Information

0,1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol und DNA-Löslichkeit

0,1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol und DNA-Löslichkeit


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ich verstehe, wie die DNA-Präzipitation in Gegenwart von Salz (wie 0,3 M Natriumacetat oder 0,2 M Natriumchlorid) und Alkohol (30 ~ 50 % Isopropanol oder 60 ~ 75 % Ethanol) funktioniert.

Im Trizol-Kit-Handbuch konnte die DNA jedoch gewaschen und präzipitiert werden0,1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol

Wie kann DNA bei nur 10 % Ethanol und 0,1 M Natriumion in einer "kompakten/unlöslichen" Form vorliegen, damit sie durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2000 x g für 5 Minuten) ausgefällt werden kann?


Die Natriumionen binden an und neutralisieren die (-)-Ladung auf dem Phospho-Rückgrat der DNA. Dies reduziert Wasserstoffbrückenbindungsstellen für Wasser, was dann zu einer geringeren Löslichkeit führt.

Aus Gründen der Übersichtlichkeit bearbeitet und weil ich die Frage nicht beim ersten Mal beantwortet habe. Das tut mir leid.

Die Extraktion der DNA erfolgt aus der Interphase-Schicht, die ein sehr kleiner Bruchteil der ursprünglichen Probe ist. Die Extraktion der Zwischenphasenschicht wird dann mit 100 % EtOH (300 ul pro 1,0 Trizol, das in dieser Probe verwendet wurde) gemischt. Dies sollte nach meiner Erfahrung mit dieser Methode tatsächlich 60% oder mehr EtOH sein.

Das ist der Fällungsschritt.

Die Tatsache, dass die Waschlösung nur 10 % EtOH und 0,1 M Natriumcitrat enthält und dies immer noch ausreicht, um die DNA präzipitiert zu halten, dreht sich um 0,1 M Natriumcitrat, normalerweise um 0,3 M Natriumionen (Natriumcitrat kann Mono-, Di- oder Trinatrium sein) , aber sofern nicht anders angegeben, bedeutet Natriumcitrat Tri-). Denken Sie daran, dass Sie beim Waschen keine schnelle Ausfällung vornehmen müssen, sondern nur verhindern müssen, dass es sich wieder auflöst.

Ich entferne meine Kommentare, die die gleichen Informationen enthalten.


Die einstufige Methode der RNA-Isolierung durch saure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion: über zwanzig Jahre später

Seit seiner Einführung hat sich die „einstufige“ Methode zur Isolierung von Gesamt-RNA aus biologischen Proben unterschiedlicher Herkunft durchgesetzt. Das dem Verfahren zugrunde liegende Prinzip besteht darin, dass nach Extraktion mit einer sauren Lösung, die Guanidiniumthiocyanat, Natriumacetat, Phenol und Chloroform enthält, RNA von DNA getrennt und anschließend zentrifugiert wird. Unter sauren Bedingungen verbleibt die Gesamt-RNA in der oberen wässrigen Phase, während die meisten DNA und Proteine ​​entweder in der Zwischenphase oder in der unteren organischen Phase verbleiben. Die Gesamt-RNA wird dann durch Fällung mit Isopropanol gewonnen und kann für verschiedene Anwendungen verwendet werden. Das ursprüngliche Protokoll, das die Isolierung von RNA aus Zellen und Geweben in weniger als 4 Stunden ermöglichte, hat die Analyse der Genexpression in Pflanzen- und Tiermodellen sowie in pathologischen Proben erheblich vorangebracht, wie die überwältigende Anzahl von Zitaten zeigt, die das Papier erreichte 20 Jahre.


Protokoll - TRI-Reagenz-DNA-Isolierung

DNA wird aus der Phenolphase und der Interphase von Proben, die homogenisiert (oder lysiert) wurden, in 1 ml TRI-Reagenz ausgefällt (Schritt 5 im RNA-Isolierungsprotokoll). Nach einer Reihe von Waschvorgängen, um restliches Phenol zu entfernen, wird das DNA-Pellet in einer milden alkalischen Lösung solubilisiert und der pH wird eingestellt. Diese Technik funktioniert gut mit Proben, die >10 &mgr;g DNA enthalten.

  • 100 % Ethanol, ACS-Qualität oder besser
  • Nukleasefreies Wasser
  • Trinatriumcitrat
  • NaOH
  • HEPES (freie Säure)
  • Nukleasefreie Zentrifugenröhrchen in angemessener Größe mit sicheren Verschlüssen, kompatibel mit Phenol/Chloroform und in der Lage, Zentrifugalkräften von 12.000 x g standzuhalten.
  • DNA-Waschlösung: 0,1 M Trinatriumcitrat in 10 % Ethanol (keine pH-Einstellung erforderlich), 2–3 ml pro 1 ml TRI-Reagenz, das bei der anfänglichen Homogenisierung verwendet wurde:
  • 75% Ethanol, 1,5–2 ml pro 1 ml TRI-Reagenz, das bei der anfänglichen Homogenisierung verwendet wurde
  • 8 mM NaOH,300–600 μl pro 50–70 mg Gewebe oder 10 7 Zellen
  • 0,1 M oder 1 M HEPES (freie Säure), siehe Tabelle 1
  • Sofern nicht anders angegeben, führen Sie das Verfahren bei Raumtemperatur durch.
  • Das Molekulargewicht der gewonnenen DNA hängt von den während der Homogenisierung aufgebrachten Scherkräften ab. Wenn DNA mit hohem Molekulargewicht gewonnen werden soll, verwenden Sie im ersten Homogenisierungsschritt des RNA-Isolierungsprotokolls einen locker sitzenden Homogenisator. Vermeiden Sie die Verwendung eines Polytron-Homogenisators.
  • Wenn die DNA nur zu quantitativen Zwecken isoliert wird: a) Proben können stärker homogenisiert werden, einschließlich der Verwendung eines Polytrons b) Phenolphase und Interphase können bei 4°C für einige Tage oder bei –70°C für einige Monate c) die DNA kann mit 40 mM NaOH anstelle einer 8 mM Lösung solubilisiert werden und durch Vortexen des DNA-Pellets statt Pipettieren.

Das Ausgangsmaterial für dieses Verfahren enthält TRI-Reagenz, das ein Gift (Phenol) und ein Reizmittel (Guanidinthiocyanat) enthält. Kontakt mit TRI-Reagenz führt zu Verbrennungen und kann tödlich sein. Bei der Arbeit mit TRI-Reagenz Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung verwenden.


Neurobiologie der Zytokine

Dan Lindholm, . Eero Ċastrén , in Methoden der Neurowissenschaften , 1993

Lösungen

Puffer D (denaturierender Puffer):

Guanidiumthiocyanat (4 m)

Natriumcitrat (25 ml)m), pH 7

Sarkosyllaurylsulfat (0,5%)

Guanidium, Natriumcitrat und Sarkosyl mischen und in 50-ml-Falcon-Röhrchen aufbewahren.

