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Wie unterscheidet sich das Molekulargewicht der Untereinheit vom nativen Molekulargewicht?

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Mir ist aufgefallen, dass sich das native Molekulargewicht eines Enzyms vom Molekulargewicht seiner Untereinheit unterscheidet. Warum sind sie anders? Sind die Gene, die zur Expression des Enzyms benötigt werden, im nativen Organismus und im heterologen Expressionssystem nicht die gleichen?

Beeinflusst das heterologe Expressionssystem zufällig das Molekulargewicht des Enzymendprodukts? Wenn das so ist, wie?


Ihre Frage wird in der Veröffentlichung beantwortet, das Protein existiert wahrscheinlich in vivo als Homodimer und eine Denaturierung (wie mit SDS PAGE -> Western Blot durchgeführt) trennt die Dimere in Monomere:

„Um die Quartärstruktur zu bestimmen, wurde eine Größenausschluss-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems der Agilent 1100-Serie mit einer Bio-Sil SEC-250-Säule (300 x 7,8 mm) und einer mobilen Phase von 0,1 M Na2PO4 . durchgeführt , 0,15 M NaCl und 0,01 M NaN3, pH 6,8. Ein Bio-Rad-Standard wurde verwendet, um die Retentionszeit der Säule in Bezug auf die Molmasse zu standardisieren (ergänzende Daten).Alle Experimente wurden zweimal mit < 0,05 min Abweichung in der Retention wiederholt Das Molekulargewicht von XR wurde aus seiner Retentionszeit zu 53 kDa berechnet. Die Monomerisierung konnte in Gegenwart von 15 % SDS induziert werden, wodurch XR als einzelner Peak eluiert wurde, mit einer Retentionszeit, die einer Molekulargewicht von . entspricht 34 kDa Die Daten legen nahe, dass der native XR ein nichtkovalent verknüpftes Dimer ist. Der signifikante Unterschied zwischen dem berechneten Molekulargewicht des Dimers und seinem scheinbaren Molekulargewicht ist bei XRs anderer Spezies nicht ungewöhnlich (7, 21, 33), die ebenfalls typischerweise als Dimere vorliegen. Um sich jedoch der Proteingröße zu vergewissern, wurde N. crassa XR einer Massenanalyse durch Elektrospray-Ionisation-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie unterzogen. Der Peak mit der höchsten Häufigkeit hatte einen Wert von 38.381 m/z, was genau der vorhergesagten Molekülmasse für den His6-markierten XR mit entferntem N-terminalen fMet entsprach (ergänzende Daten). Darüber hinaus entspricht ein 2M+-Peak mit einer Häufigkeit von etwa 20 % bei 76.759 m/z gut der vorhergesagten Masse der dimeren Form des Enzyms (76.762 Da).


Western Blotting: Warum unterscheiden sich beobachtete und berechnete Molekulargewichte?

Western Blotting ist eine weit verbreitete Labormethode zum Nachweis spezifischer Proteinmoleküle in einem Gewebehomogenat oder Zelllysat. Typischerweise umfasst es die Trennung von Proteinen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die Übertragung auf einen festen Träger [Polyvinylidendifluorid (PVDF) oder Nitrozellulosemembran] und den Nachweis des interessierenden Proteins unter Verwendung von Antikörpern. Die Größe des Proteins kann durch Trennung durch Elektrophorese bestimmt werden – kleinere Proteine ​​wandern schneller als ihre größeren Gegenstücke. Die Proteingröße wird dann aus Molekulargewichtsstandards geschätzt und wird als das "beobachtete Molekulargewicht" bezeichnet.

Das berechnete (oder vorhergesagte) Molekulargewicht eines Proteins wird durch Addieren der tatsächlichen Molekulargewichte einzelner Aminosäuren in einem gegebenen Protein bestimmt. Das berechnete Molekulargewicht weicht gelegentlich von dem beim Western Blot beobachteten ab. Mehrere Faktoren können zum Unterschied zwischen beobachteten und berechneten Molekulargewichten beitragen.


Pyruvatkinase aus Hefe. Natives und Untereinheits-Molekulargewicht

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Romling, U. &. Galperin, M.Y. Bakterielle Zellulosebiosynthese: Vielfalt der Operons, Untereinheiten, Produkte und Funktionen. Trends Mikrobiol. 23, 545–557 (2015).

Hollenbeck, E.C. et al. Phosphoethanolamin-Cellulose verbessert die Curli-vermittelte Adhäsion von uropathogenen Escherichia coli zu den Epithelzellen der Blase. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 115, 10106–10111 (2018).

Thongsomboon, W. et al. Phosphoethanolamin-Cellulose: eine natürlich hergestellte chemisch modifizierte Cellulose. Wissenschaft 359, 334–338 (2018).

Anderson, A.C., Burnett, A.J.N., Hiscock, L., Maly, K.E. & Weadge, J.T. The Escherichia coli Cellulosesynthase-Untereinheit G (BcsG) ist eine Zn 2+ -abhängige Phosphoethanolamin-Transferase. J. Biol. Chem.-Nr. 295, 6225–6235 (2020).

Keegstra, K. Pflanzenzellwände. Pflanzenphysiologie. 154, 483–486 (2010).

Mélida, H., Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. & Bulone, V. Analysen extrazellulärer Kohlenhydrate in Oomyceten enthüllen die Existenz von drei verschiedenen Zellwandtypen. Eukaryont. Zelle 12, 194–203 (2013).

McCrate, O.A., Zhou, X., Reichhardt, C. & Cegelski, L. Summe der Teile: Zusammensetzung und Architektur der bakteriellen extrazellulären Matrix. J.Mol. Biol. 425, 4286–4294 (2013).

Stewart, P. & Costerton, J. Antibiotikaresistenz von Bakterien in Biofilmen. Lanzette 358, 135–138 (2001).

Snarr, B. D. et al. Mikrobielle Glykosidhydrolasen als Antibiofilmmittel mit länderübergreifender Aktivität. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 114, 7124–7129 (2017).

Iguchi, M., Yamanaka, S. & Budhiono, A. Bakterielle Zellulose ein Meisterwerk der Kunst der Natur. J. Mater. Wissenschaft 35, 261–270 (2000).

Morgan, J., Strumillo, J. & Zimmer, J. Kristallographische Momentaufnahme der Cellulosesynthese und Membrantranslokation. Natur 493, 181–186 (2013).

McNamara, J.T., Morgan, J.L.W. & Zimmer, J. Eine molekulare Beschreibung der Zellulosebiosynthese. Annu. Rev. Biochem. 84, 17.11–17.27 (2015).

Morgan, J. L. W., McNamara, J. T. & Zimmer, J. Mechanismus der Aktivierung der bakteriellen Cellulosesynthase durch cyclisches di-GMP. Nat. Struktur. Mol.-Nr. Biol. 21, 489–496 (2014).

Nojima, S. et al. Kristallstruktur der flexiblen Tandem-Repeat-Domäne der bakteriellen Cellulosesynthese-Untereinheit C. Wissenschaft Repräsentant 7, 13018 (2017).

Acheson, J. F., Derewenda, Z. S. & Zimmer, J. Architecture of the Cellulosesynthase Exterior Membran Channel and its Assoziation mit der periplasmatischen TPR-Domäne. Struktur 27, 1855–1861.e3 (2019).

Mazur, O. & Zimmer, J. Apo- und Cellopentaose-gebundene Strukturen der bakteriellen Cellulosesynthase-Untereinheit BcsZ. J. Biol. Chem.-Nr. 286, 17601–17606 (2011).

