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Wie groß ist die Proteinveränderung durch alternatives Spleißen?

Wie groß ist die Proteinveränderung durch alternatives Spleißen?


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Wie unterschiedlich können die Proteine ​​sein, die von derselben DNA-Sequenz kodiert werden, aber einem alternativen Spleißen unterzogen werden?

Was ich versuche zu erklären ist, warum wir so auf die DNA-Sequenzen und wofür sie kodieren, fixiert sind, wenn das Ergebnis durch alternatives Spleißen sehr unterschiedlich sein kann.


Für Ihre erste Frage können sie dramatisch variieren.

Ich habe ursprünglich nicht als formelle Antwort gepostet, da meine folgende Aussage schwer zu zitieren ist und daher etwas subjektiv wäre, obwohl ich der Behauptung ziemlich sicher bin. Es basiert auf meiner eigenen Erfahrung beim Lesen von GWAS- und EWAS-Literatur. Meine Forschung betrifft Methoden zur Analyse solcher Daten.

Um Ihre zweite Frage zu beantworten, hat sich der Schwerpunkt von genetischer Variation (obwohl noch getan) auf Expressionsvariation und epigenetische Variation verlagert. Die Expressionsforschung konzentriert sich genau auf die Art des Themas, das Sie beim alternativen Spleißen diskutieren, und dies ist weitgehend möglich, da die Kosten für RNAseq gesenkt werden. Wir sind nicht mehr so ​​auf Sequenzen fixiert; Das Aufkommen von GWAS, das einst als Allheilmittel zur Erklärung der Krankheitsanfälligkeit galt, hat nur einen Bruchteil der Schätzungen der genetischen Erblichkeit erklärt. Um nicht zu sagen, dass es sich nicht darauf konzentriert, nur im Zusammenhang mit anderen Arten von Variationen und Umweltbelastungen.


Alternatives Spleißen

Abstrakt

Alternatives Spleißen ist der Prozess der Auswahl verschiedener Kombinationen von Spleißstellen innerhalb eines Messenger-RNA-Vorläufers (Prä-mRNA), um variabel gespleißte mRNAs herzustellen. Diese multiplen mRNAs können Proteine ​​kodieren, die in ihrer Sequenz und Aktivität variieren und dennoch aus einem einzigen Gen stammen. Alternatives Spleißen ist ein wichtiger Mechanismus bei der entwicklungs- und zelltypspezifischen Kontrolle der Genexpression und als Mechanismus zur Erhöhung der Proteomdiversität. Es wird in fast allen eukaryontischen Organismen gefunden, die standardmäßiges nukleäres Prä-mRNA-Spleißen durchführen, einschließlich Tieren, Pflanzen und in einigen Fällen Pilzen. Alternatives Spleißen wird durch viele Proteine ​​moduliert, die mit einer großen Anzahl von Spleiß-Enhancer- und Spleiß-Suppressor-Sequenzen interagieren.


Hintergrund

Sequenzinsertionen/-deletionen (Indels) treten während der Evolution und des alternativen Spleißens (AS) in Eukaryoten auf. Die Erzeugung verschiedener Proteinisoformen durch alternatives Spleißen gilt als einer der wichtigsten evolutionären Mechanismen zur Erhöhung der Proteomgröße und funktionellen Diversität [1, 2]. Jüngste Hochdurchsatzanalysen basierend auf mRNA-SEQ-Daten aus verschiedenen menschlichen Geweben und Zelllinien legen nahe, dass alternatives Spleißen fast universell (bis zu 94 %) in menschlichen Multi-Exon-Genen ist [3]. Während es mehrere Arten von Spleißereignissen gibt, die im Vergleich zu den Primärsequenzen zu unterschiedlichen Spleißisoformen führen, wie Trunkierung, Substitution, Insertion und Deletion, sind die Fälle der internen Insertion/Deletion die dominante Form alternativer Spleißvarianten und von großem Interesse aufgrund seines möglichen Einflusses auf die Faltung und Stabilität isoformer Strukturen [3, 4]. Darüber hinaus haben Gene, die "schalterähnliche" Exons enthalten, eher Isoformen mit Indels [3]. Für unser Verständnis der Funktion alternativ gespleißter Proteinisoformen ist es entscheidend, wenn wir wissen, wie sich Sequenzänderungen, insbesondere Sequenzinsertionen und -deletionen, auf die Struktur der Spleißvarianten auswirken, da Strukturen Schlüsselinformationen für die Funktion von Proteinen enthalten.

Unser derzeitiges Wissen darüber, wie alternatives Spleißen Proteinstrukturen beeinflusst, ist sehr begrenzt. Während es etwa 28.000 kommentierte Proteinisoformen aus der jüngsten UniProt-Version 15.11 (24. November 2009) [5] und über 60.000 Proteinstrukturen in der Protein Data Bank (PDB) [6] gibt, haben weniger als 10 Paare von alternativ gespleißten Isoformen dokumentierte Strukturen [7]. Die Vorhersage von Isoformstrukturen fällt im Allgemeinen in die Kategorie der Homologiemodellierung. Die Homologiemodellierung von Proteinen mit Indels ist jedoch keine triviale Aufgabe. Der Schlüssel zum Erfolg bei der Homologiemodellierung mit Indels ist die Ausrichtungsgenauigkeit, insbesondere die Positionierung der Insertions- oder Deletionssequenzen. Zum Beispiel verwendeten mehrere Gruppen an CASP8 (the 8th Community Wide Experiment on the Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction) das gleiche Protein 2G39 als Matrize, um das Zielprotein T0438 zu modellieren, aber nur drei von neun Modellen platzierten die Insertionssequenz (12 Aminosäuren) an der richtigen Stelle [8]. Ein weiteres berüchtigtes / berühmtes Beispiel für die Indel-Positionierung ist die Modellierung der langen AS-Isoform von Piccolo C2Eine Domäne mit einer Neun-Reste-Insertion in einer Schleife. Anstatt sich als Teil der Schleife zu falten, verdrängt das aus neun Resten bestehende Insert einen β-Strang, der durch lokale Umlagerung in die Calciumbindungsregion geschoben wird, was zu einer dramatischen Änderung der Calciumbindungsaffinität führt [9].

