexprimiert wurde. Die Eingangs- und gebundenen Proben wurden auf 8% SDS-PAGE laufen gelassen und auf Sec6 und Sec9 immungeblottet. (B) Aus Hefelysaten immunpräzipitiertes Sec1 bindet endogen exprimiertes Sec6-HA3. Die eingegebenen und gebundenen Proben wurden auf 8% SDS-PAGE laufen gelassen und auf V5- und HA-Epitop-Tags immungeblottet.

Wir testeten, ob rekombinantes Sec6 mit Sec1 interagieren könnte, während es in vitro an andere Exozysten-Untereinheiten gebunden war. Die paarweisen Affinitäten der Exozysten-Exozysten-Wechselwirkungen scheinen recht schwach zu sein (geschätzte >10 μM Dong et al., 2005 Sivaram et al., 2006). Daher haben wir die Bindung von Sec6–Sec1 an eine Kombination von Exozysten-Untereinheiten analysiert. Sec1 wurde auf dem Harz immobilisiert und an Sec6 vorgebunden. Nach dem Waschen, um das ungebundene Sec6 zu entfernen, wurde eine äquimolare Mischung von Exo70, Sec10 und Exo84CT zugegeben. Die Untereinheiten der Exozyste konnten schwach mit dem Sec6-Sec1-Komplex wechselwirken (Abbildung 5A). Exo70 zeigte die robusteste Interaktion, während Sec10 und Exo84CT auch eine gewisse unspezifische Bindung an das Harz zeigten. Im Gegensatz dazu interagierte Sec6, das an immobilisiertes MBP-Sec9CT gebunden war, nicht mit den Exozysten-Untereinheiten (Fig. 5B). Zusammen weisen diese Daten darauf hin, dass Sec1 mit Sec6 in Gegenwart der anderen Exozysten-Untereinheiten interagieren kann und in vivo einen schwachen oder vorübergehenden Komplex mit der Exozyste bilden kann. Im Gegensatz dazu scheint Sec9 mit Exocysten-Untereinheiten um die Sec6-Bindung zu konkurrieren.

ABBILDUNG 5: Sec1 interagiert mit Exocysten-gebundenem Sec6, wohingegen Sec9 mit nicht-Exocysten-gebundenem Sec6 interagiert. (A) In vitro wurden gereinigte Exocysten-Untereinheiten gleichzeitig bei einer Konzentration von 1,5 und 5 μM zu vorgeformtem immobilisiertem Sec1-V5-His . hinzugefügt6-Sec6-Komplexe. Nach 1 h Inkubation bei 4 °C wurden Input- und gebundene Proben auf 8 und 12% SDS-PAGE laufen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. (B) Ähnliche Experimente wurden unter Verwendung von MBP-Sec9 immobilisiert auf Amyloseharz durchgeführt. Gereinigte Exozysten-Untereinheiten (5 μM) wurden mit immobilisiertem Sec9 oder vorgeformten Sec9-Sec6-Komplexen inkubiert. Gebundene Proteine ​​wurden auf SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen und mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt. Ein Sternchen weist auf ein Abbauprodukt des MBP-Sec9-Proteins hin. (C) Superose 6 10/30 analytische Gelfiltration von Hefelysaten wurde durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung spezifischer polyklonaler Antikörper analysiert. Die Bandenintensitäten wurden auf die intensivste Bande normalisiert, wie durch ECL visualisiert, die Datenpunkte wurden über drei Durchläufe gemittelt und die Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert ± SEM.

