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16: Transkriptionsregulation (Prokaryoten) - Biologie

16: Transkriptionsregulation (Prokaryoten) - Biologie


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  • 16.1: Das lac Operon
    Frühe Einblicke in Mechanismen der Transkriptionsregulation kamen aus Studien an E. coli durch die Forscher Francois Jacob & Jacques Monod. In E. coli und vielen anderen Bakterien können Gene, die für mehrere verschiedene Proteine ​​kodieren, auf einer einzigen Transkriptionseinheit lokalisiert sein, die als Operon bezeichnet wird. Die Gene in einem Operon teilen die gleiche Transkriptionsregulation, werden aber einzeln translatiert. Eukaryoten gruppieren Gene im Allgemeinen nicht als Operons (Ausnahme ist C. elegans und einige andere Arten).
  • 16.2: Die Verwendung von Mutanten zum Studium des lac-Operons
    Das lac-Operon und seine Regulatoren wurden zuerst charakterisiert, indem Mutanten von E. coli untersucht wurden, die verschiedene Anomalien im Laktosestoffwechsel aufwiesen.
  • 16.3: Genregulation bei Prokaryoten
    Viele prokaryontische Gene sind in Operons organisiert, verknüpfte Gene, die in eine einzelne mRNA transkribiert werden, die für zwei oder mehr Proteine ​​kodiert. Operons kodieren normalerweise Proteine ​​mit verwandten Funktionen. Die Regulierung der Aktivität eines Operons (anstelle mehrerer einzelner Gene, die einzelne Proteine ​​kodieren) ermöglicht eine bessere Koordination der Synthese mehrerer Proteine ​​gleichzeitig. coli, das regulierte lac-Operon kodiert drei Enzyme, die am Stoffwechsel von Laktose (einem alternativen Nährstoff zu Glukose) beteiligt sind.

Prokaryontische Transkriptomik: eine neue Sicht auf Regulation, Physiologie und Pathogenität

Transkriptomweite Studien an Eukaryoten sind seit mehr als einem Jahrzehnt maßgeblich an der Charakterisierung grundlegender Regulationsmechanismen beteiligt. Im Gegensatz dazu wurden bei Prokaryoten (Bakterien und Archaeen) aufgrund der allgemeinen Ansicht, dass die mikrobiellen Genstrukturen einfach sind, sowie der technischen Schwierigkeiten bei der Anreicherung von mRNAs, denen Poly(A)-Schwänze fehlen, bis vor kurzem keine Ganztranskriptomstudien durchgeführt. Deep RNA-Sequenzierung und Tiling-Array-Studien revolutionieren jetzt unser Verständnis der Komplexität, Plastizität und Regulation mikrobieller Transkriptome.


16: Transkriptionsregulation (Prokaryoten) - Biologie

  1. Der Repressor wird an Lactose binden, wenn er vom Operator entfernt wird.
  2. Der Repressor bindet den Operator in Gegenwart von Lactose.
  3. Der Repressor bindet den Operator in Gegenwart von Lactose nicht.
  4. Der Repressor wird den Operator in Abwesenheit von Lactose nicht binden.
  1. Die DNA enthält viele Methylmoleküle.
  2. Die DNA enthält viele Acetylmoleküle.
  3. Die DNA hat wenige Methylgruppen.
  4. Die Histone haben viele Acetylgruppen.
  1. Die DNA enthält viele Methylmoleküle.
  2. Die DNA enthält viele Acetylmoleküle.
  3. Die DNA hat wenige Methylgruppen.
  4. Die Histone haben wenige Acetylgruppen.
Das Transkriptionsniveau eines Gens wird getestet, indem Deletionen im Gen erzeugt werden, wie in der Abbildung gezeigt. Diese modifizierten Gene werden auf ihr Transkriptionsniveau getestet: (++) normale Transkriptionsniveaus (+) niedrige Transkriptionsniveaus (+++) hohe Transkriptionsniveaus. Welche Deletion ist in einem Enhancer an der Regulierung des Gens beteiligt?

Welche Deletion ist bei einem Repressor an der Regulation des Gens beteiligt?

Das bereitgestellte Diagramm zeigt verschiedene Regionen (1-5) eines prä-mRNA-Moleküls, eines reifen-mRNA-Moleküls und des Proteins, das der mRNA entspricht. Eine Mutation in welcher Region ist am ehesten zellschädigend? Was entsprechen den Regionen 1 und 5? Was sind die Regionen 1 bis 5 im Diagramm?
  1. 1, 3 und 5 sind Exons 2 und 4 sind Introns.
  2. 2 und 4 sind Exons 1,3 und 5 sind Introns.
  3. 1 und 5 sind Exons 2, 3 und 4 sind Introns.
  4. 2, 3 und 4 sind Exons 1 und 5 sind Introns.
Eine Mutation führt zur Bildung der mutierten reifen mRNA, wie im Diagramm angegeben. Beschreiben Sie, welche Art von Mutation aufgetreten ist und was das wahrscheinliche Ergebnis der Mutation ist.
  1. Mutationen in den GU-AG-Stellen von Introns erzeugten ein nicht-funktionelles Protein.
  2. Eine Transversionsmutation in den Introns führte zu einem alternativen Spleißen, wodurch ein funktionelles Protein entstand.
  3. Eine Transversionsmutation in der GU-AG-Stelle mutierte diese mRNA und produzierte ein nicht-funktionelles Protein.
  4. Übergangsmutationen in den Introns könnten ein funktionelles Protein produzieren.