Vor Gebrauch 360 µl 2-Mercaptoethanol/50 ml zugeben.

Chloroform-Isoamylalkohol, 49:1

KomponenteAktieFür 300 μlFür 600 μl
NaHPO4 (100 mm), pH 7100 mm30 μl60 μl
Deionisiertes Glyoxal 70 μl140 μl
Dimethylsulfoxid 200 μl400 μl
KomponenteAktieFür 20 mlFür 40 ml
Entionisiertes Formamid (50%)100%10 ml20 ml
NaHPO4 Puffer (50 mm), pH 71 m1 ml2 ml
SSC (3×)20×6 ml12 ml
Sicherheitsdatenblatt (0,5%)10%1 ml2 ml
N / A2EDTA (5 mm)0.5 m200 μl400 μl
ssDNA (250 μg/ml)10 mg/ml500 μl1 ml
Denhardts Lösung (5×)50×2 ml4 ml

Enzymatische Biokonversion von Zitrus-Hesperidin durch Aspergillus sojae Naringinase: Erhöhte Löslichkeit von Hesperetin-7-Ö-Glucosid mit in vitro Hemmung der humanen intestinalen Maltase, HMG-CoA-Reduktase und des Wachstums von Helicobacter pylori

Hesperetin-7-Ö-Glucosid (Hes-7-G) wurde durch die enzymatische Umwandlung von Hesperidin durch Aspergillus sojae Naringinase aufgrund der Entfernung der terminalen Rhamnose. Extrakte aus Orangensaft und -schalen, die das Hesperidin enthielten, wurden mit diesem Enzym so behandelt, dass das Hesperidin auch in Hes-7-G umgewandelt werden konnte. Die Löslichkeit von Hes-7-G in 10 % Ethanol war 55- bzw. 88-fach höher als die von Hesperidin bzw. Hesperetin, was Hes-7-G möglicherweise besser bioverfügbar macht. Hes-7-G war 1,7- bzw. 2,4-fach besser als Hesperidin bzw. Hesperetin bei der Hemmung der humanen intestinalen Maltase. Hes-7-G war bei der Hemmung der humanen HMG-CoA-Reduktase um das 2- und 4-fache stärker als Hesperidin. Darüber hinaus zeigte Hes-7-G eine wirksamere Hemmung des Wachstums von Helicobacter pylori als Hesperetin, während seine Wirksamkeit der von Hesperidin ähnlich war. Daher legen die Ergebnisse nahe, dass biokonvertiertes Hes-7-G wirksamer und bioverfügbarer ist als Hesperidin, da es verbesserte Hemm- und Löslichkeitseigenschaften aufweist.

Höhepunkte

► Hes-7-G könnte von Hesperidin umgewandelt werden durch Aspergillus sojae Naringinase. ► Hes-7-G war sehr viel besser löslich als Hesperidin und Hesperetin. ► Hes-7-G war bei der Hemmung der intestinalen Maltase stärker als Hesperidin. ► Hes-7-G war bei der Hemmung der HMG-CoA-Reduktase stärker als Hesperidin.


Methoden

Ethik-Erklärung

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Committee on Human Care and Use vom NASA und JAXA Ethical Review Board und dem Human Research Multilateral Review Board (HRMRB) genehmigt wurden. Alle Teilnehmer haben ihr schriftliches Einverständnis gegeben.

Vorbereitung der Haarprobe

An der Studie nahmen zehn Astronauten der Internationalen Raumstation (ISS) teil. Sie waren auf einer sechsmonatigen Mission auf der ISS. Während jeder Mission wurden von jedem Astronauten sechsmal fünf Haarsträhnen entnommen. Die 6 verschiedenen Abtastzeiten waren wie folgt (Abb. 1): erster Preflight (Launch (L)-180

3 Monate vor dem Start), zweiter Preflight (L-60

14: 2 Monate bis 2 Wochen vor dem Start), erster Flug (L + 20 .)

37: von 20 bis 37 Tage nach dem Start), zweiter Flug (Return (R)-20

7: von 20 117 bis 7 Tage vor Rückflug), erster Postflight (R + 2

7: 2 bis 7 Tage nach der Rückkehr) und zweiter Postflight (R + 30

90: 1 bis 3 Monate nach der Rückkehr). Die Probenahmetage waren für jeden Astronauten aufgrund unterschiedlicher Zeitpläne unterschiedlich. Bei jeder Mission wurden zwei Astronauten gepaart und einzelne Haarproben entnommen. Für jede einzelne Probe wurden fünf Haarsträhnen möglichst nah an der Kopfhaut gegriffen und mit einer Pinzette in Haarwuchsrichtung herausgezogen, ohne die Haarwurzeln zu beschädigen. Die Preflight- und Postflight-Proben wurden bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Die Inflight-Proben wurden so bald wie möglich nach der Entnahme im Minus Eighty Degree Laboratory Freezer auf der ISS (MELFI) gelagert, bis sie zur Analyse zurückgegeben wurden.

RNA-Extraktion

Als Quelle für die extrahierte mRNA wurden Haarwurzeln (ca. 2–3 mm) verwendet. Die Wurzeln wurden unter Verwendung eines mikrochirurgischen Messers unter einem Stereomikroskop in ungefähr 15 Fragmente (jeweils 0,1–0,2 mm) geschnitten. Die gesammelten Fragmente wurden in 800 &mgr;l ISOGEN-Reagens (Nippon Gene Toyama, Japan) in Röhrchen eingetaucht und unter Verwendung eines Bioruptor UCD-250-Beschallungsgeräts (Cosmo Bio Tokyo, Japan) gerührt (15 Sek. × 2 Mal). Anschließend wurde die RNA aus Haarlysaten mit einem ISOGEN-Kit nach Herstellerangaben gereinigt. Kurz gesagt wurden die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur gehalten, gefolgt von der Zugabe von 200 &mgr;l Chloroform. Der anschließende Prozess der RNA-Aufreinigung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach der Isolierung wurden RNA-Pellets mit 70 % Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 10 &mgr;l RNA-freiem Wasser (Gibco-BRL Gaithersburg, MD) resuspendiert. Die Gesamt-RNA wurde bei 260 nm unter Verwendung eines NanoDrop ND-1000-Spektrophotometers (NanoDrop Technologies Inc. Wilmington, DE) quantifiziert. Die RNA-Qualität wurde unter Verwendung eines Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Palo Alto, CA) bestimmt. Das 28S:18S-rRNA-Verhältnis und die RNA-Integritätszahl (RIN) wurden mit der Software 2100 Expert bzw. RIN Beta Version (Agilent Technologies) berechnet.