Während allgemein angenommen wird, dass Insertionen und Deletionen in Schleifen gut toleriert werden [10, 11], können Insertionen und Deletionen innerhalb von Sekundärstrukturen (α-Helices und β-Faltblätter) dramatische Auswirkungen auf die Gesamtstruktur haben und werden als schädlich und ungünstig angesehen während der Evolution [4, 12]. Tress et al. argumentierten, dass die AS-Isoform aufgrund der wahrscheinlich großen strukturellen Auswirkungen von Indels wahrscheinlich ein unwahrscheinlicher Weg zur Erhöhung der funktionellen Vielfalt ist [4]. In einer Reihe von Studien mit gentechnisch veränderten Insertionen und Deletionen auf T4-Lysozym zeigte die Gruppe von Matthews jedoch, dass das Protein eine strukturelle Plastizität besitzt, um Indels innerhalb von Sekundärstrukturen zu tolerieren [13–15]. Drei kürzlich durchgeführte groß angelegte Analysen boten ebenfalls eine ähnliche Ansicht, dass Proteinstrukturen ein gewisses Maß an "Plastizität" aufweisen, um Insertionen und Deletionen durch Beibehaltung der gleichen strukturellen Faltung zu tolerieren [16-18].

Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss kurzer interner Indel (weniger als 40 Aminosäuren) auf Proteinstrukturen zu untersuchen, insbesondere für Indel innerhalb von Sekundärstrukturen. Große Indels können sich als einzelne Domäne falten oder die Proteinpaare können aufgrund der großen Unterschiede zwischen zwei Sequenzen unterschiedliche Faltungen annehmen [8]. Terminale Indel werden in dieser Studie nicht berücksichtigt, da terminale Fragmente relativ flexibel sind und terminale Deletion/Trunkierung zu einem Standardprotokoll bei der rekombinanten Proteinexpression und Proteinkristallisation geworden ist [19–21]. Darüber hinaus führen die weit verbreiteten Klonierungsvektoren mit His-Tags zu Sequenzartefakten, die in den PDB-SEQRES-Records enthalten sind, und die Bestimmung der genauen Tag-Sequenzen ist problematisch [22, 23]. Obwohl es seit 1992 mehrere ähnliche Untersuchungen zur Indel-Statistik gibt [10, 24–27], unterscheidet sich unser Ansatz, da unser Ziel darin besteht, den Einfluss von Indels auf die Proteinstruktur zu untersuchen und Leitlinien für die Vorhersage der Isoformstruktur bereitzustellen. Daher ist es wichtig, dass die Positionen der Indels einzigartig und eindeutig sind. Andernfalls wären die strukturellen Veränderungen weniger gut definiert. So ist es beispielsweise nicht ungewöhnlich, dass zwei Proteine ​​mit hoher globaler Sequenzidentität eine geringe lokale Sequenzähnlichkeit aufweisen [28]. Um dieses Problem anzugehen, berücksichtigen wir lokale Sequenzähnlichkeiten und betrachten nur Proteinpaare mit sowohl hoher globaler als auch lokaler (Sequenzen flankieren die Indels) Sequenzähnlichkeit (>75%), um die Einzigartigkeit der Indel-Sequenzen und -Positionen sicherzustellen. Außerdem beziehen wir die „ungeordnete Konformation“ in unsere Strukturanalyse mit ein. Es wurde gezeigt, dass intrinsisch ungeordnete oder unstrukturierte Regionen für viele wichtige zelluläre Funktionen verantwortlich sind, und kürzlich wurde über einen Zusammenhang zwischen alternativem Spleißen und proteinintrinsischer Störung berichtet [17, 29, 30].

In diesem Artikel berichten wir über eine systematische Analyse eines großen nicht-redundanten Indel-Datensatzes mit hochhomologen Proteinpaaren. Zuvor fanden wir, dass die Immunglobulin (Ig)-Familie, die reich an bestimmten Aminosäuren wie Tyrosin, Glycin und Serin in der dritten komplementaritätsbestimmenden Region der Ig-Schwerkette (CDR-H3) ist, in einem Indel-Datensatz überrepräsentiert war [28, 31, 32]. Daher werden diese Ig-bezogenen Indel-Sequenzen in unserer aktuellen Analyse nicht berücksichtigt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass interne Indels tendenziell weniger regelmäßige Sekundärstrukturen (α-Helices und β-Stränge) aufweisen, aber reich an "ungeordneter Konformation" sind, was mit der Arbeit von Romero . übereinstimmt et al [17]. Unsere Daten zeigen auch, dass Proteine ​​mit kurzen Indels, einschließlich solcher innerhalb regulärer Sekundärstrukturen, im Allgemeinen die strukturelle Faltung mit einer gewissen lokalen Strukturumlagerung und Neufaltung erhalten, vermutlich aus Gründen der strukturellen Stabilität und Funktionalität. Die Quelle des Indels, entweder natürlich vorkommend oder experimentell manipuliert, wird beschrieben und die statistische Signifikanz der Merkmale von natürlichen Indels wird diskutiert. Ein Webserver SCINDEL http://bioinfozen.uncc.edu/scindel wurde zur komfortablen Visualisierung von Indel-induzierten Strukturänderungen entwickelt.


Ergebnisse

Profiling von AS in GBM durch Wiederholung

Wir erstellten ein Profil von 37 menschlichen GBM-Proben von 23 Patienten, 19 primären unbehandelten Fällen und 18 wiederkehrenden Fällen, die mit Standardtherapie (Bestrahlung, Temozolomid und chirurgische Resektion) behandelt wurden. 34 Proben waren patientenangepasste Längsschnittproben (Abb. 1a Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Wir führten RNA-seq an jeder dieser Proben durch und generierten über 277 Millionen Reads pro Probe. Darüber hinaus erhielten wir 15 öffentliche RNA-seq-Datensätze aus Längsschnitt-GBM-Proben und 29 öffentliche RNA-seq-Datensätze aus nicht-malignen adulten und fötalen Hirngeweben (Abschnitt „Materialien und Methoden“).

ein Konzeptioneller Überblick über Studiendesign und verwendete Stichproben. B T-verteilte stochastische Nachbarschaft (tSNE) Einbettung von AS PSI in primäre GBM, rezidivierende GBM und nicht-maligne GTEx-Gehirnproben. C Wie in B, aber PCA. D Wikipathway Cancer Gen-Ontologie-Analyse von Genen innerhalb der oberen 20% Ladungen der positiven und negativen Hauptkomponente eine von C. e Die Verteilungen der AS-Typen bei tumorspezifischen AS-Ereignissen, Vergleich von primären und rezidivierenden GBMs

