Information

Warum wird Gel in der Elektrophorese verwendet?

Warum wird Gel in der Elektrophorese verwendet?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Was ist der Zweck des Gels bei der Analyse des Aminosäuregehalts in einem Protein durch Gelelektrophorese? Würde das Einbringen der Aminosäure in das Gel nicht verhindern, dass sich die Aminosäure in der Pufferlösung auflöst (deren pH-Wert die Protonierung und Deprotonierung der Aminosäure steuert)?


Bei der Gelelektrophorese ist das Gel der Mechanismus, durch den Makromoleküle unterschiedlicher Größe getrennt werden. Indem Sie das Gel mit Aminosäuren (oder Proteinen oder DNA) beladen, starten Sie alle Proben gleichmäßig und drücken sie dann mit einer salzigen Pufferlösung, die elektrisiert wird, durch ein Gel.

Das Gel hat eine bestimmte Konzentration eines Polymers (üblicherweise Agarose oder Polyacrylamid), das wie ein Netz wirkt, das Ihre Makromoleküle verlangsamt. Nachdem ein Gel für eine bestimmte Zeit laufen gelassen wurde, haben Moleküle unterschiedlicher Größe also unterschiedliche Entfernungen zurückgelegt. Dies kann nach weiterer Präparation mit verschiedenen Methoden (Ethidiumbromid für DNA und Antikörper für Proteine, üblicherweise) sichtbar gemacht werden.

Daher sollten die betreffenden Aminosäuren nicht in Puffer gelöst werden, da dies zu Probenverlusten führen würde.

Bearbeiten:

Zum letzten Punkt: Beim Laden von Proben auf ein Gel müssen diese zuerst in etwas Ladepuffer aufgelöst werden, damit sich die Probe in der Vertiefung absetzen und nicht ausdiffundieren kann. Ich habe Ihre Erwähnung von "Puffer" in der ursprünglichen Frage als den Laufpuffer für die Elektrophorese verstanden, in dem Sie Ihre Probe nicht auflösen sollten. Ich bin auch nicht mit der Analyse von Aminosäuren durch Elektrophorese vertraut und weiß nicht, ob es einen spezialisierten gibt Ladepuffer, den diese Art von Analyse erfordern würde. Ein kurzer Blick hat nichts ergeben, aber Sie könnten das Problem mit dem Ladepuffer besser beantworten.


Warum wird bei der Gelelektrophorese Puffer anstelle von Wasser verwendet?

Puffer in Gelelektrophorese sind Gebraucht um stromführende Ionen bereitzustellen und den pH-Wert auf einem relativ konstanten Wert zu halten. Diese Puffer enthalten viele Ionen, die für den Stromdurchgang notwendig sind.

Was sind außerdem alle Zwecke des Puffers? EIN Puffer ist eine Lösung, die einer pH-Änderung bei Zugabe einer sauren oder basischen Komponente widerstehen kann. Es ist in der Lage, kleine Mengen zugesetzter Säure oder Base zu neutralisieren, wodurch der pH-Wert der Lösung relativ stabil gehalten wird. Dies ist wichtig für Prozesse und/oder Reaktionen, die spezielle und stabile pH-Bereiche erfordern.

Was würde auch passieren, wenn Sie Wasser anstelle von TAE-Puffer verwenden?

Verwenden Sie stattdessen Wasser von Puffer für das Gel oder Laufen Puffer Agarosegele werden gegossen und laufen unter Verwendung von TAE oder FSME Puffer. wenn du tun Wasser verwenden, Ihr Gel schmilzt kurz nach dem Anlegen der Spannung zu die Elektrophorese-Einheit.

Was ist der Unterschied zwischen TAE- und FSME-Puffer?

TAE (Tris-Acetat-EDTA) Puffer wird sowohl als Lauf verwendet Puffer und in Agarosegel. DNA-Probe von TAE-Puffer ist hierfür geeignet, während DNA aus FSME-Puffer ist nicht. Borat im FSME-Puffer ist ein starker Inhibitor für viele Enzyme.


Gelelektrophorese

Gelelektrophorese ist der Prozess, bei dem wir die DNA nehmen und eine elektrische Ladung durch sie laufen lassen, daher können wir sie verwenden, um zwei DNA-Proben zu vergleichen, daher der Name DNA-Fingerabdruck.

Erläuterung:

Gelelektrophorese ist im Grunde der Prozess, bei dem wir die DNA nehmen und eine elektrische Ladung durch sie leiten. Die DNA, die standardmäßig negativ geladen ist, bewegt sich zur positiven Seite. Wenn dies geschieht, wird die DNA mit geringerer Dichte eine geringere Entfernung nach oben zurücklegen. Dies kann ein sehr einzigartiges DNA-Muster erzeugen.

Jetzt können Sie dies mit einer anderen DNA-Probe tun und sie mit den Frequenzen der bekannten Probe abgleichen. Wenn sie gleich sind, stammen sie höchstwahrscheinlich aus derselben Quelle. Das nennt man DNA-Fingerabdruck-Methode. Dies wird hauptsächlich bei der Ermittlung von Straftaten verwendet, bei denen DNA, die an Tatorten gefunden wurde, mit DNA von Verdächtigen verglichen wird.

Das Gel tut dies nicht, Sie fügen der DNA-Probe einen Farbstoff hinzu, bevor Sie sie einfüllen, und etwas Farbstoff kann unter UV-Licht gesehen werden, nachdem das Gel mit einer Chemikalie behandelt wurde, die den Farbstoff aktiviert (z. B. Ethylbromid).