Yasutake, Y. et al. Strukturelle Charakterisierung der Acetobacter xylinum Endo-β-1,4-Glucanase CMCax, die für die Zellulosebiosynthese erforderlich ist. Proteine 64, 1069–1077 (2006).

Zouhir, S., Abidi, W., Caleechurn, M. & Krasteva, P.V. Struktur und Multitasking des c-di-GMP-sensing Cellulosesekretionsregulators BcsE. Mbio 11, e01303–20 (2020).

Fang, X. et al. GIL, eine neue c-di-GMP-bindende Proteindomäne, die an der Regulierung der Zellulosesynthese in Enterobakterien beteiligt ist. Mol.-Nr. Mikrobiol. 93, 439–452 (2014).

Le Quéré, B. &. Ghigo, J.-M. BcsQ ist ein wesentlicher Bestandteil der Escherichia coli Zellulosebiosyntheseapparat, der sich am Bakterienzellpol befindet. Mol.-Nr. Mikrobiol. 72, 724–740 (2009).

Sun, L. et al. Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der BcsG-Untereinheit der Cellulosesynthase in Ssalmonella typhimurium. J.Mol. Biol. 430, 3170–3189 (2018).

Krasteva, P.V. et al. Einblicke in die Struktur und den Aufbau eines bakteriellen Zellulose-Sekretionssystems. Nat. Komm. 8, 2065 (2017).

Thongsomboon, W., Werby, S. H. & Cegelski, L. Bewertung der Phosphoethanolamin-Celluloseproduktion unter bakteriellen Gemeinschaften unter Verwendung von Kongorot-Fluoreszenz. J. Bakteriol. 202, e00030-20 (2020).

Omadjela, O. et al. BcsA und BcsB bilden den katalytisch aktiven Kern der bakteriellen Cellulosesynthase, die für die in vitro-Cellulosesynthese ausreichend ist. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 110, 17856–17861 (2013).

Du, J., Vepachedu, V., Cho, S.H., Kumar, M. & Nixon, B.T. Structure of the Cellulosesynthase Complex of Gluconacetobacter hansenii bei 23,4 Å Auflösung. Plus eins 11, e0155886 (2016).

Clairfeuille, T. et al. Struktur des essentiellen Lipopolysaccharid-PbgA-Komplexes der inneren Membran. Natur 584, 479–483 (2020).

Fan, J., Petersen, E.M., Hinds, T.R., Zheng, N. & Miller, S.I. Mbio 11, e03277–19 (2020).

Anandan, A. et al. Die Struktur einer Lipid-A-Phosphoethanolamin-Transferase legt nahe, wie Konformationsänderungen die Substratbindung steuern. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 114, 2218–2223 (2017).

Ghosal, D., Trambaiolo, D., Amos, L.A. &. Lowe, J. MinCD-Zellteilungsproteine ​​bilden alternierende copolymere zytomotorische Filamente. Nat. Komm. 5, 5341 (2014).

Lackner, L.L., Raskin, D.M. & de Boer, P.A. ATP-abhängige Interaktionen zwischen Escherichia coli Min-Proteine ​​und die Phospholipidmembran in vitro. J. Bakteriol. 185, 735–749 (2003).

Nixon, B.T. et al. Vergleichende Struktur- und Computeranalysen unterstützen achtzehn Cellulosesynthasen im pflanzlichen Cellulosesynthesekomplex. Wissenschaft Repräsentant 6, 28696 (2016).

Ross, P. et al. Regulierung der Cellulosesynthese in Acetobacter xylinum durch cyclische Diguanylsäure. Natur 325, 279–281 (1987).

Spiers, A. J., Bohannon, J., Gehrig, S. M. & Rainey, P. B. Biofilmbildung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche durch die Pseudomonas fluorescens Der Faltenstreuer SBW25 erfordert eine acetylierte Form von Zellulose.Mol.-Nr. Mikrobiol. 50, 15–27 (2003).

Marmont, L.S.et al. Oligomeres Lipoprotein PelC leitet den Export von Pel-Polysacchariden durch die äußere Membran von Pseudomonas aeruginosa. Proz. Natl Acad. Wissenschaft Vereinigte Staaten von Amerika 114, 2892–2897 (2017).

Low, K. E. & Howell, P. L. Gram-negative Synthase-abhängige Exopolysaccharid-Biosynthesemaschinen. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 53, 32–44 (2018).

Das PYMOL Molecular Graphics System v.2.0 (Schroedinger, LLC, 2021)

Pettersen, E.F. et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Computer. Chem.-Nr. 25, 1605–1612 (2004).

Edgar, R. C. MUSCLE: Ausrichtung mehrerer Sequenzen mit hoher Genauigkeit und hohem Durchsatz. Nukleinsäuren Res. 32, 1792–1797 (2004).

Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M. & Barton, G. J. Jalview Version 2 – ein multipler Sequenz-Alignment-Editor und eine Analyse-Workbench. Bioinform. 25, 1189–1191 (2009).

Drozdetskiy, A., Cole, C., Procter, J. & Barton, G.J. JPred4: ein Server zur Vorhersage der Sekundärstruktur von Proteinen. Nukleinsäuren Res. 43, W389–W394 (2015).


ERGEBNISSE

Die mitochondriale Funktion wird durch die Fusion des Bio-Tags mit dem Carboxy-Terminus nicht beeinflusst

Es wurden zwei Versionen des Cbp1-Bio-Proteins hergestellt: Die erste Fusion, Bio1, enthält die Tetrapeptid-Erkennungsstelle für die Faktor-Xa-Protease (Nagai und Thogersen, 1984) zwischen Cbp1 und dem Bio-Tag, während der zweiten Version, Bio2, der Faktor . fehlt Xa-Site. Die Fusionen wurden in die CBP1 Chromosomenortung durch Genersatz (siehe MATERIAL UND METHODEN). Stämme, die die markierten Cbp1-Proteine ​​enthielten, wuchsen auf dem Glycerin-enthaltenden Medium YEPG mit ähnlichen Geschwindigkeiten wie der ungetaggte Wildtyp-Stamm S150, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Funktion in diesen Stämmen nicht beeinträchtigt war (unsere unveröffentlichten Daten).

Extraktion und Löslichkeit von Cbp1

Um die intramitochondriale Lokalisation von Cbp1 zu bestimmen, wurden Mitochondrien aus dem Bio1-Stamm durch osmotischen Schock und Beschallung zerstört und die lösliche Matrixfraktion wurde durch Ultrazentrifugation von der unlöslichen Membranfraktion getrennt. Proteine ​​sowohl im löslichen Überstand als auch im unlöslichen Pellet wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert. Unter Verwendung von Standard-Beschallungspuffer, der 1 M KCl enthielt, befand sich Cbp1 in der unlöslichen Membranfraktion. Wenn jedoch KCl aus dem Beschallungspuffer weggelassen wurde, befanden sich >90% von Cbp1 in der löslichen Matrixfraktion ( 1A ). Die Löslichkeit von Cbp1 war umgekehrt proportional zur Salzkonzentration im Beschallungspuffer, was auf hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Cbp1-Monomeren oder zwischen Cbp1 und anderen Proteinen hindeutet.