Wir konstruierten ein integriertes AS-Modell zwischen nicht-malignem Gehirn, primären und rezidivierenden GBM-Bedingungen über MAJIQ [4] (Abb. 1b Abschnitt „Materialien und Methoden“). Wir stellten fest, dass nicht-maligne Hirnproben einen deutlichen Cluster bildeten, der sich von primären und rezidivierenden GBM-Proben trennte, wenn sie in einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) von marginalen prozentualen ausgewählten Indizes (PSIs) betrachtet wurden (Abb. 1c Zusätzliche Datei 2: Tabelle S2). Die PSI-Werte wurden mit dem Bayes-Modell von MAJIQ berechnet und schätzen die Häufigkeiten, mit denen Spleißstellen in AS-Ereignissen ausgewählt werden. Eine genontologische Analyse von AS-Ereignissen, deren PSIs variabel die Hauptkomponente eins belasteten, zeigte Wachstumsfaktor-Signalgebung (z. PDGFRB, PIK3R1, FOS, MAPK9), Tumorwachstumsfaktor (z. B. TGFB1, SMAD2, SMAD4) und entzündungsfördernd (z. B. NFKB1, RELA, STAT1, STAT3) Signalisierung (Abb. 1d, Zusatzdatei 3: Abb. S1). Die relativen Anteile der AS-Ereignistypen waren beim Vergleich von primärer und rezidivierender Erkrankung stabil (Abb. 1e).

Identifizierung von Targets für die autologe T-Zelltherapie

Wir begannen mit einem Screening auf GBM-spezifische Targets in krebsspezifischen Neojunktionen, die zuvor in einer Pan-Krebs-Analyse identifiziert worden waren [2]. Wir identifizierten 2011 mutmaßliche Neojunction-Ereignisse in Zelloberflächenproteinen, die in GBMs exprimiert werden. Davon fielen 37,8% in extrazelluläre Domänen und wären daher als CAR-T-Zell-Targets geeignet (Abb. 2a). Wir verglichen dann humane GBM-scRNA-seq-Daten (Abschnitt „Materialien und Methoden“), um zu validieren, dass Neojunction-Sequenzen in neoplastischen Zellen exprimiert, aber nicht in nicht-malignen Glia- oder Immunzellen exprimiert werden (Abb. 2b). Wir fanden eine Vielzahl von Neojunctions, die spezifisch von neoplastischen GBM-Zellen exprimiert werden (Zusatzdatei 4: Tabelle S3). Dazu gehörten extrazelluläre Matrixrezeptoren, die seit langem als Mediatoren der GBM-Invasion untersucht wurden (z. PTPRZ1 Abb. 2c) [5], sowie der Marker von Gliom-Stammzellen des mesenchymalen Subtyps Verhaak, CD44. Wir fanden mehrere Zielsequenzen, die in 10–35 % der neoplastischen Zellen innerhalb einzelner Tumoren und in 5–10 % der GBM-Fälle exprimiert wurden (Abb. 2d, Zusatzdatei 3: Abb. S2A).

ein Die von Kahles et al. [2] über die Domänen von Zelloberflächenproteinen. B Die Häufigkeiten von Neojunctions in den extrazellulären Domänen von Zelloberflächenproteinen und in neoplastischen Zellen vs. nicht-maligne Glia-, Immun- und Endothelzellen. C Die Häufigkeiten der Expression von Neojunction-Sequenzen in humanen neoplastischen GBM-Zellen in Smart-seq2-scRNA-seq-Daten. D Die Häufigkeit von Neojunctions in den GBM- und Pan-Krebs-Populationen, wie anhand der RNA-Seq-Daten des Cancer Genome Atlas (TCGA) bewertet

Anschließend haben wir unsere neuartigen RNA-Seq-Daten auf tumorspezifische AS-Ereignisse abgefragt. Wir identifizierten unterschiedlich gespleißte Gene zwischen allen GBM-Proben im Vergleich zu nicht-malignen Hirnproben (Abschnitt „Materialien und Methoden“ Zusätzliche Datei 5: Tabelle S4). Diese Ereignisse wurden dann gefiltert, um nur diejenigen zu behalten, die im nicht-malignen Gehirn vollständig fehlten. Zu diesem Zweck betrachteten wir weiterhin nur AS-Ereignisse mit PSI = 0 in allen nicht-malignen Hirnproben und erwarteten in Tumorproben einen absoluten PSI > 10 % mit einem Konfidenzniveau von 95 %. Wir fanden weit weniger tumorspezifische Ereignisse als in unserer vorherigen differentiellen Splicing-Analyse (Abb. 3a). Dennoch identifizierten wir 221 tumorspezifische AS-Ereignisse (Abb. 3b), wobei die Mehrheit nur bei rezidivierendem GBM auftrat (Zusatzdatei 3: Abb. S2B). Beim Vergleich unserer GBM-scRNA-seq-Daten fanden wir 21 und 18 mutmaßliche Neojunction-Ereignisse in Zelloberflächenproteinen, die spezifisch in neoplastischen Zellen exprimiert wurden und in extrazellulären Domänen vorhanden waren (Abb. 3c, d Zusätzliche Datei 6: Tabelle S5 ). Nach dem Ansatz von Kahles et al. [2] haben wir Neojunction-übergreifende Polypeptidsequenzen abgeleitet und mit der Datenbank des Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) verglichen [6]. Wir fanden heraus, dass über 75 % unserer Proben mindestens eine CPTAC-bestätigte Neojunction exprimierten (Abb. 3e), wobei im Durchschnitt drei bis vier Neojunctions pro Probe bestätigt wurden (Abb. 3f). Wir halten dies für eine konservative Unterschätzung, da alternative vom Spleißen abgeleitete Junction-Spanning-Polypeptide aufgrund der Spaltungseigenschaften von Trypsin in Massenspektrometriedaten wie CPTAC schlecht vertreten sind [7]. Somit wären alle unsere Kandidaten auf RNA-Ebene für die weitere Validierung und Entwicklung als CAR-T-Zell-Targets geeignet.

ein Die Verteilung des AS-Ereignistyps bei tumorspezifischen AS-Ereignissen, Vergleich von primären und rezidivierenden GBMs. B Die Anteile tumorspezifischer AS-Ereignisse in Zelloberflächenproteinen im Vergleich zwischen primärem und rezidivierendem GBM. C Die Prozentsätze der tumorspezifischen Neojunctions, die in verschiedenen Proteindomänen gefunden werden. D Die Häufigkeiten tumorspezifischer Neojunctions in neoplastischen GBM-Zellen aus Smart-seq2 scRNA-seq. e Die Bruchteile der Fälle mit mindestens einer CPTAC-bestätigten Neojunction. F Die durchschnittliche Anzahl CPTAC-bestätigter Neojunctions pro Fall