Antworten:

Gelelektrophorese ist eine Biotechnik, die verwendet wird, um DNA-Fragmente und andere Makromoleküle wie RNA und Proteine ​​basierend auf ihrer Größe und Ladung zu trennen.

Erläuterung:

Die zu trennenden Moleküle werden von einem elektrischen Feld durch ein Gel mit kleinen Poren geschoben. Die Moleküle wandern mit einer umgekehrten Geschwindigkeit durch diese Poren im Gel. Dies bedeutet, dass ein kleines Molekül eine größere Strecke durch das Gel zurücklegt als ein größeres Molekül. Ein Ende des Gels ist positiv geladen und das andere Ende ist negativ geladen.

Strukturell sind DNA und RNA negativ geladene Moleküle, sodass sie zum positiv geladenen Ende des Gels gezogen werden. Im Fall von Proteinen sind sie nicht rein negativ geladen, daher werden Proteine ​​zuerst mit einem anionischen Detergens namens Natriumdodecylsulfat gemischt. Durch diese Behandlung entfalten sich die Proteine ​​in eine lineare Form und überziehen sie mit einer negativen Ladung, wodurch sie zum positiven Ende des Gels wandern und getrennt werden können.

Schritte der Gelelektrophorese:

Wenn DNA, RNA und Proteinmoleküle mittels Gelelektrophorese getrennt wurden, können Banden unterschiedlicher Größe durch UV-Strahler nachgewiesen werden.


3.1: Gelelektrophorese

  • Beigetragen von Michael Blaber
  • Professor (Biomedizinische Wissenschaften) an der Florida State University

Gelelektrophorese wird verwendet, um eine der grundlegendsten Eigenschaften – die Molekülmasse – sowohl von Polynukleotiden als auch von Polypeptiden zu charakterisieren. Gelelektrophorese kann auch verwendet werden, um zu bestimmen: (1) die Reinheit dieser Proben, (2) Heterogenität/Ausmaß des Abbaus und (3) Untereinheit Komposition.

Das gängigste Gelelektrophoresematerial für DNA-Moleküle ist Agarose und Acrylamid.

DNA-Agarose-Gele

Die elektrophoretische Migrationsrate von DNA durch Agarosegele ist abhängig von vier Hauptparameter:

1. Die Molekülgröße der DNA. Moleküle linearer Duplex-DNA wandern durch Agarosegele mit einer Geschwindigkeit, die umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts ist.

Beispiel: Vergleich der Molekülmasse mit der erwarteten Migrationsrate:

1/log (Molek. Masse)
d.h. Verwandter Mr

Abbildung 3.1.1:Relative Migrationsrate mit Molekularmasse

2. Die Agarosekonzentration. Zwischen dem Logarithmus der elektrophoretischen Mobilität und der Gelkonzentration besteht eine umgekehrt lineare Beziehung.

inv log(1/Gel %) (d. h. relativer Herr)

Abbildung 3.1.2:Relative Migrationsrate mit Gelkonzentration

3. Die Konformation der DNA.

  • geschlossene zirkuläre DNA (Form-I) - typischerweise supercoiled
  • eingekerbt kreisförmig (Form-II)
  • lineare DNA (Form-III)

Diese verschiedenen Formen der gleiche DNA wandern mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch ein Agarosegel. Fast immer die lineare Form (Form-III) wandert am langsamste Geschwindigkeit der drei Formen und supercoiled DNA (Form-I) wandert normalerweise die am schnellsten.

4. Das angewendete Stromspannung.

Trennbereich linearer DNA (in Kilobasen)

Schließlich ist die DNA ein saures Molekül, wandert in Richtung der positiv geladene Elektrode (Kathode).

Abbildung 3.1.3:Gelelektrophorese-Setup

DNA-Acrylamid-Gele

Acrylamidgele eignen sich zur Trennung von kleine DNA-Fragmente typischerweise Oligonukleotide <100 Basenpaare. Diese Gele sind normalerweise von a niedrige Acrylamidkonzentration (<=6%) und enthalten die nichtionischen Vergällungsmittel Harnstoff (6M). Das Denaturierungsmittel verhindert die Bildung von Sekundärstrukturen in Oligonukleotiden und ermöglicht eine relativ genaue Bestimmung der Molekularmasse.

Gelelektrophorese für Proteine

Die Gelelektrophorese von Proteinen verwendet fast ausschließlich Polyacrylamid. Die Acrylamidlösung enthält normalerweise zwei Komponenten: Acrylamid und Bisacrylamid. Ein typischer Wert für das Acrylamid:Bis-Verhältnis ist 19:1. Das Bisacrylamid ist im Wesentlichen a Vernetzung Bestandteil des Acrylamidpolymers. Die gesamt Die Acrylamidkonzentration im Gel beeinflusst die Migration von Proteinen durch die Matrix (wie bei der Konzentration von Agarose).

Proteingele werden normalerweise unter Denaturierungsbedingungen in Gegenwart des Reinigungsmittels Natriumdodecylsulfat (SDS). Die Proteine ​​werden durch Hitze in Gegenwart von SDS denaturiert. Das SDS bindet über hydrophobe Wechselwirkungen an die Proteine ​​in einer Menge ungefähr proportional zur Größe des Proteins. Aufgrund der geladenen Natur des SDS-Moleküls haben die Proteine ​​somit eine etwas konstantes Verhältnis von Ladung zu Masse und wandern mit einer Geschwindigkeit proportional zu ihrer Molekularmasse durch das Gel. Die Proteine ​​wandern in Richtung des Anode.

Trennbereich von Polypeptiden (in Kilodalton)

Da die SDS-Behandlung nicht-kovalente Proteinkomplexe dissoziiert, können sie daher eine viel lniedriger als erwartet molekulare Masse auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDB SEITE). Protein-PAGE-Gele werden üblicherweise zwischen zwei Glasplatten polymerisiert und verlaufen in vertikaler Richtung.