Das Diagramm veranschaulicht die Rolle von p53 als Reaktion auf UV-Exposition. Was wäre das Ergebnis einer Mutation im p53-Gen, die es inaktiviert?
  1. Die Haut schält sich als Reaktion auf die UV-Exposition.
  2. Die Apoptose tritt als Reaktion auf die UV-Exposition auf.
  3. Als Reaktion auf UV-Exposition treten keine DNA-Schäden auf.
  4. Als Reaktion auf die UV-Exposition tritt kein Abschälen der Haut auf.

Was passiert, wenn Tryptophan vorhanden ist?

  1. Der Repressor bindet an den Operator und die RNA-Synthese wird blockiert.
  2. RNA-Polymerase bindet an den Operator und die RNA-Synthese wird blockiert.
  3. Tryptophan bindet an den Repressor und die RNA-Synthese schreitet fort.
  4. Tryptophan bindet an RNA-Polymerase und die RNA-Synthese schreitet fort.

Was passiert ohne Tryptophan?

  1. RNA-Polymerase bindet an den Repressor
  2. der Repressor bindet an den Promotor
  3. der Repressor dissoziiert vom Operator
  4. RNA-Polymerase dissoziiert vom Promotor

Anabaena ist ein einfaches mehrzelliges photosynthetisches Cyanobakterium. In Abwesenheit von fixiertem Stickstoff exprimieren bestimmte sich neu entwickelnde Zellen entlang eines Filaments Gene, die für stickstofffixierende Enzyme kodieren und werden zu nicht-photosynthetischen Heterozysten. Die Spezialisierung ist vorteilhaft, da einige stickstofffixierende Enzyme in Abwesenheit von Sauerstoff am besten funktionieren. Heterozysten betreiben keine Photosynthese, sondern versorgen benachbarte Zellen mit fixiertem Stickstoff und erhalten im Gegenzug fixierten Kohlenstoff und reduzierte Energieträger. Wie im obigen Diagramm gezeigt, stimuliert eine Erhöhung der Konzentration von freien Calciumionen und 2-Oxyglutarat bei niedrigem Stickstoffgehalt in der Umgebung die Expression von Genen, die zwei Transkriptionsfaktoren (NtcA und HetR) produzieren, die die Expression von Gene, die für die Heterozystenentwicklung verantwortlich sind. HetR verursacht auch die Produktion eines Signals, PatS, das verhindert, dass sich benachbarte Zellen als Heterozysten entwickeln. Basierend auf Ihrem Verständnis der Art und Weise, wie die Signalübertragung die Zellfunktion vermittelt, welche der folgenden Vorhersagen stimmt am ehesten mit den oben gegebenen Informationen überein?


Resultate und Diskussionen

Stufe 1: Identifizieren Sie regulatorische Knoten in der E coli Metabolisches Netzwerk.

Stufe eins des Arbeitsablaufs (Abb. 1) identifiziert Schlüsselenzyme in E coli Stoffwechsel, die einer Regulierung bedürfen (Abb. 2EIN). Da PTMs in Stoffwechselwegen angereichert sind und diese regulieren können (Abb. 2B und SI-Anhang, Abb. S1), zeigt dieses Stadium weiter, dass PTMs bevorzugt an diesen Enzymen lokalisiert sind. Zuerst sagen wir mit Constraint-based Modeling (17 ⇓ –19) die Nutzung von Stoffwechselwegen vorher, die den stationären Fluss durch alle Stoffwechselwege in einer Zelle schätzt (19) (SI-Anhang, Abb. S2). Zweitens erweitern wir diesen Rahmen, um vorherzusagen, welche Enzyme bei einer plötzlichen Ernährungsumstellung reguliert werden müssen (um eine optimale Zellfitness sicherzustellen). Dazu verwenden wir eine Methode namens Regulated Metabolic Branch Analysis (RuMBA) (SI-Anhang, Abb. S3), um vorherzusagen, welche metabolischen Enzyme, wenn sie reguliert sind, in der Lage sind, den Fluss schnell auf günstigere Wege umzuleiten. Schließlich vergleichen wir unsere Ergebnisse mit veröffentlichten Listen (20 ⇓ ⇓ –23) metabolischer Enzyme mit gemessenen PTMs. Mit diesem Rahmen können Tausende von Stoffwechselenzymen systematisch über Tausende von Nährstoffverschiebungen hinweg bewertet werden, um zu verstehen, welche Enzyme während Umweltverschiebungen wahrscheinlich modifiziert werden.

Metabolisch regulierte Enzyme können in silico vorhergesagt werden. (EIN) Die metabolische Regulation bringt den Stoffwechsel oft an Stoffwechselzweigpunkten wieder ins Gleichgewicht, z. B. bei der Flussaufspaltung bei Isocitrat, die den Fluss zwischen dem TCA-Zyklus und dem Glyoxylat-Shunt während der Glucose-Acetat-Diauxie aufteilt. (B) PTMs werden an vielen Enzymen im zentralen Stoffwechsel und anderen Stoffwechselwegen gefunden. Wir fanden heraus, dass 56 % der Proteine ​​mit PTMs in E coli Metabolismus, der ∼2× erwartet (29%) ist, wenn man proteinkodierende Gene betrachtet (oder 35%, wenn man nur exprimierte Gene betrachtet). (C) Clustering-Analyse aller Enzyme, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine Regulierung für mindestens eine der 15.051 Medienverschiebungen erfordern. (D) Wir fanden heraus, dass 43% der Enzyme in den stark regulierten Clustern ein oder mehrere PTMs aufweisen, während ∼9% in den weniger regulierten Clustern PTMs aufweisen. Nur 3% der Enzyme, die nie einer Regulierung bedürfen, haben PTMs. (E) Enzymcluster mit PTMs zeigen Wege auf, die die PTMs während einer Ernährungsumstellung häufiger regulieren.