Auch Gelfiltrationsstudien unterstützten diese Idee. Sec1, Sec9 und die Exocysten-Untereinheiten aus Hefelysaten wurden auf einer analytischen Gelfiltrationssäule laufen gelassen und ihre Mobilität durch Western-Blot-Analysen überwacht (Fig. 5C). Wir haben zuvor gezeigt, dass Sec6 sowohl in Exocysten-gebundenen als auch in nicht-Exocysten-gebundenen Fraktionen vorhanden ist, obwohl die Größe der Pools zwischen den verschiedenen Experimenten erheblich variierte (Sivaram et al., 2005). Wir schlugen ursprünglich vor, dass der Nichtexozysten-Pool ein Dimer von Sec6 enthielt, da es mit ungefähr dem doppelten Molekulargewicht von Sec6 wanderte, aber wir konnten andere Komplexe mit Sec6 nicht ausschließen. Hier fanden wir, dass assemblierte Exocystenkomplexe als klarer Peak (∼10–12,5 ml) mit einem scheinbaren Molekulargewicht von >1 MDa wanderten. Es wird ein Nichtexozysten-Pool von Sec6 (93 kDa) beobachtet (scheinbares Molekulargewicht 250 kDa), der mit einer Fraktion von Sec8 (122 kDa) wanderte. Ein nicht an Exozysten gebundener Pool von Exo70 wurde ebenfalls beobachtet (scheinbares Molekulargewicht ∼70 kDa), der mit einem monomeren Pool von Exo70 (Molekulargewicht 71 kDa) übereinstimmt, der an der Plasmamembran vorhanden ist (Boyd et al., 2004 Er et al., 2007). Der Hauptpeak von Sec1 wurde als Spezies mit hohem Molekulargewicht (scheinbares Molekulargewicht >1 MDa) gefunden, die teilweise mit dem Exozystenkomplex-Peak überlappt. Die Mobilität von Sec1 stimmt damit überein, dass ein kleiner Bruchteil von Sec1 mit der Exozyste interagiert (Wiederkehr et al., 2004), wobei die Mehrheit entweder mit anderen Bindungspartnern interagiert oder oligomerisiert. Umgekehrt wurde Sec9 überwiegend als Spezies mit niedrigerem Molekulargewicht gefunden, wobei die Mobilität die des nicht-Exocysten-gebundenen Pools von Sec6 überlappte. Das scheinbare Molekulargewicht (∼600 kDa) von Sec9 ist auch viel größer als für ein Monomer (74 kDa) erwartet, was auf eine Oligomerisierung und/oder Wechselwirkungen mit anderen Partnern schließen lässt. Außerdem waren viele der Proteine ​​im Hohlraumvolumen (~8 ml) der Säule vorhanden, was darauf hinweist, dass sie große Oligomere oder Aggregate bildeten. Die Gelfiltrationsstudien stützen die Idee, dass die Sec6-Sec1-Wechselwirkung innerhalb des Exozystenkomplexes stattfindet, aber dass Sec6-Sec9 aus dem Exozystenkomplex ausgeschlossen ist.

Regulierung der binären SNARE-Komplexanordnung

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt beim Aufbau des SNARE-Komplexes ist die Bindung von Sec9 an das Syntaxin Sso1 (oder sein Homolog Sso2 Nicholson et al., 1998). Die Bildung des Sec9-Sso1-Komplexes wird in vitro und in vivo durch die N-terminale autoinhibitorische Domäne von Sso1 (Nicholson et al., 1998 Munson et al., 2000 Munson und Hughson, 2002). Diese Sso1-Autohemmung muss bei der Vesikelankunft an den Sekretionsstellen spezifisch freigesetzt werden, um den Zusammenbau des t-SNARE-Komplexes zu erleichtern. Anschließend bindet das v-SNARE Snc2 (oder sein Homolog Snc1), was zur Membranfusion führt (Nicholson et al., 1998). Die Faktoren, die die Sso1-Hemmung auslösen, sind unbekannt.