Wofür wird Gelelektrophorese verwendet?

Wofür wird Gelelektrophorese verwendet: Es ist ein Prozess, der verwendet wird, um die DNA-Stränge aus den Verunreinigungen herauszulösen. Wenn wir eine DNA-Probe von einem Organismus erhalten, enthält dieser auch Verunreinigungen, also ignorieren wir einfach all diese Verunreinigungen und ziehen unsere DNA als rein heraus.

Alle Pathologie-, Forensik- und Forschungslabore verwenden diesen Prozess exzessiv, um reine DNA aus den Proben für weitere Forschungen und Studien zu gewinnen. Diese Technik kommt immer nach der Polymerase-Kettenreaktion, die auch in Labors sehr verbreitet ist.

Da die Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird, um DNA-Kopien zu vervielfachen, und nach dieser Reaktion gibt es viele Verunreinigungen in der DNA-Probe, die wir ignorieren müssen (wie Grundierungen, Taq-Polymerase-Enzym, und Nukleotide etc ) und unsere DNA-Stränge aus ihnen herausholen, also wird dann Elektrophorese verwendet.

Gelelektrophoresematerialien:

Gelelektrophoresematerialien sind wie folgt:

  • Gel-Tanks
  • Agarose-Gel
  • Batterie
  • DNA-Proben (zu verarbeiten).
  • Mikropipette (um Proben in Wells zu transferieren)
  • Gel Kamm.
  • Stoppuhr.

Gelelektrophorese-Prozess:

Gelelektrophorese-Prozess besitzt keine Raketenwissenschaft, es ist ein einfacher Prozess, der die folgenden Schritte umfasst:

  1. Machen Sie Agarose-Gel, indem Sie Agarose-Pulver in Wasser mischen und erhitzen. Gießen Sie die Agaroselösung in den Geltank mit eingesetztem Kamm und lassen Sie ihn abkühlen. Wenn es abgekühlt ist, entfernen Sie den Kamm und Sie werden sehen, dass sich im Gel Vertiefungen bilden.
  2. Platzieren Sie Ihre DNA-Probe in den Vertiefungen, die durch Kämmen im Gel mit einer Mikropipette erzeugt wurden.
  3. Legen Sie Batteriespannung auf beiden Seiten des Geltanks an und die DNA beginnt sich aufgrund der negativen Ladung darauf zum Pluspol des Batteriepols zu bewegen.
  4. Beachten Sie nach einiger Zeit die von den DNA-Strängen im Gel zurückgelegte Strecke. Je kleiner der DNA-Strang ist, desto mehr Strecke wird er zurücklegen, während größer der DNA-Strang eine geringere Strecke zurücklegt.
  5. Trennen Sie diese DNA-Stränge und jetzt können diese für die Forschung oder jede Art von Untersuchung weiterverarbeitet werden.

Welche Ladung hat DNA?

Welche Ladung hat DNA? ist eine sehr logische Frage. Es gibt ein reines negative Ladung beim DNA & ist dies der einzige Grund, warum sich die DNA in Richtung des +ve-Endes der Batterie bewegt, wenn wir auf beiden Seiten des Geltanks Strom anlegen. Dies -ve Ladung ist auch der Grund für die Existenz der Gelelektrophoresetechnik.

Welche Arten der Elektrophorese gibt es?

Es gibt ungefähr 14 verschiedene Arten der Elektrophorese die sind wie folgt:

  • Agarose-Gelelektrophorese
  • Papierelektrophorese.
  • Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
  • Zonenelektrophorese.
  • Temperaturgradienten-Gelelektrophorese und Denaturierung von Gradienten-Gelelektrophoren (TGGE) und (DGGE).
  • Zonenelektrophorese.
  • Zymogramm-Elektrophorese.
  • Immunelektrophorese.
  • Pulsfeldelektrophorese (PFE).
  • Kapillarelektrophorese.
  • Fluorophor-unterstützte Kohlenhydrat-Elektrophorese (FACE).
  • Mikrochip-Elektrophorese.
  • Affinitätselektrophorese.

Was ist Agarose?

Was ist Agarose: Ein aus Algen gewonnenes Polysaccharid. Es ist ein lineares Polymer, das aus sich wiederholenden Einheiten der Agarobiose hergestellt wird. Agarose ist ein Teil des Agar-Inhalts, der eine isolierte Komponente aus Agar darstellt, indem der Rest der Komponenten entfernt wird. Agarose geht beim Mischen mit Wasser in Gelform über.


Gelelektrophorese: Grundlagen & Schritte

Zweck: Um DNA-Moleküle nach ihrer Größe zu trennen. Dies kann zu forensischen Zwecken erfolgen, um nach Krankheiten in bestimmten Genen oder Vaterschaftstests zu suchen.

Kurzübersicht: DNA ist negativ geladen, um sie nach Größe zu trennen, wird sie in eine Lösung gegeben, in der ein Strom fließt, der die negativ geladene DNA zum gegenüberliegenden Ende zieht.

Größere DNA-Stücke stoßen in der Lösung auf mehr Widerstand und bewegen sich daher nach der gleichen Zeit nicht so weit wie kleinere Segmente.

Sobald der elektrische Strom durchgelassen wurde, wird ein Farbstoff hinzugefügt, um die DNA-Banden (auch als Bahnen bezeichnet) zu sehen, und aufgrund ihrer Lage ist die Länge der DNA bekannt (gemessen in Basenpaare).