Abbildung 1. Extraktion und Löslichkeit von Cbp1. (A) Wirkung von Salz auf die Extraktion von Cbp1 aus Mitochondrien. Mitochondrien, die aus dem Cbp1-Bio1-Stamm isoliert wurden, wurden durch Beschallung in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von KCl zerstört. Lösliche Proteine ​​(S) wurden durch Ultrazentrifugation von unlöslichen Proteinen (P) getrennt (siehe MATERIALIEN UND METHODEN). Alle Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western Blot unter Verwendung von HRP-gekoppeltem Neutravidin analysiert. Die Banden entsprechen dem Cbp1-Bio1-Protein. (B) Wirkung der Beschallung in Abwesenheit von Salz auf lösliche und Membranproteine. Mitochondrien wurden in Puffer ohne Salz aufgebrochen und wie in A beschrieben zentrifugiert. Western-Blots wurden mit Neutravidin zum Nachweis von Cbp1-Bio, mit Antiserum gegen Mdh1, mitochondrialer Malatdehydrogenase und mit monoklonalen Antikörpern gegen Cox2 sondiert. (C) Wirkung der alkalischen Karbonatextraktion auf Cbp1. Mitochondrien wurden mit 100 mM Natriumcarbonat für 30 min auf Eis behandelt und lösliche Proteine ​​wurden durch Ultrazentrifugation von unlöslichen Membranproteinen getrennt (siehe MATERIALIEN UND METHODEN). Western-Blots wurden mit Neutravidin sondiert, um Cbp1-Bio nachzuweisen, mit Antiserum gegen Mss51, einem peripheren Membranprotein, und mit monoklonalen Antikörpern gegen Cox2, einem integralen Membranprotein.

Um zu untersuchen, wie das lösliche Enzym Malatdehydrogenase, Mdh1 (Thompson und McAlister-Henn, 1989) und die integrale Membranprotein-Cytochromoxidase-Untereinheit II, Cox2 (Tsukihara et al., 1996), aufgeteilt, wenn Mitochondrien in Abwesenheit von Salz beschallt wurden, wurden Western-Blots mit Antiserum gegen Mdh1 oder mit monoklonalen Antikörpern gegen Cox2 ( 1B ) umgesetzt. Wie erwartet befand sich Mdh1 hauptsächlich in der löslichen Fraktion und Cox2 hauptsächlich in der Membranpelletfraktion.

Dass Cbp1 durch einen salzfreien Beschallungsschritt solubilisiert werden kann, legt nahe, dass das Protein peripher mit der Membran assoziiert ist. Eine traditionelle Methode zur Extraktion extrinsischer Membranproteine ​​ist die Behandlung mitochondrialer Membranen mit Alkalicarbonat. Nach der Behandlung mit Natriumcarbonat verblieb Cbp1 in der unlöslichen Pelletfraktion, während das extrinsische Membranprotein Mss51 (Decoster et al., 1990 Siep et al., 2000) wurde in der löslichen Fraktion gefunden (Abbildung 1C). Das integrale Membranprotein Cox2 verblieb wie erwartet in der Pelletfraktion. Ähnlich den Ergebnissen mit KCl (Abbildung 1A) verstärkte die Carbonatbehandlung, die ionische Wechselwirkungen unterbricht, die Assoziation zwischen Cbp1 und der Membran, was darauf hindeutet, dass diese Assoziation hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen erfolgt.

Solubilisierte Cbp1-Aggregate in Salz

Um die Wirkung von Salz auf die Aggregation von Cbp1 nach der Beschallung zu untersuchen, wurde die Cbp1-haltige lösliche Fraktion, die durch Beschallung ohne Salz erhalten wurde, auf drei Arten aufgespalten und die Aliquots wurden mit keinem Salz oder 150 mM oder 1 M KCl für 1 Stunde auf Eis behandelt . Die Proben wurden dann zentrifugiert, um alle aggregierten Proteine ​​zu pelletieren. In den salzbehandelten Proben pelletierte Cbp1 mit der unlöslichen Fraktion (Abbildung 2A). Im Kontrollexperiment, bei dem Wasser anstelle von KCl zugegeben wurde, verblieb Cbp1 im löslichen Überstand. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass solubilisiertes Cbp1 und/oder assoziierte Proteine ​​einen hydrophoben Patch aufweisen, der bei Zugabe von Salz eine Aggregation der Proteine ​​verursacht.

Figur 2. Löslichkeit nach Beschallung und Membranassoziation in Gegenwart von Salz. (A) Löslichkeit von Cbp1, wenn Salz nach der Beschallung hinzugefügt wird. Mitochondrien wurden in Puffer ohne KCl beschallt (S, P). Nach Beschallung und Ultrazentrifugation wurden Aliquots der löslichen Fraktion (S) für 1 h auf Eis entweder mit H&sub2;2O oder die angegebenen Konzentrationen von KCl. Die Proben wurden dann ultrazentrifugiert und sowohl die löslichen Überstände (S) als auch die unlöslichen Pellets (P) wurden durch SDS-PAGE und Western Blot unter Verwendung von HRP-gekoppeltem Neutravidin analysiert. (B) Saccharosegradientenanalyse von Cbp1 in der Pelletfraktion nach Beschallung in salzhaltigem Puffer. Mitochondrien wurden in Puffer mit 1 M KCl beschallt, zentrifugiert und die Pelletfraktion wurde resuspendiert und auf einen 40–70% Saccharosegradienten geladen. Die Fraktionen 1–14 wurden gesammelt und durch Western-Blot analysiert. Der Blot wurde zuerst mit Neutravidin-HRP sondiert, um Cbp1-Bio1 nachzuweisen. Der Blot wurde erneut mit Anti-Mss51-Antiserum sondiert, das das mitochondriale Membranprotein Mss51 (Siep et al., 2000) und Cox2-Antikörper, die das integrale Membranprotein Cox2 (Molecular Probes) nachweisen. Cbp1-Bio1, Mss51 und Cox2 wurden am stärksten in den Fraktionen 8, 9 und 10 nachgewiesen.

Cbp1 ist mit Membranen assoziiert, wenn Mitochondrien in salzhaltigem Puffer beschallt werden

Cbp1 ist löslich, wenn Mitochondrien in Abwesenheit von Salz beschallt werden, aber die solubilisierte Form aggregiert, wenn Salz hinzugefügt wird. Dies führte uns zu der Frage, ob das Cbp1-Protein, das nach Beschallung in Gegenwart von Salz in der Pelletfraktion gefunden wurde, mit den Membranen oder mit einer unlöslichen Masse assoziiert ist. Um diesen Punkt zu untersuchen, wurde die mitochondriale Pelletfraktion, die nach der Beschallung in Puffer mit 1 M KCl erhalten wurde, resuspendiert, dialysiert und auf einen 40–70% kontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet. Nach der Zentrifugation wurden die Gradientenfraktionen durch SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Cbp1-Bio band an einer Position innerhalb des Gradienten, die typisch für mitochondriale Membranen ist, und Mss51 und Cox2 wurden in den gleichen Fraktionen nachgewiesen, die Cbp1-Bio enthielten (Abbildung 2B). In den schwereren Saccharosefraktionen am Boden des Röhrchens wären Proteinaggregate zu erwarten (Ackerman und Tzagoloff, 1990). Wenn Mitochondrien in Gegenwart von KCl beschallt werden, befindet sich Cbp1-Bio daher aufgrund seiner Anheftung an Mitochondrienmembranen in der Pelletfraktion.