RNA-Amplifikation

Da die aus den Haarproben extrahierte RNA-Probe klein war, wurde vor der Microarray-Hybridisierung ein doppelter RNA-Amplifikationsschritt eingebaut. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Ambion MessageAmp aRNA-Kits (Thermo Fisher Scientific Waltham MA, USA) amplifiziert. Kurz gesagt wurden Erst- und Zweitstrang-cDNA synthetisiert. Unmarkierte aRNA wurde erzeugt durch in vitro Transkription mit nicht-biotinylierten NTPs. Zur Sondenpräparation wurde RNA mit Primern der zweiten Runde revers transkribiert. Die Zweitstrang-cDNA wurde mit T7-Oligo(dT)-Primern synthetisiert und gereinigt. Biotin-markierte cRNA wurde über in vitro Transkription und gereinigt unter Verwendung eines RNeasy Kits (Qiagen Venlo, Niederlande).

DNA-Extraktion aus Haar-RNA-Proben

DNA-Proben aus den Haarwurzeln der Astronauten wurden mit ISOGEN (Nippon Gene Toyama, Japan) aus den restlichen extrahierten RNA-Proben nach Herstellerangaben extrahiert. Kurz gesagt wurden jeder Probe 0,3 ml 100 % Ethanol zugesetzt, gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Nach Zentrifugation mit einer gekühlten Mikrozentrifuge (Kubota Modell 3500 KUBOTA Tokyo, Japan) bei 2000 g und 4°C für 5 Minuten wurde der Niederschlag in den Röhrchen mit 1 ml 0,1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol für 30 Minuten gewaschen. Nach weiterer Zentrifugation bei 2000 g und 4°C für 5 Minuten, die Niederschläge wurden erneut mit 1 ml 0,1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol für weitere 30 Minuten gewaschen. Die isolierten DNA-Pellets wurden mit 1 ml Ethanol gewaschen und dann bei 2000 . zentrifugiert g und 4 °C für 5 Minuten. Die gespülten DNA-Proben wurden luftgetrocknet und in 50 &mgr;l Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Pufferlösung (TE-Lösung) resuspendiert. Um die DNA-Menge zu quantifizieren, wurden die Absorptionsraten bei 260 nm unter Verwendung eines U-1900-Spektrophotometers (Hitachi High-Tech Science Tokyo, Japan) gemessen. Das 260 nm/280 nm Absorptionsverhältnis der DNA-Proben wurde ebenfalls gemessen, um die DNA-Qualität zu bestimmen.

Messung von mtDNA/nDNA-, mtRNA/nRNA- und mtRNA/mtDNA-Verhältnissen

Das Verhältnis von mitochondrialer (mt) und nukleärer (n) DNA sowie das Verhältnis von mtRNA und nRNA aus den Haarwurzeln der Astronauten wurden mittels SYBR Green-basierter quantitativer PCR (qPCR) analysiert. Für die qPCR wurden die oben beschriebenen DNA- und RNA-Proben verwendet. Zehn Nanogramm DNA wurden verwendet, um mt oder nDNA nachzuweisen, und 2 ng RNA wurden verwendet, um mt oder nRNA nachzuweisen. Die qPCR-Reaktionen wurden mit dem ABI Prism 7000 Sequenzerkennungssystem (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) unter Verwendung eines QuantiTect SYBR Green PCR Kits (QIAGEN Valencia, CA, USA) wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen. Zum ND1 und GAPDH Amplifikation betrug die Denaturierungstemperatur 95 °C, die Denaturierungszeit 15 Sekunden, die Annealing-Temperatur 55 °C, die Annealing-Zeit 30 Sekunden, die Elongationstemperatur 72 °C und die Elongationszeit 40 Sekunden.

NADH-Dehydrogenase-Untereinheit 1 (ND1) Primer wurden verwendet, um mtDNA oder mtRNA und Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Primer wurden verwendet, um nDNA oder nRNA nachzuweisen. Diese Primersequenzen sind wie folgt.

ND1 F: 5′-ACCCCCGATTCCGCTACGACCAAC-3′,

ND1 R: 5′-GGTTTGAGGGGGAATGCTGGAGAT-3′,

GAPDH F: 5′-GGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3′,

GAPDH R: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'.

Berechnung der mtDNA/nDNA-, mtRNA/nRNA- und mtRNA/mtDNA-Verhältnisse

Die mtDNA/nDNA-, mtRNA/nRNA- und mtRNA/mtDNA-Verhältnisse wurden unter Verwendung der folgenden Gleichungen berechnet. Der Schwellenwertzyklus (Ct) ist definiert als „die fraktionale Zykluszahl, bei der die von SYBR Green erzeugte Fluoreszenz einen festen Schwellenwert überschreitet“.

Verhältnis von mtDNA/nDNA und Verhältnis von mtRNA/nRNA = 2^(GAPDH Ct-ND1 Ct).

Verhältnis von mtRNA/mtDNA = (mtRNA/nRNA)/(mtDNA/nDNA).

Messungen der Genexpressionen von MnSOD, CuZnSOD, Nrf2, Keap1, GPx4 und Catalase

Die qPCR-Reaktionen wurden mit dem Sequenzerkennungssystem ABI Prism 7000 (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) unter Verwendung eines QuantiTect SYBR Green PCR Kits (QIAGEN Valencia, CA, USA) durchgeführt. GAPDH wurde zur Kontrolle verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: For MnSOD, Nrf2, Keap1, GPx4 Amplifikation, die Denaturierungstemperatur betrug 95 °C, die Denaturierungszeit betrug 15 Sekunden, die Annealing- und Elongationstemperatur betrug 60 °C, die Annealing- und Elongationszeit betrug 1 Minute. Zum CuZnSDO Amplifikation betrug die Denaturierungstemperatur 95 °C, die Denaturierungszeit 30 Sekunden, die Annealingtemperatur 55 °C, die Annealingzeit 30 Sekunden, die Elongationstemperatur 72 °C und die Elongationszeit 30 Sekunden. Zum Katalase Amplifikation betrug die Denaturierungstemperatur 95 °C, die Denaturierungszeit 10 Sekunden, die Annealingtemperatur 55 °C, die Annealingzeit 30 Sekunden, die Elongationstemperatur 72 °C und die Elongationszeit 40 Sekunden. GAPDH wurde als Kontrollamplifikation verwendet. Diese Primersequenzen sind wie folgt.

MnSOD F: 5′-TTCTGGACAAACCTCAGCCCTAACGGT-3′

MnSOD R: 5′-AACAGATGCAGCCGTCAGCTTCTCTTAAA-3′

CuZnSOD F: 5′-CATTGCATCATTGGGCCGCACACTG-3′

CuZnSOD R: 5′-ACCACAAGCCAAACGACTTCCAGC-3′

Nrf2 F: 5′-GTGGCTGCTCAGAATTGCAGAAAAAGAAAA-3′

Nrf2 R: 5′-TGTTTTTCAGTAGGTGAAGGCTTTTGTCA-3′

Behalten1 F: 5′-CCATGAAGCACCGGCGAAGTGCC-3′

Behalten1 R: 5′-GTCTGTATCTGGGTCGTAACACTCCAC-3′

GPx4F: 5′-GAGCCAGGAGTAACGAAGAGATCAAA-3′

GPx4R: 5′-TCACGCAGATCTTGCTGAACATATCGAATT-3′

Katalase F: 5′-TGACTACGGGAGCCACATCCAGGC-3′

Katalase R: 5′-TCACAGATTTGCCTTCTCCCTTGC-3′

GAPDH F: 5′-GGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3′,

GAPDH R: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'.