ERGEBNISSE

Empfohlenes Verfahren

Die Gelbox wird aus einem Kunststoff-Aufbewahrungsbehälter (14 × 20 × 5 cm, 1,6 L) hergestellt und mit Aluminiumfolienelektroden (1 × 25 cm vierlagiger Faltstreifen) im Abstand von 14 cm bestückt, mit Klebeband oder Kleber befestigt. Die Elektroden werden über Drähte mit Krokodilklemmen in Reihe an fünf 9-V-Batterien angeschlossen. Die Gele wurden in eine saubere Glasbackform (9 × 13 Zoll) gegossen, in die mit einem Wachsmalstift ein Rechteck (8,5 × 5,5 cm) gezeichnet wurde. Agar der Telefonmarke (1 g) wurde unter Verwendung eines Mikrowellenofens in 50 ml Laufpuffer (3 g L –1 Seachem Neutral pH Regulator) geschmolzen. Nach vorsichtigem Gießen des geschmolzenen Agars in das Buntstiftrechteck bis zum Füllen wurden ein Kamm aus einer Geschenkkarte aus einem Plastikgeschäft und Bindeklammern verwendet, um ungefähr 1 cm vom Ende des Gels entfernt Vertiefungen zu bilden. Nach dem Abkühlen des Gels (10–20 min) wurde der Kamm entfernt, das Gel aus der Gießschale gehoben, in die Gelbox mit den Vertiefungen nahe der Kathode gelegt und in Laufpuffer (bis 1 cm über dem Gel) eingetaucht. DNA-Proben (∼ 10 μl) wie eine Standard-Lambda-HindIII-Leiter (Fisher Scientific ∼ 1 $ pro Spur) oder genomischer Extrakt wurden 1:1 in Ladefarbstoff (ein Tropfen Maissirup mit drei Tropfen grüner Lebensmittelfarbe) mit einer Pipette gegeben. Die Elektrophorese wurde 1 bis 1,5 h lang durchgeführt, während die Wanderung der Tracking-Farbstoffe beobachtet wurde. Die Gele wurden 12 bis 72 Stunden lang ohne Schütteln bei Raumtemperatur in ein Gentianaviolettbad (10.000-fache Verdünnung) eingetaucht gefärbt. DNA-Banden wurden mit Hintergrundbeleuchtung sichtbar gemacht und zur weiteren Analyse fotografiert.

Typische Ergebnisse

Das Ergebnis einer typischen Geltrennung einer Lambda-HindIII-Leiter ist in 2 gezeigt. Beachten Sie, dass nach dem Färben diskrete Banden sichtbar sind, die jeweils ein unterschiedlich großes DNA-Fragment der Leiter darstellen. Die Schüler in unserem Klassenzimmertest waren erfolgreich bei der Visualisierung von DNA-Banden in ihren Gelen. Genomische DNA neigt dazu, diffuse Banden mit hohem Molekulargewicht zu bilden, kann aber auch mehr als eine Bande erzeugen. Diese können von unterschiedlicher Größe sein oder es können unterschiedliche Konformationen (z. B. Supercoiled) der genomischen DNA sein, die zu Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität führen. Eine längere Elektrophorese verschiebt die DNA-Banden weiter in das Gel und sorgt für eine bessere Trennung. Ein breiterer Bereich von Bandengrößen kann erhalten werden, indem zuerst genomische DNA durch wiederholtes schnelles Passieren durch eine Spritzennadel geschert wird oder indem kommerziell erhältliche Restriktionsenzyme verwendet werden.

Terminplanung und Bewertung

Je nach Klingelzeitplänen ist es möglicherweise am besten, die Schritte im Protokoll in verschiedene Blöcke zu unterteilen. In unseren Versuchen wurde der erste Block für eine Übung zum Pipettieren und für Diskussionen über das Verfahren und seine Begründung verwendet. Die Gelboxen wurden konstruiert, Gele gegossen, geladen und im zweiten Block (unter Verwendung einer Lambda-HindIII-Leiter) laufen gelassen. Später entfernte der Lehrer die Gele aus der Färbung und lagerte diese für einen dritten Block ein, in dem die Bandenmuster dokumentiert und analysiert wurden. Die Schüler erhielten ein Arbeitsblatt, das sie ausfüllen mussten, während sie auf den Abschluss von Verfahren warteten, die Fragen zur Grundlage der Elektrophorese, zur negativ geladenen Rückgrat-DNA, die eine elektrophoretische Trennung ermöglicht, und zur Bestimmung der Moleküllängen durch Analyse der Bandenmuster enthielt. Offene Fragen, schülerzentrierte Antworten, angemessene Wartezeiten und nonverbale Verhaltensweisen wurden verwendet, um einen Dialog zu führen und Ideen zu entwickeln [ 15-18 ]. Die Schüler erstellten einen Standard-Laborbericht und wurden entsprechend ihrer kontinuierlichen Interaktionen während des Unterrichts benotet. Lehrer können das Verständnis der Schüler auch durch Erweiterungsprojekte beurteilen (siehe unten).