Cbp1 eluiert aus einer Größenausschlusssäule im 900.000-Da-Bereich

Um den löslichen mitochondrialen salzfreien Extrakt zu analysieren, wurde der Schallüberstand auf einer Sephacryl S300-Säule fraktioniert. Der abgeleitete Ve/Vo-Wert von Cbp1 wurde mit Ve/Vo mehrerer Markerproteine ​​verglichen, die zur Kalibrierung der Säule verwendet wurden. Der Peak von Cbp1 bei Fraktion 46 entsprach einem Molekulargewicht von ~900 kDa (Abbildung 3, A und B). Das hohe Molekulargewicht der Cbp1 enthaltenden Gelfiltrationsfraktionen deutet darauf hin, dass Cbp1 mit anderen mitochondrialen Proteinen assoziiert. Um zu untersuchen, ob Cbp1 Teil eines oder mehrerer Komplexe ist, wurde die lösliche Fraktion, die durch salzlose Beschallung von Mitochondrien erhalten wurde, durch blaue native Gelelektrophorese analysiert, die Proteinkomplexe nach Größe und Ladungsverteilung auf ihren Oberflächen trennt (Schägger und von Jagow , 1991 Schägger et al., 1994). Eine Immunblot-Analyse der ersten, nativen Dimension zeigte, dass Cbp1 in einer hochmolekularen Bande nachgewiesen wird (Abbildung 4). Der Isocitrat-Dehydrogenase-Komplex mit einem nativen Molekulargewicht von 320 kDa wanderte schneller als der Cbp1-Komplex (Abbildung 4). Bei Zugabe des nichtionischen Detergens Laurylmaltosid bis zu einer Endkonzentration von 1% reagierte das HRP-gekoppelte Neutravidin zusätzlich zur 900-kDa-Bande mit mehreren kleineren Molekulargewichtsbanden zwischen 66 und 140 kDa, was darauf hindeutet, dass der Cbp1-enthaltende Komplex bescheiden ist empfindlich gegen Waschmittelbehandlung.

Figur 3. Gelfiltrationsanalyse von Cbp1-Bio1. (A) Feinkartierung des Peak-Elutionsvolumens von Cbp1-haltigen Fraktionen. Die Gelfiltrationsfraktionen 43–56 (entsprechend dem Volumen in Millilitern, Ve) aus dem Stamm Cbp1-Bio1 wurden einer Elektrophorese unterzogen, geblottet und auf das Vorhandensein von Cbp1-Bio1-Protein mit HRP-gekoppeltem Neutravidin sondiert. (B) Berechnung des Molekulargewichts des Cbp1-Bio1-enthaltenden Komplexes. Die Grafik zeigt den Logarithmus der Molekulargewichte (y-Achse) gegen Ve/Vo der zur Kalibrierung der Säule verwendeten Markerproteine ​​(x-Achse). Rechts sind Namen und Molekulargewichte der zur Kalibrierung verwendeten Proteine ​​angegeben. Die Position des Peaks Ve/Vo des Cbp1-Bio1-haltigen Komplexes ist durch einen Pfeil und eine gestrichelte Linie gekennzeichnet.

Figur 4. Blaue native PAGE-Analyse von Cbp1-Bio1. Lösliche mitochondriale Proteine ​​aus dem Cbp1-Bio1-Stamm wurden einer blauen nativen Gelelektrophorese unterzogen. Eine Spur des Gels wurde mit Coomassie Brilliant Blue R250 nachgefärbt, um die Proteinkomplexe sichtbar zu machen (links). Die anderen Spuren, die parallele Proben enthielten, wurden geblottet und mit einem gegen Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) gerichteten Antikörper oder mit Neutravidin-HRP zum Nachweis von Cbp1-Bio1 sondiert. Laurylmaltosid wurde einer Probe des Proteinextrakts bis zu einer Endkonzentration von 1% vor der Elektrophorese (+ Detergens) zugesetzt.

Reinigung von Cbp1-Bio1 durch Affinitätschromatographie und Faktor-Xa-Protease-Elution

Cbp1-Bio1 wurde durch Adsorption des löslichen Extrakts an Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen gereinigt. Die Kügelchen adsorbieren viele verschiedene Proteine ​​sowohl aus dem Wildtyp- als auch aus den Cbp1-Bio1-Extrakten (Fig. 5A, gebundene Fraktion). Die Proteinmuster waren bis auf eine kleine Anzahl schwach silbergefärbter Banden identisch, die nur im Cbp1-Bio1-Extrakt nachgewiesen wurden. Einer davon hatte eine für Cbp1-Bio1 erwartete Größe. In einem Western-Blot eines doppelten Gels reagierte diese Bande mit Neutravidin, was bestätigt, dass es sich um Cbp1-Bio1 handelt. Das gesamte Cbp1-Bio1-Protein in der löslichen Fraktion band an die Kügelchen. Zwei andere Proteine ​​von 120 und 45 kDa, die entweder biotinyliert sind oder ein Proteinmotiv mit Affinität für Streptavidin aufweisen, wurden ebenfalls an die Affinitätsmatrix adsorbiert (Fig. 5B, gebundene Fraktion).

Abbildung 5. Reinigung von Cbp1-Bio1 auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. (A) Visualisierung von Proteinmustern durch Färbung. Lösliche mitochondriale Proteine ​​von entweder dem unmarkierten Stamm (WT) oder dem Cbp1-Bio1-Stamm (-Bio) wurden an Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen adsorbieren gelassen. Proteine, die adsorbierten, wurden durch Verwendung eines Magneten von denen getrennt, die dies nicht taten. Die Kügelchen wurden gewaschen und dann in Gelladepuffer gekocht. Gebundene und ungebundene Fraktionen wurden auf einem 7,5% denaturierenden Acrylamidgel getrennt. Proben, die die ursprüngliche lösliche Fraktion (lösliche Fraktion) enthielten, oder Proteine, die nicht an die Kügelchen absorbierten (ungebundene Fraktion), wurden mit Coomassie Blue gefärbt. Proben des an den Streptavidinkügelchen haftenden Materials (gebundene Fraktion) wurden mit Silbernitrat gefärbt. (B) Western-Blot-Analyse. Ein doppeltes Gel zu dem in A gezeigten wurde durch Western-Blot mit HRP-gekoppeltem Neutravidin analysiert.

Cbp1-Bio1 wurde von den Kügelchen durch Behandlung mit Faktor Xa-Protease eluiert. Als Kontrolle wurde ein Cbp1-Bio2 enthaltender Extrakt, dem die Faktor Xa-Stelle fehlt, an Neutravidin-Kügelchen adsorbiert und mit Faktor Xa behandelt. Western-Blot- und SDS-PAGE-Analyse zeigten, dass Cbp1-Bio2 nach Proteaseverdau an die Kügelchen gebunden blieb, während Cbp1-Bio1 durch Behandlung mit Protease effizient von den Kügelchen freigesetzt wurde ( 6A ). Ein mit Silber gefärbtes Doppelgel zeigte mindestens 10 Proteinbanden, die in der Faktor Xa-eluierten Fraktion der Cbp1-Bio1-adsorbierten Perlen vorhanden waren, aber in den Cbp1-Bio2- und nicht markierten Wildtyp-Xa-eluierten Fraktionen fehlten (Abbildung 6B). Die für die Protease-behandelten Probe einzigartigen Proteine ​​hatten geschätzte relative Molekulargewichte von 110, 85 und 68 kDa, und einige lagen im Bereich von 40 bis 50 kDa. Das 68-kDa-Protein hat die richtige Größe, um Cbp1 zu sein.