Wir stellten ursprünglich die Hypothese auf, dass die Exozysten-Untereinheit Sec6, weil sie Sec9 bindet, der Faktor sein könnte, der die Sso1-Hemmung freisetzt und sie für den SNARE-Komplexaufbau öffnet. Stattdessen hemmt die Zugabe von gereinigtem Sec6 die Bildung des binären Sso1-Sec9-SNARE-Komplexes um das ∼3,5-fache (Sivaram et al., 2005 Abbildung 6A). Die wahrscheinliche Erklärung ist, dass Sso1 eine seltene spontane Öffnungsrate hat, wenn Sso1 geöffnet wird, Sec9 ist nicht verfügbar, weil es an Sec6 gebunden ist, was die effektive Konzentration von freiem Sec9 verringert und die Geschwindigkeit des SNARE-Aufbaus verlangsamt. Diese Sec6-Hemmung des SNARE-Komplexaufbaus wird durch genetische Experimente mit Hefe unterstützt. Die Überexpression von Sec6, das für Wildtyp-Hefezellen nicht toxisch ist, zeigt in Kombination mit dem sek9-4 temperaturempfindliche Mutation, die das Zellwachstum hemmt (Abbildung 6B). Im Gegensatz dazu hat die Überexpression der Exozysten-Untereinheit Sec5 oder Sec1, die eine positive Rolle beim Aufbau des SNARE-Komplexes und bei der Membranfusion vermutet, keinen Einfluss auf das Wachstum von sek9-4 Zellen.

ABBILDUNG 6: Sec6-Hemmung der SNARE-Komplex-Assemblierung. (A) Sec6 hemmt die Sec9-Sso1-Bildung, die durch Zugabe von Sec1 nicht gelindert wird. Gereinigte Sec6 ± Sec1-Proteine ​​wurden bei äquimolaren Konzentrationen mit Sso1 und Sec9 für 0 oder 8 h bei 18°C ​​inkubiert, um den Zusammenbau des SNARE-Komplexes zu ermöglichen. Die Reaktionen wurden auf 6% nativen PAGE-Gelen durchgeführt und mit Coomassie-Blau gefärbt. Repräsentative Gele (mehr als drei Experimente zu vier verschiedenen Zeitpunkten wurden durchgeführt) für die Zeitpunkte 0 h (Mitte) und 8 h (rechts) sind gezeigt, die unkomplexierten Proteine ​​wurden zum Vergleich auf einem separaten Gel ausgeführt (links). Ein Sternchen zeigt die Mobilität des Sso1-Sec9-Komplexes an. (B) Überexpression von SEC6, aber nicht SEC5 oder SEC1, hat in Kombination mit einen synthetischen Defekt sek9-4. Zehnfache Verdünnungsreihe von Wildtyp oder sek9-4 Stämme, transformiert mit Vektor allein, Gal-SEC6, Gal-SEC5, oder Gal-SEC1-V5-His6, wurden auf SC-leu- bzw. SC-ura-Platten, die entweder Glucose oder Galactose enthielten, ausplattiert und bei den angegebenen Temperaturen inkubiert.

Eine Möglichkeit für die Anforderung von Sec1 vor der SNARE-Komplexmontage (Hashizume et al., 2009) ist, dass Sec1 Sec6 binden würde, um das gehemmte Sec6-Sec9-Zwischenprodukt freizusetzen, um den Aufbau des binären SNARE-Komplexes voranzutreiben. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit von Sec1, mit Sec9 um die Bindung von Sec6 zu konkurrieren (Abbildung 3), fanden wir jedoch, dass die Zugabe von Sec1 zur Sec6-haltigen Reaktion die Geschwindigkeit des SNARE-Aufbaus nicht erhöhte (Abbildung 6A). Tatsächlich hemmte die Zugabe von Sec1 allein die Reaktion leicht, wenn auch nicht im gleichen Ausmaß wie Sec6, vermutlich aufgrund der schwach konkurrierenden Sec1-Sec9- und Sec1-Sso1-Wechselwirkungen (Abbildung 2, B und C). Im Gegensatz dazu hat die Exo84CT-Untereinheit, die in Abwesenheit anderer Exozysten-Untereinheiten nicht direkt mit Sec6 interagiert, keinen Einfluss auf die Geschwindigkeit des Zusammenbaus des binären SNARE-Komplexes. Daher reicht die Sec1-Sec6-Wechselwirkung allein nicht aus, um die SNARE-Komplex-Assembly-Reaktion in vitro zu fördern.