Studentenumfragen

Die Testklasse am NEM bestand hauptsächlich aus Studenten im zweiten Jahr in fünf Gruppen zu je 4–5 Schülern. Umfragen mit einer Likert-Skala wurden von allen 21 Schülern mit entsprechender Erlaubnis der Eltern und der Schule ausgefüllt (Tabelle I). Insgesamt lagen die Punktzahlen bei 4,0 oder höher, was darauf hindeutet, dass die Schüler die Aktivität schätzten und für wertvoll hielten. Die Werte waren signifikant (P < 0,05) höher als erwartet für jede Frage (außer Q13) unter Verwendung der Chi-Quadrat-Analyse und der Erwartung einer gleichmäßigen Verteilung über die Antworten. Die Schüler sahen die Aktivität als mit ihrer Kursarbeit verbunden und als aktuell an. Die Schüler fühlten sich aktiv beteiligt, lernten etwas Wertvolles und wollten mehr wissenschaftliche Untersuchungen durchführen. Die höchsten Punktzahlen waren sich einig, dass die Aktivität Spaß gemacht und gut organisiert war. Die Studenten waren nicht enttäuscht, dass bei der Aktivität kostengünstige Materialien anstelle von Laborgeräten verwendet wurden. Obwohl die durchschnittlichen Antworten positiv waren, hatten zwei der Schüler insgesamt niedrigere Punktzahlen, die knapp unter neutral (3,0) fielen. Zusammengenommen waren diese Umfrageergebnisse deutlich höher (P < 0,01) als erwartet und legen nahe, dass die Schüler die Elektrophorese-Aktivität als erfolgreich und als wertvolle Ergänzung zu einem Einführungskurs in Biologie an der High School ansahen. Inhaltserhebungen, die zuvor nach ähnlichen elektrophoretischen Aktivitäten mit Laborgeräten an NEM und anderen WPS-Hochschulen durchgeführt wurden, zeigten einen signifikanten Anstieg des aktivitätsspezifischen Inhaltswissens [ 11 ]. Es muss darauf hingewiesen werden, dass eine einzelne Unterrichtsaktivität für sich genommen nicht erwartet wird, dass sie die Leistung bei breit angelegten naturwissenschaftlichen Prüfungen oder den Gesamtkursnoten merklich steigert.

Frage Punktzahl ± SDa a Likert-Skala: 1 = stimme überhaupt nicht zu 2 = stimme nicht zu 3 = stimme weder zu noch stimme nicht zu 4 = stimme zu 5 = stimme voll und ganz zu.
1. Die Gellabor-Sitzungen waren gut organisiert 4.3 ± 0.8
2. Die experimentellen Schritte wurden gut erklärt 4.2 ± 0.8
3. Das Gellabor regte zur aktiven Teilnahme an 4.1 ± 0.9
4. Ich war motiviert, die Ergebnisse zu sehen 4.1 ± 0.9
5. Das Experiment hat für meine Gruppe gut funktioniert 4.1 ± 0.9
6. Ich war unzufrieden, dass wir kostengünstige Materialien verwendet haben 2.1 ± 1.0
7. Das Gellabor hat mich zum kreativen Denken angeregt 3.7 ± 0.8
8. Ich hatte das Gefühl, echte Nachforschungen anzustellen 3.5 ± 1.0
9. Der Einsatz neuer Laborgeräte weckt mein Interesse an der Wissenschaft 4.0 ± 0.9
10. Das Gellabor enthielt aktuelle Informationen 4.0 ± 0.9
11. Mein Lehrer konnte meine Fragen beantworten 4.1 ± 1.1
12. Das Gellabor hat mir geholfen, wichtige Konzepte zu verstehen 3.9 ± 0.9
13. Mein Verständnis von DNA ist nach dem Gellabor besser 3.7 ± 1.1
14. Ich habe gelernt, wie man Mikropipetten benutzt 4.0 ± 1.2
15. Ich habe das Gefühl, bei dieser Aktivität etwas gelernt zu haben 4.1 ± 0.8
16. Das Gellabor war für meine Klasse relevant 4.2 ± 0.8
17. Das Gellabor war ein wertvolles Lernwerkzeug 3.9 ± 1.0
18. Die Aktivität hat mich dazu gebracht, mehr Experimente zu machen 3.9 ± 1.0
19. Das Gellabor war von hoher Qualität 4.0 ± 0.8
20. Es hat Spaß gemacht, das Gellabor zu machen 4.3 ± 0.8
  • a Likert-Skala: 1 = stimme überhaupt nicht zu 2 = stimme nicht zu 3 = stimme weder zu noch stimme nicht zu 4 = stimme zu 5 = stimme voll und ganz zu.

Grundprinzipien der Gelelektrophorese zur Trennung von Nukleinsäuren

Die Gelelektrophorese ist eine gängige Labortechnik in der Molekularbiologie zur Identifizierung, Quantifizierung und Reinigung von Nukleinsäuren. Aufgrund seiner Geschwindigkeit, Einfachheit und Vielseitigkeit wird das Verfahren weithin zur Trennung und Analyse von Nukleinsäuren verwendet. Mittels Gelelektrophorese können Nukleinsäuren im Bereich von ca. 0,1–25 kbp für die Analyse innerhalb von Minuten bis Stunden aufgetrennt und abgetrennte Nukleinsäuren mit relativ hoher Reinheit und Effizienz aus den Gelen gewonnen werden [1,2].

Die Technik beinhaltet das Anlegen eines elektrischen Feldes an Mischungen geladener Moleküle, um sie auf der Grundlage von Größe, Ladung und Struktur durch eine Gelmatrix wandern zu lassen. Die Phosphatgruppen der Ribose-Phosphat-Rückgrate von Nukleinsäuren sind bei neutralem bis basischem pH negativ geladen (Abbildung 1A). Als solches trägt jedes Nukleotid eine negative Nettoladung, was bedeutet, dass die Gesamtladung eines Nukleinsäuremoleküls proportional zur Gesamtzahl der Nukleotide oder seiner Masse ist. Mit anderen Worten, DNA- oder RNA-Moleküle tragen ein konstantes Verhältnis von Ladung zu Masse. Infolgedessen wird ihre Mobilität in der Gelelektrophorese hauptsächlich auf der Grundlage der Größe bestimmt, wenn sie eine vergleichbare Struktur aufweisen (mehr darüber, wie sich die Nukleinsäurestruktur auf die Migration auswirkt). Daher wandern Nukleinsäuren, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt werden, von der negativen Elektrode (Kathode) zur positiven Elektrode (Anode), wobei sich kürzere Fragmente schneller bewegen als längere, was zu einer Trennung nach Größe führt (Abbildung 1B).