Unter Verwendung des obigen Schemas haben wir RuMBA zum Studium angewendet E colikanonische diauxische Verschiebung vom Glukose- zum Acetat-Stoffwechsel. Das metabolische Netzwerk wird verwendet, um den metabolischen Fluss durch alle Wege zu simulieren und ermöglicht so die Berechnung von Änderungen der Flussaufteilungen an jedem Metabolitenknoten beim Wechsel zwischen zwei Nährstoffbedingungen (Abb. 2EIN). Hier testeten wir, ob sich der Fluss durch metabolische Verzweigungspunkte signifikant änderte, wenn Nährstoffe von einer Reaktion zu einer anderen Reaktion im selben Verzweigungspunkt verschoben wurden (SI-Anhang, Abb. S3 BD). Unser Modell sagte eine signifikante Umlenkung des Flusses am Verzweigungspunkt zwischen dem TCA-Zyklus und dem Glyoxylat-Shunt (7, 24) während des Wechsels vom Glukose- zum Acetat-Stoffwechsel voraus, was darauf hindeutet, dass dieser Verzweigungspunkt wahrscheinlich reguliert ist (P << 1 × 10 -5 SI-Anhang, Abb. S3E und Datensatz S1). In Übereinstimmung mit diesen Vorhersagen wird Isocitrat-Dehydrogenase hauptsächlich während des Glukosestoffwechsels verwendet, während das Wachstum auf Acetat Isocitrat-Lyase verwendet, um Anaplerose zu unterstützen. Zu diesem Zweck werden sich RuMBA-vorhergesagte Enzyme wahrscheinlich an Schlüsselpunkten im Netzwerk befinden, um den Fluss auf Schlüsselwege umzuleiten.

Wir verglichen unsere Vorhersagen für die Glucose-Acetat-Diauxie mit mehreren experimentell validierten Fällen, um zu zeigen, dass RuMBA wichtige regulatorische Knoten im Stoffwechsel genau identifiziert. Erstens überschneiden sich die vorhergesagten Regulatoren signifikant mit Enzymen, von denen bekannt ist, dass sie durch kleine Moleküle reguliert werden (unter Verwendung von 1.219 experimentell validierten Fällen SI-Anhang, Feigen. S3F und S5 und Datensatz S2), insbesondere für Enzyme, die allosterisch durch Metaboliten reguliert werden (SI-Anhang, Abb. S3g). Zweitens zeigt die Analyse von Transkriptomikdaten, dass die Regulation dieser Proteine ​​schließlich durch die transkriptionelle Regulation verstärkt wird (P = 3 × 10 −10 SI-Anhang, Abb. S6). Mit anderen Worten, Proteine ​​werden vorübergehend durch kleine Moleküle reguliert und können durch Transkriptionsänderungen auf längeren Zeitskalen aufrechterhalten werden. Drittens stellen wir fest, dass PTMs [einschließlich Serin-, Threonin- oder Tyrosinphosphorylierung, Lysinacetylierung oder Succinylierungsstellen (20 ⇓ ⇓ –23)] an Proteinen angereichert sind, von denen vorhergesagt wird, dass sie einer Regulierung bedürfen (SI-Anhang, Abb. S4). Darüber hinaus ändern sich mehrere dieser PTMs signifikant in der Häufigkeit zwischen Glukose- und Acetatmedien (Datensatz S17) (16).

Darüber hinaus untersuchten wir Veränderungen an metabolischen Verzweigungspunkten unter verschiedenen Veränderungen der Umweltbedingungen, über die Glucose-Acetat-Diauxie hinaus. Wir simulierten Veränderungen im Stoffwechsel für 15.051 Verschiebungen zwischen Paaren von 174 verschiedenen Medien (Datensatz S4) und prognostizierten Regulierung bei jeder Ernährungsänderung. Unter allen Bedingungen sind bekannte PTMs in 92% der simulierten Nährstoffverschiebungen unter den regulierten Enzymen angereichert [Hypergeometrischer Test, False Discovery Rate (FDR) < 0,01 SI-Anhang, Abb. S4C]. Wir fanden heraus, dass Proteine ​​mit experimentell gemessenen PTMs stärker reguliert werden mussten als Proteine ​​ohne PTMs (Wilcoxon P = 6 × 10 –6 ). Von RuMBA vorhergesagte Enzyme wurden nach Nährstoffverschiebung gruppiert (Abb. 2C).D). Im Gegensatz dazu hatten 43% der Enzyme im am stärksten regulierten Cluster PTMs, die an glykolytischen Enzymen und dem Glyoxylat-Shunt angereichert sind (Abb. 2E und SI-Anhang, Abb. S7). Also, in E coli, sind PTMs effektiv an Enzymen lokalisiert, die das größte Potenzial haben, den Stoffwechsel unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu regulieren.

Stufe 2: Charakterisieren Sie den zellulären Einfluss der Sondierung von PTM-Standorten.

Wir gehen davon aus, dass die Regulierung der von RuMBA vorhergesagten Enzyme (ab Stufe eins) entscheidend ist, um den Fluss von einem Zweig zum anderen unmittelbar nach einer Änderung des Nährstoffzustands schnell zu erzwingen. Um diese Hypothese zu testen, haben wir Genome Editing verwendet, um den in-vivo-Effekt der Nachahmung von Modifikationen zu untersuchen sowie die Fähigkeit der Zelle, spezifische PTM-Stellen innerhalb dieser Untergruppe von Enzymen während Nährstoffverschiebungen zu modifizieren, zu deaktivieren. Das wichtigste aus dieser Phase gewonnene Verständnis ist die Identifizierung von PTM-Stellen (unter der Untergruppe der RuMBA-vorhergesagten Enzyme), die Veränderungen der zellulären Fitness unter bestimmten Nährstoffverschiebungen hervorrufen.