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit dem F-Test von Scheffe durchgeführt. Alle P Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.


Anmerkung des Herausgebers: Springer Nature bleibt in Bezug auf gerichtliche Ansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildung 1 Röntgenstrukturen von TIRR–53BP1 und NUDT16TI–53BP1.

ein, Die vier TIRR- und zwei 53BP1-Tudor-Moleküle in der asymmetrischen Einheit sind gezeigt. B, Die beiden NUDT16TI- und zwei 53BP1-Tudor-Moleküle in der asymmetrischen Einheit sind gezeigt

Ergänzende Abbildung 2 Konformationen der TIRR 53BP1-Bindungsschleife und der entsprechenden Schleifenregion in NUDT16.

Links: Aminosäuresequenz-Alignment der TIRR 53BP1-Bindungsschleife mit der entsprechenden Region von NUDT16. Rechts: Strukturelle Überlagerung der Loop-Regionen in TIRR (blau) und NUDT16 (grau). Hervorgehoben sind Pro104 und Arg105 in NUDT16 und die wichtigsten 53BP1-wechselwirkenden Reste Pro105 und Arg107 in TIRR. 53BP1-Reste, die mit TIRR Pro105 und Arg107 interagieren, sind ebenfalls gezeigt.

Ergänzende Abbildung 3 Eine flexible Schleife in TIRR (Reste 101–107) ist hochspezifisch für die 53BP1-Interaktion.

Silbergefärbtes Gel (ein) und Immunblot (B) von TIRR-FH- und TIRR-Loop-FH-Partnerproteinen, die aus dem löslichen Kernextrakt von U2OS-Zellen für die massenspektrometrische Analyse gereinigt wurden. TIRR-Loop-FH entspricht TIRR-FH, das mutiert ist, um die Loop-Region von NUDT16 zu beherbergen (siehe ergänzende Abb. 2). Massenspektrometriedaten sind in der Zusatztabelle 1

Ergänzende Abbildung 4 Klassenwechsel-Rekombination in stimulierten B-Zellen.

Dargestellt sind repräsentative Durchflusszytometrie-Plots der in Abb. 5h . dargestellten Daten

Ergänzende Abbildung 5 Vergleich der Röntgenstrukturen von TIRR–53BP1 und NUDT16TI–53BP1.

ein, Überlagerung der TIRR–53BP1- und NUDT16TI–53BP1-Strukturen mit TIRR in Blau, NUDT16TI in Hellblau und 53BP1 in Orange. Die C-terminalen α-Helices im TIRR-Homodimer (grau dargestellt) existieren in NUDT16TI nicht. B, Details der Bindungsschnittstellen von TIRR–53BP1 und NUDT16TI–53BP1 veranschaulichen die bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen den beiden Komplexen. Gleiche Farbcodierung wie in A.


Enzymatische Hydrolyse und gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation von Sojabohnenverarbeitungszwischenprodukten zur Herstellung von Ethanol und Konzentration von Proteinen und Lipiden

Kohlenhydrate in Sojabohnen sind aufgrund ihrer geringen Verdaulichkeit und weil sie wertvollere Bestandteile (Proteine, Lipide) „verdünnen“, generell unerwünscht. Um diese Kohlenhydrate zu entfernen und den Titer an wertvolleren Komponenten zu erhöhen, wurde die Ethanolproduktion untersucht. Kommerzielle Enzyme (Novozyme-Cellulase, β-Glucosidase und Pektinase) wurden zu gemahlenen Sojabohnen (SB), Sojabohnenmehl (SBM), Sojabohnenschalen (SH) und Sojabohnen-Weißflocken (WF) mit einer Feststoffbeladungsrate von 10 % zugegeben, um hydrolysiertes Glucan zu quantifizieren. Die Verzuckerung führte zu einer Glucanreduktion von 28%, 45%, 76% bzw. 80% (SBM, SB, SH, WF). Simultane Verzuckerungs- und Fermentationsversuche (SSF) wurden bei 5 %, 10 %, 15 % und 20 % Feststoffbeladung mit . durchgeführt Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034 und Scheffersomyces-Stipitis NRRL Y-7124, mit Protein-, Ballaststoff- und Lipidanalyse bei SSF 10 % Feststoffen und Verzuckerungsversuchen. S. cerevisiae und S. Stipitis produziert

2.5–8.6 g/L Ethanol auf SB, SBM und WF über alle Feststoffbeladungsraten. SH führte bei beiden zu höheren Ethanoltitern S. cerevisiae (

9–23 g/L) und S. Stipitis (

9,5–14,5 g/l). Die Proteinkonzentrationen nahmen bei SB, SBM und WF um 2,5–10 % ab, bei SH jedoch um 53–55 % zu. Ölkonzentrationen erhöht um

1. Einleitung

Sojabohnen gehören aufgrund ihres hohen Öl- und Proteingehalts zu den wertvollsten Nutzpflanzen der Welt, was eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten ermöglicht. Sojaöl wird als Lebens- und Futtermittelzutat sowie in der Kosmetik [1–4] und zur Biodieselherstellung [5] verwendet. Sojabohnenprotein ist hochverdaulich und wurde zusammen mit vielen menschlichen Nahrungsmitteln in Vieh- und Aquakulturfutter verwendet [6-10]. Sojaproteinergänzungen werden aufgrund ihrer vielen gesundheitlichen Vorteile in der menschlichen Ernährung gefördert [9, 11–15].

Im Gegensatz zu Öl und Proteinen finden sich Kohlenhydrate in Sojabohnen (

10 % Trockengewicht) sind aufgrund ihrer geringen Verdaulichkeit weitgehend unerwünscht [16]. Stachyose und Raffinose, zwei der primären Kohlenhydrate in Sojabohnen, sind für den Menschen und andere Monogastrier unverdaulich, können aber von der natürlichen Flora im Darmtrakt fermentiert werden, was zu einer unangenehmen Gasbildung führt [17–19]. Stachyose und Raffinose können auch die Verdaulichkeit von Lebensmitteln, die sie enthalten, verringern [17]. Die Anwesenheit dieser Kohlenhydrate verdünnt auch effektiv die Konzentration des Proteins und des Öls in Sojabohnen.

In vielen Ländern werden Sojabohnen „zerkleinert“ und dann mit Hexan oder anderen Lösungsmitteln extrahiert, um Sojabohnenöl von den Feststoffen (z. B. Sojabohnenmehl, SBM) zu trennen. SBM hat einen Proteingehalt von etwa 45% und wird häufig als Viehfutter verwendet. Sojabohnen können durch Ethanolextraktion weiterverarbeitet werden, um Kohlenhydrate zu entfernen, was zu Sojaproteinkonzentrat (SPC) führt, das mindestens 65 % Protein enthält [18]. Dies ist ein teures Verfahren und der entfernte Zucker hat wenig Nutzen, aber das SPC ist viel besser verdaulich und kostet das 2- bis 2,5-fache des Preises von SBM.