Abbildung 1. (A) Negative Nettoladungen, die von einer Nukleinsäurekette getragen werden. (B) Trennung von Nukleinsäurefragmenten unterschiedlicher Länge in der Gelelektrophorese.

Darüber hinaus zeigen die Migrationsstrecken von Nukleinsäuren in der Gelelektrophorese im Allgemeinen eine vorhersagbare Korrelation mit ihrer Größe, was eine Berechnung der Größe von Nukleinsäuren in einer gegebenen Probe ermöglicht. Bei linearen doppelsträngigen DNA-Fragmenten ist die Wanderungsstrecke innerhalb eines bestimmten Bereichs umgekehrt proportional zum Logarithmus des Molekulargewichts (Abbildung 2A) [3]. Für eine ungefähre Größenbestimmung werden Migrationsstrecken üblicherweise mit Proben verglichen, die Moleküle bekannter Größen enthalten (Molekulargewichtsstandards, manchmal als „Leitern“ bezeichnet), die oft im Gellauf enthalten sind. Ein weithin akzeptiertes Modell der Nukleinsäuremobilität durch ein Gel ist die „voreingenommene Reptation“ – eine Migration, die auf die angelegte elektrische Kraft ausgerichtet ist und eine Schlangenbewegung beinhaltet, bei der die Vorderkante den Rest zieht (Abbildung 2B) [4,5]. Dieses Modell wurde durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht [6].

Abbildung 2. Mobilität von Nukleinsäuren in der Gelelektrophorese. (EIN) Korrelation von Größe und Migration von linearen doppelsträngigen DNA-Fragmenten. (B) Voreingenommenes Reptationsmodell.


Warum wird Gel in der Elektrophorese verwendet? - Biologie

BISC411
EXPERIMENTELLE MOLEKULARBIOLOGIE DER CELL

Prinzipien der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Leistungsstarke elektrophoretische Techniken wurden entwickelt, um Makromoleküle auf der Basis des Molekulargewichts zu trennen. Die Beweglichkeit eines Moleküls in einem elektrischen Feld ist umgekehrt proportional zur Molekülreibung, die das Ergebnis seiner Molekülgröße und -form ist, und direkt proportional zur Spannung und Ladung des Moleküls. Proteine ​​könnten in einer halbfesten Matrix elektrophoretisch streng molekulargewichtsbasiert aufgelöst werden, wenn sich bei einer eingestellten Spannung ein Weg finden ließe, diese Moleküle im gleichen Maße und mit dem gleichen Vorzeichen aufzuladen. Unter diesen Bedingungen wäre die Beweglichkeit der Moleküle einfach umgekehrt proportional zu ihrer Größe.

Genau diese Idee wird bei PAGE ausgenutzt, um Polypeptide nach ihrem Molekulargewicht zu trennen. Bei der PAGE trennen sich Proteine, die durch die Bindung des anionischen Detergens SDS (Natriumdodecylsulfat) negativ geladen wurden, innerhalb einer Matrix aus Polyacrylamidgel in einem elektrischen Feld entsprechend ihrem Molekulargewicht.
Polyacrylamid wird durch die Polymerisation des durch N,N'-Methylen-bis-acrylamid (abgekürzt BIS) vernetzten Monomermoleküls Acrylamid gebildet. Durch Ammoniumpersulfat (APS) erzeugte freie Radikale und ein als Sauerstofffänger wirkender Katalysator (-N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin [TEMED]) sind erforderlich, um die Polymerisation zu starten, da Acrylamid und BIS selbst nicht reaktiv sind oder wenn miteinander vermischt.

Der entscheidende Vorteil von Acrylamid-Gelsystemen besteht darin, dass die Anfangskonzentrationen von Acrylamid und BIS die Härte und den Vernetzungsgrad des Gels steuern. Die Härte eines Gels wiederum steuert die Reibung, die Makromoleküle erfahren, wenn sie sich in einem elektrischen Feld durch das Gel bewegen, und beeinflusst daher die Auflösung der zu trennenden Komponenten. Hartgele (12-20% Acrylamid) verzögern die Migration großer Moleküle stärker als kleine. In bestimmten Fällen sind Acrylamidgele mit hoher Konzentration so dicht, dass sie große Moleküle vom Eindringen in das Gel ausschließen, aber die Migration und Auflösung von Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht einer komplexen Mischung ermöglichen. Alternativ wandern in einem losen Gel (4-8% Acrylamid) Moleküle mit hohem Molekulargewicht viel weiter das Gel hinunter und können sich in einigen Fällen direkt aus der Matrix heraus bewegen.

SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Natriumdodecylsulfat (SDS oder Natriumlaurylsulfat) ist ein anionisches Detergens, das Proteinmoleküle denaturiert, ohne Peptidbindungen zu brechen. Es bindet stark an alle Proteine ​​und erzeugt ein sehr hohes und konstantes Ladungs-Masse-Verhältnis für alle denaturierten Proteine. Nach der Behandlung mit SDS erhalten alle Proteine ​​unabhängig von ihrer nativen Ladung eine hohe negative Ladung.