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Materialen und Methoden

Strains and culture conditions

Stock d4-2 of P. tetraurelia, the wild-type reference strain, was used in all feeding experiments. The nd7-1 mutant, carrying a recessive monogenic mutation preventing trichocyst discharge [82], was used for the expression of GFP fusions. Cells were grown at 27°C in a wheatgrass infusion (BHB, GSE Vertrieb, Germany), bacterized with Klebsiella pneumoniae, and supplemented with 0.8 μg/ml β-sitosterol according to standard procedures [83].

Gene cloning

Genomic DNA was amplified by PCR, using specific primers (given in S3 Table) in order to fuse the TZ genes to the GFP coding sequence in the pPXV vector, between SpeIch und XhoIch Restriktionsseiten. If these restriction sites were present in the sequence to be cloned, we used the Gibson cloning method [84]. For gene silencing constructs, sequences of interest were designed for their ability to inactivate all the paralogs, if possible with the help of RNAi off-target tools in ParameciumDB [85] to prevent RNAi off-target. The sequences were cloned into the feeding vector, L4440, between two T7 promoters [86].


Einführung

Vectorial protein transport between the ER and Golgi complex requires the coordinated action of many different small GTP-binding proteins of the Ras superfamily, each controlling distinct aspects of the cargo sorting, vesicle formation and vesicle fusion processes (Bonifacino and Glick, 2004 Zerial and McBride, 2001). These GTP-binding proteins share a common mode of action involving the recruitment of cytosolic protein complexes to localized domains on membrane surfaces (Munro, 2002 Short et al., 2005). Sar1 and ARF1 recruit COPII and COPI coat complexes to ER and Golgi membranes, respectively, thus promoting vesicle formation (Bonifacino and Glick, 2004). Rabs recruit protein complexes important for directed vesicle movement and target recognition (Pfeffer, 1999 Waters and Hughson, 2000). To do this, these proteins cycle between a GDP bound inactive state, and a GTP bound membrane-associated active state (Pfeffer and Aivazian, 2004 Vetter and Wittinghofer, 2001). It is this GTP bound state that makes specific interactions with so-called effector complexes, and thus promotes their recruitment to membranes. This cycle of activation and inactivation is under the control of GDP-GTP exchange factors (GEFs) and GAPs (Pfeffer and Aivazian, 2004 Zerial and McBride, 2001).

In the case of ER to Golgi trafficking, Rab1 and Rab2 have been implicated in the tethering and fusion reactions, and are thought to act sequentially (Allan et al., 2000 Alvarez et al., 1999 Segev, 1991 Tisdale and Balch, 1996 Tisdale et al., 1992). First, COPII vesicles, formed from specialized exit sites on the endoplasmic reticulum (ER exit sites: ERES), are tethered together by the action of Rab1 together with its effector p115 to give rise to vesicular-tubular clusters (VTCs) adjacent to the Golgi (Allan et al., 2000 Alvarez et al., 1999 Bannykh et al., 1996 Cao et al., 1998). TRAPP, the GEF for Rab1, promotes tethering of COPII vesicles by activating Rab1 and also serves as a structural component of the tether (Barrowman et al., 2000 Jones et al., 2000 Sacher et al., 2001 Wang et al., 2000). Recent evidence shows that TRAPP is assembled onto forming COPII vesicles by direct interaction with the coat, thus providing a mechanism to ensure all vesicles can recruit active Rab1 (Cai et al., 2007). Second, Rab2 and its effectors promote the maturation of these VTC structures and their incorporation into the Golgi (Short et al., 2001 Tisdale and Balch, 1996). Finally, in addition to its role in COPII vesicle tethering, Rab1 may also have a function in regulating the exit of secretory cargo from the ER. This idea arose from experiments showing that extraction of Rabs using the Rab chaperone GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitor) prevented the exit of the vesicular stomatitus virus G-protein (VSV G) from the ER and that this could be complemented by a complex of Rab1 and GDI (Peter et al., 1994). Later, Ypt1 and Uso1, the yeast homologues of Rab1 and p115, respectively, were found to play a role in coupling the sorting of secretory cargo to vesicle formation (Morsomme and Riezman, 2002), providing further support for this idea.