Als Alternative zum Waschen mit Ethanol haben wir die Verzuckerung und Bioumwandlung von Sojabohnenkohlenhydraten in Ethanol untersucht. Dies würde ein zusätzliches Produkt schaffen, um die Verarbeitungskosten zu kompensieren, während gleichzeitig ein nicht ausreichend genutztes Material (Sojabohnenkohlenhydrate) verwendet wird. Kommerzielle hydrolytische Enzyme und Hefe wurden an Sojabohnen und drei Fraktionen aus der Sojabohnenöl-Extraktionsanlage getestet. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Großteil des Proteins oder der Lipide, die von Hefe als Nährstoffe verwendet werden, in den endgültigen Feststoffen als Hefezellmasse zurückbleibt. Darüber hinaus erwarteten wir eine Erhöhung des Proteingehalts durch die Umwandlung von Kohlenhydraten in Zellprotein.

2. Materialien und Methoden

2.1. Substrate

Zu den getesteten Substraten gehörten ganze Sojabohnen, Sojabohnenschalen, weiße Flocken und entfettetes Sojabohnenmehl. Diese wurden als Geschenk von South Dakota Soybean Processors, Volga, SD, USA, erhalten. 1 zeigt ein vereinfachtes Prozessflussdiagramm der Sojabohnenverarbeitung mit organischen Lösungsmitteln, um die Quelle der Substrate zu bezeichnen. Die Substrate wurden unter Verwendung eines Wiley Mill (2 mm)-Siebs gemahlen und bei Raumtemperatur gelagert. Diese Substrate wurden von Olson Agricultural Analytical Laboratories an der South Dakota State University in Brookings, SD, USA einer Nahanalyse unterzogen und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.


2.2. Enzyme

Enzyme wurden als Geschenk von Novozymes (Franklinton, NC, USA) erhalten. NS 50013 (Celluclast 1,5 L) ist ein Cellulase-Cocktail mit einer Aktivität von 70 FPU/g. NS 50010 (Novozyme 188) ist a β-Glucosidase mit einer Aktivität von 250 CBU/g. NS 22016 ist ein Pektinase-Cocktail mit einer Aktivität von 3800 U/mL. Die Enzyme wurden vor der Verwendung bei 4°C gelagert.

2.3. Hefe

Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034 und Scheffersomyces-Stipitis NRRL Y-7124 wurden von der USDA ARS Culture Collection (Peoria, IL, USA) erhalten. Zur kurzfristigen Erhaltung wurden die Kulturen auf Potato Dextrose Agar (PDA)-Platten und Schrägen 72 h bei 35 °C gezüchtet und dann bei 4 °C gelagert, wobei die Organismen alle 4 Wochen subkultiviert wurden. Zur Langzeitlagerung wurde Lyophilisation in einer 20%igen Saccharoselösung verwendet.

Das Inokulum für alle Versuche wurde hergestellt, indem sterile Brühe mit 5 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt (100 ml in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben) mit einem 1 % (v/v) Aliquot für S. cerevisiae, oder 5% (v/v) für S. Stipitis, aus Nährbrühe, die bei 4°C gelagert wurde. Fläschchen für das Inokulum wurden 24 h bei 35 °C in einem 250 UpM-Rotationsschüttler inkubiert. Nährlösungskulturen wurden vor dem Kühlen 24 h bei 250 UpM gezüchtet und innerhalb von 60 Tagen verwendet, um Kolben für das Inokulum zu beimpfen.

2.4. Puffer und Antibiotika

Verzuckerungs- und SSF-Versuche wurden in einem sterilen 0,1 M Natriumcitratpuffer durchgeführt, wobei der pH unter Verwendung von konzentriertem H&sub2; auf 4,8 eingestellt wurde2SO4. Eine Stammlösung von 10 mg/ml Tetracyclin-HCl (70% Ethanol und filtersterilisiert) wurde hergestellt und bei -20 °C gelagert, von der 0,4 ml/100 ml des gesamten Versuchsvolumens verwendet wurden, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Eine Stammlösung von 10 mg/ml Cycloheximid (filtersterilisiert) wurde hergestellt und bei 4 °C gelagert, von der 0,3 ml/100 ml des gesamten Versuchsvolumens nur zur Kontaminationskontrolle in Verzuckerungsversuchen verwendet wurden.

2.5. Verzuckerung von Sojabohnenfraktionen

Verzuckerungsversuche wurden durch Mischen von 15 g gemahlenem Substrat mit 75 ml sterilem 0,1 M Natriumcitratpuffer zusammen mit Tetracyclin- und Cycloheximidlösungen in 250 ml Erlenmeyerkolben mit Gummistopfen durchgeführt. Der pH-Wert der Lösungen wurde mit konzentriertem H&sub2; auf 5,0 eingestellt2SO4 oder 12 M NaOH. Die Stopfen wurden mit 21-Gauge-Spritzennadeln und Whatman 0,2 . durchstochen μm Spritzenfilter. Die Enzymdosierungen pro Gramm Glucan umfassten 23,2 FPU von NS 50013, 41 CBU von NS 50010 und 500 U NS 22016. Tabelle 2 bietet eine Zusammenfassung der in der Literatur für jede Sojabohnenfraktion gefundenen Glucanspiegel, und diese wurden gemittelt, um die Enzymdosierung zu berechnen. Tabelle 3 zeigt das Enzymvolumen, das für jedes Substrat verwendet wurde. Steriles entionisiertes Wasser wurde jedem Kolben zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 150 ml zu bringen, was zu einer Feststoffbeladungsrate von 10 % führte. Verzuckerungsversuche wurden 96 h lang in einem hin- und hergehenden Schüttler von 50°C, eingestellt auf 250 U/min, durchgeführt. Flaschen, denen Enzyme fehlten, wurden als Kontrollen verwendet, um die Art und Menge der Kohlenhydrate zu bestimmen, die durch die Solubilisierung freigesetzt würden.