Wir untersuchten die globalen Veränderungen der Zellfitness nach dem Einsatz von Multiplexed Automatic Genome Engineering (MAGE) (25) zur Störung des PTM-Status in einem gepoolten Screening-Ansatz (Abb. 3 .).EIN) (26). PTM-Stellen wurden aus den von RuMBA vorhergesagten Enzymen ausgewählt (268 Modifikationen an 134 bekannten PTM-Stellen in 61 Proteinen, die alle Proteine ​​mit PTMs und bekannten Proteinstrukturen zum Zeitpunkt des Versuchsdesigns abdecken) und über fünf Medienbedingungen zu mehreren Zeitpunkten unter Verwendung von MAGE-Sequenzierung (MAGE-Seq) (27) (Datensätze S5 und S6). Codons wurden geändert in (ich) ein PTM nachahmen (d. h. S/T/Y-Reste durch Glutamat ersetzen, um die negative Ladung der Phosphorylierung nachzuahmen, oder Asparagin, um die fehlende Ladung bei der Acetylierung nachzuahmen, die als „PTM-Nachahmung“ bezeichnet wird) oder (ii) entfernen die Neigung zur PTM-Addition (dh Ersetzen von S/T/Y durch Asparagin, das nicht phosphoryliert werden kann, um die Größe und Polarität von S/T/Y oder Lysin nachzuahmen, durch Arginin, das nicht acetyliert werden kann, aber die angegebene positive Ladung behält als „PTM-null“).

Das Erzwingen von PTM-Zuständen mit MAGE zeigt, dass PTMs funktionell relevant sind und sich auf die Fitness auswirken. (EIN) Codons in der MAGE-erzeugten Mutantenpopulation wurden an PTM-Stellen editiert, um den PTM nachzuahmen oder den PTM zu verbieten (PTM-null). Ein Mutantenpool mit 268 verschiedenen Mutationen an 134 Codons auf 61 Genen wurde erhalten und unter verschiedenen Medienbedingungen gescreent. Die Häufigkeit von Mutanten wurde durch Amplikon-Sequenzierung von MAGE-Sites (MAGE-Seq) quantifiziert. Der Mutantenpool wurde unter fünf statischen Medienbedingungen und zwei oszillierenden Bedingungen gescreent, um PTM-Stellen zu identifizieren, die, wenn sie in einen PTM-nachahmenden oder -null-Zustand gezwungen wurden, unter bestimmten Bedingungen die zelluläre Fitness verändert hatten. (B) Einzelne Mutanten zeigten medienspezifische Reaktionen (z. B. verstärktes Wachstum auf Acetat-M9-Medien für die GlyA K54R-Mutante Rechts). (C) PTM-Nachahmungs- und -Null-Modifikationen für jede Wachstumsbedingung und jeden Zeitpunkt wurden verglichen. PTM-Stellen auf 35 Proteinen zeigten eine signifikante Präferenz für die PTM-nachahmenden oder -null-Zustände. (D) Die meisten Mimic/Null-Präferenzen waren zustandsspezifisch, wobei oszillierende Medien umfassendere Präferenzen zeigten (Beispiele für PTM-Sites sind hervorgehoben, siehe SI-Anhang, Abb. S9C für alle Sites mit signifikanten Präferenzen für PTM-Nachahmung oder -null-Modifikationen).

Gezielte Mutationen beeinflussten die Fitness des Organismus unter bestimmten Medienbedingungen, wie durch die PTM-Null-Mutation an Position K54 der Serinhydroxymethyltransferase (glyA) veranschaulicht. Zum Beispiel verdoppelte diese Mutation die Wachstumsrate auf Acetat-M9-Minimalmedium, hatte jedoch keinen nennenswerten Einfluss auf das Wachstum auf Glucose-M9-Minimalmedium (Abb. 3 .).B). Nach Glucosemangel zeigte die K54R-Mutante jedoch eine erhöhte Wachstumsrate während der kurzen Umstellung auf restliche Fermentationsprodukte (SI-Anhang, Abb. S8).

Eine Computeranalyse der MAGE-Daten zeigt, dass die Modifikation von 88% der Stellen die Fitness in mindestens einer Bedingung signifikant erhöhte oder verringerte (Abb. 3 .).D und SI-Anhang, Abb. S9 EIN und C). Darüber hinaus wiesen 35 Gene PTM-Stellen auf, die in mindestens einer Bedingung signifikant unterschiedliche Auswirkungen zwischen PTM-nachahmenden und -null-Varianten zeigten (FDR < 0.05 Abb. 3C). Dies legt nahe, dass viele PTM-Zustände unter bestimmten Nährstoffbedingungen bevorzugt werden.

Eine Analyse aller Screen-Daten weist auf globale Muster hin: PTMs beeinflussen die zelluläre Fitness, indem sie kritische Proteine ​​an Schlüsselpositionen in dynamischen Nährstoffverschiebungen regulieren. Wir quantifizierten die Eigenschaften der modifizierten Proteine, die am meisten zu Fitnessänderungen beitrugen, unter Verwendung einer verallgemeinerten Schätzgleichung (GEE) (28). Erstens zeigte unsere Analyse, dass die überlebenswichtigen Enzyme primäre Ziele für die Regulation sind, um Fitnessvorteile zu erzielen (SI-Anhang, Abb. S9B). Zweitens treten Modifikationen, die die Fitness beeinflussen, häufig an Positionen in Proteinen auf, die die Enzymaktivität beeinflussen (z. B. Salzbrückenreste oder Reste in der Nähe des aktiven Zentrums, P << 1 × 10 –10 und P = 9 × 10 –7 ). Schließlich wirken sich Mutationen stärker auf die zelluläre Fitness aus, wenn Nährstoffe oszillieren (z. B. Wechsel zwischen Glucose zu Acetat-Minimalmedium und zurück zu Glucose P = 3 × 10 –3 ). Somit sind PTMs auf den Enzymen positioniert, die das Wachstum direkt regulieren, und wenn Proteine ​​gezwungen werden, in einem einzigen PTM-Zustand zu bleiben (wodurch eine vorübergehende Kontrolle an diesen Stellen verhindert wird), beeinflussen sie die zelluläre Fitness wesentlich stärker.