To determine which specific Rabs are of general importance for ER to Golgi trafficking and Golgi organization in mammalian cells, we have screened 38 human Rab GAPs for their ability to disrupt the organization of the Golgi complex and protein transport. Rab GAPs are characterized by a conserved catalytic domain, the TBC (Tre2/Bub2/Cdc16) domain (Albert and Gallwitz, 1999 Albert et al., 1999 Strom et al., 1993), that promotes GTP hydrolysis by a dual arginine-glutamine-finger catalytic mechanism related to the arginine-finger mechanism of Ras GAPs (Ahmadian et al., 1997 Albert et al., 1999 Pan et al., 2006 Rak et al., 2000). As we have shown previously, in the case of Rab5 (Haas et al., 2005), Rab GAPs can be used to specifically inactivate the endogenous pool of a Rab and thus interfere with the process that this Rab is involved in. By mutating the catalytic arginine residue of the TBC domain to alanine, the non-specific effects of GAP expression can easily be discriminated from the specific effects of Rab inactivation (Haas et al., 2005).


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Environmental Health & Safety

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EINLEITUNG

WDR5 is a highly-conserved WD40-repeat protein that participates in numerous chromatin-centric processes. Its most prominent role is in scaffolding the assembly of epigenetic ‘writer’ complexes, including the MLL/SET histone methyltransferases (HMTs) that catalyze histone H3 lysine 4 (H3K4) di- and tri-methylation (me2,3), and the non-specific lethal (NSL) and Ada2-containing (ATAC) histone acetyltransferase (HAT) complexes that acetylate histone H4 at lysine 16 (H4K16) ( 1). But WDR5 also functions as an epigenetic ‘reader’, recognizing specific post-translational modifications on histone H3 ( 2, 3), it features in the genetic compensation response ( 4), and it serves as a critical co-factor for the retinoic acid receptor ( 5) and for the MYC family of oncoprotein transcription factors ( 6–9). The many and disparate functions of WDR5 in the nucleus clearly establish its moonlighting capabilities ( 10), but also hamper a fundamental prehension of the protein, making it difficult to establish the predominant biological setting in which WDR5 operates.

Difficulties in pinpointing a clear biologic role for WDR5 are not just conceptual, as WDR5 has emerged as a promising target for anti-cancer therapies ( 11). The motivation for targeting WDR5 is based on its overexpression in multiple cancers ( 12–20), its involvement in malignant processes such as the epithelial to mesenchymal transition ( 21) and cell motility ( 22), and its ties to oncogenic drivers such as MLL-fusion oncoproteins ( 23) and MYC ( 6–9). To date, drug discovery efforts have centered on targeting the ‘WIN’ site of WDR5 ( 10), a deep pocket that binds arginine-containing motifs (consensus ‘ARA’) present in a number of key WDR5-interaction partners, including histone H3 ( 24), KANSL1 [NSL complex ( 25)], and all five MLL/SET family members ( 24). With regard to the latter, the actions of WIN site inhibitors against cancer cell lines have generally been attributed to their ability to inhibit H3K4 methylation via MLL1-containing HMT complexes, which in turn drives decreases in the expression of linked genes ( 23, 26, 27). But with the relatively long time-frame over which mechanism of action studies have been performed, skepticism as to whether changes in H3K4 methylation would even cause changes in transcription ( 28), and the absence of a coherent biological framework for understanding WDR5, the true mode of action of WIN site inhibitors in cancer cells is uncertain.

Recently, we discovered potent small molecule inhibitors of the WIN site of WDR5 and determined their mechanism of cell inhibition in the human Mixed Lineage Leukemia (MLL) cell line MV4:11, which carries the MLL–AF4 fusion oncogene ( 29, 30). This study produced several surprising findings. First, despite the general association of H3K4me3 with transcriptionally active chromatin ( 28), WDR5 binds to just ∼160 sites on chromatin in this setting, as measured by chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-Seq). Although the instances of WDR5 binding are small, the sites involved are strongly enriched in genes connected to protein synthesis (protein synthesis genes PSGs), and encompass half of the ribosome protein genes (RPGs), as well as translation initiation factors and nucleolar components. Second, WIN site inhibitors act rapidly to displace WDR5 from chromatin and diminish transcription from WDR5-bound PSGs, and do so before changes in H3K4me3 status are detected. And third, WIN site inhibitors decrease the protein synthesis capacity of MV4:11 cells, induce nucleolar stress, and activate p53-mediated apoptosis. From these data, we proposed that WDR5 is tethered to chromatin at PSGs via the WIN site, and that WIN site inhibitors act through a primary non-epigenetic mechanism to trigger an ultimately lethal nucleolar stress response in sensitive cell lines.