Obwohl unser Hauptaugenmerk auf der Identifizierung von Zielen für CAR-T-Zellen lag, suchten wir auch nach mutmaßlichen Zielen für T-Zell-Rezeptor (TCR)-transduzierte T-Zell-Therapien. TCR-T-Zellen sind weniger flexibel als CAR-T-Zellen, da sie eine Zielprozessierung und Präsentation auf dem humanen Leukozytenantigen der Klasse I (HLA) erfordern. Auf der anderen Seite können CAR-T-Zellen unabhängig von der HLA-Präsentation auf jedes Zelloberflächenprotein abzielen, und die Peptidverarbeitung ist keine Voraussetzung. Um mutmaßliche Ziele für die TCR-T-Zelltherapie zu identifizieren, mussten wir daher zunächst den Klasse-I-HLA-Serotyp für jeden Patienten aus den zugehörigen RNA-seq-Daten bestimmen (Abb. 4a Abschnitt „Materialien und Methoden“ Zusätzliche Datei 7: Tabelle S6) . Anschließend extrahierten wir Sequenzen aus der Referenz in einem 50-Basenpaar-Fenster um jede unserer mutmaßlichen Neojunctions und verwendeten NetMHCpan, um gespaltene Peptide aus dem assoziierten Proteinprodukt vorherzusagen. NetMHCpan wurde außerdem verwendet, um die HLA-Bindung der generierten Peptide unter Berücksichtigung des Serotyps des Patienten vorherzusagen. Wir identifizierten 704 von Neojunction abgeleitete putative Neoantigene (Fig. 4b). Beachten Sie, dass eine einzelne Neojunction zu mehreren mutmaßlichen Neoantigenen führen kann. Wir beobachteten eine Zunahme sowohl der Anzahl der abgeleiteten Neoantigene als auch der vorhergesagten Bindungsaffinität dieser Antigene in rezidivierenden GBMs ( 4c , d).

ein Ein Überblick über die Pipeline zur Entdeckung von Neoantigenen. B Die Anzahl von primärtumorangereicherten, rezidivierenden Tumoren angereicherten und gemeinsamen mutmaßlichen Neojunction-abgeleiteten Neoantigenen. C Die Häufigkeit von Neojunction-abgeleiteten Neoantigenen bei primärem vs. rezidivierendem GBM. D Der HLA-I prognostizierte Bindungsaffinitäten von Neojunction-abgeleiteten Neoantigenen bei primärem vs. rezidivierendem GBM

AS-Ereignisse angereichert in wiederkehrenden GBM

Als nächstes führten wir über MAJIQ einen differentiellen PSI-Test durch, bei dem primäre und wiederkehrende Proben verglichen wurden. Wir identifizierten 172 AS-Ereignisse in 107 Genen (100 kodierende und 7 lange nicht-kodierende RNA) mit einem erwarteten differentiellen PSI von mehr als 10%, bei einem Konfidenzniveau von 95% (Abschnitt „Materialien und Methoden“ Zusätzliche Datei 8: Tabelle S7). Viele dieser Ereignisse traten in Genen auf, die für die maligne Progression entscheidend sind. Zum Beispiel mehrere Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAP4K4, MAPK9, MAPK10), Wachstumsfaktorrezeptoren (FGFR1, FGFR2, EGFR) und matrizelluläre Proteine ​​(TNC, FN1) zeigte signifikante Unterschiede im PSI zwischen primärem und rezidivierendem GBM (Abb. 5a, Zusatzdatei 3: Abb. S3A). Wir fanden, dass diese und andere AS, die in unseren Daten in rezidivierenden GBMs angereichert waren, auch in rezidivierenden Fällen in öffentlich zugänglichen GBM-RNA-Seq angereichert waren [8] (Abb. 5b).

ein Beispiele für AS-Ereignisse mit signifikantem differentiellem Spleißen zwischen primären und wiederkehrenden GBMs. B Die Prozentsätze der Überlappung zwischen rezidivierenden AS-Ereignissen in unseren Daten im Vergleich zu rezidivierender spezifischer Expression in TCGA- und INCB-Daten

Rezidivierende GBMs exprimieren bevorzugt Isoformen, die die Invasion verstärken

Die Sequenzen der unterschiedlich gespleißten Gene wurden nach RNA-bindenden Proteinmotiven und mutmaßlichen Bindungsstellen gescannt. Die meisten Bindungsstellen wurden in kodierenden Regionen gefunden, weniger in untranslatierten und intronischen Regionen (Abb. 6a). Zu den am häufigsten beobachteten Motiven gehörten diejenigen, die von zuvor beschriebenen Transmediatoren von AS erkannt wurden. Insbesondere wurden mehrere Serin- und Arginin-reiche Spleißfaktor-(SRSF)-RNA-bindende Proteine ​​identifiziert (Fig. 6b). SRSF-Spleißfaktoren wurden zuvor wegen ihrer Fähigkeit, variable Exons zu binden und das Exon-Skipping zu hemmen oder zu fördern, mit der Krebsprogression in Verbindung gebracht (z. B. [9]).

ein Die Verteilung von RNA-bindenden Protein-Erkennungsstellen über differenziell gespleißte Gene zwischen primärem und rezidivierendem GBM. B Die Häufigkeit des Auftretens von RNA-bindenden Proteinmotiven in unterschiedlich gespleißten Genen zwischen primärem und rezidivierendem GBM. C Alternativer Exon-Einschluss in MAP4K4. D Abgeleitete Bindungsstellen für SRSF-Proteine ​​in MAP4K4. e PSI-Werte für Junctions, die die Aufnahme von Exon 19 und andere unterstützen, verglichen zwischen primärer und rezidivierender GBM-RNA-seq, unter Verwendung der hauseigenen Daten. F Wie in e, jedoch unter Verwendung öffentlicher Daten von TCGA und INCB. g Die Häufigkeiten der Expression von Exon-19 unterstützenden Neojunction-Sequenzen bei primärem vs. rezidivierendem GBM im Vergleich zwischen unseren internen Daten, TCGA- und INCB-Daten. h Die Häufigkeiten des Auftretens von MAP4K4 Exon Junctions, die den Einschluss von Exon-19 in stammähnliche und nicht stammähnliche neoplastische GBM-Zellen unterstützen. ich Die Ergebnisse eines extrazellulären Matrixinvasionsassays zum Vergleich von SRSF5 OE in U87-Zellen mit Kontrollen, mit und ohne TMZ-Behandlung bei IC50 für 48 h