Stufe 3: Aufklärung der Kontrollmechanismen von PTMs.

Atomistische Simulationen bieten eine kontextuelle Grundlage für die Analyse, wie PTMs Proteinstruktur und -funktion modulieren. Um die spezifischen Mechanismen zu entschlüsseln, durch die die PTMs die Proteine ​​regulieren, haben wir drei untersucht E coli Proteine. Klassische MD-Simulationen und biochemische In-vitro-Assays zeigten, dass die PTMs (ich) modulieren Interaktionen an Proteingrenzflächen in Serinhydroxymethyltransferase (GlyA), (ii) die Konformationen der Bindungsstellen in Transaldolase manipulieren und (iii) kontrollieren katalytische Reste in der Enolase.

Erstens fanden wir heraus, dass PTMs die Enzymaktivität beeinflussen können, indem sie die Proteininteraktion modulieren. Insbesondere MD-Simulationen, enzymatische In-vitro-Assays und MAGE für GlyA legen alle nahe, dass die Acetylierung an der Dimer-Grenzfläche die Aktivität unterbricht und somit einen vorübergehenden Kontrollmechanismus bereitstellt (Abb. 4 .).EIN und SI-Anhang, Abb. S10). Für GlyA, das in 12% der 15.051 simulierten Substratverschiebungen reguliert wird, findet die Acetylierung an den Positionen K54, K250 und K354 in der Nähe der Dimer-Grenzfläche statt, die ebenfalls Teil der Substratbindungsdomäne sind (Abb. 4EIN). Die Analyse einer 100-ns-MD-Trajektorie legt nahe, dass die Acetylierung von K250 und K354 die Struktur der N-terminalen Domäne von monomerem GlyA beeinflusst [durchschnittliche quadratische Abweichung (rmsd) von 3,5 Å relativ zur kristallographischen Struktur] SI-Anhang, Abb. S11] zusätzlich zur Cofaktorbindung (Tetrahydrofolat). Die ortsgerichtete Mutation dieser Reste zur Nachahmung der Acetylierung beeinflusste letztendlich die enzymatische Aktivität in vitro (Abb. 4 .).B) sowie die Fitness des Organismus für die PTM-Nachahmung in vivo (Abb. 4C). In ähnlicher Weise störte die Acetylierung von K54 die zelluläre Fitness, da sie eine Salzbrückenwechselwirkung mit E36 der benachbarten Untereinheit unterbrach und die intermolekulare Wechselwirkung um 2–4 Å im Vergleich zum WT-Protein erhöhte (Abb. 4 .).EIN und SI-Anhang, Abb. S12). Diese Ergebnisse stimmen mit In-vitro-Assays überein, die den Verlust dieser Wechselwirkung nachahmen (Abb. 4 .).B), die einen fast vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität zeigen. In vivo verringerte die PTM-mimetische Modifikation von K54N die Fitness signifikant, während die K54R-Mutante bevorzugt wurde (Abb. 4 .).C). Diese Reaktion war am stärksten für das Wachstum auf glukoneogenen Substraten, bei denen die PTM ihren Katabolismus blockieren konnte, wenn glykolytische Substrate verfügbar waren. Darüber hinaus war die Modifizierung des PTM-Zustands für die Zelle besonders störend, wenn der Nährstoffzustand zwischen Acetat und Glukose oszilliert (Abb. 4 .).D).

PTMs, die die Zellfitness beeinflussen, modulieren Bindungskonfigurationen, Protein-Protein-Wechselwirkungen und enzymatische Aktivität. (EIN) Molekulare Wechselwirkungen, die in der Serin-Hydroxymethyl-Transferase (GlyA) stattfinden. Die Acetylierung von K250 von GlyA unterbricht eine Salzbrücke, was zu einer verminderten THF-Bindung führt (Oberer, höher). K54 ist an einer Salzbrücke mit E36 der anderen Proteinuntereinheit beteiligt (Untere), und Acetylierung vergrößert den Abstand zwischen K54 und E36 um >4 Å (SI-Anhang, Abb. S12). (B) Enzymatische Assays für Transaldolase, GlyA und Enolase. (C) Für die PTM-Nachahmung (x Achse) und die PTM-Null (ja Achse) MAGE-Mutanten für Transaldolase, GlyA und Enolase. Vergleichen B und C, sehen wir, dass für Transaldolase enzymatische Assays eine reduzierte Aktivität von S226D- und S226N-Mutanten zeigen, aber die offene Konformation rettet die reduzierte Aktivität des S226 MAGE PTM-mimetischen Zustands. Für GlyA verringert der K54-PTM-Mimic-Zustand die katalytische Aktivität und die zelluläre Fitness, während der K250-PTM-Null-Zustand das Wachstum signifikant fördert. Bei Enolase heben PTMs, die zwei katalytische Reste modifizieren, die Enzymaktivität auf, was mit MAGE-Mutanten übereinstimmt, die den PTM-Null-Genotyp bevorzugen. (D) Das Erzwingen der PTM-nachahmenden Mutation von K54 in GlyA und S372/K342 in Enolase hemmt das Wachstum unter glukoneogenen Bedingungen und ist besonders wachstumsschädlich unter oszillierenden Bedingungen. FFO, 5-Formyltetrahydrofolat PLG, n-Glycin-[3-hydroxy-2-methyl-5-phosphono-oxymethyl-pyridin-4-yl-methan].