2.6. Gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation von Sojabohnenfraktionen

Gemahlene Substrate (15, 30, 45 oder 60 g) wurden mit 150 ml sterilem 0,1 M Natriumcitratpuffer zusammen mit einer geeigneten Menge Tetracyclinlösung in 500 ml Erlenmeyerkolben mit Gummistopfen, die mit einer 21-Gauge-Spritze durchstochen wurden, gemischt Nadeln und befestigt an Whatman 0.2 μm Spritzenfilter. Der pH wurde mit konzentrierter H&sub2; auf 5,0 eingestellt2SO4 oder 12 M NaOH. Die Substrate wurden nicht autoklaviert, um die Protein- und Kohlenhydratintegrität durch Verhinderung der Maillard-Reaktion [25] sowie die wahrscheinlichsten Parameter für industrielle Anwendungen zu bewahren. Die Enzymdosierungen pro Gramm Glucan umfassten 23,2 FPU von NS 50013, 41 CBU von NS 50010 und 500 U von NS 22016. Tabelle 2 zeigt die Menge an Substrat, Ballaststoffen und Enzymen, die bei einer Beladungsrate von 5 % für jedes Substrat verwendet wurden. Die Mengen dieser Komponenten stiegen bei den höheren Feststoffbeladungsgraden proportional an. Steriles entionisiertes Wasser wurde hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 297 ml zu bringen, und dann 3 ml einer 24-Stunden-Kultur von entweder S. cerevisiae oder S. Stipitis wurde hinzugefügt. Die Kolben wurden 96 h in einem hin- und hergehenden Schüttler von 35 °C, eingestellt auf 250 U/min, inkubiert. Kontrollkolben ohne Enzyme wurden ebenfalls eingeschlossen, um die Ethanolproduktion aus den freien Kohlenhydraten, die von den Substraten freigesetzt wurden, zu beurteilen. Diese Kontrollen wurden auf die gleiche Weise wie oben beschrieben hergestellt, außer dass die Enzymvolumina durch steriles entionisiertes Wasser ersetzt wurden.

2.7. Analytische Methoden

Proben (5–10 ml) wurden nach 0, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 und 96 h aseptisch aus den Kolben gezogen. Die Proben wurden 5 Minuten gekocht, um Enzyme zu inaktivieren, und dann 10 Minuten bei 2400 × g zentrifugiert. Nach 24 h Einfrieren bei -20 °C wurden die Proben aufgetaut, erneut 15 min bei 13.000 U/min zentrifugiert und der Überstand durch 0,2 filtriert μm Spritzenfilter in HPLC-Autosampler-Fläschchen.

Kohlenhydrate wurden unter Verwendung einer Waters 1200 HPLC mit einer Waters Sugar-pak I Säule und einem Brechungsindexdetektor analysiert. Die mobile Phase für die Sugar-pak I-Säule war 0,0001 M Calcium-EDTA, das mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min floss, wobei die Säule 65 °C hatte. Die Ethanolkonzentrationen wurden unter Verwendung einer Waters 717 HPLC mit einer Aminex HPX-87H-Säule und einem Waters 2410 Brechungsindexdetektor (RID) bestimmt. Die mobile Phase betrug 0,005 M H2SO4 Fließen mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml/min, wobei die Säule bei 65°C steht.

Am Ende der Verzuckerungs- und SSF-Versuche wurden in den Experimenten mit einer Feststoff-Beladungsrate von 10 % die Aufschlämmungen aus allen Wiederholungen eines Versuchs kombiniert und in einem 80°C-Ofen 96 h lang zur Trockne eingedampft. An den Feststoffen wurde von Olson Agricultural Analytical Laboratory Services (South Dakota State University, Brookings, SD, USA) eine Nahanalyse durchgeführt.

2.8. Datenanalyse

Verzuckerungsversuche wurden in sechsfacher Wiederholung durchgeführt, während die SSF-Versuche dreifach durchgeführt wurden. Zu den analysierten Parametern gehörten die maximale Ethanolkonzentration, die Ethanolproduktivität und Restkohlenhydrate. Der prozentuale Unterschied des Ballaststoff-, Protein- und Lipidgehalts im Vergleich zum ursprünglichen Substrat wurde unter Verwendung der unten aufgeführten Formeln berechnet. Restkohlenhydrate wurden korrigiert, indem zusätzliche Kohlenhydratergebnisse abgezogen wurden, die aus denaturierten Enzymen oder Puffer resultierten. Grafiken und Berechnungen wurden in Microsoft Excel 2007 erstellt. (i) Ethanolproduktivität (g/l/h) = (Nettomaximale Ethanolkonzentration)/Zeit. (ii) Prozentualer Unterschied der Komponente (%) = ((% der getrockneten Aufschlämmung nach dem Versuch) – (% des ursprünglichen Substrats))/% des ursprünglichen Substrats.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Verzuckerung von Sojabohnenfraktionen

Tabelle 4 zeigt die Zusammensetzung der vier Sojabohnensubstrate nach 96 h Verzuckerung. Versuche (sechs Wiederholungen) wurden mit einer Feststoffbeladungsrate von 10 % sowohl mit als auch ohne Enzyme durchgeführt. Die Gehalte an löslichen Kohlenhydraten in der verzuckerten Brühe wurden mittels HPLC für jede einzelne Replikation bestimmt. Nach der Verzuckerung wurden die Feststoffe aus den sechs Wiederholungen jeder Behandlung kombiniert, getrocknet und auf Ballaststoff-, Protein- und Lipidspiegel analysiert. Der prozentuale Unterschied der Ballaststoff-, Protein- und Lipidkonzentrationen im Vergleich zum Substrat vor der Verzuckerung wurde berechnet.

Wie erwartet führte die Anwesenheit von Enzymen zu höheren Gehalten an löslichen Kohlenhydraten für jedes der Substrate im Vergleich zu Kontrollversuchen ohne Enzyme. Dieser Unterschied war für alle Substrate außer den weißen Flocken statistisch signifikant und korrelierte auch mit der Verringerung des Fasergehalts. Ganze Bohnen enthielten aufgrund des Vorhandenseins von Lipiden und Proteinen die niedrigste Ballaststoffkonzentration. Folglich waren die löslichen Kohlenhydrate am niedrigsten und es wurde nur eine mäßige Reduzierung des Ballaststoffanteils beobachtet. Die enzymatische Verzuckerungseffizienz bei rohen Bohnen kann durch das Fehlen jeglicher Vorbehandlungswirkung, die der typische Sojaverarbeitungsvorgang bietet, verringert worden sein. Andererseits enthielten die Schalen den höchsten Ballaststoffgehalt und reagierten daher am stärksten auf enzymatische Hydrolyse, was den höchsten Kohlenhydratgehalt und die größte prozentuale Ballaststoffreduktion ergab.

Bei der Sojabohnenzerkleinerung werden die Feststoffe nach der Ölgewinnung als weiße Flocken bezeichnet. Dieses Material wird dann erhitzt, um jegliches restliche Hexan auszutreiben und bestimmte antinutritive Faktoren zu inaktivieren. Dann können den weißen Flocken geringe Mengen an Schalen zugesetzt werden, um den Proteingehalt auf . zu reduzieren

45%. Dieses Material wird dann Sojabohnenmehl genannt. Somit haben weiße Flocken und Sojabohnenmehl eine relativ ähnliche Zusammensetzung, und wir erwarteten ähnliche Ergebnisse bei der Verzuckerung. Wie in Tabelle 4 zu sehen ist, führte Sojabohnenmehl zu höheren löslichen Kohlenhydraten und einer stärkeren Wirkung der Enzymzugabe. Vielleicht war dies auf die zusätzliche Wärmebehandlung und/oder das Vorhandensein einiger Rümpfe zurückzuführen.