Abbildung 6. Elution von Cbp1-Bio1 aus den Streptavidin-Kügelchen mit Faktor Xa-Protease. (A) Western-Blot-Analyse von eluierten Proteinen. Die Streptavidin-gebundenen Fraktionen der mitochondrialen Extrakte aus WT, Cbp1-Bio1 und Cbp1-Bio2 wurden mit Faktor-Xa-Protease behandelt. Die auf den Streptavidin-Kügelchen verbliebenen Proteine ​​wurden unter denaturierenden Bedingungen eluiert. Die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE und Western Blot unter Verwendung von HRP-gekoppeltem Neutravidin analysiert. (B) Silberfärbungsanalyse von eluierten Proteinen. Das silbergefärbte Gel zeigt die Proteinzusammensetzung der Eluatfraktionen, die die Proteine ​​enthalten, die mit Faktor Xa-Protease von den Beads abgespalten wurden, die Fraktionen, die an die Beads gebunden blieben, und als Kontrolle die ohne Zugabe der Protease erhaltenen Eluate. Proteinbanden, die für das Eluat des Cbp1-Bio1-Stammes einzigartig sind, sind durch Sternchen gekennzeichnet.

MALDI-Analyse identifiziert eines der Proteine ​​als Pet309

Die drei Proteine ​​mit dem höchsten Molekulargewicht, die einzigartig für das Cbp1-Bio1 + Xa-Eluat von Fig. 6B (110, 85 und 68 kDa) sind, konnten aus eindimensionalen Gelen ausgeschnitten werden, ohne das Risiko, kontaminierende Banden einzuschließen. Diese drei Banden wurden von den Gelen gesammelt und für die MALDI-Analyse vorbereitet, wie in MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben. Nur für die 110-kDa-Bande wurde eine ausreichende Anzahl von Peptidpeaks erhalten, um eine allgemeine Datenbanksuche zu ermöglichen. Fünf von 10 Peptiden, die aus dieser Bande identifiziert wurden, stimmten mit dem 113-kDa-Protein Pet309 überein. Pet309 ist ein mitochondriales Protein, das die Translation der COX1 mRNA, analog zur Funktion von Cbp1 für COB mRNA (Manthey und McEwen, 1995). Wie erwartet stimmten zwei von drei experimentellen Peaks, die für das 68-kDa-Protein durch MALDI erhalten wurden, mit den theoretischen Peptidmassen überein, die für das Cbp1-Protein bestimmt wurden. Die Identität der Proteine ​​in den anderen einzigartigen Banden erfordert zusätzliche Untersuchungen.

Blue Native PAGE identifiziert Pet309 und Cbp1 als Komponenten desselben hochmolekularen Komplexes

Eine zweidimensionale blaue native PAGE-Analyse wurde verwendet, um die mutmaßliche Interaktion zwischen Cbp1 und Pet 309 zu verifizieren. Um beide Proteine ​​im selben Extrakt nachzuweisen, wurde ein Stamm mit HA-markiertem Pet309 zusätzlich zu Cbp1-Bio1 konstruiert (siehe MATERIALIEN UND METHODEN). . Die Zerstörung der Mitochondrien entweder durch Beschallung oder durch Verwendung von Detergenzien führte zur Spaltung des Pet309-HA-Proteins in mehrere kleinere Fragmente. Wir fanden jedoch heraus, dass die wiederholte Behandlung einer mitochondrialen Suspension durch abwechselndes Einfrieren und Auftauen genügend des hochmolekularen Komplexes mit Cbp1 (unsere unveröffentlichten Daten) freisetzte, um eine Analyse durch zweidimensionale blaue native PAGE zu ermöglichen. Wie in 7 gezeigt, enthielt dieser Extrakt mindestens zwei sichtbare Banden mit Molekulargewichten >670 kDa ( 7A ). Diese Banden führten zu einem komplexen Proteinmuster im denaturierenden Gel der zweiten Dimension, wie durch Silberfärbung sichtbar gemacht wurde ( 7B ). Sowohl Cbp1-Bio als auch Pet309-HA wurden in der zweiten und dritten Spur (0,6–0,9 cm vom oberen Rand des Gels der ersten Dimension) mit den hochmolekularen Banden nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass sie Teil eines einzigen Komplexes sind ( Abbildung 7C). Darüber hinaus wurde eine große Menge an monomerem Pet309-HA-Protein in Spuren nachgewiesen, die einem ungefähren Molekulargewicht von ∼140 kDa (3,3–3,9 cm von der Oberkante des Gels der ersten Dimension) entsprachen. Ebenso wurde monomeres Cbp1-Bio hauptsächlich in den Spuren beobachtet, die Protein- oder Proteinkomplexgrößen von 69–140 kDa (3,9–4,5 cm vom oberen Rand des Gels der ersten Dimension) entsprachen.

Abbildung 7. Zweidimensionale Analyse eines löslichen mitochondrialen Extrakts des Stamms Cbp1-Bio1/Pet309-HA. (A) Lösliche Proteine ​​wurden aus Cbp1-Bio1/Pet309-HA-Mitochondrien in Abwesenheit von Salz durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen extrahiert und in Gegenwart von Serva Blue einer Elektrophorese unterzogen, wie in MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben. Als Molekulargewichtsmarker wurde ein Aliquot des „HMW Calibration Kit for native Electrophoresis“ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) verwendet. Die Richtung der Elektrophorese wird durch den Pfeil angezeigt. (B) Für die anschließende Analyse der Proteinzusammensetzung der Komplexe durch SDS-PAGE wurde das Gel der ersten Dimension von oben beginnend in Scheiben von 3 mm geschnitten. Die Gelstücke wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Zum Vergleich wurde auch der lösliche mitochondriale Extrakt (S) einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Trennung wurden die Proteine ​​mit Silbernitrat gefärbt. Links sind die Positionen von Molekulargewichtsmarkerproteinen der denaturierenden zweiten Dimension dargestellt. Unten sind die relativen Positionen der Molekulargewichtsmarker der ersten Dimension angegeben. (C) Ein mit dem in B identisches Gel wurde auf eine PVDF-Membran geblottet und nacheinander mit Anti-HA-Peroxidase (auf 50 mU/ml verdünnt) (Roche Diagnostics) sondiert, um HA-markiertes Pet309 und Neutravidin-HRP zu erkennen (1: 1500 Verdünnung) (Pierce Chemical) zum Nachweis von Cbp1-Bio.


Inhalt

Probenvorbereitung Bearbeiten

Proben können jegliches Material sein, das Proteine ​​oder Nukleinsäuren enthält. Diese können biologisch abgeleitet sein, beispielsweise von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, Geweben, Viren, Umweltproben oder gereinigten Proteinen. Bei festen Geweben oder Zellen werden diese oft zunächst mechanisch mit einem Mixer (bei größeren Probenvolumina), mit einem Homogenisator (kleinere Volumina), durch Beschallung oder durch Hochdruckzyklen und einer Kombination aus biochemischen und mechanische Techniken – einschließlich verschiedener Arten von Filtration und Zentrifugation – können verwendet werden, um verschiedene Zellkompartimente und Organellen vor der Elektrophorese zu trennen. Als Analyten können auch synthetische Biomoleküle wie Oligonukleotide verwendet werden.