Zweitens deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bestimmte PTMs als präzise, ​​aber vorübergehende mechanochemische „Schalter“ zur Einstellung der Enzymaktivität fungieren, indem sie die Zugänglichkeit des aktiven Zentrums beeinflussen. Bei der Transaldolase, die in 22% der 15.051 simulierten Substratverschiebungen reguliert wird, lokalisieren viele experimentell nachgewiesene PTMs in einem flachen Kanal, in dem Metaboliten passieren, um in das aktive Zentrum einzutreten/aus ihm auszutreten (SI-Anhang, Abb. S10). Es ist bekannt, dass die Konformation dieses Kanals die Substratbindung und die Katalyse beeinflusst (29). Wir untersuchten die Proteinkonformationen von Wildtyp (WT) und fünf modifizierten Transaldolase-Proteinen während einer 1,05-μs-MD-Trajektorie (SI-Anhang, Abb. S13) und fanden heraus, dass PTMs an bestimmten Resten die Zugänglichkeit des Kanals beeinflussen, nämlich S226 und K308. Die Phosphorylierung von S226 förderte die Öffnung des Kanals, während die Acetylierung das Schließen des Kanals stark induzierte. In vitro reduzierte die Modifikation von S226 die Enzymaktivität um 40% (Abb. 4B), jedoch wurde der MAGE-PTM-mimetische Zustand unter bestimmten Bedingungen gegenüber dem PTM-Null-Zustand bevorzugt (Abb. 4C), vermutlich um die Öffnung des Substratkanals aufrechtzuerhalten. Das Erzwingen der Nachahmung der Acetylierung an K308 verringerte die Fitness des Organismus signifikant (Abb. 4 .).C), indem die Zugänglichkeit der Bindungstasche gestört wird, die durch eine Salzbrücke zwischen D305 und S37 aufrechterhalten wird. Somit scheinen für Transaldolase PTMs verwendet zu werden, um die Zugänglichkeit der Bindungstasche aufrechtzuerhalten, und dies beeinflusst die zelluläre Fitness unter bestimmten Bedingungen.

Drittens beeinflusst die Modifikation katalytischer Reste direkt die Proteinreaktivität, wie es bei der Enolase festgestellt wurde. Enolase war ein Verzweigungspunkt-Enzym im metabolischen Netzwerk, von dem vorhergesagt wurde, dass es in 48 % der 15.051 Substratverschiebungen reguliert wird. Eine Analyse der Proteinstruktur zeigte, dass PTMs an den Resten S372 und K341 im aktiven Zentrum die Bindung von zwei Mg 2+ -Ionen destabilisierten, die für die Katalyse erforderlich sind (SI-Anhang, Feigen. S10 und S14). Wir führten außerdem in vitro Enzymassays durch, um die Wirkung der Modifizierung von K341 und S372 auf die Enzymaktivität zu untersuchen (Abb. 4 .).B und SI-Anhang, Abb. S15). In Übereinstimmung mit einer neueren Studie (30) stoppte die Mutation von K341 zu Asparagin oder Glutamin die Katalyse vollständig. Die Mutation von S372 zu Aspartat stoppte ebenfalls die Aktivität vollständig, da das Phosphorylierungsmimetikum eine negative Ladung in der Nähe von Mg 2+ einführte, während S372N die Aktivität nur teilweise verringerte, was zeigt, dass die Ladung des PTM mehr für das Ausschalten des Enzyms verantwortlich ist. Diese Veränderungen hatten auch erhebliche Auswirkungen auf die Fitness des Organismus in vivo in bestimmten Nährstoffumgebungen (Abb. 4 .).C). Insbesondere wurde der PTM-Null-Zustand für glukoneogene Substrate bevorzugt (Abb. 4D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die direkte Modulation katalytischer Reste einen präzisen Mechanismus zur Regulierung eines hochempfindlichen Verzweigungspunkts, wie etwa der Enolase, bietet.


Prokaryotische versus eukaryotische Genexpression

Prokaryonten regulieren die Genexpression, indem sie die Transkriptionsmenge kontrollieren, während die eukaryotische Kontrolle viel komplexer ist.

Lernziele

Vergleichen und kontrastieren Sie prokaryontische und eukaryontische Genexpression

Die zentralen Thesen

Wichtige Punkte

  • Die prokaryontische Genexpression wird hauptsächlich auf der Ebene der Transkription kontrolliert.
  • Die eukaryotische Genexpression wird auf den Ebenen der Epigenetik, Transkription, Posttranskription, Translation und Posttranslation kontrolliert.
  • Die prokaryontische Genexpression (sowohl Transkription als auch Translation) findet aufgrund des Fehlens eines definierten Zellkerns innerhalb des Zytoplasmas einer Zelle statt, sodass die DNA frei im Zytoplasma lokalisiert ist.
  • Die eukaryotische Genexpression findet sowohl im Zellkern (Transkription) als auch im Zytoplasma (Translation) statt.