Einige vorhergesagte SRSF-Bindungsstellen traten in Exons auf, die spezifisch in rezidivierenden GBM beibehalten wurden. Beispielsweise interagiert MAP4K4 selektiv mit MAPK8, um die Migration und Invasion bei Krebs zu fördern, abhängig von der Aufnahme von Exon 19 [10, 11]. Ein kürzlich aufgetretener Funktionsverlust-Bildschirm wurde identifiziert MAP4K4 als essentiell für die GBM-Invasion und den Übergang vom Epithel zum Mesenchym [12]. Wir fanden Exon 19 von MAP4K4 in unseren Daten bevorzugt im rekurrenten GBM erhalten, aber bevorzugt im primären GBM ausgespleißt werden (Abb. 6c). Darüber hinaus waren SRSF5- und SRSF9-Motive (zwei der in unserer Analyse am stärksten überrepräsentierten) in Exon 19 angereichert (Fig. 6d). Diese Anreicherung für den Exon-19-Einschluss beim Rezidiv wurde in unseren Daten (Abb. 6e) deutlich und in öffentlichen longitudinalen GBM-RNA-seq-Daten validiert [8], sowohl durch MAJIQ-Modellierung (Abb. 6f) als auch in Bezug auf die Anzahl der primären vs Rezidivierende Fälle, die die assoziierte Neojunktion exprimieren (Abb. 6g).

Um die Zelltypspezifität von zu bestimmen MAP4K4 Isoform-Expression haben wir veröffentlichte scRNA-seq-Daten gescreent, die über die Smart-seq2- und 10X Genomics-Plattformen erhalten wurden [13, 14]. Wir fanden eine mehr als 2-fache Zunahme der Exon-19-unterstützenden Junction-Sequenzen in stammähnlichen Zellen im Vergleich zu Zellen mit einem differenzierteren Phänotyp (Abb. 6h, Zusatzdatei 3: Abb. S3B Abschnitt „Materialien und Methoden“). Darüber hinaus wurde diese Isoform überwiegend in stammähnlichen Zellen des mesenchymalen Subtyps Verhaak gefunden. In Übereinstimmung mit der Rolle dieser Isoform bei der Stimulierung von MAPK8 fanden wir signifikant erhöhte MAPK8 Ausdruck in rekurrenten GBM (adj. P = 0,045 Zusatzdatei 9: Tabelle S8).

Um die Wirkung von zu bestimmen SRSF5 Überexpression (OE) transfizierten wir die vom Patienten stammende Gliomzelllinie U87 mit Plasmiden, die SRSF5 oder Leervektorkontrollen (Abschnitt „Materialien und Methoden“). Transfizierte Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines durch den Vektor exprimierten Fluoreszenzmarkers selektiert. 500.000 Zellen pro Bedingung (in Duplikat) wurden für einen Boyden-Kammer-basierten Invasionsassay extrazellulärer Matrix aliquotiert. Wir betrachteten zwei Arme mit und ohne 48-stündiger Behandlung mit der GBM-Standardtherapie Temozolomid (TMZ) bei der halben maximalen Hemmkonzentration (IC50), die wir aus früheren Studien für diese Zelllinie ermittelt hatten [14]. Wir haben das gefunden SRSF5 OE erhöhte die Invasivität und dieser Effekt wurde durch die TMZ-Behandlung verstärkt (Abb. 6i).


Diskussion

Ein umfassender FL-Transkriptom-Atlas der Erdnuss wurde von PacBio Iso-seq aus Geweben von Wurzeln, Blättern, Triebspitzen, Blüten und Zapfengeweben rekonstruiert. Unter Verwendung von Iso-Seq-Daten haben wir mehrere AS-Ereignisse entdeckt, die mit Zapfengewebe und entwicklungsstadienspezifischen FL-Transkripten verbunden sind. Wir identifizierten 1448, 1102, 832 und 902 alternativ gespleißte Transkripte in Erdnuss S1, S2, S3 bzw. S4, darunter 184 alternativ gespleißte Transkripte im Zusammenhang mit Licht- und mechanischer Reaktion, Schwerkraftstimulation, hormonvermittelten Signalwegen und kalziumabhängigen Proteine, von denen angenommen wurde, dass sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Erdnusspflöcken spielen, wie z.

S1-Stöpsel stellten die befruchteten Luftpflöcke dar, die die Schwerkraft spürten und sich nach unten beugten. In diesem Stadium identifizierten wir mehrere spezifisch exprimierte Transkripte im Zusammenhang mit Licht- und mechanischem Stimulus, Schwerkraftstimulation, Hormonreaktionsfaktoren und kalziumabhängigen Proteinkinasen und Sensorrezeptoren (Tabelle S5). Unter diesen Transkripten fanden wir 21 Transkripte, die mit Licht und mechanischem Stimulus zusammenhängen, einschließlich vakuoläres Proteinsortierung-assoziiertes Protein (9 Transkripte), Peroxidase-verwandte Proteine ​​(6 Transkripte), V-Typ-Proton-ATPase-Untereinheit (4 Transkripte) und vakuoläre Kationen /Protonenaustauscher 5 (2 Transkripte), von denen berichtet wurde, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Verlängerung der Erdnusszapfen und der Schotenentwicklung spielen [4, 7, 9, 24]. Frühere Studien zeigten, dass ABC-Transporter, Mikrotubuli, Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​und Hitzeschockproteine ​​eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf die pflanzliche Schwerkraftstimulation spielen [25,26,27]. In dieser Studie identifizierten wir 20 spezifisch exprimierte Transkripte im Zusammenhang mit der Schwerkraftstimulation, darunter 8 ABC-Transporter-Transkripte, 5 Alpha-Tubulin-Transkripte, 3 Mikrotubuli-assoziierte Proteintranskripte, zwei Mikrotubuli-bindende Protein-TANGLED-Transkripte und zwei kleine Hitzeschock-Proteintranskripte. Bemerkenswert sind zwei gravitrope Gene, VERÄNDERTE REAKTION AUF DIE GRAVITÄT (ARG1) und GRAVITROPISMUS DEFEKT 2 (GRV2), von denen gut charakterisiert war, dass sie das Pflanzenwachstum als Reaktion auf die Schwerkraft beeinflussen [28,29,30], wurden jeweils alternativ 2 Isoformen transkribiert und nur in S1-Pflöcken eindeutig exprimiert. Es wurde berichtet, dass die Schwerkraftwahrnehmung zu einer asymmetrischen Umverteilung von Auxin führen und die Pflanzenorgane dazu bringen könnte, sich weg zu beugen oder in Richtung des Schwerkraftvektors zu wachsen [31, 32]. Wir identifizierten 15 Transkripte im Zusammenhang mit Hormonreaktionsfaktoren, darunter 7 Auxin-Reaktionsfaktoren, 2 Auxin-responsive Proteine ​​IAA26, 2 Ethylen-Überproduktionsproteine ​​1, 2 Ethylen-responsiver Transkriptionsfaktor RAP2–12 und 2 IAA-Aminosäurehydrolase ILR1-like 6, die spezifisch in S1-Stiften exprimiert wurden. Die Reaktion der Schwerkraftstimulation könnte den Ca 2+ -Spiegel im Zytoplasma erhöhen und die Dehnbarkeit der Zellwand weiter fördern, was den polaren Transport von Auxin verändert [33, 34]. Wir fanden 6 spezifisch exprimierte Transkripte im Zusammenhang mit Calcium-abhängigen Proteinkinasen und Sensing-Rezeptoren, einschließlich Calcium Sensing-Rezeptor (3 Transkripte) und Calcium-abhängiger Proteinkinase (3 Transkripte). Zum Beispiel identifizierten wir 14 zellwandstrukturbezogene Transkripte, darunter 10 Villins, 2 Polygalacturonasen und 2 Expansine. Villins waren an der Regulierung der Aktindynamik von Pflanzen, wie dem Wachstum von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren, beteiligt [35, 36]. Expansine spielen eine wichtige Rolle bei mehreren morphogenetischen Prozessen, wie der Verlängerung und Ausdehnung der Pflanzenzellwand, dem Wachstum von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren, der Regulierung der Auxinwirkung [37, 38]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Villins und Expansine zur Dehnung von S1-Pegs beitragen können. Ein weiteres Gen, GDSL-Esterase/Lipase, von dem berichtet wurde, dass es Funktionen bei der Regulierung von Ethylen-Signalkomponenten hat, um die systemische Immunität in zu modulieren Arabidopsis [39, 40], wurde als alternativ transkribierte 2 Isoformen identifiziert und nur in S1-Pegs exprimiert.