Die zu analysierende Probe wird gegebenenfalls mit einem chemischen Denaturierungsmittel gemischt, wenn dies erwünscht ist, üblicherweise SDS für Proteine ​​oder Harnstoff für Nukleinsäuren. SDS ist ein anionisches Detergens, das sekundäre und nicht-disulfidgebundene Tertiärstrukturen denaturiert und zusätzlich jedem Protein im Verhältnis zu seiner Masse eine negative Ladung verleiht. Harnstoff bricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren der Nukleinsäure, wodurch die konstituierenden Stränge aneinandergelagert werden. Das Erhitzen der Proben auf mindestens 60 °C fördert die Denaturierung zusätzlich. [7] [8] [9] [10]

Zusätzlich zu SDS können Proteine ​​optional in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (beta-Mercaptoethanol/BME) kurzzeitig bis zum Siedepunkt erhitzt werden, das die Proteine ​​durch Reduktion von Disulfidbrücken weiter denaturiert. Dadurch werden einige Formen der tertiären Proteinfaltung überwunden und die quartäre Proteinstruktur (oligomere Untereinheiten) aufgebrochen. Dies wird als reduzierende SDS-PAGE bezeichnet.

Der Lösung kann ein Tracking-Farbstoff zugesetzt werden. Dies hat typischerweise eine höhere elektrophoretische Mobilität als die Analyten, um es dem Experimentator zu ermöglichen, den Fortschritt der Lösung durch das Gel während des Elektrophoreselaufs zu verfolgen.

Acrylamidgele vorbereiten Bearbeiten

Die Gele bestehen typischerweise aus Acrylamid, Bisacrylamid, dem optionalen Denaturierungsmittel (SDS oder Harnstoff) und einem Puffer mit einem eingestellten pH-Wert. Die Lösung kann unter Vakuum entgast werden, um die Bildung von Luftblasen während der Polymerisation zu verhindern. Alternativ kann dem Trenngel (für Proteine) nach dem Gießen Butanol zugesetzt werden, da Butanol Blasen entfernt und die Oberfläche glatt macht. [11] Eine Quelle für freie Radikale und ein Stabilisator wie Ammoniumpersulfat und TEMED werden zugegeben, um die Polymerisation zu starten. [12] Bei der Polymerisationsreaktion entsteht aufgrund des zugesetzten Bisacrylamids ein Gel, das Querverbindungen zwischen zwei Acrylamidmolekülen bilden kann. Das Verhältnis von Bisacrylamid zu Acrylamid kann für spezielle Zwecke variiert werden, beträgt jedoch im Allgemeinen etwa 1 zu 35. Auch die Acrylamidkonzentration des Gels kann variiert werden, im Allgemeinen im Bereich von 5 % bis 25 %. Gele mit niedrigerem Prozentsatz eignen sich besser zum Auflösen von Molekülen mit sehr hohem Molekulargewicht, während viel höhere Prozentsätze an Acrylamid benötigt werden, um kleinere Proteine ​​aufzulösen. Der durchschnittliche Porendurchmesser von Polyacrylamidgelen wird durch die Gesamtkonzentration an Acrylamiden (% T mit T = Gesamtkonzentration von Acrylamid und Bisacrylamid) und die Konzentration des Vernetzers Bisacrylamid (%C mit C = Bisacrylamidkonzentration) bestimmt. [13] Die Porengröße wird reziprok auf %T reduziert. Bezüglich %C erzeugt eine Konzentration von 5% die kleinsten Poren, da der Einfluss von Bisacrylamid auf die Porengröße eine Parabelform mit einem Scheitelpunkt bei 5% hat.

Gele werden normalerweise zwischen zwei Glasplatten in einem Gelgießer polymerisiert, wobei oben ein Kamm eingesetzt wird, um die Probenvertiefungen zu erzeugen. Nachdem das Gel polymerisiert ist, kann der Kamm entfernt werden und das Gel ist bereit für die Elektrophorese.

Elektrophorese Bearbeiten

In PAGE werden je nach Art der Probe und Versuchsziel unterschiedliche Puffersysteme verwendet. Die an Anode und Kathode verwendeten Puffer können gleich oder verschieden sein. [9] [14] [15]

Über das Gel wird ein elektrisches Feld angelegt, wodurch die negativ geladenen Proteine ​​oder Nukleinsäuren über das Gel wandern, weg von der negativen Elektrode (das ist die Kathode, da dies eher eine elektrolytische als eine galvanische Zelle ist) und in Richtung der positiven Elektrode (der Anode). Je nach Größe bewegt sich jedes Biomolekül anders durch die Gelmatrix: Kleine Moleküle passen leichter durch die Poren im Gel, größere haben es schwerer. Das Gel wird normalerweise einige Stunden lang laufen gelassen, obwohl dies von der über das Gel angelegten Spannung abhängt. Die Migration erfolgt bei höheren Spannungen schneller, aber diese Ergebnisse sind typischerweise weniger genau als bei niedrigeren Spannungen. Nach der eingestellten Zeit sind die Biomoleküle je nach Größe unterschiedlich weit gewandert. Kleinere Biomoleküle wandern weiter im Gel, während größere näher am Entstehungsort bleiben. Biomolecules may therefore be separated roughly according to size, which depends mainly on molecular weight under denaturing conditions, but also depends on higher-order conformation under native conditions. The gel mobility is defined as the rate of migration traveled with a voltage gradient of 1V/cm and has units of cm 2 /sec/V. [3] : 161–3 For analytical purposes, the relative mobility of biomolecules, RF, the ratio of the distance the molecule traveled on the gel to the total travel distance of a tracking dye is plotted versus the molecular weight of the molecule (or sometimes the log of MW, or rather the MR, molecular radius). Such typically linear plots represent the standard markers or calibration curves that are widely used for the quantitative estimation of a variety of biomolecular sizes. [3] : 161–3

Certain glycoproteins, however, behave anomalously on SDS gels. Additionally, the analysis of larger proteins ranging from 250,000 to 600,000 Da is also reported to be problematic due to the fact that such polypeptides move improperly in the normally used gel systems. [16]

Further processing Edit

Following electrophoresis, the gel may be stained (for proteins, most commonly with Coomassie Brilliant Blue R-250 or autoradiography for nucleic acids, ethidium bromide or for either, silver stain), allowing visualization of the separated proteins, or processed further (e.g. Western blot). After staining, different species biomolecules appear as distinct bands within the gel. It is common to run molecular weight size markers of known molecular weight in a separate lane in the gel to calibrate the gel and determine the approximate molecular mass of unknown biomolecules by comparing the distance traveled relative to the marker.

For proteins, SDS-PAGE is usually the first choice as an assay of purity due to its reliability and ease. The presence of SDS and the denaturing step make proteins separate, approximately based on size, but aberrant migration of some proteins may occur. Different proteins may also stain differently, which interferes with quantification by staining. PAGE may also be used as a preparative technique for the purification of proteins. For example, quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC-PAGE) is a method for separating native metalloproteins in complex biological matrices.

Polyacrylamide gel (PAG) had been known as a potential embedding medium for sectioning tissues as early as 1964, and two independent groups employed PAG in electrophoresis in 1959. [17] [18] It possesses several electrophoretically desirable features that make it a versatile medium. It is a synthetic, thermo-stable, transparent, strong, chemically relatively inert gel, and can be prepared with a wide range of average pore sizes. [19] The pore size of a gel and the reproducibility in gel pore size are determined by three factors, the total amount of acrylamide present (%T) (T = Total concentration of acrylamide and bisacrylamide monomer), the amount of cross-linker (%C) (C = bisacrylamide concentration), and the time of polymerization of acrylamide (cf. QPNC-PAGE). Pore size decreases with increasing %T with cross-linking, 5%C gives the smallest pore size. Any increase or decrease in %C from 5% increases the pore size, as pore size with respect to %C is a parabolic function with vertex as 5%C. This appears to be because of non-homogeneous bundling of polymer strands within the gel. This gel material can also withstand high voltage gradients, is amenable to various staining and destaining procedures, and can be digested to extract separated fractions or dried for autoradiography and permanent recording.