Schlüsselbegriffe

  • Epigenetik: das Studium der erblichen Veränderungen, die durch die Aktivierung und Deaktivierung von Genen ohne Veränderung der DNA-Sequenz verursacht werden
  • Nukleosom: jede der Untereinheiten, die sich im Chromatin wiederholen, eine DNA-Winkel, die einen Histonkern umgibt

Prokaryotische versus eukaryotische Genexpression

Um zu verstehen, wie die Genexpression reguliert wird, müssen wir zunächst verstehen, wie ein Gen für ein funktionelles Protein in einer Zelle kodiert. Der Prozess läuft sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen ab, nur auf leicht unterschiedliche Weise.

Prokaryontische Organismen sind einzellige Organismen, denen ein definierter Kern fehlt, daher schwimmt ihre DNA frei im Zellzytoplasma. Um ein Protein zu synthetisieren, laufen die Prozesse der Transkription (DNA zu RNA) und Translation (RNA zu Protein) fast gleichzeitig ab. Wenn das resultierende Protein nicht mehr benötigt wird, stoppt die Transkription. Somit ist die Regulation der Transkription das primäre Verfahren, um zu kontrollieren, welcher Proteintyp und wie viel von jedem Protein in einer prokaryontischen Zelle exprimiert wird. Alle nachfolgenden Schritte erfolgen automatisch. Wenn mehr Protein benötigt wird, findet mehr Transkription statt. Daher liegt die Kontrolle der Genexpression in prokaryotischen Zellen hauptsächlich auf der Transkriptionsebene.

Im Gegensatz dazu haben eukaryotische Zellen intrazelluläre Organellen, die zu ihrer Komplexität beitragen. In eukaryotischen Zellen befindet sich die DNA im Zellkern, wo sie in RNA transkribiert wird. Die neu synthetisierte RNA wird dann aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert, wo Ribosomen die RNA in Protein übersetzen. Die Prozesse der Transkription und Translation sind physikalisch durch die Kernmembran getrennt. Die Transkription erfolgt nur innerhalb des Kerns und die Translation findet nur außerhalb des Kerns innerhalb des Zytoplasmas statt. Die Regulation der Genexpression kann in allen Phasen des Prozesses erfolgen. Eine Regulation kann auftreten, wenn die DNA abgewickelt und von Nukleosomen gelöst wird, um Transkriptionsfaktoren zu binden (Epigenetik), wenn die RNA transkribiert wird (transkriptionelle Ebene), wenn die RNA prozessiert und nach der Transkription in das Zytoplasma exportiert wird (posttranskriptionelle Ebene) , wenn die RNA in Protein übersetzt wird (translationale Ebene) oder nachdem das Protein hergestellt wurde (posttranslationale Ebene).

Prokaryotische vs. eukaryotische Genexpression: Prokaryontische Transkription und Translation erfolgen gleichzeitig im Zytoplasma, und die Regulation erfolgt auf Transkriptionsebene. Die eukaryotische Genexpression wird während der Transkription und der RNA-Prozessierung, die im Zellkern stattfindet, und während der Proteintranslation, die im Zytoplasma stattfindet, reguliert. Eine weitere Regulation kann durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen erfolgen.


Materialen und Methoden

CGB-Plattform

CGB ist eine Python-Bibliothek für vergleichende Genomik der Transkriptionsregulation in Prokaryonten. Es ist vollständig in Python 2.7 geschrieben, verwendet das objektorientierte Programmierparadigma und wird als virtuelle Conda-Umgebung (Continuum Analytics) bereitgestellt. CGB ist unter einer GPL-Lizenz auf GitHub frei verfügbar [54]. Externe CGB-Anforderungen sind Clustal Omega [55], NCBI BLAST+ [56] und BayesTraits [35].

Motivdaten und Motivfindung

Sammlungen experimentell validierter TF-Bindungsstellen für HrpB und HrpX wurden aus der CollecTF-Datenbank heruntergeladen [57]. HrpB-Orthologe in Proteobakterien und LexA-Orthologe im Balneolaeota-Stamm wurden als beste reziproke BLAST-Treffer unter Verwendung der Ralstonia solanacearum HrpB-Protein [WP_011004170.1] und die Verrucomicrobium spinosum DSM 4136 LexA Protein [WP_009959117] als Abfragen und ein Cut-off e-Wert von 10 − 30 . Die stromaufwärts gelegenen Regionen (− 250, + 50 bp von der vorhergesagten translationalen Startstelle) von Genen, die für identifizierte LexA-Orthologe kodieren, wurden aus der NCBI GenBank-Datenbank heruntergeladen und in MEME zur Motivfindung unter Verwendung der Verteilung und des Motivs einer beliebigen Anzahl von Wiederholungen (ANR) eingegeben Breitengrenzen von 10–22 bp. CGB-Konfigurationsdateien für die hier berichteten Analysen werden als ergänzendes Material bereitgestellt (Additional File 2).

Proteinreinigung und Elektromobilitäts-Shift-Assays

Die Balneola vulgaris DSM 17893 lexA Gen [B155_RS0104985] wurde von ATG:biosynthetics GmbH, Deutschland synthetisiert, in den pUA1108-Vektor [58] subkloniert und in . überexprimiert E coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene)-Zellen. Das resultierende LexA His-markierte Protein wurde nach einem zuvor beschriebenen Protokoll gereinigt [52]. Elektromobilitäts-Shift-Assays (EMSA) wurden unter Verwendung von 100 bp langen DNA-Sonden (Additional File 3) durchgeführt. Sonden wurden unter Verwendung von zwei komplementären synthetischen Oligonukleotiden erzeugt, die auf vorhergesagten LexA-Bindungsstellen zentriert waren, und eine PCR mit M13-Forward- und Reverse-Digoxigenin-markierten Oligos durchgeführt, wie zuvor beschrieben [59]. EMSAs wurden mit einer Mischung durchgeführt, die 20 ng jeder Digoxigenin-markierten DNA-Sonde und 40 nM gereinigtes LexA-Protein enthielt [60]. Die Proben wurden auf 6% nicht denaturierende Tris-Glycin-Polyacrylamidgele geladen und Digoxigenin-markierte DNA-Protein-Komplexe wurden unter Verwendung des Herstellerprotokolls (Roche NimbleGen) nachgewiesen.