Es wurde nicht erwartet, dass sich die Protein- und Lipidspiegel in den Proben signifikant ändern, da nur geringe Mengen an Enzymen, Puffern und anderen Komponenten zugegeben wurden und die Gesamtfeststoffe gewonnen wurden. Die einzige erwartete signifikante Änderung war die Umwandlung von Ballaststoffen in lösliche Zucker, wie oben beschrieben. Veränderungen des relativen Proteingehalts variierten von -14 % bis +11 % und zeigten keine signifikanten Trends. Die Lipidspiegel in ganzen Bohnen stiegen von 4,5% auf 12,9%, was wiederum wahrscheinlich auf eine stärkere Solubilisierung während des Verzuckerungsprozesses zurückzuführen ist. Die Lipidspiegel in den anderen Materialien waren sehr niedrig, und daher führte eine geringe Variabilität der Werte zu großen prozentualen Änderungen.

3.2. Sojabohnensubstrat SSF

Each substrate was subjected to SSF treatment using four different concentrations of substrate (5%, 10%, 15%, or 20% solid loading rate (SLR)) as well as either S. cerevisiae oder S. stipitis. Enzyme dosages were normalized based on glucan levels and control trials lacking enzymes were also performed. Carbohydrate and ethanol titers were monitored throughout each 96 h SSF. After SSF, the replicates from the 10% solid loading rate treatments were combined and dehydrated for fiber, protein, and lipid analysis by Olson Agricultural Analytical Laboratory Services.

Figure 2 shows that the maximum ethanol titer of both yeasts increased as the SLR of soybeans was increased from 5% to 20%, as was expected. In most treatments, S. cerevisiae produced more ethanol than S. stipitis (maxima of 12.357 g/L ± 5.213 for S. cerevisiae with enzymes, 7.726 g/L ± 1.167 for S. stipitis). However, the difference was only significant in the 15% SLR trial with enzymes and the 20% SLR trial without enzymes. The presence of enzymes enhanced ethanol levels, but was only statistically significant in the 5% SLR trials. The high degree of variability in the 15% and 20% SLR trials was likely due to the high viscosity of these trials, which reduced mixing efficiency.


Maximum ethanol titer from soybeans after 96 h SSF or fermentation 1 . 1 Error bars represent one standard deviation.

Figure 3 shows the corresponding ethanol productivities for the soybean SSF or fermentation trials, which were calculated at the time of maximum ethanol concentration. As expected, ethanol productivities also increased as SLRs increased from 5% to 20%. In most comparisons, S. cerevisiae had significantly higher productivities compared to S. stipitis. Ethanol productivities were actually higher in many of the enzyme-free trials (maxima of 0.397 g/L/h ± 0.127 for S. cerevisiae and 0.134 g/L/h ± 0.107 for S. stipitis, both 15% SLR without enzymes), suggesting that enzymatic hydrolysis of the nonpretreated soybean was the rate limiting factor.


Ethanol productivity from soybeans after 96 h SSF or fermentation 1 . 1 Error bars represent one standard deviation.

Figure 4 shows the total residual carbohydrate levels after 96 h SSF or fermentation. The levels of residual carbohydrates increased as the SLR increased, reflecting an accumulation of stachyose, raffinose, or partial hydrolysis products of the oligosaccharides. This was due to the inability of either yeast to fully catabolize the oligosaccharides [26]. S. cerevisiae can hydrolyze the fructose residue from both stachyose and raffinose by use of invertase [27, 28], but cannot hydrolyze the other bonds. S. stipitis does not produce invertase and cannot catabolize either oligosaccharide. In most treatments, total residual carbohydrate levels were similar between yeasts however, at the 10% and 20% SLR trials with enzymes, S. stipitis accumulated significantly higher carbohydrate levels than S. cerevisiae. Also expected were the higher carbohydrate levels in enzyme-hydrolyzed trials compared to enzyme-free trials. The highest carbohydrate concentration was 20% SLR with enzymes and S. stipitis (18.76 g/L ± 5.501), and the lowest was 5% SLR without enzymes with S. cerevisiae (1.96 g/L ± 0.661).


Residual carbohydrates from soybeans after 96 h SSF or fermentation 1 . 1 Error bars represent one standard deviation.

Figures 5–7 show the maximum ethanol titers, ethanol productivities, and residual carbohydrate levels for SSF and fermentation trials with hulls. Since the hulls contain primarily fiber, and lower levels of oligosaccharides than the other soybean fractions, we anticipated that ethanol production would be enhanced. Figure 5 shows a statistically significant difference in ethanol production between SSF trials with versus without enzymes as well as increased ethanol production as the SLR increased (except between 15% and 20% SLR). S. cerevisiae outperformed S. stipitis at the higher SLRs, perhaps due to increased ethanol tolerance. Maximum concentrations obtained were 23.177 g/L ± 10.148 for S. cerevisiae and 14.501 g/L ± 6.748 for S. stipitis. As with the beans, the hulls were highly viscous at the higher SLRs, making proper mixing of the slurry very difficult, adding to the variability of the trials.


IHC Troubleshooting Guide

The following image provides an example of IHC staining.

Immunohistochemistry of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cancer tissue. Analysis was performed to compare Connexin 43 membrane staining in FFPE sections of human lung adenocarcinoma (right) compared to a negative control without primary antibody (left). To expose target proteins, heat-induced epitope retrieval (HIER) was performed using 10 mM sodium citrate (pH 6.0), followed by heating in a microwave for 8 to 15 minutes. After HIER, tissues were blocked in 3% H2O2 in methanol for 15 minutes at room temperature, washed with distilled H2O and PBS, and then probed overnight at 4°C in a humid environment with an Invitrogen Connexin 43 monoclonal antibody (Cat. # 13-8300), diluted 1:20 in PBS/3% (w/v) BSA. Tissues were washed extensively in PBS buffer containing 0.05% (v/v) Tween-20 (PBST). Detection was performed using an HRP-conjugated secondary antibody followed by chromogenic detection using DAB as the substrate. The sections were counterstained with hematoxylin and dehydrated with ethanol and xylene prior to mounting.

The following points are provided to help identify the cause of high background staining, which results in a poor signal-to-noise ratio. See also the additional notes sections at the bottom of this page for more information.

Cause: Endogenous enzymes

Incubate a test tissue sample with the detection substrate alone for a length of time equal to that of the antibody incubation. A strong background signal suggests interference from endogenous peroxidases or phosphatases.

  • Lösung: Quench endogenous peroxidases with 3% H2O2 in methanol or water or use a commercial kit, such as Thermo Scientific Peroxidase Suppressor.

Endogenous phosphatases can be inhibited with the endogenous alkaline phosphatase inhibitor, levamisole.

Cause: Endogenous biotin or lectins

High background can occur when endogenous biotin is not blocked prior to adding the avidin–biotin–enzyme complex.

If the ABC complex is made with avidin, the highly-glycosylated protein can bind to lectins in the tissue sample.

  • Lösung: Block endogenous lectins with 0.2 M alpha-methyl mannoside in dilution buffer. Alternatively, use streptavidin or Thermo Scientific NeutrAvidin Protein instead of avidin, because both are not glycosylated and won't bind to lectins.