Although empirical tests of cancer cell sensitivity can be informative, a detailed knowledge of the conserved gene networks controlled by WDR5, and the role of the WIN site in this context, is needed to meaningfully evaluate the potential of WDR5 inhibition as an anti-cancer strategy. It is thus important to establish whether the behavior of WDR5 in MV4:11 cells is atypical, or reflects more general unappreciated aspects of the role WDR5 plays in cells. In this study, we compare the location of WDR5 on chromatin in a panel of mouse and human cells lines of diverse cancer types, and use a WIN site inhibitor to interrogate how WDR5 is tethered to chromatin in different contexts and to reveal the gene networks under the influence of WDR5. We find that the number and location of WDR5 binding sites on chromatin across different cell lines is variable, but that there is a conserved cohort of PSGs that are invariantly bound by WDR5 via the WIN site and transcriptionally repressed by WIN site inhibition. These studies define WDR5 as a conserved regulator of gene networks that promote biomass accumulation, and support the notion that—if a therapeutic window can be established—drug-like WIN site inhibitors could have utility as triggers of nucleolar surveillance and ribosome quality control pathways in cancer cells.


Diskussion

Ribosome production is an essential process during neoplastic transformation. Regulation of cellular growth and proliferation mainly depends on the rate of ribosomal biogenesis. Cancer cells required increased production of ribosomes to sustain their high demand for protein synthesis. Protein synthesis requires ribosomal RNAs besides the protein components of the translation machinery [6].

The underlying molecular mechanisms of ribosomal modifications in various human diseases including malignancy are diverse and not fully understood [32,33,34]. Previous studies on neuroblastoma and lymphocytic leukemia demonstrated that snoRNP signature displayed highly significant prognostic value and was an independent predictor of poor prognosis through its effect on genomic stability and telomere maintenance [10, 11].

NOP10 is one of four essential protein components of H/ACA snoRNPs, which plays a potential role in facilitating the modification and stabilization of ribosomal RNAs. In addition, NOP10 is required for optimal enzymatic activity [35].

To further explore the potential value of snoRNPs family, we investigated for the first time, to the best our knowledge, the prognostic and predictive significance of NOP10 in BC using genomic, transcriptomic, and proteomic data of large BC cohorts. NOP10 protein expression was assessed in the nuclei and nucleoli of BC cells to determine its association with the nucleolar score [4].

The number and size of nucleoli as a consequence of its elevated activity in ribosomal biogenesis has been widely used as a prognostic marker of aggressive cancer [4, 36]. In the current study, a significant association between high NOP10 at both level protein (whether in nucleus or nucleoli) and mRNA expression (transcriptomic) with the nucleolar score (phenotype) was observed. These findings may support the speculation that NOP10 expression correlates with nucleoli appearance and size through its functional role in ribosomal RNA modification.

We revealed the significant association between the high expression of NOP10, at both protein and mRNA levels, and poor prognostic clinicopathological parameters and worse survival supporting its importance in BC progression. These data are in accordance with a study which showed alterations in NOP10 mRNA are associated with poor prognosis in endometrial cancer [37]. Moreover, we demonstrated a significant association between NOP10 mRNA expression and CN variation which supports the idea that hypotheses the diverging expression of snoRNPs could be closely associated with an overall elevation in genetic aberrations in BC [10, 38]. We reported a higher percentage in NOP10 expression at the proteomic level compared to the mRNA level, this could be related to sample fixation, age of stored samples or the specificity of antigen retrieval technique [39, 40]. Also, transcriptomic data reflects the mRNA level of all cells within the tissue samples either tumour cells or other surrounding cells.