Die Denaturierung von Proteinen wird durchgeführt, indem sie in einem Puffer erhitzt werden, der ein lösliches Thiol-Reduktionsmittel (z. B. 2-Mercaptoethanol-Dithiothreitol) und SDS enthält. Mercaptoethanol reduziert alle Disulfidbindungen von Cysteinresten zu freien Sulfhydrylgruppen, und das Erhitzen in SDS unterbricht alle intra- und intermolekularen Proteinwechselwirkungen. Diese Behandlung führt zu einzelnen Polypeptidketten, die eine durch die Bindung des Detergens induzierte überschüssige negative Ladung und ein identisches Verhältnis von Ladung zu Masse tragen. Danach können die denaturierten Proteine ​​in einem gepufferten Polyacrylamidgel, das SDS und Thiolreduktionsmittel enthält, elektrophoretisch streng nach Größe aufgetrennt werden.

SDS-PAGE-Gelsysteme sind äußerst nützlich bei der Analyse und Auflösung komplexer Proteingemische. Viele Anwendungen und Modifikationen dieser Technik sind für moderne experimentelle Biologen relevant. Einige werden unten erwähnt. Sie werden eingesetzt, um die Enzymreinigung zu überwachen, die Zusammensetzung der Untereinheiten von oligomeren Proteinen zu bestimmen, die Proteinkomponenten subzellulärer Organellen und Membranen zu charakterisieren und durch Vergleich von Proteinextrakten von Wildtyp-Organismen und unterdrückbaren Mutanten spezifische Proteine ​​spezifischen Genen zuzuordnen. Außerdem ist die Mobilität von Polypeptiden in SDS-PAGE-Gelsystemen proportional zum Kehrwert des Logarithmus ihrer Molekulargewichte. Diese Eigenschaft ermöglicht es, das Molekulargewicht eines unbekannten Proteins mit einer Genauigkeit von +/- 5 % schnell, kostengünstig und reproduzierbar zu messen.

Diskontinuierliche SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Scheibengele bestehen aus zwei verschiedenen Acrylamidgelen übereinander. Das obere oder Sammelgel enthält 4-5% Acrylamid (ein sehr lockeres Gel), das bei pH 9,0 schwach gepuffert ist. Das Gel mit geringerer Auflösung (oft als Laufgel bezeichnet) enthält eine höhere Acrylamidkonzentration oder einen Acrylamidgradienten, der bei pH 9,0 stark gepuffert ist. Beide Gele können als Röhrchen in Glas- oder Kunststoffzylinder (Röhrengele) oder als dünne Platten in Glasplatten gegossen werden, eine Anordnung, die die Auflösung erheblich verbessert und es ermöglicht, viele Proteinproben auf einmal zu analysieren und zu vergleichen gleiches Gel (Plattengele). Heute konstruieren und betreiben Sie Plattengele.

Die Diskontinuität der Ionenstärke zwischen dem losen Sammelgel und dem hartlaufenden Gel führt zu einer Spannungsdiskontinuität, wenn Strom angelegt wird. Das Ziel dieser Gele besteht darin, die Auflösung von Proteinmolekülen zu maximieren, indem die Probe auf eine ultradünne Zone (1-100 nm) an der Grenze zwischen Gel und Laufgel reduziert und konzentriert wird. Die Proteinprobe wird je nach Menge und Dicke des Gels oder Röhrchens in einem Well innerhalb des Sammelgels als relativ lange Flüssigkeitssäule (0,2-0,5 cm) aufgetragen. Die Proteinprobe enthält Glycerin oder Saccharose, so dass sie mit einem Laufpuffer überschichtet werden kann. Dieser Puffer wird Laufpuffer genannt, und die Anordnung ist so, dass sich die Ober- und Unterseite des Gels im Laufpuffer befinden, um einen Kreislauf zu bilden.

Wenn Strom angelegt wird, beginnen die Proteine, durch das Stapelgel nach unten in Richtung des positiven Pols zu wandern, da sie durch das gebundene SDS negativ geladen werden. Da das Sammelgel sehr locker ist, werden Proteine ​​mit niedrigem und mittlerem Molekulargewicht nicht in ihrer Wanderung behindert und bewegen sich viel schneller als im laufenden Gel. Darüber hinaus erzeugt die geringere Ionenstärke des Stapelgels (schwacher Puffer) einen hohen elektrischen Widerstand (dh ein hohes elektrisches Feld V/cm), damit sich Proteine ​​schneller bewegen als im laufenden Gel (hohe Ionenstärke, geringerer Widerstand, daher niedrigeres elektrisches Feld, V/cm). Denken Sie daran, dass die angelegte Spannung durch die Wanderung von Ionen zu einem Stromfluss im Gel führt. Daher bedeutet eine niedrige Ionenstärke einen hohen Widerstand, da weniger Ionen vorhanden sind, um die Spannung abzuleiten, und das elektrische Feld (V/cm) erhöht wird, wodurch die stark polyanionischen Proteine ​​schnell wandern.

Die schnelle Migration von Proteinen durch das Sammelgel führt dazu, dass sie sich als sehr dünne Zone an der Grenze von Sammelgel/Laufgel ansammeln und stapeln, und vor allem, da das 4-5%ige Sammelgel die Beweglichkeit der großen Komponenten nur geringfügig beeinflusst , ist der Stapel in der Reihenfolge der Mobilität der Proteine ​​in der Mischung angeordnet. Dieser Stapeleffekt führt zu einer überlegenen Auflösung innerhalb des laufenden Gels, in das Polypeptide entsprechend ihrer Größe und Form viel langsamer eintreten und wandern.