Cause: Secondary antibody cross-reactivity or nonspecific binding

The secondary antibody may show a strong or moderate affinity for identical or similar epitopes on non-target antigens.

  • Lösung: If normal serum from the source species for the secondary antibody is used to block the tissue, then increase the serum concentration to as high as 10% (v/v), if necessary. If you are blocking with another reagent (BSA, nonfat dry milk), then add 2% (v/v) or more normal serum from the source species for the secondary antibody. Alternatively, reduce the concentration of the biotinylated secondary antibody.

Egg white, which contains avidin, was often used to coat slides, dilute antibodies or block tissue samples because it is a readily available and inexpensive source of carrier proteins. It is used very rarely nowadays.

  • Lösung: Avoid using egg whites to prevent egg white–based avidin from binding biotinylated secondary antibody during IHC staining. Synthetic tissue adhesives as well as avidin-free antibody diluents and blocking buffers are readily available.

Cause: Issues with the primary antibody

Nonspecific interactions between the primary antibody and non-target epitopes in the tissue sample occur regularly during incubation but at a level that does not influence background staining. A high primary antibody concentration will increase these interactions and thus increase nonspecific binding and background staining.

The primary antibody may also show a strong or moderate affinity for identical or similar epitopes on non-target antigens.

  • Lösung: Increase the blocking buffer composition and/or concentration, or use a different primary antibody.

The primary antibody diluent may contain little or no NaCl, which helps to reduce ionic interactions.

  • Lösung: Add NaCl to the blocking buffer/antibody diluent so that the final concentration is between 0.15 M and 0.6 M NaCl. The best NaCl concentration to use will have to be determined empirically.

Mehr erfahren

Produkte auswählen

See also the additional notes sections at the bottom of this page for more information.

Cause: Enzyme–substrate reactivity

Even when the tissue sample is properly prepared and labeled, the enzyme–substrate reaction must occur for the chromogenic precipitate to form. Deionized water can sometimes contain peroxidase inhibitors that can significantly impair enzyme activity. Additionally, buffers containing sodium azide should not be used in the presence of HRP. Finally the pH of the substrate buffer must be appropriate for that specific substrate.

A simple test to verify that the enzyme and substrate are reacting properly is to place a drop of the enzyme onto a piece of nitrocellulose and then immediately dip it into the prepared substrate. If the enzyme and substrate are reacting properly, a colored spot should form on the nitrocellulose.

Lösung: Change the enzyme diluent and/or prepare substrate at the proper pH and repeat the test.

Cause: Primary antibody potency

Primary antibodies generally lose affinity for the target antigen over time, either due to protein degradation or denaturation caused by long-term storage, microbial contamination, changes in pH or harsh treatments (e.g., freeze/thaw cycles).

Test the primary antibody for potency by staining tissue samples known to contain the target antigen with various concentrations of the primary antibody do the test concurrently with the test sample. If the positive control is not positive for the target antigen at all, then this suggests that the primary antibody has lost potency. In fact, it is good laboratory practice to always run a positive control sample through your staining protocol along with the experimental samples.

Lösung: Ensure that the antibody diluent pH is within the specified range for optimum antibody binding (7.0 to 8.2) and that the antibody is stored according to the manufacturer's instructions. To prevent contamination of your antibody solutions, wear gloves when dispensing antibodies, and use sterile pipette tips, if appropriate. Even if you store your antibodies in a refrigerator, always divide them into separate small aliquots. This prevents contamination or loss of the whole vial of antibody if a problem arises.

Cause: Secondary antibody inhibition

While high concentrations of the secondary antibody can increase background staining, extremely high concentrations can have the opposite effect and reduce antigen detection.

To test if the secondary antibody concentration is inhibitory, stain positive control samples using decreasing concentrations of the secondary antibody. An increase in signal as the concentration decreases suggests that antibody concentration is too high.

Lösung: Reduce the concentration of the secondary antibody.

If the diluent and/or blocking solution contains antigen-neutralizing antibodies, such as those found in serum, then the antibodies will block secondary antibody binding.

Lösung: Remove the neutralizing antibodies or change to a different diluent and/or blocking solution.


Beim Setzen Ihres Benutzer-Cookies ist ein Fehler aufgetreten

Diese Seite verwendet Cookies, um die Leistung zu verbessern. Wenn Ihr Browser keine Cookies akzeptiert, können Sie diese Seite nicht anzeigen.

Einstellung Ihres Browsers zum Akzeptieren von Cookies

Es gibt viele Gründe, warum ein Cookie nicht korrekt gesetzt werden konnte. Nachfolgend sind die häufigsten Gründe aufgeführt:

  • Sie haben Cookies in Ihrem Browser deaktiviert. Sie müssen Ihren Browser zurücksetzen, um Cookies zu akzeptieren oder Sie zu fragen, ob Sie Cookies akzeptieren möchten.
  • Ihr Browser fragt Sie, ob Sie Cookies akzeptieren möchten und Sie haben abgelehnt. Um Cookies von dieser Website zu akzeptieren, verwenden Sie die Schaltfläche Zurück und akzeptieren Sie das Cookie.
  • Ihr Browser unterstützt keine Cookies. Versuchen Sie einen anderen Browser, wenn Sie dies vermuten.
  • Das Datum auf Ihrem Computer liegt in der Vergangenheit. Wenn die Uhr Ihres Computers ein Datum vor dem 1. Januar 1970 anzeigt, vergisst der Browser das Cookie automatisch. Um dies zu beheben, stellen Sie auf Ihrem Computer die richtige Uhrzeit und das richtige Datum ein.
  • Sie haben eine Anwendung installiert, die das Setzen von Cookies überwacht oder blockiert. Sie müssen die Anwendung während der Anmeldung deaktivieren oder sich an Ihren Systemadministrator wenden.

Warum benötigt diese Website Cookies?

Diese Website verwendet Cookies, um die Leistung zu verbessern, indem sie sich daran erinnert, dass Sie eingeloggt sind, wenn Sie von Seite zu Seite wechseln. Um den Zugriff ohne Cookies zu ermöglichen, müsste die Website für jede von Ihnen besuchte Seite eine neue Sitzung erstellen, was das System auf ein inakzeptables Maß verlangsamt.

Was wird in einem Cookie gespeichert?

Diese Seite speichert im Cookie nichts anderes als eine automatisch generierte Session-ID, es werden keine weiteren Informationen erfasst.

Im Allgemeinen können in einem Cookie nur die Informationen gespeichert werden, die Sie beim Besuch einer Website angeben oder die Sie treffen. Beispielsweise kann die Site Ihren E-Mail-Namen nicht ermitteln, es sei denn, Sie geben ihn ein. Wenn Sie einer Website erlauben, ein Cookie zu erstellen, erhalten diese oder eine andere Website keinen Zugriff auf den Rest Ihres Computers, und nur die Website, die das Cookie erstellt hat, kann es lesen.


Schau das Video: DNA ISOLATION - Simple Animated Tutorial (Kann 2022).