We also evaluated the association of NOP10 and BC subtypes. NOP10 protein expression was significantly associated with shorter DMFS and BCSS in TNBC, while mRNA predicted poor outcome in HER2+ tumours. Such discrepancies might be attributed to the differences in the number of cases in each subtype between the Nottingham and METABRIC cohorts or might be due to tumour-specific differences in NOP10 mRNA/protein stability or post-transcriptional regulation of NOP10 expression.

NOP10 protein expression was independent prognostic markers in all cases and in TNBC, which may have potential clinical relevance in improving survival rate prediction. TNBC is highly malignant, prone to metastasis and relapse, and significantly correlated with a poorer prognosis and a greater risk of mortality comparing to other BC subtypes [41, 42]. NOP10 elevation is doubtlessly attributable to TNBC aggressive character through its heavier protein requirements for cell survival and proliferation which is compatible with increased rRNA synthesis [43]. This implies that NOP10 plays a role in tumourigenic pathways and could be a marker of poor prognosis in TNBC.

Since high expression of NOP10 was associated with worse prognostic features and outcome in patients with TNBC subtype, we hypothesized that NOP10 may play an important role in response to chemotherapy. Our findings showed that patients with high NOP10 expression showed poorer outcome than those with low levels of NOP10 even when chemotherapy was received which indicates that NOP10 could potentially contribute to chemotherapy resistance. These findings suggest that assessment of NOP10 expression prior to adjuvant treatment could predict the chemotherapy resistance and eventually tumour relapse.

NOP10 plays a critical role for the stability of the domain as well as in the assembly and integrity of H/ACA snoRNPs complexes (DKC1, NHP2, NOP10 & GAR1), where they implicated mainly in the isomerization of uridine to pseudouridine thereby, promote the folding and stabilization of RNAs, such as the local RNA structure in the ribosome [44]. The current study confirmed the correlation among the gene expressions of all H/ACA ribonucleoproteins. High NOP10 protein expression was correlated with the high level of DKC1, indicating a system of functional coupling between these biomarkers at the protein level in isomerization and stabilization of RNAs.

Biogenesis of H/ACA snoRNPs is regulated in response to high demands for protein synthesis and c-Myc plays a crucial role in regulating cellular growth, size, and protein synthesis. Our study revealed a positive significant relationship between NOP10 and c-Myc. Therefore, it can be speculated that modulation of c-Myc transcriptional activity may regulate NOP10 expression in order to fulfil increased demands for protein synthesis that is highly required to maintain the proliferation and self-renewal of tumour cells [45,46,47].

TP53 mutations were also highly prevalent in breast tumours where there was high NOP10 mRNA expression. Marcel et al. have demonstrated that the level of rRNA methylation usually increased in cancer cells with dysfunctional p53, substantially elucidating that rRNA modifications contribute to the tumourigenic process. The high level of rRNA methylation resulted in initiating protein translation through a process called internal ribosome entry sequences (IRESs) which resulted in products that promote tumour development (The insulin-like growth factor 1 (IGF-1R), c-Myc, Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and acidic fibroblast growth factor (FGF1)) [47,48,49].

Despite the remarkable results this study presents, there are some identified limitations. The subjectivity of the semi-quantitative H-score method, that has been used to score the sections, is one of our study weaknesses. It was aimed to reduce the impact of this limitation by allowing two well-trained observers to score about 10% of the cores to ensure the reproducibility and liability of the procedure. On the other hand, using TMA could underestimate the role of tumour heterogeneity.

In conclusion, our study revealed the prognostic and predictive importance of NOP10 in BC. NOP10 was associated with poor prognostic characteristics and poor survival outcome. Overexpression of NOP10 appears to play a role in the progression of TNBC and is potentially predictive for selecting patients who might develop resistance to chemotherapy. Thus, it could act as a potential prognostic marker and a therapeutic target. Functional assessment is warranted to reveal the specific role played by NOP10 in the BC, especially in the highly proliferative molecular subtypes.


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Bemerkungen:

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