S2 repräsentierte die unterirdischen Pflöcke, die 24 h in den Boden eindrangen und die im Vergleich zu S1-Pflöcken andere morphologische und physiologische Eigenschaften aufwiesen. Wir identifizierten mehrere alternativ gespleißte Transkripte, die spezifisch in S2-Pegs exprimiert wurden (Tabelle S5), von denen hauptsächlich mechanischer Stimulus, Schwerkraftstimulation, Auxin-Transporter und responsive Proteine, Transporter und Proteinkinasen in Zusammenhang stehen. Zweiundzwanzig alternativ gespleißte Transkripte im Zusammenhang mit Gravitationsstimulation (10 Transkripte) und mechanischem Stimulus (12 Transkripte) wurden spezifisch in S2-Pflöcken exprimiert, was darauf hindeutet, dass die Transkripte nach dem Eindringen in den Boden innerhalb von 24 Stunden zur Verlängerung der Erdnussstifte beitrugen. Ein gravitropes Gen, SCHIESSEN GRAVITROPISMUS 6 (SGR6), von dem berichtet wurde, dass es an der Regulation morphologischer und vakuolärer Membranstrukturen Veränderungen in schwerkraftempfindlichen endodermalen Zellen beteiligt ist Arabidopsis [41], wurden durch ein AA-Ereignis als 3 Isoformen identifiziert und spezifisch nur in S2-Pegs exprimiert. Eine weitere Analyse identifizierte 5 Transkripte, die wahrscheinlich auf Auxintransport reagieren und darauf ansprechen, darunter 2, die am Auxintransporter-ähnlichen Protein 4 beteiligt sind, und 3 am Auxin-responsiven Protein IAA30. Wir identifizierten mehrere spezifisch exprimierte Transportertranskripte in S2-Pegs, darunter GABA-Transporter 1 (2 Transkripte), Magnesiumtransporter NIPA6 (4 Transkripte), Sulfattransporter 4.2 (4 Transkripte), Proteintransportprotein Sec24-like At3g07100 (3 Transkripte), Zuckertransporter ERD6-like 6 (2 Transkripte), Tonoplast-Dicarboxylat-Transporter (3 Transkripte) und Tonoplast-Dicarboxylat-Transporter (2 Transkripte), die mit früheren Transkriptom-Studien in Erdnuss übereinstimmen [4]. Eine große Zahl von Transkripten, die für Serin/Threonin-Proteinkinaseproteine ​​kodieren, wurde als an Kälte, Salzstress und an der Regulation des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung durch Autophosphorylierung identifiziert [42, 43].

S3-Stöpsel repräsentierten im Gegensatz zu S2 die Neuorientierung der unterirdischen Pflöcke gegen die Schwerkraft nach dem Eindringen in den Boden für drei Tage. Wir identifizierten viele alternativ gespleißte Transkripte im Zusammenhang mit mechanischem Stimulus, wie Peroxidasen, vakuoläre Sortierrezeptoren und Protonen-ATPasen vom V-Typ und viele Hormonantwortproteine, dh Auxin-responsive und Ethylen-Überproduktionsproteine, was darauf hindeutet, dass diese Transkripte eine Rolle im Untergrund spielen Entwicklung der Pflöcke. Ähnlich wie bei S2-Pegs fanden wir mehrere Transkripte, die mit Serin/Threonin-Proteinkinase-Proteinen verwandt sind, insbesondere für die LRR-Rezeptor-ähnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (10 Transkripte), die an der frühen Signalübertragung von Abscisinsäure beteiligt waren und als wesentlicher Regulator in Arabidopsis embryonale Musterbildung und Keimblatt-Primordia-Generierung [44,45,46]. Insbesondere entdeckten wir viele AS-Transkripte, die an der Regulation des Entwicklungsprozesses in S3-Stiften beteiligt waren. Ein Gen, EMBRYO DEFEKT 1674 (EMB1674), hatte aufgrund eines AA-Ereignisses, das an der Regulierung der normalen Embryonalentwicklung beteiligt war, zwei Isoformen Arabidopsis [47]. Das Gen BASIC PENTACYSTEINE4 (BPC4), mit zwei Isoformen als AD-Ereignis, fungierte als positiver Transkriptionsregulator, der an Entwicklungsprozessen in beteiligt war Arabidopsis [48]. Ein Gen Aberrantes Wurzelbildungsprotein 4 (ALF4), das für ein nuklear-lokalisiertes Protein kodiert, hatte aufgrund eines IR-Ereignisses zwei Isoformen, die eine wesentliche Rolle in spielen Arabidopsis seitliche Wurzelbildung [49]. In der Zwischenzeit haben wir einige Gene entdeckt, die an der Lichtregulation der Entwicklung beteiligt sind, zum Beispiel: FAR1-BEZOGENE SEQUENZ 5 (FRS5), hatte drei Isoformen aufgrund von AD-, AA- und ES-Ereignissen, die als Transkriptionsaktivator fungierten, der an der Regulierung der Lichtsteuerung der Entwicklung in beteiligt ist Arabidopsis [50] XAP5 zirkadianer Zeitnehmer (XCT) hatte zwei Isoformen durch ein AA-Ereignis, das an der Koordination von Lichtsignalen für die Photomorphogenese und die zirkadiane Uhr beteiligt war Arabidopsis [51].