Bei allen Gelsystemen wird der Proteinprobe ein Tracking-Farbstoff (normalerweise Bromphenolblau) beigefügt, um den Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem die Operation abgebrochen werden sollte. Bromphenolblau ist ein kleines Molekül, das sich im Wesentlichen ungehindert direkt hinter der Ionenfront nach unten zum Boden des Gels bewegt. Nur wenige Proteinmoleküle reisen diesem Tracking-Farbstoff voraus. Wenn die Farbstofffront den Boden des laufenden Gels erreicht, wird der Strom abgeschaltet, um sicherzustellen, dass Proteine ​​nicht aus dem Gel in den Puffertank elektrophoresieren.

Visualisierung der Proteine

Die Gele werden aus Röhrchen oder von den Glasplatten entfernt und mit einem Farbstoff, Coomassie Brilliant Blue, gefärbt. Coomassie Blue bindet stark an alle Proteine. Ungebundener Farbstoff wird durch ausgiebiges Waschen des Gels entfernt. Blaue Proteinbanden können danach lokalisiert und quantifiziert werden, da die Menge an gebundenem Farbstoff proportional zum Proteingehalt ist. Gefärbte Gele können getrocknet und konserviert, fotografiert oder mit einem Aufzeichnungsdensitometer gescannt werden, um die Intensität der Farbe in jeder Proteinbande zu messen. Wenn die Proteine ​​radioaktiv sind, können die Proteinbanden alternativ durch Autoradiographie nachgewiesen werden, eine Technik, die in der modernen Zell- und Molekularbiologie weit verbreitet ist. Wenn Gele als dünne Platten hergestellt werden, um die Auflösung zu maximieren, wie Sie es heute tun, werden die Acrylamidplatten von den Trägerglasplatten entfernt und auf Filterpapier getrocknet. Über die getrocknete Platte wird in einer lichtdichten Box ein Stück Röntgenfilm gelegt und festgeklemmt. Der Röntgenfilm wird durch die Radioaktivität in den Proteinbanden belichtet und nach der Entwicklung sind dunkle Flecken oder Banden auf dem Film zu sehen. Diese dunklen Banden können wiederum quantifiziert werden, da ihre Intensität proportional zur Menge der Radioaktivität und damit zum Proteingehalt ist.


Restriktionsenzyme

Ein DNA-Fingerabdruck wird erstellt, indem zuerst eine DNA-Probe mit einem Restriktionsenzym verdaut wird. Restriktionsenzyme erkennen sehr spezifische DNA-Sequenzen (wie 5’-GAATTC-3’), die normalerweise Palindrome sind. Palindrome Sequenzen ermöglichen die Erkennung derselben Sequenz auf beiden DNA-Strängen (Abbildung 5, oben). The restriction enzyme will then cut the DNA at a specific point. You can think of restriction enzymes as very specific molecular scissors. In the top DNA sequence seen in Figure 5, the restriction enzyme EcoRI recognizes the sequence GAATTC and cuts between the G and the A on both strands of DNA.

A point mutation (a change in one base in the DNA) can change the site a restriction enzyme recognizes and eliminate the restriction site (Figure 5, bottom). The restriction enzyme will not cut the DNA since its recognition site is no longer present. Alternatively, the point mutation could create a new restriction site where there was not one originally. If the restriction site is present, two short fragments will be produced. In contrast, if the restriction site is absent, one long fragment will remain intact. Other than identical twins, no two individuals will have the same DNA fingerprint. The genomes of any two non-identical individuals will contain a large number of differences in the DNA sequence that have the potential to change restriction sites.

Figure 5 In the top sequence (above the blue line), the EcoR1 restriction enzyme recognition site (GAATTC) is present, so the enzyme cuts the DNA between the G and the A on both strands of DNA. This produces two shorter segments of DNA. In the bottom sequence (below the blue line), a point mutation (red) has eliminated the recognition sequence so the enzyme does not cut the DNA. Credit: Lisa Bartee CC 4.0


How gel concentration affects relative mobility

So what happens if you want to characterize all of the proteins in a sample? . run more than one gel, of course! A gel with low density will resolve the larger polypeptides while cutting off the lighter ones, and one of higher density will reveal the smaller polypeptides, while compressing and possibly distorting the larger ones.

Here are some examples of the effect of acrylamide concentration on relative mobility. Molecular weight standards are identified by number. A typical erythrocyte membrane protein sample is also presented, with band 3 protein labeled as a reference.

Standard 1 = myosin (205,000) std. 2 = beta-galactosidase (116,000) std. 3 = phosphorylase B (92,000) std. 4 = bovine serum albumin (66,000) std. 5 = egg albumin (45,000) std. 6 = carbonic anhydrase (29,000).

On the gels from 6 to 10% there is a distinct dark doublet at the top of the membrane lane. Notice in the 12% gel the doublet is jammed together and appears as one band. One could estimate MW of band 3 from the first five gels although the best estimate comes from the 6%, which produced the greatest separation between the standards on either side of band 3. The 12% gel did not resolve bands well at all above the fourth standard (serum albumin, 66,000). Analysis should be confined to the part of the gel below 66,000 or even lower if the same sample was run on a lower density gel.

Frequently, students analyze the upper part of a high density acrylamide gel that overlaps part of a lower density gel. That practice suggests that the student missed the point of the anaysis and/or did not understand the limitations of the method. Interpret only that part of the denser gel that doesn't overlap the other one. To put it another way, use high density gels to study proteins (or parts of proteins) of relatively low molecular weight, and lower density gels to resolve proteins of higher molecular weight.

Don't forget that different polypeptides can have similar or even identical molecular masses. One band on a gel can therefore consist of one or more polypeptides. This is most likely to happen toward the top of a gel, and especially in higher density gels.


Schau das Video: Metoder - Gelelektroforese. Biotech Academy (Juni 2022).