Prokaryontische Sigmafaktoren und ihre transkriptionellen Gegenstücke in Archaeen und Eukarya

RNA-Polymerasen (RNAPs) führen die Transkription in den drei Lebensbereichen durch, Bakterien, Archaeen, und Eukarya. Die Transkriptionsinitiation wird durch eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren stark reguliert, deren Anzahl und Komplexität der Untereinheiten während der Evolution zunehmen. Dieser Vorgang ist geregelt in Bakterien bis zum σ Faktor, während die drei eukaryontischen RNAPs einen komplexen Satz von Transkriptionsfaktoren (TFs) und ein TATA-bindendes Protein (TBP) benötigen. Das archaeale Transkriptionssystem scheint eine Vorfahrenversion des eukaryotischen RNAPII zu sein, das Transkriptionsfaktor B (TFB), TBP und Transkriptionsfaktor E (TFE) benötigt. Die Funktion des bakteriellen Sigma (σ) Faktor wurde mit den Rollen der eukaryotischen RNAP II und der archaealen RNAP korreliert. Zusätzlich, σ Faktoren, TFB und TFIIB enthalten alle mehrere DNA-bindende Helix-Turn-Helix (HTH)-Strukturmotive, obwohl TFIIB und TFB zwei HTH-Domänen aufweisen, während die bakteriellen σ Faktor umfasst 4 HTH-Motive. Die Sequenzähnlichkeiten und Struktur-Alignments der bakteriellen σ Faktor, eukaryotischer TFIIB und archaealer TFB beweisen, dass diese drei Proteine ​​Homologe sind.

Wichtige Punkte
• Transkriptionsinitiation wird stark durch TFs reguliert.
• Die Transkription wird in allen Lebensbereichen durch verschiedene TFs fein reguliert.
• Spezifische TFs in Bakterien, Eukarya und Archaea sind Homologe.

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Hintergrund

Der circadiane Rhythmus von etwa 24 Stunden ist eine grundlegende physiologische Funktion, die in fast allen Organismen vom Prokaryoten bis zum Menschen beobachtet wird. Es ist bekannt, dass zirkadiane Rhythmen in Schrittmacherzellen, den suprachiasmatischen Kernen (SCN) des Hypothalamus bei Säugetieren, erzeugt und durch Umwelteinflüsse wie Licht, Temperatur, Lärm, Nahrungsaufnahme oder soziale Signale mitgerissen werden, während eine kürzlich durchgeführte Analyse mit mPer2-Luciferase-Knockin Mäusen hat gezeigt, dass peripheres Gewebe selbsterhaltende zirkadiane Schwingungen exprimiert [1]. The output of circadian oscillation appears as locomotive activity, hormonal secretion, the sleep-wake cycle, and many other physiological functions. Disruption of the circadian rhythms has been associated with various kinds of diseases, such as cardiovascular diseases, psychiatric diseases and cancer in humans [2–6]. Identification of clock genes has allowed study of the molecular bases for circadian behaviors and temporal physiological processes and has prompted the idea that molecular clocks reside not only in a central pacemaker, but also in peripheral tissues, even in immortalized cells [2, 3, 6]. Furthermore, previous molecular dissection revealed that the mechanism of circadian oscillation at a molecular level is based on transcriptional regulation of clock and clock-controlled genes, which consists of interwoven positive and negative feedback loops [2, 7–10].

There is a distinct connection between genes and behaviors in circadian rhythms, which is conserved from fly or other lower organisms to humans [6, 8]. Die Drosophila period mutants, originally identified as a circadian mutant brought us the first clock gene, Zeitraum [8, 11], while a point mutation of hPer2 was recently shown to cause a familial advanced sleep phase syndrome [12]. As described above, circadian rhythms rely on a negative feedback loop in gene expression that involves a limited number of clock genes. Recent molecular dissection has increased our understanding of the molecular nature of the transcriptional regulation of some clock genes. The circadian phenotypes at the cellular level may be represented as temporal mRNA expression. Global gene expression profiling using microarrays has led to the discovery of many circadian-regulated genes, but there is only a minor overlap of cycling transcripts between tissues [10, 13, 14]. Thus, circadian rhythms are an appropriate study target for systems biology.

In this study, we systematically examined the mRNA expression of common circadian-regulated genes in several mouse peripheral tissues and made oscillatory profiles of canonical clock genes. Moreover, by bioinformatics, we identified 3 clock elements for circadian transcription (E-box, RORE, DBPE). These 3 elements and their combination would suffice to explain the biological timing of expression of these clock and clock-controlled genes.


Schau das Video: Genregulation bei Prokaryoten - Operon-Modell (Juli 2022).


Bemerkungen:

  1. Fenrijin

    Bravo, diese ziemlich gute Idee ist übrigens nur notwendig

  2. Platon

    Du lässt den Fehler zu. Schreib mir per PN, wir regeln das.

  3. Zuluzil

    Meiner Meinung nach bist du auf dem falschen Weg.

  4. Vallen

    Ich werde mich bei der Auswahl nur nach meinem Geschmack richten. Es gibt keine anderen Kriterien für die hier hochgeladene Musik. Etwas ist meiner Meinung nach eher zum morgendlichen Hören geeignet. Etwas - für den Abend.

  5. Sar

    Ich habe diese Meldung entfernt



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