S4 stellte eine unterirdische Schote dar, die nach dem Eindringen in den Boden anschwillt und dehnt. Wir identifizierten 902 alternativ gespleißte Transkripte in S4-Pods. Unter diesen Transkripten haben wir mehrere Transkripte entdeckt, die mit mechanischem Stimulus, Auxin-Reaktionsproteinen, Calcium-bindenden/transportierenden Proteinen, Transporten, Cyclin-Proteinen und Regulatoren des Entwicklungsprozesses zusammenhängen. Siebzehn Transkripte, die mit mechanischem Stimulus (8 Transkripte) und Calcium-bindenden/transportierenden Proteinen (7 Transkripte) in Verbindung stehen, wurden identifiziert, die spezifisch in frühen, anschwellenden Schoten exprimiert werden. Acht Transkripte, die für den Auxin-Response-Faktor 3/4 und das Auxin-responsive Protein IAA9 kodieren, wurden spezifisch in S4-Pods exprimiert, die an der Expressionsregulation von Auxin-Response-Genen beteiligt waren [52]. Mehrere anorganische Ionen und kleine organische Substanzen-Transporter-Transkripte zeigten eine einzigartige Expression in S4-Pods. Ein Gen, Auxin-Transportprotein BIG (BIG), das ein Calossin-ähnliches Protein kodiert, hatte aufgrund eines AD-Ereignisses, das am polaren Auxintransport während lichtvermittelter Stimuli beteiligt war, zwei Isoformen [53]. Viele AS-Transkripte, die für Cyclin-Proteine ​​kodieren, wurden spezifisch in frühen, anschwellenden Schoten exprimiert. Von diesen Cyclinproteinen Cyclin-D4-1 (CYCD4–1) fungierte als Aktivator von Arabidopsis Wurzelspitzenteilung und förderte die Samenkeimung [54]. Darüber hinaus identifizierten wir mehrere spezifisch exprimierte Transkripte, die mit Regulatoren des Entwicklungsprozesses in S4-Schoten in Verbindung stehen. Seven transcripts from gene TOPLESS (TPL) encoding transcriptional corepressor were identified uniquely expressed in early swelling pods, which were functioned as an essential factor in ovule development [55]. Notably, five transcripts from gene ROOT HAIR DEFECTIVE 3 (RHD3) encoding GTP-binding protein were identified in swelling pods, which was involved in root or root hair cells enlargement [56,57,58].


4. Alternative splicing and nonsense-mediated decay

NMD is an extensive and complicated mechanism, ranging from yeast to human, exploited to achieve another level of robustness in post-transcriptional gene expression control. Studies have revealed that up to one-third of human alternative splicing events contain premature termination codons (PTC), which are recognized and lead to the degradation of transcripts containing NMD cis-elements in their 3′ UTRs (56, 57). In vertebrates, it has been proposed that the coupling of the exon junction complex (EJC) to mRNA transcripts, followed by binding of 3′UTRs to EJCs, triggers vertebrate specific NMD (58). The sensitivity of mRNA transcripts to NMD is modulated by alternative splicing events in the 5′ or 3′UTRs and aids with the wide range of protein biosynthesis (59). Furthermore, analysis of quantitative alternative splicing microarray profiling has demonstrated that individual knockdown of NMD factors [Up-Frameshift (UPF)] strongly affects PTC-introducing alternative splicing events, indicating a role for different UPF factor requirements in alternative splicing regulation (60). In a second example, regulation of intron retention by alternative splicing-NMD in a specific differentiation event has been recently observed (61).


Kontrolle der RNA-Stabilität

Before the mRNA leaves the nucleus, it is given two protective “caps” that prevent the ends of the strand from degrading during its journey. 5′ and 3′ exonucleases can degrade unprotected RNAs. Die 5′ cap , which is placed on the 5′ end of the mRNA, is usually composed of a methylated guanosine triphosphate molecule (GTP). The GTP is placed “backward” on the 5′ end of the mRNA, so that the 5′ carbons of the GTP and the terminal nucleotide are linked through three phosphates. Die Poly-A-Schwanz , which is attached to the 3′ end, is usually composed of a long chain of adenine nucleotides. Diese Veränderungen schützen die beiden Enden der RNA vor einem Angriff der Exonuklease.

Sobald die RNA in das Zytoplasma transportiert wurde, kann die Verweildauer der RNA dort kontrolliert werden. Jedes RNA-Molekül hat eine definierte Lebensdauer und zerfällt mit einer bestimmten Geschwindigkeit. Diese Zerfallsrate kann beeinflussen, wie viel Protein sich in der Zelle befindet. Wenn die Zerfallsrate erhöht wird, existiert die RNA nicht so lange im Zytoplasma, was die verfügbare Zeit für die Translation der mRNA verkürzt. Umgekehrt, wenn die Zerfallsrate verringert wird, verbleibt das mRNA-Molekül länger im Zytoplasma und mehr Protein kann translatiert werden. Diese Zerfallsrate wird als RNA-Stabilität bezeichnet. Ist die RNA stabil, wird sie über längere Zeiträume im Zytoplasma nachgewiesen.

Auch die Bindung von Proteinen an die RNA kann deren Stabilität beeinflussen. Proteins called RNA-binding proteins , or RBPs, can bind to the regions of the mRNA just upstream or downstream of the protein-coding region. These regions in the RNA that are not translated into protein are called the untranslated regions , or UTRs. Sie sind keine Introns (die im Kern entfernt wurden). Vielmehr sind dies Regionen, die die mRNA-Lokalisierung, Stabilität und Proteintranslation regulieren. The region just before the protein-coding region is called the 5′ UTR , whereas the region after the coding region is called the 3′ UTR (Figure 3). Die Bindung von RBPs an diese Regionen kann die Stabilität eines RNA-Moleküls erhöhen oder verringern, abhängig von dem spezifischen RBP, das bindet.