Komponenten bearbeiten

Polyacrylamide gels are composed of a stacking gel and separating gel. Stacking gels have a higher porosity relative to the separating gel, and allow for proteins to migrate in a concentrated area. Additionally, stacking gels usually have a pH of 6.8, since the neutral glycine molecules allow for faster protein mobility. Separating gels have a pH of 8.8, where the anionic glycine slows down the mobility of proteins. Separating gels allow for the separation of proteins and have a relatively lower porosity. Here, the proteins are separated based on size (in SDS-PAGE) and size/ charge (Native PAGE). [20]

Chemical buffer stabilizes the pH value to the desired value within the gel itself and in the electrophoresis buffer. The choice of buffer also affects the electrophoretic mobility of the buffer counterions and thereby the resolution of the gel. The buffer should also be unreactive and not modify or react with most proteins. Different buffers may be used as cathode and anode buffers, respectively, depending on the application. Multiple pH values may be used within a single gel, for example in DISC electrophoresis. Common buffers in PAGE include Tris, Bis-Tris, or imidazole.

Counterion balance the intrinsic charge of the buffer ion and also affect the electric field strength during electrophoresis. Highly charged and mobile ions are often avoided in SDS-PAGE cathode buffers, but may be included in the gel itself, where it migrates ahead of the protein. In applications such as DISC SDS-PAGE the pH values within the gel may vary to change the average charge of the counterions during the run to improve resolution. Popular counterions are glycine and tricine. Glycine has been used as the source of trailing ion or slow ion because its pKa is 9.69 and mobility of glycinate are such that the effective mobility can be set at a value below that of the slowest known proteins of net negative charge in the pH range. The minimum pH of this range is approximately 8.0.

Acrylamide ( C
3 Stunden
5 NO mW: 71.08) when dissolved in water, slow, spontaneous autopolymerization of acrylamide takes place, joining molecules together by head on tail fashion to form long single-chain polymers. The presence of a free radical-generating system greatly accelerates polymerization. This kind of reaction is known as vinyl addition polymerisation. A solution of these polymer chains becomes viscous but does not form a gel, because the chains simply slide over one another. Gel formation requires linking various chains together. Acrylamide is carcinogenic, [21] a neurotoxin, and a reproductive toxin. [22] It is also essential to store acrylamide in a cool dark and dry place to reduce autopolymerisation and hydrolysis.

Bisacrylamide (n,n′-Methylenebisacrylamide) ( C
7 H
10 N
2 O
2 mW: 154.17) is the most frequently used cross linking agent for polyacrylamide gels. Chemically it can be thought of as two acrylamide molecules coupled head to head at their non-reactive ends. Bisacrylamide can crosslink two polyacrylamide chains to one another, thereby resulting in a gel.

Sodium dodecyl sulfate (SDS) ( C
12 H
25 NaO
4 S mW: 288.38) (only used in denaturing protein gels) is a strong detergent agent used to denature native proteins to individual polypeptides. This denaturation, which is referred to as reconstructive denaturation, is not accomplished by the total linearization of the protein, but instead, through a conformational change to a combination of random coil and α helix secondary structures. [6] When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this process, the intrinsic charges of polypeptides become negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit weight. The electrophoretic mobilities of these proteins is a linear function of the logarithms of their molecular weights. Without SDS, different proteins with similar molecular weights would migrate differently due to differences in mass-charge ratio, as each protein has an isoelectric point and molecular weight particular to its primary structure. This is known as native PAGE. Adding SDS solves this problem, as it binds to and unfolds the protein, giving a near uniform negative charge along the length of the polypeptide.

Urea ( CO(NH
2 )
2 mW: 60.06) is a chaotropic agent that increases the entropy of the system by interfering with intramolecular interactions mediated by non-covalent forces such as hydrogen bonds and van der Waals forces. Macromolecular structure is dependent on the net effect of these forces, therefore it follows that an increase in chaotropic solutes denatures macromolecules,

Ammonium persulfate (APS) ( N
2 H
8 S
2 O
8 mW: 228.2) is a source of free radicals and is often used as an initiator for gel formation. An alternative source of free radicals is riboflavin, which generated free radicals in a photochemical reaction.

TEMED (n, n, n′, n′-tetramethylethylenediamine) ( C
6 H
16 N
2 mW: 116.21) stabilizes free radicals and improves polymerization. The rate of polymerisation and the properties of the resulting gel depend on the concentrations of free radicals. Increasing the amount of free radicals results in a decrease in the average polymer chain length, an increase in gel turbidity and a decrease in gel elasticity. Decreasing the amount shows the reverse effect. The lowest catalytic concentrations that allow polymerisation in a reasonable period of time should be used. APS and TEMED are typically used at approximately equimolar concentrations in the range of 1 to 10 mM.

Chemicals for processing and visualization Edit

The following chemicals and procedures are used for processing of the gel and the protein samples visualized in it.

Tracking dye as proteins and nucleic acids are mostly colorless, their progress through the gel during electrophoresis cannot be easily followed. Anionic dyes of a known electrophoretic mobility are therefore usually included in the PAGE sample buffer. A very common tracking dye is Bromophenol blue (BPB, 3',3",5',5" tetrabromophenolsulfonphthalein). This dye is coloured at alkali and neutral pH and is a small negatively charged molecule that moves towards the anode. Being a highly mobile molecule it moves ahead of most proteins. As it reaches the anodic end of the electrophoresis medium electrophoresis is stopped. It can weakly bind to some proteins and impart a blue colour. Other common tracking dyes are xylene cyanol, which has lower mobility, and Orange G, which has a higher mobility.

Loading aids most PAGE systems are loaded from the top into wells within the gel. To ensure that the sample sinks to the bottom of the gel, sample buffer is supplemented with additives that increase the density of the sample. These additives should be non-ionic and non-reactive towards proteins to avoid interfering with electrophoresis. Common additives are glycerol and sucrose.

Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB)( C
45 H
44 N
3 NaO
7 S
2 mW: 825.97) is the most popular protein stain. It is an anionic dye, which non-specifically binds to proteins. The structure of CBB is predominantly non-polar, and it is usually used in methanolic solution acidified with acetic acid. Proteins in the gel are fixed by acetic acid and simultaneously stained. The excess dye incorporated into the gel can be removed by destaining with the same solution without the dye. The proteins are detected as blue bands on a clear background. As SDS is also anionic, it may interfere with staining process. Therefore, large volume of staining solution is recommended, at least ten times the volume of the gel.