Figure 3. The protein-coding region of mRNA is flanked by 5′ and 3′ untranslated regions (UTRs). The presence of RNA-binding proteins at the 5′ or 3′ UTR influences the stability of the RNA molecule.


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Wissenschaft

Vol 351, Issue 6280
25 March 2016

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Wissenschaft 25 Mar 2016 : 1390-1392

3D snapshots reveal dynamics of the spliceosome on the mRNA splicing pathway [Also see Research Article by Agafonov et al.]


Evolution: Alternative splicing of RNA rewires signaling in different tissues, may contribute to species differences

MIT biologists have found that alternative splicing of messenger RNA accounts for much of the differences seen between species. Credit: Wikimedia Commons

When genes were first discovered, the canonical view was that each gene encodes a unique protein. However, biologists later found that segments of genes can be combined in different ways, giving rise to many different proteins.

This phenomenon, known as alternative RNA splicing, often alters the outputs of signaling networks in different tissues and may contribute disproportionately to differences between species, according to a new study from MIT biologists.

After analyzing vast amounts of genetic data, the researchers found that the same genes are expressed in the same tissue types, such as liver or heart, across mammalian species. However, alternative splicing patterns—which determine the segments of those genes included or excluded—vary from species to species.

"The core things that make a heart a heart are mostly determined by a heart-specific gene expression signature. But the core things that make a mouse a mouse may disproportionately derive from splicing patterns that differ from those of rats or other mammals" says Chris Burge, an MIT professor of biology and biological engineering, and senior author of a paper on the findings in the Dec. 20 online edition of Wissenschaft.

Lead author of the paper is MIT biology graduate student Jason Merkin. Other authors are Caitlin Russell, a former technician in Burge's lab, and Ping Chen, a visiting grad student at MIT.

A variety of proteins

Alternative RNA splicing (a discovery for which MIT Institute Professor Phillip Sharp shared the 1993 Nobel Prize in medicine or physiology), controls the composition of proteins encoded by a gene. In mammals, genes—made of DNA stored in the cell nucleus—consist of many short segments known as exons and introns. After the DNA is copied into an RNA transcript, all introns and frequently some exons are excised before the messenger RNA (mRNA) leaves the nucleus, carrying instructions to make a specific protein.

This process allows cells to create a much wider variety of proteins than would be possible if each gene encoded only one protein. Some proteins, including Dscam in fruit flies and neurexin in humans, have thousands of alternate forms. These variant proteins can have vastly different functions, Burge says. For example, the full version of a protein may bind to DNA at one end and activate DNA transcription at the other end. If an alternatively spliced form is missing the activation section, it will compete for binding to the same DNA regions as the full-length protein, preventing activation of transcription.

In 2008, Burge and colleagues analyzed mRNA from 10 different human tissues, publishing their results in Natur, and found that nearly every gene is alternatively spliced. Furthermore, most alternative splicing was found to differ among tissues.

In the new study, the researchers compared tissues from several different mammalian species—the rhesus monkey, rat, mouse and cow—as well as one species of bird, the chicken. For each species, the researchers analyzed nine types of tissue (brain, colon, heart, kidney, liver, lung, muscle, spleen and testes) from three individuals, sequencing more than a trillion bases of mRNA.

Using new high-speed sequencing technology, the researchers analyzed both gene expression and alternative splicing patterns in each tissue sample. They found that gene expression patterns were extremely similar across tissues, no matter what species the tissue came from. That is, the genes active in kidney tissue from rats were nearly identical to those turned on in cows' kidney tissue.

"That was not a big surprise," Burge says. "It's consistent with the idea that the gene expression pattern actually determines the identify of the tissue. You need to express certain structural and motor proteins if you're a muscle cell, and if you're a neuron you have to express certain synaptic proteins."

The results from the alternative splicing pattern comparison were very different. Instead of clustering by tissue, the patterns clustered mostly by species. "Different tissues from the cow look more like the other cow tissues, in terms of splicing, than they do like the corresponding tissue in mouse or rat or rhesus," Burge says.

Because splicing patterns are more specific to each species, it appears that splicing may contribute preferentially to differences between those species, Burge says. "Splicing seems to be more malleable over shorter evolutionary timescales, and may contribute to making species different from one another and helping them adapt in various ways," he says.

The new study is the first large-scale effort to look at the role of alternative splicing in evolution, says Brenton Graveley, a professor of genetics and developmental biology at the University of Connecticut Health Center. "It provides a lot of new insight into the potential role of alternative splicing in driving differences between species," says Graveley, who was not involved in this study.

The researchers also found that a major function of alternative splicing is the addition and deletion of short protein segments that contain one or more phosphorylation sites. Phosphorylation (addition of a phosphate molecule) is a very common way for cells to activate or deactivate proteins.

When a variant form of a protein lacks a key phosphorylation site, it may lose the function of the original form. Phosphorylation can also direct proteins to different locations within the cell, which may alter their function.

Changes in splicing patterns also help to modify the signaling networks that regulate most cellular activity. These networks are often controlled by phosphorylation of proteins involved in the network, many of which can be alternatively spliced. "You can think about it as rewiring signaling networks so they control different outputs. Splicing can add a new output or delete it in a tissue-specific way," Burge says.

The researchers also identified several thousand new alternative exons in each species, and are now studying how these exons evolved and exploring their potential functions.

ABSTRACT
Most mammalian genes produce multiple distinct messenger RNAs through alternative splicing, but the extent of splicing conservation is not clear. To assess tissue-specific transcriptome variation across mammals, we sequenced complementary DNA from nine tissues from four mammals and one bird in biological triplicate, at unprecedented depth. We find that while tissue-specific gene expression programs are largely conserved, alternative splicing is well conserved in only a subset of tissues and is frequently lineage-specific. Thousands of previously unknown, lineage-specific, and conserved alternative exons were identified widely conserved alternative exons had signatures of binding by MBNL, PTB, RBFOX, STAR, and TIA family splicing factors, implicating them as ancestral mammalian splicing regulators. Our data also indicate that alternative splicing often alters protein phosphorylatability, delimiting the scope of kinase signaling.


Schau das Video: Alternatives Spleißen Genregulation, Eukaryoten - Biologie, Oberstufe (Juni 2022).


Bemerkungen:

  1. Carmichael

    Es ist schade, dass ich jetzt nicht sprechen kann - ich muss gehen. Aber ich werde zurückkehren - ich werde auf jeden Fall schreiben, was ich in diesem Thema denke.

  2. Totaxe

    Fall, dass Ihre Hände!

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