Ethidium bromide (EtBr) is a popular nucleic acid stain. EtBr allows one to easily visualize DNA or RNA on a gel as EtBr fluoresces an orange color under UV light. [23] Ethidium bromide binds nucleic acid chains through the process of Intercalation. [3] While Ethidium bromide is a popular stain it is important to exercise caution when using EtBr as it is a known carcinogen. Because of this fact, many researchers opt to use stains such as SYBR Green and SYBR Safe which are safer alternatives to EtBr. [24] EtBr is used by simply adding it to the gel mixture. Once the gel has run, the gel may be viewed through the use of a photo-documentation system. [3]

Silver staining is used when more sensitive method for detection is needed, as classical Coomassie Brilliant Blue staining can usually detect a 50 ng protein band, Silver staining increases the sensitivity typically 10-100 fold more. This is based on the chemistry of photographic development. The proteins are fixed to the gel with a dilute methanol solution, then incubated with an acidic silver nitrate solution. Silver ions are reduced to their metallic form by formaldehyde at alkaline pH. An acidic solution, such as acetic acid stops development. [25] Silver staining was introduced by Kerenyi and Gallyas as a sensitive procedure to detect trace amounts of proteins in gels. [26] The technique has been extended to the study of other biological macromolecules that have been separated in a variety of supports. [27] Many variables can influence the colour intensity and every protein has its own staining characteristics clean glassware, pure reagents and water of highest purity are the key points to successful staining. [28] Silver staining was developed in the 14th century for colouring the surface of glass. It has been used extensively for this purpose since the 16th century. The colour produced by the early silver stains ranged between light yellow and an orange-red. Camillo Golgi perfected the silver staining for the study of the nervous system. Golgi's method stains a limited number of cells at random in their entirety. [29]

Autoradiography, also used for protein band detection post gel electrophoresis, uses radioactive isotopes to label proteins, which are then detected by using X-ray film. [30]

Western blotting is a process by which proteins separated in the acrylamide gel are electrophoretically transferred to a stable, manipulable membrane such as a nitrocellulose, nylon, or PVDF membrane. It is then possible to apply immunochemical techniques to visualise the transferred proteins, as well as accurately identify relative increases or decreases of the protein of interest.


Abschluss

In conclusion, a storage protein was isolated from the aerial tuber of Dioscorea bulbifera zum ersten Mal. The storage protein has similar functional properties and structural homology with the storage proteins of other Dioscorea Spezies. The storage protein is heat stable and exhibited carbonic anhydrase, dehydroascorbate reductase and trypsin inhibitory activities. It is also a good source of essential amino acids thus, the protein may be suitable for development as functional food.


Native molecular weight determination - using restricted SDS in PAGE (Oct/10/2010 )

I wish to determine molecular weight of the native protein (without dissociating the subunits). My protein will remain and migrate in intact form during the PAGE in the absence of SDS, but since there will be no uniform charge on the molecules, the separation will not occur only on the basis of size, hence I will not be able to determine the exact molecular weight. I am aware of other techniques such as gel filtration, blue-native PAGE which are more commonly used for this purpose. But since they require specialized chemicals and/or equipments, I was looking for a simpler method. While doing so, I came to know from here, that PAGE with restricted SDS can be used for native and subunit molecular weight determination simultaneously . I did one experiment and both native and denatured forms of my two test protein migrated the same distance which I did not expect. My next experiment will be doing the PAGE in the complete absence of SDS, where I wont be able to see the exact weight, but I can at least get an idea of what is happening. Meanwhile, does anybody has the experience with native molecular mass determination with this/similar method?
Thanks for your time

Hi Ram,
If you want to look for a native protein marker,
try look for NativeMark LC0725 from invitrogen
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/LC0725?ICID=search-product

p/s: can you send me (pm) the article that you mentioned? I didn't subscribe to it. Vielen Dank

adrian kohsf on Mon Oct 11 02:58:09 2010 said:

Hi Ram,
If you want to look for a native protein marker,
try look for NativeMark LC0725 from invitrogen
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/LC0725?ICID=search-product

p/s: can you send me (pm) the article that you mentioned? I didn't subscribe to it. Vielen Dank

Thanks for the reply Adrian. I am already using the same marker. Find attached paper in the PM


How Molecular Weight Is Determined

Empirical data on the molecular weight of a compound depends on the size of the molecule in question. Mass spectrometry is commonly used to find the molecular mass of small to medium-sized molecules. The weight of larger molecules and macromolecules (e.g., DNA, proteins) is found using light scattering and viscosity. Specifically, the Zimm method of light scattering and the hydrodynamic methods dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography (SEC), diffusion-ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy (DOSY), and viscometry may be used.


Ribosome: Types, Structure and Functions

The ribosome is one of the essential membrane-bound organelles of the cells. It is a minute spherical structure that contains RNA and protein and serves as the site of protein synthesis. It occurs either freely in the cytoplasm or in the matrix of mitochondria and chloroplast or attached on the outer membranes of the endoplasmic reticulum (ER) and nucleus. The word ribosome comes from ‘ribo’ meaning ribonucleic acid and Greek ‘soma’, meaning body.

Albert Claude first observed the tiny particles or granules of ribonucleoprotein and lipid under an electron microscope and he called them as microsomes in 1943. But Romanian born American Cell Biologist George E. Palade discovered it as dense particles or granules of the cytoplasm in 1955. In 1958, Richard B. Roberts proposed the name “Ribosome”. George E. Palade and other scientists discovered that ribosomes are the protein synthesizer in the cells and for this reason, in 1974 Palade was awarded the Nobel Prize for his great job.

Ribosomes are remarkably plentiful in cells. A mammalian cell contains about 10 billion protein molecules and most of them are produced from the ribosomes. One active eukaryotic cell contains about 10 million ribosomes while the prokaryotic cell (Escherichia coli) contain about 15000-20000 ribosomes which are equal about 25% of the total cell mass. The size of the ribosomes varies within cells which depend on the cell types. The average size of the ribosomes of the Escherichia coli is 200 Å in diameter.

Types of Ribosome

Ribosomes are of two types on the basis of the size and sedimentation coefficient (S) such as the 70S and 80S. Here, ‘S’ refers to Svedberg unit. This is a sedimentation coefficient which shows how fast a cell organelle sediments in an ultracentrifuge.

70S Ribosome: This type of ribosome is comparatively smaller and has sedimentation coefficient 70S which consists of two subunits such as large 50S subunit and small 30S subunit and they are linked together. The molecular weight is 2.7×106 Daltons. They are found in all prokaryotic cells, in mitochondria and chloroplast of eukaryotic cells.

80S Ribosome: This type of ribosome is comparatively larger and has sedimentation coefficient 80S which consists of large circular 60S subunit and small elliptical 40S subunit. The molecular weight is 40×106 Daltons. They are found in all eukaryotic cells.

Physical Structures of Ribosome

Each ribosome contains two subunits, such as a larger one and a smaller one. Ribosomal subunits are made in the nucleolus from the proteins and nucleic acids. Then, through the nuclear pores, they are exported into the cytoplasm. The sizes of the two subunits are unequal and exist in this state until required for use. The larger sub-unit is about two times larger than smaller one

The 40S and 60S are the small and large subunits of eukaryotic cells, respectively, while 30S and 50S are the small and large subunit, respectively of prokaryotic cells. The smaller subunit occurs above the larger subunit-like a cap. The ribosomal subunits occur individually when ribosomes are not involved in protein synthesis. The two subunits join together when protein synthesis starts and undergo dissociation when protein synthesis stops. During protein synthesis, two subunits are grouped and form polyribosome or polysome.

Chemical Structure of Ribosome

Chemically, ribosomes consist of ribosomal proteins and rRNA(ribosomal RNA). In the prokaryotic cells, ribosomes have 40% protein and 60% rRNA while in eukaryotic cells, ribosomes are made up of about 50% protein and 50% rRNA. Besides these, ribosomes also contain trace amounts of Magnesium (Mg), Calcium(Ca) and manganese(Mn).


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